מאמר שיטה

בדיקת מינון זיהומי של תרבית רקמה (TCID50) בזמן אמת וללא תוויות באמצעות אימפדנס לכימות אוטומטי של טיטר ויראלי

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67956

⸱

9 בינואר 2026

 ,  ,  ,  , 
1Agilent Technologies, Inc.

במאמר זה

סיכום

מבחן TCID50 המדווח כאן משתמש במדידות התנגדות בזמן אמת ללא תוויות ובמודול הווירולוגיה של המערכת כדי לנטר באופן אובייקטיבי את ההשפעות הציטופתיות הנגרמות על ידי וירוס (CPE) בזמן אמת. הבדיקה היעילה הזו מקצרת משמעותית את זמן העבודה תוך תמיכה במדידות CPE קינטיות ומהירות תפוקה גבוהה וכמותית ומאפשרת חישובי TCID50 אוטומטיים בזמן אמת.

תקציר

מדידת הטיטר הוויראלי, ריכוז הווירוס בדגימה, היא הליך יסודי במחקר הווירולוגיה. למרות שהן חיוניות, שיטות מסורתיות כמו בדיקת פלאק ובדיקת TCID50 עלולות להיות גוזלות זמן, דורשות צביעה או תיוג של תגובות, ולעיתים כוללות פרשנות סובייקטיבית, במיוחד כאשר השפעות ציטופתיות (CPE) עדינות או קשות לכימות באמצעות הדמיה. לדוגמה, בדיקות TCID50 עשויות להשתמש בצבעי חיוניות כמו MTT או MTS, בעוד שבדיקות פלאק מסתמכות על הדמיה וצביעה כדי להמחיש פלאקים ויראליים, ששניהם יכולים לגרום לשונות. יתרה מזאת, שיטות מסורתיות אלו מציעות רק תמונת מצב סטטית של הזיהום הוויראלי, ומגבילה את היכולת ללכוד את האינטראקציות הדינמיות בין וירוסים לתאים מתירניים. כדי להתגבר על המגבלות הנוכחיות במדידת טיטר הווירוסים, פותח מבחן TCID50 יעיל באמצעות טכנולוגיה מבוססת התנגדות כדי למדוד CPE באופן אובייקטיבי, לא פולשני ובזמן אמת, תוך ביטול הצורך בתוויות. במחקר זה, שני מודלים של תאי וירוס מאפשרים שימשו לאימות בדיקת התנגדות TCID50: האדנו-וירוס המסומן ב-GFP (Adv-GFP) בתאי HEK293A ווירוס שפעת A (IAV) בתאי MDCK. תהליך העבודה פשוט, וכולל זריעה של תאים, חיסון וירוסים, ניטור בזמן אמת וניתוח אוטומטי של TCID50 על ידי התוכנה. במהלך תקופת ההדבקה, ערכי TCID50 חושבו אוטומטית על ידי תוכנת המערכת באמצעות נוסחת ריד-מונש בכל נקודות הזמן המתועדות. ערכי TCID50 של IAV שהתקבלו באמצעות קריאות התנגדות היו דומים לאלו שנוצרו במבחן TCID50 המסורתי המבוסס על צביעת סגול קריסטלית. תוצאות אלו מראות כי ניתן לבצע כימות וירוסים בדיוק וביעילות באמצעות מדידת התנגדות בשילוב עם מודול הווירולוגיה של תוכנת המערכת. המבחן החדש מייעל שיטות מסורתיות תוך מתן תובנות מעמיקות יותר לדינמיקה הוויראלית, ובכך תומך במחקר וירולוגי מתקדם ומרחיב יישומים קליניים פוטנציאליים.

מבוא

ככל שמחקר הווירולוגיה מתפתח במהירות, כימות מדויק של זיהום הווירוס נותר חיוני להבנת מנגנוני הווירוסים, פיתוח טיפולים אנטי-ויראליים והערכת יעילות החיסונים. אחד ההליכים החשובים ביותר הוא מדידת טיטר ויראלי, ריכוז חלקיקי הווירוס בדגימה. מבחן TCID50, שמכמת את מספר חלקיקי הווירוס המדבקים הנדרשים לייצור CPE ב-50% מהתאים המחוסנים, הוא אחת השיטות הנפוצות ביותר לקביעת טיטר וירוסי תפקודי. מבחן נקודת קצה נפוץ זה הוא בעל ערך מיוחד לווירוסים שאינם יוצרים פלאקים ויכול לשמש כחלופה לבדיקת פלאק1.

באופן כללי, בדיקת TCID50 אורכת 2-14 ימים, בהתאם לווירוס ולתאים המאפשרים לבד. CPE, כולל שינויים בהתרבות התאים, במורפולוגיה ובחיוניות, מוערך באמצעות (1) מדידה צבעונית לאחר הוספת תגובות, כגון בדיקת MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) ובדיקת MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium), באמצעות קורא לוחות2, או (2) הערכה חזותית של שינויים מורפולוגיים או קשורים לתרבות באמצעות פלטפורמות הדמיה אופטית – לדוגמה, הערכת CPE על ידי מדידת אחוז חיבור3, או (3) זיהוי חזותי של CPE באמצעות צביעת קריסטל סגול לאחר קיבוע בארות מטופלות בוירוס עם פורמלין או פאראפורמלדהיד (PFA). שיעור ההדבקה הוויראלית החיובי שמקורו במספר השכפולים החיוביים ל-CPE בכל דילול ויראלי הוא הבסיס לחישוב TCID50. הדילול שבו 50% מהתרביות מציגות CPE מחושב סטטיסטית באמצעות נוסחאותמבוססות 4, כגון Reed-Muench, Spearman-Karber ו-Improved-Karber, והתוצאה מדווחת כ-TCID50 למיליליטר (TCID50/mL).

בדיקות TCID50 מסורתיות ובדיקות פלאק מוכרות כסטנדרט הזהב לכימות ויראלי פונקציונלי ויכולות לספק תובנות יקרות ערך. עם זאת, בדיקות אלו לעיתים קרובות מייגעות, גוזלות זמן ודורשות צביעה ידנית כדי להמחיש CPE, מה שמוביל לתפוקה נמוכה, סיכון מוגבר לטעויות אנוש וסובייקטיביות. עבור וירוסים מדבקים או קטלניים מאוד, הפחתת זמן החשיפה לווירוסים והפחתת פסולת המכילה וירוסים כתוצאה משלבים נוספים, כמו צביעה, הם שיקולים חשובים לשיפור הבטיחות הביולוגית. מלבד מבחן TCID50 המבוסס על הדמיה ללא תווית, רוב בדיקות TCID50 והפלאק הן גם בדיקות קצה, מה שעלול לגרום לתזמון לא אופטימלי להערכת טיטר ולהגביל את היכולת לצפות באינטראקציות הדינמיות בין וירוסים לתאי המארח. כדי להתגבר על מגבלות אלו, פותחה והוקמה בדיקת TCID50 יעילה, ללא תוויות בזמן אמת. למרות שהשיטה החדשה דומה לבדיקה TCID50 המסורתית, היא משתמשת בקריאות התנגדות תאיות, שנקלטות ומנותחות על ידי מערכת RTCA MP, כדי לנטר את ההדבקה באופן אובייקטיבי ורציף לאורך זמן.

