מבחנים התנהגותיים למניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים בדרוזופילה מלנוגסטר

Ainul Huda; Thomas J. Vaden; Hua Bai; Riley T. Rawls; Rebecca J. Peppers; Charlotte F. Monck; Henry D. Holley; Allison N. Castaneda; Lina Ni

doi:10.3791/67964

מאמר שיטה

מבחנים התנהגותיים למניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים בדרוזופילה מלנוגסטר

DOI:

10.3791/67964

⸱

7 בפברואר 2025

Ainul Huda^*¹ , Thomas J. Vaden^*¹ , Hua Bai¹ , Riley T. Rawls¹ , Rebecca J. Peppers² , Charlotte F. Monck¹ , Henry D. Holley¹ , Allison N. Castaneda¹^,³ , Lina Ni¹

¹School of Neuroscience, Virginia Tech, ²Academy of Integrated Science, Virginia Tech, ³Fairfax County Public Schools, Westfield High School

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג שיטות למניפולציה אופטוגנטית ב-Drosophila melanogaster, תוך שימוש ב-CsChrimson ו-GtACR2 כדי להפעיל ולהשתיק נוירונים ספציפיים. ארבעה ניסויים מתוארים לשימוש באופטוגנטיקה כדי לחקור התנהגויות תרמוטקטיות וטעמיות, ומספקים תובנות לגבי המנגנונים העצביים הבסיסיים השולטים בתהליכים אלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אופטוגנטיקה הפכה לטכניקה בסיסית במדעי המוח, המאפשרת שליטה מדויקת בפעילות העצבית באמצעות גירוי אור. מחקר זה מציג הגדרות קלות ליישום ליישום שיטות אופטוגנטיות ב-Drosophila melanogaster. שני כלים אופטוגנטיים, CsChrimson, תעלת קטיון המופעלת באור אדום, ו-GtACR2, ערוץ אניונים המופעל באור כחול, הופעלו בארבע גישות ניסיוניות. שלוש מהגישות הללו כוללות ניסויים של זבוב יחיד: (1) בדיקת העדפה תרמו-טקטית אופטוגנטית באור כחול המכוונת לתאי חימום רגישים לטמפרטורה, (2) בדיקת העדפה אופטוגנטית באור אדום המפעילה נוירונים של חישה מרה, ו-(3) בדיקת תגובת הרחבת פרובוסקיס המפעילה את נוירוני החישה המתוקה. הגישה הרביעית (4) היא מערך מבוך זבובים להערכת התנהגויות הימנעות באמצעות זבובים מרובים. היכולת לתמרן את הפעילות העצבית באופן זמני ומרחבי מציעה תובנות עוצמתיות לגבי עיבוד חושי וקבלת החלטות, ומדגישה את הפוטנציאל של אופטוגנטיקה לקדם את הידע שלנו על תפקוד עצבי. שיטות אלו מספקות מסגרת נגישה וחזקה למחקר עתידי במדעי המוח כדי לשפר את ההבנה של מסלולים עצביים ספציפיים ותוצאותיהם ההתנהגותיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אופטוגנטיקה התגלתה כטכניקה רבת עוצמה המשלבת אופטיקה וגנטיקה במדעי המוח, ומספקת שליטה מדויקת ולא פולשנית על הפעילות העצבית באמצעות גירוי אור¹. ב-Drosophila melanogaster, אורגניזם מודל בשימוש נרחב, כלים אופטוגנטיים מאפשרים הפעלה ועיכוב של נוירונים ספציפיים, ומאפשרים לחוקרים לווסת מעגלים עצביים. בין הכלים בהם נעשה שימוש, CsChrimson ו-GtACR (Guillardia theta anion channel rhodopsins) מספקים גישות משלימות למיקוד עצבי. CsChrimson channelrhodopsin, תעלת קטיון רגישה לאור אדום מאצות ירוקות, מקלה על הפעלה עצבית באמצעות דה-פולריזציה כאשר היא נחשפת לאור אדום, עם הפעלה שיא של כ-590 ננומטר². CsChrimson מציע חדירת רקמות טובה יותר מאשר תעלות רודופסינים קודמים ומפחית חפצים התנהגותיים המושרים על ידי אור במחקרי דרוזופילה ². לעומת זאת, GtACR, הכולל גרסאות כמו GtACR2, הוא ערוץ כלוריד מגודר אור שמשתיק נוירונים באמצעות היפרפולריזציה ^3,4. GtACR2 מוליך אניונים ומופעל על ידי אור כחול עם הפעלת שיא בסביבות 470 ננומטר⁴. CsChrimson ו-GtACR2 מופעלים על ידי אורכי גל מובחנים של אור, מה שמבטיח שליטה מדויקת ועצמאית בפעילות העצבית ללא הפעלה צולבת⁵.

