הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה ברזולוציה גבוהה של ביופילם Proteus mirabilis על ידי מיקרוסקופ הרחבה

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67932

⸱

18 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Scientific Image Analysis SCIAN-Lab, Integrative Biology Program, Centro de Informática Médica y Telemedicina CIMT, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 2Biomedical Neuroscience Institute BNI, 3Advanced Center for Chronic Diseases ACCDiS, 4Laboratorio de Biofilms Microbianos, Departamento de Microbiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 5Red de Equipamiento Científico Avanzado REDECA, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 6National Center for Health Information Systems CENS, 7Centro de Modelamiento Matemático, Universidad de Chile

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף עבור PmbExM, טכניקת מיקרוסקופיית הרחבה שתוכננה במיוחד עבור ביופילמים של Proteus mirabilis . PmbExM משתמש בטיפול אנזימטי מדורג בדגימות ביופילם כדי להשיג התרחבות איזוטרופית פי 4.3, המאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של הארגון המרחבי של מבנים תאיים ותת-תאיים בתוך קהילות מיקרוביאליות יושבות אלה.

תקציר

גישה למידע חזותי מפורט ונתונים כמותיים מדגימות מיקרוביולוגיות באמצעות מיקרוסקופיה אופטית קונבנציונלית מוגבלת על ידי מחסום העקיפה. פתרון אחד לשיפור הרזולוציה הוא מיקרוסקופיית הרחבה (ExM), טכניקה חדשנית וחסכונית ברזולוציה גבוהה המגדילה פיזית דגימות בערך פי ארבעה מגודלן המקורי. לצורך התרחבות מוצלחת, חיוני להומוגניזציה של התכונות המכניות של החומר הביולוגי. ביופילמים הם קהילות חיידקים, הנצמדות למשטח ומוטמעות במטריצה חוץ-תאית שהם מייצרים; הם דורשים התאמה של פרוטוקולי ExM כדי להתאים לרכיבים המבניים הייחודיים שלהם. מאמר זה מציג את Proteus mirabilis biofilm ExM (PmbExM), גרסה מיוחדת של ExM המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של ביופילמים של P. mirabilis שגדלו במשך 48 שעות. הפרוטוקול מתמקד בפירוק ממוקד של מרכיבים מבניים מרכזיים של דגימות באמצעות עיכול אנזימטי סדרתי, המותאם לתנאים התיאורטיים שלהם. PmbExM משתמש בשילוב של אנזימים, כולל α-עמילאז, צלולאז וליטיקאז גליקוזיד-הידרולאז להידרוליזה של פוליסכריד; מוטנוליזין להידרוליזה של פפטידוגליקן; ופרוטאינאז K להידרוליזה של חלבון. הליכי עיכול אלה אינם תלויים בתהליך הג'לציה, ומאפשרים שינויים כדי לעמוד בדרישות הומוגניזציה ספציפיות במודלים שונים של ביופילם. יכולת הסתגלות זו מציעה פוטנציאל גדול ליישום על פני מיני חיידקים ותנאי גידול שונים. ExM יושם על מיני ביופילם שונים עם גורמי התפשטות לא אופטימליים כוללים. לעומת זאת, PmbExM משיג את מקדם ההתפשטות המקסימלי התיאורטי של הידרוג'ל אקרילאמיד-אקרילט ExM הסטנדרטי, ללא עיוות משמעותי של מורפולוגיה או טופולוגיה. מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול נגיש ברזולוציה גבוהה להמחשת הארכיטקטורה, ההרכבה והתכונות התאיות והתוך-תאיות של ביופילמים של P. mirabilis .

מבוא

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היא כלי בשימוש נרחב לחקר ארכיטקטורת ביופילם, הרכב ותפקוד1. עם זאת, היכולת של מיקרוסקופיה אופטית לפתור את המאפיינים המבניים, התאיים והתת-תאיים של ביופילמים מוגבלת על ידי מחסום העקיפה. מיקרוסקופיית הרחבה (ExM) היא טכניקת סופר-רזולוציה חדשנית, נגישה וקלה לשימוש שיש לה פוטנציאל גדול לחשוף מבנה ביופילם מעבר לגבול העקיפה 2,3. ExM משפר את הרזולוציה על ידי הרחבה איזוטרופית של דגימות ביולוגיות בערך פי ארבעה מגודלן המקורי. השיטה כוללת פילמור באתרו של הידרוג'ל יוני מתנפח לאורך הדגימה ושמירה על הסידור המרחבי היחסי של מטרות מולקולריות כאשר מיושמים בזהירות 4,5.

כדי ש-ExM יעבוד כראוי, הומוגניזציה של התכונות המכניות של החומר הביולוגי היא שלבמכריע 6. גרסאות ExM סטנדרטיות פותחו על תרביות ורקמות של תאי יונקים, שם הם השיגו ביעילות הומוגניזציה רק באמצעות עיכול פרוטאוליטי של פרוטאינאז K 4,5 או דנטורציה של חלבון רך עם חומרי ניקוי וחיטוי7, מה שהניב התרחבות איזוטרופית פי 4. עם זאת, במקרה של חיידקים וביופילמים חיידקיים, דופן התא הפפטידוגליקן ואלמנטים של מטריצת EPS, כגון פוליסכרידים מבניים, מהווים מכשולים נגד התרחבות 2,3,8,9.