הוכח ואומת כי חישה ביולוגית מבוססת התנגדות מספקת קריאה איכותית וכמותית של מספר התאים, המורפולוגיה וחוזק ההצמדה של תא למצע בצורה ללא תוויות ולא פולשנית 5,6. מחקרים קודמים הראו כי ניתן לכמת CPE שנגרם על ידי וירוס במדויק בזמן אמת באמצעות מדידות התנגדות RTCA 7,8,9. במקום לדווח על ערכי התנגדות גולמיים, המערכות משתמשות בפרמטר ללא יחידה הנקרא Cell Index (CI) כדי לשקף שינויים באימפדנס הנובעים מאירועים תאיים. לדוגמה, כאשר התאים נדבקים לתחתית הבאר, מתפשטים וגדלים, ה-CI עולה. לעומת זאת, כאשר תאים מתים או מתכווצים, או מתנתקים, כמו במהלך זיהום ויראלי, ה-CI פוחת.

בהתחשב בדיווחים המבטיחים המשתמשים בהתנגדות למדידת CPE, מחקר זה נועד להראות כי מבחן TCID50 מבוסס התנגדות הוא חלופה אמינה ומדויקת לכימות ויראלי קונבנציונלי. מודול הווירולוגיה בתוכנת המערכת מאפשר חישוב אוטומטי של TCID50 לאורך כל מדידת CPE בזמן אמת, מייעל ומקצר את תהליך הבדיקה תוך מתן תובנות חשובות על הקינטיקה של שכפול הווירוסים והאינטראקציה שלהם עם תאים מותרים.

פרוטוקול

החומרים והציוד בהם משתמשים מופיעים בטבלת החומרים.

1. מבחן TCID50 מבוסס אימפדנס

הערה: כפי שמראה איור 1 , בדיקת TCID50 מבוססת התנגדות כוללת ארבעה שלבים, כולל זריעה מתירה של תאים על פלטת חיישן ביולוגי, הכנה וחיסון לדילול וירוסים, מדידת CPE במערכת, ולבסוף ניתוח נתונים וחישוב TCID50 באמצעות מודול הווירולוגיה של תוכנת המערכת.