דרוזופילה היא מודל יעיל למחקר במדעי המוח בשל עלות-תועלת, קלות הגידול והתגובות ההתנהגותיות החזקות לגירויים סביבתיים, כולל התנהגויות אטרקטיביות והימנעות⁶. גודלו הקטן והקוטיקולה השקופה למחצה משפרים את חדירת האור, במיוחד אור אדום באורך גל ארוך, ומאפשרים מניפולציה אופטוגנטית יעילה ^7,8. בעוד שתאי דרוזופילה אינם יכולים לייצר מספיק רשתית, גורם משלים חיוני לפונקציונליות של תעלות רודופסינים, הוספת רשתית לתזונה שלהם מפצה על מגבלה זו, ומבטיחה הפעלה יעילה של כלים אופטוגנטיים⁹.

כדי לחקור את ההשפעות של מניפולציה אופטוגנטית בדרוזופילה, אנו מתארים ארבעה ניסויים המכוונים למעגלים עצביים והתנהגויות שונות, כל אחד מהם משתמש בשיטות שונות כדי להעריך הימנעות או תגובות אטרקטיביות, החל ממבחני זבוב יחיד ועד להערכות מבוססות קבוצות. תאי חימום (HC) בדרוזופילה הם נוירונים תרמו-סנסוריים הממוקמים באריסטה, ומגיבים לעליית טמפרטורה¹⁰. נוירונים אלה מבטאים תעלות יונים רגישות לחום המעוררות התנהגות הימנעות, ומכוונות זבובים הרחק ממקורות חום^10,11. בגישה 1, השתמשנו במבחן העדפה תרמו-טקטית אופטוגנטית של אור כחול יחיד כדי לתפעל נוירונים של HC. על ידי ביטוי GtACR2 בתאי עצב אלה, עיכבנו את פעילותם בעת חשיפה לאור כחול. הזבובים נחשפו לשתי אפשרויות טמפרטורה: 25 מעלות צלזיוס ו-31 מעלות צלזיוס. תחת אור החדר, הזבובים נמנעו מהצד של 31 מעלות צלזיוס, מה שמדגים תגובה תרמו-טקטית טיפוסית. עם זאת, הפעלת אור כחול של GtACR2 השתיקה את תאי העצב של ה-HC. כתוצאה מכך, הזבובים לא הראו העדפה משמעותית לטמפרטורה, מה שמרמז על עיכוב אופטוגנטי מוצלח. בנוסף להערכת תפקודם של נוירונים חושיים, הביטוי של GtACR2 בנוירונים חושיים במורד הזרם מאפשר מניפולציות אופטוגנטיות דומות לחקר המעגלים העצביים הדרושים לשיטות חושיות ספציפיות⁵.

קולטן הטעם GR66a בדרוזופילה מתבטא במישוש השפתיים בקצה הדיסטלי של הפרובוסקיס וברגליים, ומתווך זיהוי טעם מר^12,13. נוירונים אלה מעוררים התנהגויות הימנעות בתגובה לחומרים מרים. בגישה 2, השתמשנו במבחן העדפה אופטוגנטית אופטוגנטית באור אדום של זבוב יחיד כדי לתפעל נוירונים המבטאים GR66a. על ידי ביטוי CsChrimson בתאי עצב אלה, הפעלנו אותם בחשיפה לאור אדום. זבובים הוצבו בזירה כאשר חצי אחד חשוף לאור אדום והחצי השני מסנן אור אדום. בהיעדר אור אדום, הזבובים לא הראו העדפה. עם זאת, הפעלת אור אדום של CsChrimson עוררה את תאי העצב החושבים מר, וכתוצאה מכך הימנעות משמעותית מהאזור המואר, מה שאישר הפעלה אופטוגנטית מוצלחת של נוירונים GR66a. גישות דומות שימשו לזיהוי המעגלים במורד הזרם של תאי חימום המספיקים להתנהגות ההימנעות⁵.