מאמר זה מתאר את ההליכים של Proteus mirabilis biofilm expansion Microscopy (PmbExM), וריאנט ExM מותאם אישית שנועד להרחיב את הביופילמים של P. mirabilis, חיידק גרם שלילי רלוונטי מבחינה קלינית הקשור לעמידות גבוהה לאנטיביוטיקה וזיהומים בדרכי השתן הקשורים לצנתר10. PmbExM משתמש בשילוב של טיפולים אנזימטיים מוטנוליזין, α-עמילאז, צלולאז, ליטיקאז ופרוטאינאז K להידרוליזה של דופן התא הפפטידוגליקן, פוליסכרידים וחלבונים, בהתאמה. התוצאות מדגימות כי שיטה זו משיגה התרחבות איזוטרופית של פי 4.3 של ביופילמים בני 48 שעות. הטכניקה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורת ביופילם P. mirabilis , הרכבה ותכונות תוך-תאיות באמצעות צביעה כפולה3. יתר על כן, ניתן להתאים את PmbExM למודלים אחרים של ביופילם על ידי התאמת טיפולי האנזים לרכיבי ביופילם ספציפיים למין.

מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של ההליכים הכרוכים בג'לציה, עיכול, הרחבה והרכבה של דגימות ביופילם עבור PmbExM. בנוסף, עבודה זו מתארת תנאי גידול חיידקים, פורמטים של דגימות וטכניקות צביעה פלואורסצנטיות המשמשות את המחברים, יחד עם שגרת עיבוד וניתוח נתונים שיכולה להיות מיושמת בקלות על ידי חוקרים בעלי ניסיון מוגבל בעיבוד תמונה. למדריך מקיף ומעמיק יותר על עיבוד וניתוח תמונה, עיין ב-Castagnini, D. et al.3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

התהליך הכולל של PmbExM מסוכם באיור 1. אנא עיין בקובץ משלים 1 כדי למצוא את ההרכב של כל התמיסות הנקובות (כלומר, תמיסת מונומר, תמיסת עיכול חלבון K וכו') המשמשות בעבודה זו. כמו כן, עיין בקובץ משלים 2, קובץ משלים 3 וקובץ משלים 4 לשגרת עיבוד וניתוח נתונים פשוטה שיכולה לשמש חוקרים ללא ניסיון רב בעיבוד תמונה. ניתן לבצע את הפרוטוקול בנוחות במשך תקופה של 2.5-3 שבועות: השבוע הראשון מוקדש לניקוי ועיקור כיסוי, גידול ביופילם וקיבוע דגימות; השבוע השני לדגימת צביעה ופרוטוקול PmbExM עצמו, והשלישי להרכבת דגימה ורכישת תמונה. בנוסף, שקול שבוע אחד של הכנות מוקדמות לחומרים ולפתרונות הנדרשים. פרטים על הריאגנטים, החומרים, הציוד והתוכנה המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

figure-protocol-1
איור 1: עיגון, פילמור, עיכול ודיאליזה של פרוטוקול PmbExM עבור הרחבה, תצפית וניתוח מוצלחים של ביופילם P. mirabilis . העמודה השמאלית מזהה שישה מצבים של המדגם בשלבים נבחרים במהלך פרוטוקול ההרחבה. זה מתחיל מדגימת הביופילם הקבועה, החדירה והמוכתמת, לאחר ארבעה מצבי ביניים עד למצב הג'ל והמורחב הסופי, מוכן למיקרוסקופיה וניתוח תמונה ברזולוציה על. מטריצת ה-EPS של הביופילם מוצגת בירוק, דופן תא החיידק מיוצגת על ידי קווים סגולים, מבנה תא החלבון הכללי מוצג באפור, ופולימר אקרילאמיד-אקרילט ExM מוצג כקווים כחולים גליים. כל האנזימים המעורבים בתהליך מיוצגים על ידי סמלי פק-מן: 3 גליקוזידים-הידרולזים (ירוק) להידרוליזה של אקסופוליסכריד: α-עמילאז, צלולאז וליטיקאז; מוטנוליזין (סגול) לפירוק דופן התא הפפטידוגליקן; ופרוטאינאז K (אפור) לעיכול חלבון כללי. הצבעים של סמלי פק-מן תואמים את מבני היעד המתאימים. כל האובייקטים המוצגים באטימות נמוכה או בגבולות מקווקווים מייצגים מצב של השפלה אנזימטית. איור זה שונה מ-Castagnini, D. et al.3. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

1. ניקוי ועיקור של כיסויי זכוכית ליצירת ביופילם

  1. כיסויי זכוכית אולטרה-סוניקט 12 מ"מ מחליק ב-1 M נתרן הידרוקסיד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן שוטפים במים נטולי יונים בשפע.
  2. אולטרסאונד את החלקות הכיסוי באתנול 70% (v/v) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן שטוף עם 95% (v/v) אתנול.
  3. הניחו לכיסויים להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.
  4. עיקור על ידי חיטוי.