  1. הכנת מבחן: החייאה ותת-תרבית של תאים מותירים
    הערה: שלב זה צריך להתבצע שבוע לפני הבדיקה. כדי למזער שונות בין ניסויים, מומלץ מאוד להכין בנק תאים מותר באותו מספר מעבר לשימוש במבחן. אל תשתמש בתאים בני יותר מ-15 מעברים לאחר הרכישה מהספק.
    1. הפשרת תאים מתירים שמורים בקריופ
      1. מדיום חמים לגידול תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 30 דקות. לדוגמה, Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco, שהושלף עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין, שימש לתרבית HEK293A.
      2. הפשרה של בקבוקון תאים מבנק התאים שהוקצה לבדיקות TCID50 על ידי סיבוב עדין באמבט מים של 37°C למשך 1-2 דקות עד שמופיעים כמה גבישי קרח; אל תטבל את המכסה. נגב את הבקבוקון עם 70% אתנול והכניס אותו למכסה למינרי.
      3. העבר בעדינות את התאים לצינור קוני חדש בנפח 50 מ"ל והוסיף 9 מ"ל של מדיום גדילה מחומם לתאים.
      4. צנטריפוגה את מתלי התא ב-300 x g למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
      5. השליכו את הסופרנטנט והחזירו את התאים ל-15 מ"ל של מדיום חמום של גדילה מחוממת. העבר אותם לבקבוקון T75 חדש.
      6. מגדלים תאים ל-80%-90% מפגש בדגירה של 37°C עם 5%CO2.
    2. תת-תרבית של תאים מתירים.
      1. עקוב אחרי התאים עד שהם מגיעים ל-80%-90% קונפלוקציה.
      2. הסירו את המדיום המכיל סרום מהבקבוק ושטפו בעדינות את שכבת התא המונולרית פעם אחת עם מלח דולבקקו (DPBS) ללא מגזיום וללא קאל.
      3. טריפסיניזציה של תאים על ידי חלוקה שווה של 2 מ"ל תמיסת טריפסין/EDTA 0.05% לכל בקבוק T75 והשארת הבקבוק באינקובטור של 37°C למשך 1-3 דקות.
        הערה: אל תטרפסינז את התאים בצורה מופרזת, שכן זה עלול להזיק לתאים.
      4. עצור את הטריפסיניזציה על ידי הוספת מדיום המכיל סרום של 8 מ"ל כדי לדלל את נפח הטריפסין המקורי לפחות פי חמש. העבר 2.5 מ"ל מתלה התא לבקבוק T75 חדש, ואז הוסיף 8 מ"ל חומר תרבית.
        הערה: הימנע משימוש בתאים מתירים שהופשרו זה עתה במבחן TCID50. במקום זאת, השתמשו בתאים מתורבתים בגובה של 80%-90%. כדי להפחית את השונות הבין-ניסיונית, יש לשמור על התאים שהוחזרו למקסימום שבועיים לאחר הפשרה. כדי להבטיח חיוניות גבוהה והתרבות של תאים במהלך התרבית של שבועיים: (1) לשנות את מדיום הגידול לפחות פעמיים בשבוע; (2) תאי תת-תרבית כאשר הם מגיעים ל-80%-90% קונפלוקציה. עבור תחזוקה ממושכת מעבר לשבועיים, נדרשת אימות.
  2. טיטר ויראלי
    הערה: שלב זה צריך להתבצע ביום הראשון.
    1. מדידת רקע לוח החיישן הביולוגי
      1. העבר בזהירות 50 מיקרוליטר של מדיה מחוממת מראש לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית, תוך שימוש בטכניקת פיפטינג הפוכה כדי למזער את היווצרות בועות ולהבטיח חלוקת נפח עקבית.
      2. הנח את הלוחית בתחנת הלוח; פתח את תוכנת המערכת ובחר את מודול הווירולוגיה לפני תחילת הניסוי. הזן את כל ההערות הרלוונטיות בלשונית Exp Notes , והזן מידע על התא, כולל שם ומספר, בתת-הלשונית של Cell בלשונית Layout לאחר בחירת הבארות המתאימות. לחילופין, ניתן להזין מידע על התאים לאחר הזרעה.
        הערה: יש לבצע מדידת רקע ללוח לפני הוספת תאים לבארות הלוח. קריאות רקע לכל הבארות צריכות להיות בין -0.063 ל-0.063.
      3. בלשונית לוח זמנים , לחצו על כפתור Add a Step כדי להוסיף שלב 1, המיועד למדידת רקע ללוחית. לאחר מכן, התחל הקלטה על ידי לחיצה על כפתור ההתחלה .
      4. הסר את הפלטה מהתחנה והחזיר אותה למכסה המנוע לזרעת תאים.
    2. זריעה מתירה של תאים ללוח הביוסנסר של 96 בארות
      1. טריפסיניזציה של התאים המותירים מבקבוק T75.
      2. ספרו את התאים והתאימו את תליית התאים לריכוז הרצוי. במחקר זה, ריכוז HEK293A היה 60,000 תאים/מ"ל.
      3. הוסיפו 100 מיקרוליטר של תליית תא לכל באר של הלוח.
        הערה: צפיפות תאים נכונה היא חיונית. צפיפות זריעה תת-אופטימלית עלולה להוביל לארכיפקט ניסיוני. לכן, יש לייעל את צפיפות הזריעה לפני ביצוע בדיקת TCID50.
      4. השאירו את הפלטה במכסה המנוע בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לאחר הוספת התא, כדי לאפשר לתאים להתפזר באופן שווה בתחתית הבאר.
        הערה: אי ביצוע שלב זה עלול לגרום לשינויים גדולים בין באר לבאר.
      5. הכניסו את הפלטה לתחנה בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2.
      6. עברו ללשונית Schedule בתוכנה והוסיפו שלב 2 לפי הגדרות ברירת המחדל של ההקלטה: 100 Sweeps ו-15 דקות מרווח. זה יתחיל ניטור התנגדות/CI כל 15 דקות, ויאפשר הערכה בזמן אמת של היצמדות והתרבות תאים כשלב בקרת איכות תאים (QC) לפני חיסון הווירוס.
        הערה: יום 2 - כדי למקסם את השחזוריות והעקביות של הבדיקות בין ניסויים, חשוב להעריך את ביצועי התאים במערכת לפני המעבר לשלב הבא. מכיוון ש-CI משקף את ההיצמדות והצמיחה של התאים, ערכי CI במהלך 20-28 שעות לאחר הזריעה משמשים כפרמטר מרכזי לבקרת איכות. גם הערך וגם הקינטיקה של CI הם ספציפיים לתא. במחקר זה, עבור HEK293A תאים שזרעו ב-6,000 תאים בכל באר ונתרמו במשך 20-28 שעות, התרבית אמורה לעלות על 2. אם ה-CI לא מגיע ל-2 בתוך 20-28 שעות לאחר הזרעה, תרבית התאים HEK293A נחשבת ככושלת בבקרת איכות (QC), ובדיקת TCID50 לא תתבצע. קריטריון זה מבטיח שחזוריות גבוהה של תוצאות ניסוי.
    3. הכנת דילול סדרתי של וירוסים
      1. חשב את הנפח הכולל של המדיום (DMEM + 2% FBS + 1% פניצילין / סטרפטומיצין) הנדרש להכנת הדילולים, וחמם אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. המדיום ישמש לשארית הניסוי.
      2. הפשיר במהירות בקבוקון של מלאי וירוס שנלקח באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 דקות עד שכל גבישי הקרח נמסו.
      3. הכינו וירוסים מדוללים סדרתית פי 10 על ידי העברת 20 מיקרוליטר ממאגר הווירוס לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכיל 180 מיקרוליטר של מדיה מחוממת מראש בכל שלב. פיפט למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב יסודי של מדיום וווירוס.
        הערה: אין לטבול את קצה הפיפטה עמוק מדי בתמיסה הוויראלית כדי למנוע נשיאת שאריות ויראליות מחוץ לקצה, מה שעלול לגרום לדילול לא מדויק.
      4. כדי למנוע תנודות בקריאות התנגדות הנגרמות מהוספת דגימות וירוס קור, יש לאזן את דילול הווירוס על ידי דגירה באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 למשך 20 דקות לפני החיסון.
    4. הזן מידע על טיפול בנגיף בלשונית הפריסה
      1. בלשונית Layout של התוכנה; לבחור את הבארות לטיפול בטיטר הוויראלי; לחץ על תת-הלשונית טיפול, והזן דילול התחלתי, לדוגמה, 0.001 (10-3) בניסוי זה; הכניסו 10 כ"גורם דילול"; בחר בכיוון הדילול, משמאל לימין במקרה זה. דילול הווירוס יחושב אוטומטית לפי קלט פריסת הלוחות ויוצג בכל באר מתאימה.
      2. לאחר מכן, הזן את נפח החיסון של הווירוס ולחץ על כפתור היישום כדי לשמור את כל פרטי הטיפול. שלב זה חיוני לחישוב מדויק של TCID50/mL במהלך ניתוח נתונים.
      3. הקצו את הבארות שלא יטופלו עם וירוסים כבקרים שליליים על ידי בחירת הבארות המתאימות ואז בדיקת Negative Ctrl תחת סוג באר בלשונית הטיפול .
        הערה: יש לסמן ולהוסיף בארות בקרה שליליות לדף הפריסה; השמטה תמנע את חישוב TCID50.
    5. חיסון וירוס
      1. כשאתה מוכן, לחץ על כפתור ההשהיה בתוכנה כדי לעצור את רכישת הנתונים. הסר את הלוחית מהתחנה והניח אותו במכסה המנוע הלמינרי.
      2. הסר בזהירות את מדיה התרבות מהבארות של הפלטה באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
      3. הוסיפו בעדינות 50 מיקרוליטר של דילול ויראלי באמצעות פיפטה רב-ערוצית לחלק העליון של שכבת התא, תוך הימנעות מהפרעה לתרבות התא.
      4. החזר את הלוחית לתחנה והוסף שלב 3 לפי הגדרות ברירת המחדל (100 סריקות ו-15 דקות) בלשונית לוח הזמנים כדי לחדש את התנגדות ההקלטה כל 15 דקות במשך שעתיים, מה שמאפשר לווירוס להיקשר לתאים.
      5. לאחר שעתיים של חיסון נגיף, עצרו את ההקלטה והסרו את הלוחית מהתחנה אל מכסה המנוע הלמינרי.
      6. הוסף לאט 150 מיקרוליטר של מדיום מחומם מראש לבארות באמצעות פיפטה רב-ערוצית, תוך הימנעות מהפרעה לשכבת התא; תחזיר את הלוחית לתחנה.
      7. המשיכו את שלב 3 על ידי לחיצה על Start בלשונית Schedule . אותות ההתנגדות נמדדים ברציפות כל 15 דקות לאורך תקופת החיסון.
    6. חישוב TCID50 במהלך או לאחר השלמת מבחן TCID50
      1. בלשונית ניתוח הנתונים , בחר והוסף את כל הבארות ששימשו במבחן לגרף הגרף. ציר ה-y של הגרף נקבע על ידי האפשרות שנבחרה מתפריט הציר הנפתח של ציר Y.
      2. ניווט לסעיף הפרמטרים . בחר את TCID50 מרשימת הפרמטרים כדי להתחיל את חישוב TCID50.
      3. בחר תרשים עמודות לחישוב TCID50 בנקודת זמן מסוימת או בחר TCID50 תלוי זמן כדי ליצור את מסלול הזמן של TCID50 לאורך תקופה רצויה במהלך החיסון. ה-TCID50/mL יחושב ויוצג לאחר לחיצה על כפתור הביצוע.