התמקדנו בהפעלה אופטוגנטית של התנהגות תיאבון בגישה 3. נוירונים המבטאים GR5a, הממוקמים בתחושת הטעם על התווית והרגליים, מזהים סוכרים ומניעים התנהגות האכילה. הפעלת נוירונים אלה מעוררת את תגובת הארכת הפרובוסקיס (PER)¹⁴. השתמשנו בבדיקת תגובת הרחבה אופטוגנטית של פרובוסקיס באור אדום כדי להפעיל נוירונים GR5a. על ידי ביטוי CsChrimson בתאי העצב האלה, גירינו אותם באור אדום. זבובים לא הרחיבו את החרטום שלהם בתנאי תאורה בחדר. עם זאת, הפעלת אור אדום של CsChrimson הובילה להארכת פרובוסקיס ללא גירוי מתוק, והדגימה הפעלה אופטוגנטית מוצלחת של נוירונים GR5a. גישה זו שימשה לחקירת המעגל העצבי, כולל נוירונים חושיים טעמיים, נוירונים של הקרנת טעם ונוירונים מוטוריים פרובוסקיס^15,16.

בגישה 4, חקרנו הפעלה אופטוגנטית של התנהגויות הימנעות בקבוצות זבובים, באמצעות בדיקת מבוך זבובים אופטוגנטית באור אדום המכוונת לתאי עצב GR66a. זבובים הוצבו בצומת של שני צינורות: האחד מואר באור אדום והשני מוצל. ביטוי CsChrimson בנוירונים GR66a עורר הימנעות. בהיעדר אור אדום, הזבובים לא הראו העדפה, אך הפעלת אור אדום הובילה את הזבובים המבטאים GR66a להימנע מאור אדום, מה שמרמז על הפעלה מוצלחת של המסלול. מבחני מבוך זבובים היו בשימוש נרחב לחקר שיטות חושיות שונות, כולל טמפרטורה, לחות וחוש הריח. בשילוב עם אופטוגנטיקה, גישה זו רבת עוצמה לחקירת התנהגויות אטרקטיביות והימנעות 17,18,19.

שיטות אלו מספקות מסגרת ניתנת לשחזור לחקר הפעלה ועיכוב אופטוגנטיים של מעגלים עצביים של דרוזופילה . על ידי שימוש בשילוב של תעלות רודופסינים שונים ומבחנים התנהגותיים נגישים, מחקר הוכחת היתכנות זה מדגים את היעילות של מניפולציה אופטוגנטית, ומספק שיטות פשוטות למניפולציה של פונקציות מעגלים עצביים עם יישומים רחבים יותר פוטנציאליים במחקר מדעי המוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. זנים, גידול זבובים ושואב זבוב