2. גידול ביופילם של Proteus mirabilis

  1. גדל P. mirabilis ב -10 מ"ל של מרק Luria Bertani (LB) למשך 24 שעות ב -37 מעלות צלזיוס מבלי לנער.
    הערה: זן מסוג P. mirabilis זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) נרכש ונעשה בו שימוש במחקר זה, אך מומלץ להשתמש בכל זן P . mirabilis הזמין בקלות.
  2. קח 1 מ"ל מהתרבית והוסף אותו ל -9 מ"ל מרק LB טרי וסטרילי כדי ליצור תרחיף חיידקי של דילול 1:10.
  3. בדוק את הצפיפות האופטית (OD) ב-600 ננומטר של תרחיף החיידקים 1:10 כ-0.1. התאם במידת הצורך על ידי הוספת כמויות קטנות של תרבית LB או P. mirabilis טרייה עד שהיא מגיעה ל-OD600 = 0.1.
  4. הכניסו כיסויי זכוכית 12 מ"מ (נוקו ועוקרו בעבר) בפלטת באר פוליסטירן סטרילית 24 (כיסוי אחד לבאר).
    הערה: ודא שכל משטח הכיסוי נוגע בתחתית הבאר. הביופילם ייווצר בצד הכיסוי, הפונה כלפי מעלה.
  5. זרע את בארות הצלחת עם 350 מיקרוליטר של תרחיף חיידקים OD600 = 0.1.
    הערה: מומלץ לזרוע רק את הבארות הפנימיות של הצלחת, תוך מילוי הבארות החיצוניות (כלומר בארות בשורות A ו-D ובעמודות 1 ו-6) במים סטריליים או במרק LB. הסיבה לכך היא שהבארות החיצוניות מועדות לשיעורי אידוי נוזלים גבוהים יותר מאשר הבארות הפנימיות, מה שמשפיע על צמיחת הביופילם.
  6. הניחו את צלחת הזרעים בתוך חממה ומקמו אותה עם 45 מעלות נטייה.
    הערה: השתמש בחומר מעבדה נפוץ כגון צינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל או קופסאות קצה מיקרופיפטה. המיקום המוטה יאפשר יצירת ממשק אוויר-נוזל על פני הכיסוי שבו הביופילם של P. mirabilis יבסס את האזור העבה ביותר שלו.
  7. אפשרו לביופילמים להיווצר במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מבלי לרעוד.
    הערה: מערך גידול ביופילם זה אינו מתאים לזמני דגירה ארוכים מ-48 שעות עקב ייבוש ביופילם עקב אידוי המדיום.

3. קיבוע ואחסון דגימות ביופילם

  1. הסר בזהירות את מדיום התרבית מהבארות ושטוף בעדינות את הכיסויים הנושאים ביופילם פעמיים עם 300 מיקרוליטר מאגר פוספט סטרילי (PBS) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה קלה מאוד.
    הערה: הימנע מהרס הביופילמים עם חילופי נוזלים חוזרים ונשנים על ידי שימוש בנפחים קטנים לדגירה או כביסה. 300-400 מיקרוליטר נוזל מספיקים כדי להטביע את הביופילמים בצלחת של 24 בארות. מומלץ מאוד לנקוט בפיפטינג איטי ושיטתי, כמו גם להימנע מפגיעה ישירה בביופילמים עם התמיסות המוחלפות.
  2. הסר בזהירות את ה-PBS והחלף אותו ב-400 מיקרוליטר של 4% (w/v) פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לקיבוע ביופילם.
  3. הסר את ה-PFA והחלף אותו ב-300 מיקרוליטר של 1% PBST (1% v/v Triton X-100 ב-PBS) לחדירות תאים. דוגרים למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. החלף את תמיסת ה-PBST של 1% ב-300 מיקרוליטר של 0.3% PBST (3% v/v Triton X-100 ב-PBS). דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. הסר את ה-0.3% PBST והחלף אותו ב-300 מיקרוליטר של תערובת 50:50 של מתנול ו-0.3% PBST להתייבשות דגימה. דוגרים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ואז מחליפים את התערובת ב -1 מ"ל מתנול מוחלט.
    הערה: הוסף 1 מ"ל מתנול לאט, מכוון אותו אל קירות הבאר. נפח גבוה יותר זה של מתנול משמש למניעת אידויו המוחלט במהלך אחסון הדגימות.
  6. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך יום אחד לפחות ועד חודש.
    הערה: מומלץ לאטום את הלוחות באמצעות סרט שעווה גמיש כדי לעכב את אידוי המתנול וייבוש הדגימות.
  7. עם השימוש, יש להחזיר את הדגימות ברצף על ידי החלפת המתנול ב-300 מיקרוליטר של תערובת של 50:50 של מתנול ו-0.3% PBST, ולאחר מכן ב-300 מיקרוליטר 0.3% PBST, בטמפרטורת החדר.