2. מבחן Crystal Violet-TCID50

  1. תאי זריעה מתירים במיקרופלטה עם 96 בארות בצפיפות הזריעה האופטימלית כפי שמתואר במבחן TCID50 מבוסס התנגדות (שלבים 1-2).
  2. בצע הכנת דילול סדרתי של וירוס וחיסון כפי שמוגדר במבחן TCID50 מבוסס התנגדות.
  3. קיבוע וצביעה
    1. לאחר סיום הבדיקה, יש להשליך בעדינות את הסופרנטנט מכל באר ולהוסיף 100 מיקרו-ליטר של פורמלדהיד 4% לקיבוע התאים.
    2. דגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך שעה, ואז הסרו את הקיבוע.
    3. צבעו את התאים הקבועים ב-0.5% Crystal Violet שהוכן ב-PBS. דגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    4. שטוף את הצלחת במי ברז עד שהרקע מתנשא. תן לצלחת להתייבש באוויר לגמרי לפני הניקוד.
      הערה: פסולת סיגלית קריסטלית נחשבת למסוכנת הן לפי RCRA והן לפי תקנות קליפורניה (CCR 66261.24). אסוף את כל התמיסות הקריסטל סגולות המשומשות, חומרים מזוהמים (למשל, מגבות נייר, כפפות), ושוטף פסולת במיכל פסולת מסוכנת ייעודי. השליכו את הפסולת דרך קבלן הטיפול בפסולת מסוכנת (EH&S) של המוסד שלכם או דרך קבלן מורשה לפינוי פסולת מסוכנת.
  4. ניקוד וחישוב TCID50
    1. בדוק כל באר בצורה ויזואלית ל-CPE. באר חיובית מראה הרס חלקי או מלא של שכבה אחת וכתמים קלים יותר. באר שלילית שומרת על שכבה מונולרית שלמה עם כתמים סגולים כהים.
    2. ספרו את מספר הבארות החיוביות והשליליות עבור כל דילול.
    3. חישוב ידני של TCID50/mL באמצעות שיטת Reed-Muench, בהתבסס על נפח חיסון של 150 מיקרוליטר.

תוצאות

ניטור דינמי ללא תוויות, בזמן אמת, של CPE המתווך על ידי וירוס באמצעות התנגדות
כדי לאשר שניתן למדוד CPE הנגרמת על ידי וירוס באופן אמין וכמותי באמצעות אימפדנס, תיעדנו תחילה שינויים תאיים בתאי HEK293A לאחר זיהום Adv-GFP באמצעות מערכת RTCA eSight שמודדת בו זמנית התנגדות ולוכדת תמונות של תאים חיים מאותה אוכלוסיית תאים, ומספקת מידע מעמיק על התנהגות התאים. HEK293A תאים הוזרעו על פלטת ביוסנסור עם 96 בארות בצפיפות זריעה של 6,000 תאים לבאר במשך 24 שעות ולאחר מכן נדבקו ב-Adv-GFP ב-104 IFU/mL. תועדו אימפדנס ודימות תאים חיים במשך 250 שעות לאחר החיסון (איור 2A). כדי למזער שונות מהבדלים בזריעה ולחשוף שינויים יחסיים לאחר הטיפול, נעשה שימוש במדד התאים המנורמל (NCI) לייצוג השינויים הקולקטיביים בצמיחה, בהיקשרות ובחיוניות התאים לאורך זמן. NCI מחושב על ידי חלוקת CI בנקודת זמן נתונה ב-CI שלו בנקודת זמן הנירמול (הזמן שלפני החיסון). עקבת הקינטיקה של ה-NCI של הביקורת הלא נגועה (איור 2A, עקבות שחורות) מראה עלייה הדרגתית במהלך 48 השעות הראשונות, מה שמעיד על התרבות רציפה של תאים. לאחר מכן מופיעה רמה בסוף הניסוי, המצביעה על כך שהתאים התאחדו וכיסו את כל שטח הפנים של חיישני הזהב. לעומת זאת, הקינטיקה של ה-NCI מהבארות הנגועות בנגיף ירדה מתחת לנקודת הביקורת 50 שעות לאחר החיסון וירדרה בהדרגה עד שהגיעה לאפס ב-100 שעות.

הדמיה של תאים חיים שנרכשה מאותה אוכלוסיית תאים אישרה חזותית כי אות ההתנגדות משקף באופן אמין את המצב הפיזי של התאים המתירים כשהם מתקדמים לאורך כל רצף CPE. כפי שמוצג באיור 2A, קיימת מתאם הפוך בין ה-NCI לבין ביטוי ה-GFP הוויראלי בתאי HEK293A נגועים, שנצפתה במהלך 100 השעות הראשונות לפני פירוק מלא של התאים המתירניים. בנוסף, תמונות התאים החיים (איור 2B) שנרשמו בנקודות הזמן שנקבעו מראות מצב תא מותר במהלך זיהום ויראלי. צמיחת התאים נמשכה במהלך 48 השעות הראשונות לאחר ההדבקה, בעוד שחלקיקי הווירוס נשארו ברמות נמוכות בתוך התאים. עם זאת, ככל שהשכפול והזיהום של הווירוס התקדמו, החל מוות תאים, כפי שניתן לראות בירידה בחיבור והגברת אות ה-GFP בתאי המארח. כ-100 שעות לאחר החיסון, ביטוי ה-GFP הוויראלי החל לרדת בשל אובדן משמעותי של תאים מותירים בחיים. גישה משולבת זו מחזקת את אמינות גילוי CPE שנגרם על ידי וירוס באמצעות התנגדות, ומבססת בסיס איתן למבחן TCID50 מבוסס התנגדות.