זנים ותחזוקה
1. הזנים ששימשו בניסויים כוללים HC-Gal4¹⁰, Gr5a-Gal4²⁰ (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal4²¹ (BDSC: 57670), UAS-GtACR2³, UAS-CsChrimson² (BDSC: 55136). החלק האחורי טס ב-25 מעלות צלזיוס על מדיום קמח תירס סטנדרטי במחזור אור של 12 שעות: 12 שעות חושך.
  הערה: 1 ליטר קמח תירס בינוני מכיל 1 ליטר dH₂O, 79 גרם דקסטרוז, 7.5 גרם אגר, 24 גרם שמרים פתיתים, 57 גרם קמח תירס, 2.1 גרם מתיל-4-הידרוקסיבנזואט (מומס ב -11.1 מ"ל אתנול), 6 גרם נתרן אשלגן טרטרט טטרהידרט ו -0.9 גרם סידן כלורי.
גידול זבובים והכנה לניסויים
1. מיין זבובים בני 0 עד 3 ימים. בזמן הניסוי, הזבובים יהיו בני 3 עד 6 ימים, מה שמבטיח עקביות תלוית גיל (איור 1A).
2. חלקו כל גנוטיפ לארבע קבוצות 3 ימים לפני ביצוע ניסויים: ATR אור חדר -, ATR אור חדר +, ATR אור אדום או כחול -, ואור אדום או כחול ATR +.
3. הכן תמיסת מלאי ATR של 80 מ"מ על ידי המסת ATR ב-100% אתנול. השלם את המזון עם 400 מיקרומטר ATR לקבוצות ATR +.
4. השלם את המזון באותו ריכוז של אתנול אך ללא ATR לקבוצות ה- ATR.
5. החזירו את כל הקבוצות בחושך²².
6. Starve Gr5a>CsChrimson עף במשך 16-24 שעות בבקבוקונים המכילים רקמה לחה בלבד. בקבוקוני ה- ATR + מכילים 400 מיקרומטר ATR מעורבב במים, ואילו בקבוקוני ה- ATR מכילים dH₂O מעורבב עם אותו ריכוז של אתנול.
שואב זבוב
1. הרכיבו את שואב הזבובים (איור 1B) באמצעות צינורות פלסטיק, רשת חרקים ושתי פיפטות העברה של 3 מ"ל.
2. חותכים את הקצוות והנורות של פיפטות ההעברה, ומוודאים שקצה יניקת הזבוב מאפשר מעבר נוח של זבוב. עיצוב זה מאפשר שאיבה עדינה של זבובים באמצעות שאיפה, מזעור נזק ומאפשר איסוף והעברה יעילים של זבובים בודדים.
3. עטוף רשת חרקים מעל צינור הפלסטיק ואבטח את קצות הנורה של הפיפטה לצינור באמצעות Parafilm.