4. צביעה פלואורסצנטית ביופילם

  1. דגרו את דגימות הביופילם המיובשות עם 300 מיקרוליטר של 50 מיקרוגרם/מ"ל מצומד לקטין פלואורסצנטי של נבט חיטה אגלוטינין (להלן רק מצומד WGA; ראה טבלת חומרים) ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לצביעה של דופן התא/קפסולה/אקסופוליסכרידים.
    הערה: אנא ראה נושאים רלוונטיים לגבי צביעה פלואורסצנטית בסעיף הדיון. מעתה והלאה, הגן על הדגימות מפני אור.
  2. הסר את תמיסת המצומד WGA ושטוף בעדינות פעמיים עם 300 מיקרוליטר PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

5. שלבי PmbExM

  1. עיגון MA-NHS ופילמור אקרילאמיד-אקרילט
    1. דגרו את דגימות הביופילם המוכתמות עם 400 מיקרוליטר של 1 מ"מ חומצה מתאקרילית N-הידרוקסיסוקסימידיל אסטר (MA-NHS) ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר עם תסיסה קלה.
      הערה: MA-NHS הוא אסטר מופעל הנוטה להידרוליזה במדיום מימי, לכן יש לטפל בדגימות מיד לאחר הכנת ה-1 מ"מ בתמיסת PBS.
    2. בצע שלוש שטיפות עדינות של 10 דקות עם 300 מיקרוליטר PBS בטמפרטורת החדר.
    3. הסר את ה-PBS והחלף אותו ב-300 מיקרוליטר של תמיסת מונומר. דגירה למשך הלילה (O.N.) ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. בנה את תאי הג'לציה. השתמש במגלשת זכוכית כבסיס והניח עליה שתי חתיכות של סרט דו צדדי מקופל כדי לשמש כמרווחים של 400 מיקרומטר. מסדרים את המרווחים 8-10 מ"מ זה מזה.
      הערה: ראה איור 2A להבהרה נוספת כיצד לבנות את תא הג'לציה המקדים. הסרט הדו-צדדי ששימש כאן היה בעובי של כ-100 מיקרומטר, ולכן הוא נחתך וקופל על עצמו כדי ליצור מרווחים של 3 מ"מ על 5 מ"מ על 0.4 מ"מ. מדוד את עובי הסרט הדו-צדדי הזמין וסדר אותו בהתאם. ספיגת תמיסת הג'ל על ידי מרווחי הקלטת זניחה. כחלופה לסרט דו צדדי, ניתן להדביק כיסויי זכוכית עגולים בגודל 12 מ"מ יחד עם טיפות מים ולערום אותם עד לגובה הנדרש.
    5. סדרו תאים רטובים כדי להגן על דגימות במהלך פילמור מפני התייבשות.
      הערה: ניתן להמיר בקלות קופסה נפוצה של קצות מיקרופיפטה לתא רטוב על ידי הסרת פיגום הפלסטיק של הקצוות והחלפתו במגבות נייר רטובות.
    6. הכן נפח מלאי טרי של תמיסת ג'ל על ידי ערבוב יסודי של נפחי תמיסת מונומר, 10% (w/v) N, N, N', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED), 0.5% (w/v) 4-hydroxy-TEMPO (4-HT) ו-10% (w/v) אמוניום פרסולפט (APS) ביחס של 47:1:1:1, בהתאמה. מערבבים את ה- APS עם שאר ריאגנטים לתמיסת הג'ל רק כאשר נעשים שלבים עד 5.1.5.
      הערה: הנפח הכולל של תמיסת ג'ל מלאי להכנה יהיה תלוי בכמות דגימות הביופילם המעובדות. לדוגמה, כדי לעבד שלוש דגימות ביופילם, הכינו 900 מיקרוליטר של תמיסת ג'ל על ידי ערבוב של 846 מיקרוליטר של תמיסת מונומר עם 18 מיקרוליטר של 10% (w/w) TEMED, 18 מיקרוליטר של 0.5% (w/w) 4-HT ו-18 מיקרוליטר של 10% (w/w) APS. כדי למנוע פילמור מוקדם, יש להוסיף APS אחרון לתערובת ורק כאשר דגימות, תאי ג'לציה ותאים רטובים מוכנים לשימוש. שמור על כל הריאגנטים שהוזכרו ותמיסת הג'ל שהוכנה לאחרונה מקוררת במהלך שלב זה.
    7. מיד לאחר הכנת תמיסת הג'ל, הסר בעדינות את תמיסת המונומר והחלף אותה ב -300 מיקרוליטר מהראשון. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    8. בזמן ששלב 5.1.7 נמשך, הסר את כיסוי המגן שנותר של פסי הסרט הדו-צדדיים המסודרים על שקופיות הזכוכית, וברווח ביניהם, הניחו 40 מיקרוליטר של תמיסת ג'ל.
    9. לאחר סיום שלב 5.1.7, הסר כל כיסוי נושא ביופילם מהבאר שלו והנח אותו על גבי טיפת 40 מיקרוליטר של תמיסת ג'ל שהונחה בעבר על מגלשת זכוכית. כוון את הכיסוי כך שהביופילם על פני השטח שלו ייגע בתמיסת הג'ל.
    10. סיים את בניית תא הג'לציה על ידי לחיצה עדינה על הכיסוי הנושא ביופילם באמצעות פינצטה כדי להבטיח את הדבקתו למרווחי הסרט הדו-צדדיים.
      הערה: מערך דמוי-סנדוויץ' זה מורכב ממה שנקרא תא הג'לציה (איור 2B).
    11. הניחו לדגימות להתפלמר בתוך תא רטוב ולדגור במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללא תסיסה.
    12. דמיין את הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראה שלב 6.2.1) מבלי לפרק את תאי הג'לציה לצילום תמונה לפני הרחבה.