חישוב אוטומטי של TCID50 שנגזר מקריאת התנגדות
זיהוי מדויק של בארות CPE חיוביות הוא קריטי לחישוב אמין של TCID50. כדי להעריך האם מבחן TCID50 מבוסס התנגדות יכול להבדיל בדיוק ואובייקטיבי בין CPE חיובי לשלילי בעזרת מודול הווירולוגיה של תוכנת המערכת, תאי HEK293A הוזרעו ב-6,000 תאים לבאר במשך 24 שעות לפני החיסון וטופלו בסדרה של דילול פי עשרה של Adv-GFP, תוך שימוש בשמונה שכפולים (בארות) לכל דילול. ה-CPE שנגרם על ידי Adv נרשם בזמן אמת במערכת RTCA. באיור 3A, עקבות קינטיות של התנגדות, המוצגות כ-NCI, נרשמו ושורטו אוטומטית לאורך כל הניסוי. הירידה ב-NCI לאחר החיסון מגלה CPE ברור התלוי במינון, המודגם על ידי המתאם החזק בין כמות הווירוס שנוספה לבין קצב הירידה באות ההתנגדות. התאים שנחשפו לעומסי ויראליים גבוהים, בין 10-3 ל-10-7 דילול, הראו ירידות חדות ועקביות ב-NCI, המשקפות CPE חזק ואחיד בבארות שכפול. לעומת זאת, בדילול של 10-8 וירוסים, העקבות הקינטיות הציגו שונות רבה מההתחלה, מה שהוביל לסטיות תקן גדולות משמעותית ב-NCI, במיוחד מעבר ל-100 שעות לאחר החיסון. כאשר העומס הוויראלי ירד עוד יותר מתחת לסף הנדרש לגרימת זיהום, במקרה זה, דילול של 10-10, ה-NCI הפך לבלתי ניתן להבחנה מהביקורת השלילית. נתונים אלו מצביעים על כך שבדילול של 10-8, 1) הווירוס לא הצליח לגרום ל-CPE בכל הבארות החוזרות בקינטיקה דומה; 2) דילול זה יהיה קו מפריד בין ריכוזים שגורמים ל-CPE בכל החזרות לבין אלו שמעוררים CPE רק בחלק מהשכפולים או בכלל לא; תוצאה בינארית זו, שנדבקה (מסומנת על ידי שינויים ב-CI שנגרמו על ידי CPE) או לא נגועה (ללא שינוי ב-CI), מהווה בסיס לחישוב TCID50 באמצעות שיטות סטטיסטיות בתוכנת המערכת. לכן, השונות העמוקה ב-NCI שנצפתה בריכוזי וירוס מסוימים היא אינדיקטור מכריע להתרחשות זיהום חלקי ויכולה להיות קריטית להסקה הנדרשת לחישוב TCID50.

בדומה לבדיקה הקלאסית של TCID50, יש להגדיר את הסף ל-CPE חיובי לפני שהתוכנה המובנית יכולה לזהות אוטומטית את הבארות החיוביות ל-CPE. מכיוון שווירוסים שונים ומודלים של תאים מותירים עשויים לדרוש ספים מובחנים, התוכנה מאפשרת למשתמשים להגדיר ולשפר קריטריונים אלה בתוך מודול הווירולוגיה. בהתבסס על נתונים אמפיריים, הוחל סף ברירת המחדל של התוכנה ל-CPE חיובי, שהוגדר כערך ה-NCI של הבריאות המטופלת בנגיף נמוך ביותר משלוש סטיות תקן מהממוצע של ה-NCI של הביקורות השליליות (שאינן מחוסנות), כלומר <המטופל בנגיף NCI (NCI-3 X SD) ctrl שלילי. הבארות הבודדות סווגו לאחר מכן כחיוביות (+) או שליליות (-) (איור 3B). במקרה זה, ה-TCID50/mL של Adv-GFP חושב לאחר מכן באמצעות נוסחת ריד-מונש, אחת הנוסחאות הכלולות בתוכנה. מלבד בחירה או הגדרת קריטריונים ל-CPE חיובי, לא נדרשו פעולות ידניות לחישוב TCID50, שכן התוכנה אוטומציה מלאה של התהליך.

מעקב דינמי של TCID50 במהלך הדבקה בנגיף
כדי לקבוע את משך הבדיקה המתאים של TCID50, ערכי TCID50 של Adv-GFP נלקחו בנקודות זמן רצויות לאחר ההדבקה, החל מ-30 שעות והמשך במרווחים של 30 שעות עד 240 שעות. תוספת של 30 שעות נבחרה בכוונה, שכן שכפול אדנו-וירוס מדווח כאורך של כ-30שעות ו-10. ערכי ה-TCID50 של Adv-GFP צוירו כפונקציה של הזמן (איור 4). תצפית בולטת היא ההגדלה ההדרגתית של ערכי TCID50, שנמשכת עד כ-150 שעות לאחר החיסון. מעבר לנקודה זו, נוצרת רמה, המצביעה על איזון שבו ההשפעות הציטופתיות ככל הנראה הגיעו לרוויה. העלייה התלויה בזמן, ואחריה ייצוב, מרמזת על עקומת שכפול ויראלית טיפוסית. השלב הראשוני מאופיין בהתפשטות וירוסית פעילה, שמגיעה לשיא המשקף את ההשפעה הציטופתית המקסימלית בתנאי הניסוי הנתונים. שלב הרמה של TCID50 עשוי לשקף תקרה ביולוגית שבה תהליך ההדבקה הוויראלית פגע ברוב התאים המתירים, מה שמוביל למוות תאים משמעותי ולעצר את שכפול הווירוס. מסלול הזמן הקינטי של TCID50 מציע שניתן להפסיק את הבדיקה שישה עד שבעה ימים לאחר החיסון עבור מודל האדנווירוס-HEK293A, שכן ערך TCID50 יציב של 8.9 × 109 TCID50/מ"ל נצפה כבר ב-150 שעות.

כימות טיטר של וירוס שפעת A באמצעות בדיקת TCID50 מבוססת התנגדות
כדי לבדוק האם ניתן להרחיב את מבחן TCID50 מבוסס התנגדות למודלים אחרים של וירוס-מארח, בוצעה בדיקת TCID50 בתאי MDCK שנדבקו ב-IAV. בעוד שהתחשב בשינויים קלים במדיום ההדבקה הספציפי ל-IAV, הליך הבדיקה המרכזי נשאר עקבי לזה שנקבע עבור אדנווירוס. איור 5A מציג את ה-NCI של תאי MDCK לאורך זמן לאחר החיסון עם דילול IAV שנע בין 1 x 10-2 ל-5 x 10-9. בדומה לתוצאות שנצפו בתאי HEK293 A שנדבקו ב-AdV, בארות הבקרה הלא נגועים/השליליות הציגו NCI יציב ועקבי בין שכפולים. עם זאת, הבארות הנגועות בווירוס חשפו שינוי ב-NCI התלוי במינון. במינונים הנמוכים, דילול של 6.4 ו-1.3 על 10-7 , נצפתה סטיית תקן גדולה. דבר זה מרמז שבדילול אלו, ריכוז הנגיף התקרב ל-TCID50.