2. בדיקת העדפה תרמו-טקטית אופטוגנטית של אור כחול יחיד

זני דרוזופילה וגידול זבובים
1. חצו את קו הנהג HC-Gal4¹⁰ ל-UAS-GtACR2³, וכתוצאה מכך הגנוטיפ הניסיוני HC>GtACR2. זבובי HC>GtACR2 מבטאים GtACR2 בתאי חימום.
  הערה: ודא שנעשה שימוש במספר שווה של זבובים זכרים ונקבות לכל מצב.
הגדרה וביצוע של בדיקות ניסיוניות
1. יישר שני לוחות פלדה על פלטות חמות נפרדות כך שהקצוות שלהם ייפגשו. הניחו מגן יריעות פלסטיק מעל, ואבטחו אותו עם סרט כדי למזער את התנועה. מקם פיסת נייר לבן על מגן הגיליון כדי להפחית את אותות רעשי הרקע (איור 1C).
  הערה: החלף את הנייר הלבן בתחילת כל ניסוי או כשהוא מלוכלך.
2. הנח מכסה פלסטיק שקוף (גובה 2 מ"מ × רוחב 58 מ"מ × אורך 83 מ"מ) על גבי הנייר הלבן. כיסוי זה מאפשר לזבוב ללכת בחופשיות תוך מניעת טיסתו.
3. חותכים חור בתחתית קופסת קצף פוליסטירן (גובה 27 ס"מ × רוחב 22 ס"מ × אורך 16 ס"מ) כדי להיצמד למצלמה ולאור הכחול (1,000 mA) כ-12 ס"מ מעל פני הניסוי.
4. מקם את המצלמה ואת האור הכחול כדי למזער את הבוהק תוך הפעלת ההפעלה.
  הערה: ייתכן שתידרש בדיקה מוקדמת כדי לקבוע את טווח ההפעלה של האור הכחול.
5. הגדר את המצלמה לצילום עם ההגדרות הבאות: 1 שניות זמן, שדה צר, 4000 × 3000 פיקסלים.
6. התאם את הגדרות הפלטה החמה כדי לשמור על טמפרטורת פני השטח של 25 ± 1 מעלות צלזיוס ו-31 ± 1 מעלות צלזיוס על לוחות הפלדה המתאימים.
  הערה: בתנאים הדורשים טמפרטורות מתחת ל-25 מעלות צלזיוס, יש צורך בשיטות קירור חלופיות, כגון מכשירי פלטייר או קרח. אם טמפרטורות לוחות הפלדה עולות על הרמות הרצויות, יש לרסס את המשטח במים מזוקקים כדי להשיג ולשמור על התנאים הנדרשים. לאחר מכן, השתמש במפית כדי לספוג עודף לחות ממגן יריעות הפלסטיק.
7. לפני ואחרי כל ניסוי, עקוב אחר הטמפרטורות באמצעות בדיקת טמפרטורת פני השטח.
  הערה: בקרת טמפרטורה מדויקת היא קריטית, מכיוון שתנודות יכולות להשפיע על התוצאות.
8. הנח את מכסה הפלסטיק בצד של 25 מעלות צלזיוס. בעזרת שואב זבובים, שחרר בעדינות זבוב בודד מתחת לכיסוי. מקם את הקופסה מעל אזור הניסוי כדי ליצור אור עמום (<10 לוקס) ולאפשר לזבוב להתאקלם למשך דקה אחת.
9. לאחר תקופת ההתאקלמות, הרם את הקופסה והתאם במהירות את מכסה הפלסטיק, מקם אותו עם מרכז הכיסוי מיושר עם גבול לוחית הפלדה כדי להבטיח כיסוי אחיד של הצדדים 25 מעלות צלזיוס ו-31 מעלות צלזיוס.
  הערה: במהלך תהליך זה, טמפרטורת האוויר והטמפרטורה בתוך המכסה בצד של 31 מעלות צלזיוס עולות לכ-27 מעלות צלזיוס תוך 5 שניות (איור משלים 1), מספיק להפעלת תאי חימום¹¹.
10. התחל את הניסיון על ידי הפעלת המצלמה והאור הכחול (20 kLux).
  הערה: אל תדליק את האור הכחול בתנאי תאורה בחדר. הפעל את המצלמה והקלט כמה פריימים לפני שתדליק את האור הכחול במקרה של תנועה.
11. לאחר יותר מ-2 דקות, סיים את הניסיון על ידי כיבוי המצלמה והאור. השלך את הזבובים באמצעות השואב.
  הערה: הקלט כמה פריימים נוספים במקרה של תנועה בעת כיבוי המצלמה.
ניתוח התנהגותי וסטטיסטי
1. נתח רק נתונים מזבובים שנשארים בצד של 25 מעלות צלזיוס בתחילת הניסוי.
  הערה: השלך נתונים מזבובים שמתחילים ניסויים בצד של 31 מעלות צלזיוס, שלעתים קרובות מציגים העדפות משתנות²³. השליכו ניסויים הכוללים זבובים שאינם מתקרבים לקצה הצד של 31 מעלות צלזיוס, והבטיחו שהם בחרו בין טמפרטורות. השליכו נתונים מזבובים שנשארים נייחים במשך יותר מ-30 שניות.
2. נתח את התוצאות באמצעות ההליכים שתוארו קודם לכן²³. חשב את מדד ההעדפות (PI) כיחס בין הפרש הזמן שהזבוב בילה בכל אזור טמפרטורה לזמן הכולל, כפי שמוצג בנוסחה הבאה:
  
  הערה: פרטים סטטיסטיים על הניסויים מסופקים באגדות האיור. ניתוח הנתונים מתבצע באמצעות תוכנת ניתוח נתונים מתאימה.