      הערה: אל תשאיר את דגימות הג'ל מחוץ לתא הרטוב למשך יותר משעה, מכיוון שג'לים מורחבים מראש מועדים להתייבשות, מה שהופך את הדגימה לבלתי שמישה. אנא ראה שלב SF2.3 (קובץ משלים 2) להליכי רכישה רלוונטיים לפני הרחבה.
    13. לפרק את תאי הג'לציה ולקצץ את עודפי הג'ל סביב אזור העניין בדגימת הביופילם באמצעות להב כירורגי.
      הערה: מומלץ מאוד לקצץ את הג'לים כדי להקל על הטיפול וההרכבה של דגימות מורחבות. בנוסף, כדי לעקוב אחר ההתמצאות המרחבית של אזור העניין בתוך הדגימות, חתוך את הג'לים לצורה אסימטרית או השאר חתך אופייני בג'ל לזיהוי קל של התמצאות נכונה.
    14. הנח את הכיסויים הנושאים את הג'לים הגזומים בתוך צלחת חדשה של 24 בארות, כשהג'ל פונה כלפי מעלה.
      הערה: בשלב זה, דגימות הג'ל צריכות להישאר דבוקות לכיסוי הזכוכית המקורי שלהן.
  2. עיכול אנזימטי I-III וצביעת DNA
    הערה: הומוגניזציה של התכונות המכניות של דגימות ביופילם של P. mirabilis עוקבת אחר סדרה של עיכול אנזימטי שהמחברים סיווגו בשלושה שלבים, בהתבסס על המבנה הביולוגי המיועד לפירוק: הידרוליזה של פוליסכריד (עיכול I), הידרוליזה של פפטידוגליקן (עיכול II) והידרוליזה של חלבונים (עיכול III).
    1. עיכול I
      1. טבלו את הדגימות ב-1 מ"ל של תמיסת עיכול α-עמילאז. דגירה O.N. ב-50 מעלות צלזיוס.
        הערה: נפחים גדולים (כלומר, 0.5-1 מ"ל) של תמיסה אנזימטית משמשים למניעת ייבוש דגימה עקב טמפרטורת הדגירה הגבוהה.
      2. הסר את תמיסת α-עמילאז ושטוף את הג'לים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם 300 מיקרוליטר של מאגר עיכול צלולאז.
      3. הסר את מאגר העיכול של הצלולאז והחלף אותו ב-500 מיקרוליטר של תמיסת עיכול צלולאז. יש לדגור למשך שעתיים בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס.
      4. הסר את תמיסת העיכול של הצלולאז ושטוף את הג'לים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם 300 מיקרוליטר של מאגר עיכול ליטיקאז.
      5. הסר את מאגר העיכול של הליטיקאז והחלף אותו ב-500 מיקרוליטר של תמיסת עיכול ליטיקאז. יש לדגור למשך שעתיים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
    2. עיכול II
      1. הסר את תמיסת העיכול של הליטיקאז ושטוף את הג'לים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם 300 מיקרוליטר של מאגר עיכול מוטנוליזין.
      2. הסר את מאגר העיכול של מוטנוליזין והחלף אותו ב-1 מ"ל של תמיסת עיכול מוטנוליזין. דגירה של O.N. ב-55 מעלות צלזיוס.
    3. עיכול III
      1. הסר את תמיסת העיכול של מוטנוליזין ושטוף את הג'לים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם 300 מיקרוליטר של מאגר עיכול חלבון K. הסר את מאגר העיכול של חלבון K והחלף אותו ב-500 מיקרוליטר של תמיסת עיכול חלבון K. יש לדגור למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    4. (אופציונלי) צביעת DNA
      1. הסר את תמיסת החלבון K ושטוף את הג'לים עם 300 מיקרוליטר של 10x PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. הסר את ה-PBS 10x והחלף אותו ב-300 מיקרוליטר של כתם חומצת גרעין פלואורסצנטית אדומה של 5 מיקרומטר ב-10x PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
        הערה: עיין בסעיף הדיון להערות על צביעת DNA עבור הליכי ExM.
  3. הרחבה
    1. הסר את תמיסת הפרוטאינאז K (או את תמיסת צביעת ה- DNA אם בוצע שלב 5.2.4 האופציונלי) והעביר את הג'לים לצלחת פטרי 60 מ"מ. מניחים ג'ל אחד לכל צלחת פטרי.
      הערה: השתמש במברשת שטוחה קטנה כדי לדחוף את הג'ל על כיסוי הזכוכית שלו. בעזרת פינצטה מעבדה, תפוס את כיסוי הזכוכית והשתמש בו כפלטפורמה לג'ל. מנע מהג'ל ליפול מהכיסוי בעזרת המברשת בעת הרמתו מבאר הצלחת. הימנע מהג'לים להתקפל על עצמם.
    2. ממלאים את צלחת הפטרי בעודפי מים נטולי יונים, טובלים את הג'ל במלואו ודוגרים תחת תסיסה עדינה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. החלף את המים 4-5 פעמים.
      הערה: שימו לב שהג'ל המתרחב הופך כמעט בלתי נראה כאשר הוא שקוע במים. מקם את צלחת הפטרי כנגד האור כדי להקל על איתור הג'ל כדי למנוע נזק לו עם היניקה מפיפטה פסטר או מיקרופיפטה במהלך חילופי מים.