בארות CPE חיוביות זוהו לפי אותם קריטריונים וסף שהוחלו במודל Adv-HEK293A, ובפרט סטיית תקן משולשת מתחת לממוצע בארות הביקורת השליליות. ערכי TCID50 מבוססי התנגדות עבור IAV נקבעו גם הם בנקודות זמן שונות לאחר החיסון. איור 5B מציג את ערכי TCID50 הממוצעים משני ניסויים עצמאיים. למעט נקודת הזמן המוקדמת ב-60 שעות, ערכי TCID50 מ-90 עד 150 שעות לאחר ההדבקה הראו יציבות ועקביות טובות, מה שמעיד כי ניתן להשלים באופן אמין את בדיקת TCID50 מבוססת ההתנגדות ל-IAV בארבעה ימים במקום חמישה. עקביות זו מחזקת את עמידות השיטה המבוססת על התנגדות, ומאשרת את ההסתגלות והאמינות שלה בין פתוגנים ויראליים שונים.

אימות מבחן TCID50 מבוסס התנגדות באמצעות שיטת TCID50 הקונבנציונלית
כדי לאמת את TCID50 שמקורו בהתנגדות למדידת ריכוז IAV, בוצעו בדיקות TCID50 בשתי גישות חלופיות במקביל: הדמיה ללא תוויות וצביעה בצבע סיגלי גביש. בקצרה, תאי MDCK הוכנו והוזרעו ללוחות מיקרוטיטר של 96 בארות. ביום הבא, התאים חוסנו בסדרת דילול IAV למשך 5 ימים. לבדיקת TCID50 מבוססת הדמיה, הדמיית תאים חיים נרכשה כל 4 שעות. ריכוזי עשר דגימות IAV הוערכו במחקר האימות. המפגש התאים של בארות שטופלו בנגיף הושוו לזה של בארות שליליות שאינן נגועות, באמצעות תוכנת המערכת. עם זאת, ניתוח הדמיה לתאי MDCK היה מאתגר במיוחד, כפי שמודגם באיור 6A. התמיינות מדויקת בין תאים למרחבים ריקים הייתה מאתגרת בשל המורפולוגיה השטוחה והקצוות הלא מוגדרים היטב של תאי MDCK, מה שפגע בזיהוי אמין של בארות CPE חיוביות באמצעות ניתוח מבוסס דימות. שימוש בתוכנות ניתוח דימות מתקדמות ומתקדמות עשוי לשפר את דיוק חישובי TCID50במקרים כאלה. במקרה זה, הערכת TCID50 המבוססת על הדמיה ללא תוויות לא הצליחה באמצעות תוכנת המערכת הנוכחית. בבדיקת TCID50 של צביעת סיגלית קריסטלית, התאים נקבעו ונצבעו ביום החמישי לאחר ההזרקה כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול. איור 6B מראה מתאם ליניארי חזק בין ערכי TCID50 מבוססי התנגדות וערכי TCID50 המבוססים על צביעת סגול גביש, עם משוואת רגרסיה של y = 0.9582x ו-R² = 0.9979. ניתוח השוואתי זה מדגיש את אמינות השיטה מבוססת התנגדות למדידת טיטר ויראלי ואת התאמתה לבדיקות TCID50.

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה מבוססת אימפדנס של TCID50. שלב 1: זריעה מתירה של תאים על לוח החיישן הביולוגי. זרעו את התאים המאפשרים על לוח בצפיפות זריעה אופטימלית. לאחר מכן, גידול התאים מנוטר במערכת כחלק מתהליך בקרת איכות התא (QC). שלב 2: הכנת וירוסים וחיסון. הכינו מלאי וירוסים מדוללים סדרתית באמצעות גורם דילול שהוגדר על ידי המשתמש. הסר את הפלטה מהמערכת והוסף את הווירוסים לבארות הפלטה בתוך מכסה למינרי. שלב 3: מדידת CPE וניקוד בארות חיוביות CPE באמצעות תוכנת מודול Virology. החזר את הלוחית למערכת והמשך הקלטה בזמן אמת של CPE שנגרם על ידי וירוס. התוכנה מזהה אוטומטית בארות חיוביות ל-CPE בהתבסס על סט הסף שהוגדר על ידי המשתמש לזיהוי CPE. שלב 4: חישוב TCID50. באמצעות ניקוד בזמן אמת של בארות CPE חיוביות על פני חיסון וירוסים, תוכנת מודול הווירולוגיה יכולה לחשב ערכי TCID50 בכל נקודת זמן נתונה לאורך כל הבדיקה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: CPE שנגרם על ידי אדנו-וירוס הוערך באמצעות שיטות מבוססות התנגדות ושיטות מבוססות דימות (א) פרופיל דינמי של אימפדנס (ציר y שמאל) ופלואורסצנציה ירוקה (ציר y ימני) בתאי HEK293A לאורך זמן לאחר ההדבקה ב-Adv-GFP. מדד התאים המנורמל לתאים נגועים באדנווירוס (נגועים ב-NCI Adv, קו אדום), תאי ביקורת שליליים (NCI NC, קו שחור), ועוצמה משולבת כוללת של GFP (נגוע ב-GFP Adv, קו ירוק) מסומנים כפונקציה של זמן. עוצמת ה-GFP המשולבת הכוללת משקפת את ביטוי ה-GFP בתאים מתירים ומשמשת כאינדיקטור לזיהום ויראלי. המספרים (1-6) לאורך מדד התאים המנורמל מתאימים לנקודות זמן ספציפיות במהלך תהליך ההדבקה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (N = 8). (B) תמונות עוקבות של תאי HEK293A לפני ואחרי ההדבקה באדנווירוס-GFP. (1) תמונת הבסיס (0 שעות) מלווה בתמונות ב-48 שעות (2), 72 שעות (3), 96 שעות (4), 120 שעות (5) ו-200 שעות (6) לאחר ההדבקה, הממחישות את השינוי בגדילת התאים, בחיוניות, ובפלואורסצנציה של אדנו-וירוס-GFP לאורך זמן. פסי קנה מידה = 160 מיקרון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: CPE תלוי במינון של אדנווירוס-GFP בתאי HEK293A שנמדד באמצעות אימפדנס. (A) תאים HEK293A הוזרעו בלוח ביוסנסר בצפיפות של 6,000 תאים לבאר, ו-24 שעות לאחר מכן נדבקו בסדרה של אדנו-וירוס-GFP מדולל פי 10. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (N = 8). שקע: אינדקס התאים המנורמל של הבארות שנדבקו באדנווירוס-GFP בדילול 10-8 . הנתונים מדילול 10-9, 10-11 ו-10-12 מושמטים למען בהירות. (B) הבארות/השכפולים הבודדים בכל דילול נגיף דורגו כ-CPE-חיוביים (+) או CPE-שליליים (-). כל עמודה בצלחת טופלה בדילול וירוס שונה, כאשר גרדיאנט הדילול נע מהנמוך ביותר בעמודה 1 ועד הגבוה ביותר בעמודה 10. עמודות 11 ו-12 היו בארות ביקורת שליליות, ללא טיפול בנגיף. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: מהלך הזמן של ערכי TCID50 שנגזרו ממדידות התנגדות של CPE בתאי HEK293 לאחר הידבקות באדנווירוס-GFP. TCID50/mL של אדנו-GFP חושב בנקודות זמן ספציפיות באמצעות מודול הווירולוגיה מחמישה ניסויים. למרות שמודול הווירולוגיה מספק שלוש נוסחאות חישוב TCID50, נוסחת ריד-מונש נבחרה לחישוב TCID50. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (N = 5). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5: הערכת טיטר של נגיף שפעת A באמצעות בדיקת TCID50 מבוססת אימפדנס. (A) CPE תלוי במינון של IAV בתאי MDCK שנמדד באמצעות אימפדנס. תאי MDCK הוזרעו לפלטת חיישן ביולוגית בכמות של 8,000 תאים לבאר ונדבקו 24 שעות לאחר מכן בדילול סדרתי של נגיף השפעת פי חמש. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (N = 8). הנתונים מדילול 2.6 × 10⁻⁸ מושמטים למען בהירות. (ב) מסלול הזמן של ערכי TCID50 שנגזרו ממדידות התנגדות בתאי MDCK נגועים ב-IAV. שיטת ריד-מונש שימשה לחישוב TCID50. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (N = 2). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-6
איור 6: מתאם בין בדיקות TCID50 מבוססות אימפדנס לבין צביעת קריסטל סגול. (א) תמונה של תאי MDCK שחוסנו ב-IAV. פס קנה מידה = 160 מיקרון. (B) בוצעה השוואה בין ערכי TCID50/mL שהושגו משיטות מבוססות התנגדות וצביעת קריסטל סגול באמצעות עשר דגימות IAV. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-7
איור 7: הממשקים המייצגים של תוכנת מודול הווירולוגיה של המערכת. התוכנה מיישלת את תהליך הבדיקה המבוסס על התנגדות TCID50. (1) פריסת הלוחות לתיעוד עיצוב הניסוי; (2) אינדקס התאים או אינדקס התאים המנורמל צולם והוצג אוטומטית על ידי התוכנה במהלך חיסון הווירוס; (3) התוכנה מספקת גמישות בקביעת קריטריונים ובחירות חיוביות ל-CPE עבור נוסחת חישוב TCID50; (4) ניתן לקבוע TCID50/mL בכל נקודת זמן נתונה במהלך הבדיקה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

דיון

במחקר זה, הוכחה היישום של ההתנגדות לקביעת טיטר וירוס באמצעות מודלים של אדנו-וירוס-HEK293A ושפעת A-MDCK. אחרים אימתו גם את הגילוי החזק והאמין של CPE מושרה על ידי וירוס באמצעות מערכות RTCA במגוון רחב של וירוסים, כולל אורתופוקסוירוס12, וירוס מערב הנילוס (WNV) וירוס אנצפליטיס סנט לואיס (SLEV)13, וירוס צ'יקונגוניה14, וירוס בורסלמדבק 8, קדחת כימרית צהובהדנגי 15, וירוס הפטיטיס A16, SARS-CoV-217, ונגיף דנגי9.

הקלטת CPE בזמן אמת באמצעות התנגדות מאפשרת גילוי ירידות תלויות זמן ספציפיות לערך ה-CI במודלים מסוימים של תאים מותירים לווירוסים. פאנג ואחרים הראו לראשונה כי פרמטר קינטי המאפיין CPE מושרה על ידי פלאווירוס, CIT50—המוגדר כזמן לירידה של 50% בהתנגדות התא—פרופורציונלי הפוך למינון הזיהום הנגיפי בטווח מסוים. הם גם הראו ש-CIT50 פרופורציונלי להופכי של טיטר נוגדנים מנטרל13. מאז, שארטייה ואחרים ב-Sanofi Pasteur חקרו את שיטת ניתוח התאים בזמן אמת (RTCA) מבוססת אימפדנס זו לקביעת טיטרים זיהומיים ויראליים במהלך פיתוח מוצר ותהליך חיסון קדחת צהובה כימרית (CYD)15. Charretier ואחרים אישרו עוד את מינון התרבית המבוססת על התנגדות תאים זה, 50% (CCID50) באמצעות בדיקת CCID50 מבוססת חיסונות. הם הראו כי שיטת RTCA מבוססת התנגדות דורשת כ-5 פעמים פחות עבודה ויעילה פי 3.5 מבחינת CCID50 הסטנדרטית בסביבה תעשייתית. במחקר שלנו, הוכח אימות של TCID50 מבוסס אימפדנס מול מבחן TCID50 המסורתי של Crystal Violet עבור CPE המושרה על ידי IAV. בנוסף, נעשה שימוש במודול תוכנת הווירולוגיה בתוכנת RTCA. הבארות החיוביות ל-CPE זוהו אוטומטית על בסיס קריטריונים שהוגדרו על ידי המשתמש עבור בארות CPE-חיוביות בתוכנה; במקרה שלנו, דרגת ה-CI יורדת בהשוואה לביקורת השלילית. ה-TCID50 חושב על ידי התוכנה בהתאם, מה שאפשר קביעת טיטר מדויקת מבלי להסתמך על CIT50 או לסכן את דגימת הבדיקה שנפלה מחוץ לטווח האופטימלי. קביעת סף מתאים לבארות CPE חיוביות היא קריטית, שכן היא משפיעה ישירות על הרגישות והספציפיות של הבדיקה. מומלץ למשתמשים לקבוע קריטריונים ספציפיים לנגיף על ידי השוואת שינויים במדד התאים לתוצאות מהשיטה הקונבנציונלית המאומתת שלהם. ספים אלו שמקורם אמפירית יכולים להיות מוגדרים ומשופרים בתוך מודול הווירולוגיה של התוכנה.

כמו בדיקות אחרות מבוססות תאים, מצב התאים המתירים המשמשים במבחני TCID50 מבוססי התנגדות הוא קריטי לקביעת הצלחת הבדיקה ואיכות התוצאות. כדי להבטיח רבייה גבוהה וחיוניות, מומלץ להשתמש בתאים טריים עם מעבר נמוך. בנוסף, יצירת בנק תאים מותר באותו מעבר יכולה לשפר את השכפול בין ניסויים. כפי שמוצג באיור 3A, כאשר התאים המאפשרים היו בתנאים אופטימליים, הם יצרו אותות התנגדות יציבים ועקביים בבדיקות הלא נגועות, לאורך כל הבדיקה. הוא סיפק נקודת בסיס אמינה לקביעת סף לבארות חיוביות ל-CPE, מה שהוביל לקביעת טיטר ויראלי מדויק. בנוסף, מבחן TCID50 מבוסס התנגדות מסוגל באופן ייחודי לבצע בקרת איכות על תאים מתירים לפני הערכת טיטר ויראלי. פרופיל ה-CI הקינטי האופייני של תאים בריאים מתירים משמש כמדד בקרת איכות אמין, ומבטיח שרק אוכלוסיות תאים ברות קיימא ועקביות ישמשו לכימות ויראלי, ובכך משפר את השחזוריות והדיוק של הבדיקה.