figure-protocol-2
איור 2: תא ג'לציה והרכבה לדוגמא. (A) תא טרום-ג'לציה. בשקופית, מקם 2 מרווחי סרט דו צדדיים (צהוב). כיסוי זכוכית (figure-protocol-3 = 12 מ"מ) יושב על גבי כהתייחסות למרחק. (ב) תא ג'לציה. הביופילם החיידקי (ירוק) נוצר על משטח הכיסוי התחתון. מרווחים בעובי 400 מיקרומטר (כתום) עשויים מחיתוכי סרט דו צדדי בעובי 100 מיקרומטר. מרווחים מאפשרים לג'ל להטמיע את כל הדגימה ולמנוע הצפת תמיסת ג'ל מקצוות החדר, ומונעים מהדגימה להימעך בין המגלשה לכיסוי. (C) תאי הדמיה מודפסים בתלת מימד (בקר בקישור הבא כדי לגשת לקבצי .stl https://github.com/scianlab/ExM). דגימת ג'ל מורחבת (משמאל) ודגימת ג'ל מורחבת שקועה במים נטולי יונים (מימין). ג'לים מורחבים הופכים כמעט בלתי נראים כאשר הם טובלים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

6. תצפית וניתוח

  1. הרכבה של דגימות מורחבות
    1. הכן את תאי ההדמיה עם ציפוי פולי-ליזין לקיבוע דגימה במהלך הדמיה11: השרו את משטח הזכוכית של תא ההדמיה (ראה טבלת חומרים) עם 0.1% (w/v) פולי-L-ליזין למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הסר את תמיסת הפולי-L-ליזין ובצע שתי שטיפות עם עודף מים נטולי יונים. הניחו לייבוש באוויר למשך שעה אחת או הניחו בתוך חממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להאיץ את תהליך הייבוש.
    3. לאחר מחזור הדיאליזה החמישי משלב 5.3.2, הסר את המים המכסים את הג'לים והשתמש במברשת שטוחה קטנה כדי לדחוף את הדגימה על כיסוי זכוכית בגודל 24 מ"מ על 50 מ"מ. השתמש בכיסוי המלבני כפלטפורמה לג'ל והרם אותו מצלחת הפטרי.
    4. הסר את עודפי המים מהג'ל באמצעות נייר טישו כדי למנוע ממים לחסום מגע ישיר בין פני הג'ל לציפוי הפולי-ליזין על משטח הזכוכית של תא ההדמיה.
    5. הנח בזהירות את הג'ל על משטח הזכוכית של תא ההדמיה, והימנע מהחזקת בועות אוויר בין הג'ל לזכוכית.
      הערה: משטח הזכוכית של תא ההדמיה צריך להיות יבש לחלוטין. אם צולמו תמונות טרום הרחבה, שקול כיוון נכון של הג'ל המורחב כדי להקל על מציאת שדות הראייה שצולמו בעבר בדגימה המורחבת מראש.
    6. הוסף מים נטולי יונים עד שהג'ל שקוע לחלוטין (ראה איור 2C).
      הערה: הג'לים המורחבים חייבים להישאר לחות במהלך כל תהליך ההדמיה כדי למנוע התכווצות במהלך הצילום.
  2. רכישת תמונות
    1. דמיין וצלם תמונות של הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי זמין מוגבל עקיפה.
      הערה: המחברים השתמשו במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב, עם יעד טבילה במים פי 63 של צמצם מספרי של 1.2 (NA). לצורך עירור פלואורופור, נעשה שימוש בקו לייזר במצב מוצק ב-488 ו-647 ננומטר. הצילומים נעשו באמצעות מצלמת CMOS דיגיטלית של 16 סיביות הנשלטת על ידי תוכנה קניינית (ראה טבלת חומרים). גודל הווקסל הוגדר ל-64.4 מ"מ x 64.4 מ"מ x 200 ננומטר (צירי XYZ ).
  3. עיבוד תמונה
    1. אנא עיין בקובץ משלים 2 כדי למצוא שגרת עיבוד תמונה דיגיטלית לפילוח חיידקים (סעיף SF2.1), מדידת רוחב תא (סעיף SF2.2), קביעת EF (סעיף SF2.3) והתאמת תמונה לתנאים מורחבים ומורחבים מראש (סעיף SF2.4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

PmbExM הרחיב את הביופילם של P. mirabilis פי 4.3 ושימר על מורפולוגיה וטופולוגיה
איור 3A-D מראה את ההגדלה הפיזיקלית של תאי ביופילם P. mirabilis ואת הרזולוציה המוגברת שהטכניקה מעלה . יתר על כן, זה נצפה לא רק באזורי ביופילם דקים שבהם תאים מתארגנים בפריסה דמוית שכבה אחת, אלא גם באזורים עבים יותר של סידורים מאוכלסים בצפיפות של 2 או אפילו 3 שכבות של חיידקים (איור 3G,H

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלבים קריטיים של PmbExM
כמו בכל גרסת ExM, אחד השלבים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הוא הומוגניזציה של התכונות המכניות של הדגימה. במקרה של PmbExM, זה מושג באמצעות סדרה של טיפולים אנזימטיים. עיכול לא מספיק עלול לגרום ל-EFs נמוכים ולנזק פוטנציאלי למורפולוגיה ו/או לטופולוגיה של ביופילם, מה שמוביל לרזולוציה לא אופטימלית ולתוצאות לא אמינות. לעומת זאת, עיכול אגרסיבי מדי, במיוחד טיפולים פרוטאוליטיים, יכול לגרום לאובדן פלואורסצנטי משמעותי ולפגוע במורפולוגיה ובארכיטקטורה של הביופ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא מצהירים על ניגודי אינטרסים כספיים או אישיים הקשורים לעבודה זו.

תודות

המחברים מודים לד"ר חואן אדוארדו רודריגז ולפרופ' ד"ר אולריך קוביצ'ק (U-Bonn) על תרומתם ליישום טכניקות ההרחבה ב-SCIAN-Lab. עבודה זו מומנה על ידי פרויקטים של ANID ICM P09-015-F (SH, DC, KP, JJW), FONDECYT 1211988 (SH, DC, KP), FONDECYT 3220832 (JJW), FONDEQUIP EQM210020 (DC, KP, JJW, JT, NCH, PS, SH); Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH, KP, JJW), CORFO 16CTTS- 66,390, MINEDUC GRANT RED 21994 (SH), BASAL FB210005 (SH), DAAD 57519605 (SH, NC), Centro CTI230006 (SH), FONDEF ID 23I10337 (SH), והפרויקט הדו-לאומי האזורי Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661 (SH, NCH, PS, MJG).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
α-עמילאז מ-Bacillus sp.Sigma-Aldrich 10070עיכול פוליסכריד
0.1% (w/v) תמיסת מים פולי-L-ליזין Sigma-AldrichP8920אימוביליזציה לדוגמא להדמיית
כיסויי זכוכית 12 מ"מChemglass Life SciencesCLS-1760רכיב תא ג'לציה
16 סיביות מצלמת C13440-20CUHamamatsu Photonicsלא זמיןמצלמה דיגיטלית CMOS לרכישת תמונה
כיסויי זכוכית 24 מ"מ x 50 מ"מChemglass Life SciencesCLS-1764מניפולציה/טיפול בדגימות
תא הדמיה מודפס בתלת מימדעיצובפנימי-אפשרותתא הדמיה
4-הידרוקסי-2,2,6,6-טטרמתילפיפרידין-1-אוקסיל (4-הידרוקסי-TEMPO)רכיב תמיסת ג'לSigma-Aldrich176141
צלחת תחתון זכוכית 6 בארות עם קירות שחוריםCelVisP06-1.5H-Nאפשרות תא הדמיה
חומצה אצטית רכיב חיץ אנזים818755 Sigma-Aldrich
אקרילאמיד Sigma-AldrichA4058רכיב תמיסת מונומר
אמוניום פרסולפטSigma-AldrichA3678רכיב תמיסת ג'ל
Axiovert 200 מיקרוסקופZeissלא זמיןמיקרוסקופ קונפוקלי
סידן כלורידסיגמא-אולדריץ'C8106רכיב חיץ אנזים
C-Apochromat 63x 1.2 NA מטרת טבילה במיםZeissלא זמיןמיקרוסקופ אובייקטיבי
צלולאז מAspergillus nigerSigma-Aldrich 22178עיכול פוליסכריד
Chamlide CMB 35 מ"מ צלחת תא הדמיהמגנטי מכשיר תא חילא זמיןאפשרות תא הדמיה
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ'472301MA-NHS עיגון ריאגנט פתרון מלאי 
דיסודיום פוספטסיגמא-אולדריץ'S3264רכיב חיץ אנזים
אתנולסיגמא-אולדריץ'E7023ניקוי ועיקור
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית רכיבחיץ אנזיםMerck324503
פוליסטירן פלקון 24 צלחות בארקורנינג351147פלטפורמת נהלים כלליים
פיג'יהמכונים הלאומיים לבריאות-תוכנה לעיבוד תמונה
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G7893רכיב חיץ אנזים
גואנידין הידרוכלורידתרמו סיינטיפיק24115רכיב חיץ אנזים
הויגנס תוכנהמדעית להדמיה-דה-קונבולוציהלשחזור תמונה
חומצה הידרוכלוריתסופלקו1.00317הכנת חיץ
נייר טישו Kimwipesפישר סיינטיפיק06-666הסרת עודפי מים
פינצטה מעבדהמדעי מיקרוסקופיה אלקטרוניתM5Eמניפולציה/טיפול כללי בדגימות
מרק לוריא ברטאניInvitrogen12795-027מדיום גידול ביופילם
Lyticase מArthrobacter luteusסיגמא-אולדריץ' L4025עיכול פוליסכריד
מגנזיום כלורידסיגמא-אולדריץ'D5652רכיב חיץ אנזים
חומצה מתאקרילית N-הידרוקסיסוקסימידיל אסטרסיגמא-אולדריץ'730300מגיב עיגון
מתנולסיגמא-אולדריץ'32213ייבוש ואחסון דגימות
חיידקJ --תוסף תוכנה לעיבוד תמונה
מיקרוסקופיה שקופיות זכוכיתChemglass Life SciencesCG-8221רכיב תא ג'לציה
מונוסודיום פוספטSigma-AldrichS9638רכיב חיץ אנזים
Mutanolysin מ-Streptomyces globisporusSigma-Aldrich M990Peptidoglycan עיכול
N, N, N', N', N'-tetramethylethylenediamineSigma-AldrichT7024רכיב תמיסת ג'ל
N,N′-methylenebisacrylamideSigma-AldrichM1533רכיב תמיסת מונומר
Nunc 40.4 מ"מ תחתית זכוכית צלחות פטרי תרמופישר12-567-400אפשרות תא הדמיה
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127קיבוע לדוגמא
מאגר פוספט מלחSigma-Aldrich79383רכיב תמיסת מונומר, כביסה, מאגר אנזים
פרוטאינאז K מ-Engyodontium albumInvitrogen25530-031עיכול חלבון
Proteus mirabilis ATCC 12453מיקרוביולוגיות0440Pנושא המחקר
מברשת צבע שטוחה קטנהחנות לחומרי בניין מקומית-מניפולציה/טיפול בנתרן
אצטטסיגמא-אולדריץ'241245רכיב חיץ אנזים
נתרן אקרילטסיגמא-אולדריץ'408220רכיב תמיסת מונומר
נתרן ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'S5761רכיב חיץ אנזים
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S9888רכיב תמיסת מונומר, רכיב חיץ אנזים
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'221465ניקוי שקופיות זכוכית
קו לייזר במצב מוצקאומיקרוןלא זמין488, 568 ו-647 ננומטר קו לייזר עירור
SYTO 61 צביעת חומצות גרעיןInvitrogenS11343צבע פלואורסצנטי
טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן הידרוכלורידSAFC108219רכיב חיץ אנזים
Triton X-100Sigma-AldrichX100חדירות דגימה, רכיב חיץ אנזים
Volocity 7.0.0 תוכנת לכידהQuorumTechnologies-Microscoy תוכנת בקר רכישה
Volocity ViewVox מערכת דיסק מסתובבPerkin-Elmerלא זמיןמערכת דיסק מסתובב עבור קונפוקלי מיקרוסקופ
נבט חיטה אגלוטינין – Alexa Fluor 488 לקטין פלואורסצנטי מצומדInvitrogenW11261צבע פלואורסצנטי
תוכנת