עבור כל וירוס חדש, יש לבצע גם אופטימיזציה ואימות של מבחן התנגדות TCID50 לפני היישום. גורמים מרכזיים, כמו תנאי תרביות תאים, כולל המדיום הבסיסי וריכוז FBS, הם קריטיים להשגת נתוני התנגדות תאית ניתנים לשחזור ולהגברת רגישות גילוי CPE, כפי שהודגש במחקרים קודמים 6,16. בהקשר זה, טכנולוגיה מבוססת התנגדות בזמן אמת ללא תוויות הוכיחה את עצמה ככלי פשוט, יעיל ובעל ערך לאופטימיזציה של תנאי תרבית תאים במהלך פיתוח הבדיקה16.

מגבלה של מבחן התנגדות TCID50 נובעת בווירוסים שאינם גורמים ל-CPE, שכן הבדיקה מסתמכת על CPE ליצירת שינויים בקריאת ההתנגדות, מה שמהווה את הבסיס לחישוב TCID50. במקרים כאלה, ייתכן שיהיה צורך לזהות מודל תא מתיר חלופי שיכול להציג CPE מושרה על ידי וירוס או לאמץ גישה של צביעת חיסונים, בתנאי שיש נוגדן מתאים נגד האנטיגן הספציפי של הווירוס. עם זאת, מחקר זה הדגים את יכולת מערכת RTCA MP ללכוד CPE תלוי במינון ולהבחין ביעילות בין אוכלוסיית תאים נגועים לבלתי נגועים באמצעות קריאת התנגדות אובייקטיבית ורגישה.

הכנסת ניתוח תלוי זמן TCID50 מהווה התקדמות משמעותית לעומת מדידות קצה מסורתיות. הוא מפשט את תהליך אופטימיזציית הבדיקה TCID50, שכן נקודת הזמן האופטימלית לחישוב ודיווח על טיטר ויראלי ניתנת להשגה בקלות ממבחן יחיד בזמן אמת. בעוד שבדיקות TCID50 מבוססות הדמיה וללא תוויות יכולות גם לספק ערכי TCID50 ברזולוציה בזמן, היישום שלהן מוגבל למודלים של תאי וירוס שמציגים CPE המזוהה על ידי אלגוריתמים של תוכנת ההדמיה, כפי שמודגם במודל IAV-MDCK (איור 6A). יתרה מזאת, שימוש בהתנגדות ללא תוויות לזיהוי CPE מבטל את הסיבוכים שבשימוש בחומרים שונים וזרימות עבודה מרובות שלבים שעלולים להעלות את הסיכונים הקשורים לטעויות אנוש. בנוסף לפישוט תהליך העבודה, מודול הווירולוגיה בתוכנת המערכת גם מייעל את הבדיקה. ראשית, זה מתחיל בהגדרת לוח ניסויים קל להקלטה אוטומטית מבוקרת מערכת. לאחר כל מדידה מתבצע ניקוד CPE חיובי ספונטני בזמן אמת ומסתיים בחישוב אוטומטי של TCID50 לכימות פשוט של חלקיקי נגיף זיהומי (איור 7). אוטומציה זו מפחיתה משמעותית את זמן ההתעסקות המעשית, שיפור קריטי, במיוחד בטיפול בווירוסים מדבקים מאוד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% טריפסין 0.53 מ"מ EDTA  (1x)קורנינג25-052-CI
12 מאגרי תעלהטכנולוגיות ויסטה-לאב3054-1011
אדנווירוס-GFPוקטור ביולאבס 1060
מדיום DMEMATCC30-2002
E-Plate VIEW 96אג'ילנט300601020
סרום בקר עובריאוונטור97068-085
תא Hek293Aתרמו פישר סיינטיפיק   R70507
תמיסת פניצילין-סטרפטומיציןהייקלוןSV30010
מלח בופר פוספט (1x)הייקלוןSH30256.01
אגרוז לוחית יםלונזה50101
מערכת xCELLigence RTCA eSightאג'ילנטS2833AA
מערכת xCELLigence RTCA MPאג'ילנט380601040

מקורות

  1. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. J Virol Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  2. Pourianfar, H. R., Javadi, A., Grollo, L. A colorimetric-based accurate method for the determination of enterovirus 71 titer. Indian J Virol. 23 (3), 303-310 (2012).
  3. Hochdorfer, D., Businger, R., Hotter, D., Seifried, C., Solzin, J. Automated, label-free TCID50 assay to determine the infectious titer of virus-based therapeutics. J Virol Methods. 299, 114318(2022).
  4. Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the Calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virol Sin. 36 (1), 141-144 (2021).
  5. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  6. Atienza, J. M., et al. Dynamic and label-free cell-based assays using the real-time cell electronic sensing system. Assay Drug Dev Technol. 4 (5), 597-607 (2006).
  7. Cheung, C. Y., Leung, C. K., Peiris, J. S. Potential of the real-time and label-free cell sensor impedance technology to transform cell-based infectivity assays for influenza viruses. Influenza Other Respir Viruses. 5 (Suppl 1), 151-154 (2011).
  8. Ebersohn, K., Coetzee, P., Venter, E. H. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 199, 25-28 (2014).
  9. Goh, V. S. L., et al. Evaluation of three alternative methods to the plaque reduction neutralizing assay for measuring neutralizing antibodies to dengue virus serotype 2. Virology J. 21 (1), (2024).
  10. Crisostomo, L., Soriano, A. M., Mendez, M., Graves, D., Pelka, P. Temporal dynamics of adenovirus 5 gene expression in normal human cells. PLOS One. 14 (1), e0211192(2019).
  11. Wang, T. E., et al. Differentiation of cytopathic effects (CPE) induced by influenza virus infection using deep convolutional neural networks (CNN). PLoS Comput Biol. 16 (5), e1007883(2020).
  12. Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochem Biophys Res Commun. 401 (1), 37-41 (2010).
  13. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. J Virol Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  14. Marlina, S., Shu, M. -H., Abubakar, S., Zandi, K. Development of a real-time cell analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8 (1), (2015).
  15. Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 252, 57-64 (2018).
  16. Lebourgeois, S., et al. Development of a real-time cell analysis (RTCA) method as a fast and accurate method for detecting infectious particles of the adapted strain of Hepatitis A virus. Front Cell Infect Microbiol. 8, (2018).
  17. Suryadevara, N., et al. Real-time cell analysis: A high-throughput approach for testing SARS-CoV-2 antibody neutralization and escape. STAR Protoc. 3 (2), 101387(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מדידת עכבהניטור בזמן אמתאפקט ציטופתיבדיקה ללא סימוןדילול סדרתי של נגיפיםכימות נגיפי אוטומטיתאי HEK293Aתאי MDCK
בדיקת מינון זיהומי של תרבית רקמה (TCID50) בזמן אמת וללא תוויות באמצעות אימפדנס לכימות אוטומטי של טיטר ויראלי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.