מקורות

  1. Franklin, M. J., Chang, C., Akiyama, T., Bothner, B. New technologies for studying biofilms. Microbiol Spectr. 3 (4), 10(2015).
  2. Valdivieso González, D., Jara, J., Almendro-Vedia, V. G., Orgaz, B., López-Montero, I. Expansion microscopy applied to mono- and dual-species biofilms. NPJ Biofilms Microbiomes. 9 (1), 92(2023).
  3. Castagnini, D., et al. Proteus mirabilis biofilm expansion microscopy yields over 4-fold magnification for super-resolution of biofilm structure and subcellular DNA organization. J Microbiol Methods. 220, 106927(2024).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging- Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  6. Gao, R., Asano, S. M., Boyden, E. S. Q&A: Expansion microscopy. BMC biology. 15 (1), 50(2017).
  7. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).
  8. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLoS biology. 17 (10), e3000268(2019).
  9. Kunz, T. C., et al. The expandables: Cracking the staphylococcal cell wall for expansion microscopy. Front Cell Infect Microbiol. 11, 644750(2021).
  10. Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
  11. Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: Protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. 80 (1), e56(2018).
  12. Yokogawa, K., Kawata, S., Nishimura, S., Ikeda, Y., Yoshimura, Y. Mutanolysin, bacteriolytic agent for cariogenic streptococci: partial purification and properties. Antimicrob Agents Chemother. 6 (2), 156-165 (1974).
  13. Hurst, P. L., Nielsen, J., Sullivan, P. A., Shepherd, M. G. Purification and properties of a cellulase from Aspergillus niger. Biochem J. 165 (1), 33-41 (1977).
  14. Scott, J. H., Schekman, R. Lyticase: Endoglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis. J Bacteriol. 142 (2), 414-423 (1980).
  15. Bano, S., Qader, S. A. U., Aman, A., et al. Purification and characterization of novel α-amylase from Bacillus subtilis KIBGE HAS. AAPS PharmSciTech. 12, 255-261 (2011).
  16. Kaplan, J. B., et al. Genes involved in the synthesis and degradation of matrix polysaccharide in Actinobacillus actinomycetemcomitans and Actinobacillus pleuropneumoniae biofilms. J Bacteriol. 186 (24), 8213-8220 (2004).
  17. Kaplan, J. B., et al. Recombinant human DNase I decreases biofilm and increases antimicrobial susceptibility in staphylococci. J Antibiot. 65 (2), 73-77 (2012).
  18. Schlapp, G., Scavone, P., Zunino, P., Härtel, S. Development of 3D architecture of uropathogenic Proteus mirabilis batch culture biofilms: A quantitative confocal microscopy approach. J Microbiol Methods. 87 (2), 234-240 (2011).
  19. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Proteinase K
הדמיה ברזולוציה גבוהה של ביופילם Proteus mirabilis על ידי מיקרוסקופ הרחבה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.