3. בדיקת העדפת מיקום אופטוגנטית באור אדום של זבוב יחיד

זני דרוזופילה וגידול זבובים
1. חצו את קו הנהג Gr66a-Gal4²¹ ל-UAS-CsChrimson², וכתוצאה מכך הגנוטיפ הניסיוני Gr66a>CsChrimson. זבובי Gr66a>CsChrimson מבטאים CsChrimson בנוירונים של טעם מר.
  הערה: ודא שנעשה שימוש במספר שווה של זבובים זכרים ונקבות לכל מצב.
הגדרה וביצוע של בדיקות ניסיוניות
1. ערכו את הבדיקה בחדר חשוך או בסביבה חשוכה כדי להבטיח הפעלה מבוקרת של CsChrimson (איור 1D).
2. מקם מצלמת וידיאו כ-45 ס"מ מעל פני הניסוי.
  1. השתמש במצלמת וידיאו ללא פילטר אינפרא אדום. אם למצלמת וידיאו יש מסנן אינפרא אדום פנימי קצר החוסם אורכי גל ארוכים מ- 700 ננומטר, הסר אותו.
  2. הדבק מסנן מעבר ארוך של 830 ננומטר מעל העדשה באמצעות דבק סופר כדי ללכוד את אורכי הגל האינפרא אדום. התאמה זו חיונית להקלטת תנועת זבובים בתנאי אור אינפרא אדום.
3. מקם מקור אור אדום²⁴ כ-45 ס"מ מעל פני הניסוי, והבטיח עוצמת אור של כ-2.5 kLux (1,000 mA).
  הערה: מומלצת הגנה מתאימה לעיניים שיכולה לסנן לייזר/אור אדום. משקפי בטיחות לייזר מסייעים במניעת נזק פוטנציאלי לעיניים מחשיפה ישירה לאור אדום עז.
4. השתמש באור אינפרא אדום כדי לדמיין את הזבובים בתוך ההגדרה. המשיכו לפעול לאורך כל הניסוי.
  הערה: הימנע מסנוור באזור הניסוי הנגרם על ידי אור האינפרא אדום; סנוור יכול לסבך את ניתוח הנתונים.
5. השתמש בדבק כדי לחבר מסנן מעבר ארוך אינפרא אדום 780 ננומטר למחצית כיסוי הפלסטיק.
  הערה: השתמש בכל מסנן מעבר ארוך החוסם אורכי גל מתחת ל-780 ננומטר. הצד הלא מסונן מאפשר לאור אדום ואינפרא אדום לעבור דרכו, בעוד שהצד המסונן מאפשר רק לאור אינפרא אדום לעבור דרכו.
6. הנח חומר מט שחור מתחת לאזור הניסוי כדי למזער רעשי רקע.
7. הניחו זבוב בודד מתחת לכיסוי פלסטיק שקוף (גובה 2 מ"מ × רוחב 58 מ"מ × אורך 83 מ"מ) בעזרת שואב זבובים והניחו לו להתאקלם למשך דקה.
8. המתן עד שהזבוב ייראה בצד הלא מסונן. התחל את הניסיון על ידי הדלקת מצלמת הווידאו והנורה האדומה.
  הערה: מצלמת הווידאו רגישה לתנועה מיד לאחר ההתנעה. אבטח את המצלמה ביסודיות בזמן ההקלטה והפעל את המצלמה מספר שניות לפני ההקלטה כדי למנוע תנועה חריגה שעלולה לסבך את הניתוח. אל תדליק את האור האדום עד תחילת הניסיון.
9. הקלט את תנועת הזבוב למשך דקה אחת.
  הערה: השליכו ניסויים שבהם הזבוב אינו מתקרב לקו האמצע או אינו זז במשך יותר מ-15 שניות.
10. לאחר דקה אחת, סיים את הניסיון על ידי כיבוי מצלמת הווידאו והאור. השלך את הזבובים באמצעות השואב.
  הערה: הקלט כמה פריימים נוספים כדי למנוע את השפעות התנועה בעת כיבוי המצלמה.
ניתוח התנהגותי וסטטיסטי
1. נתח את התוצאות באמצעות ההליכים שתוארו קודם לכן²³. חשב את מדד ההעדפות (PI) כיחס בין ההפרש בין הזמן שהזבוב בילה באזור ללא המסנן והשטח עם המסנן לזמן הכולל, כפי שמוצג בנוסחה הבאה:
  
  הערה: פרטים סטטיסטיים על הניסויים מסופקים באגדות האיור. ניתוח הנתונים מתבצע באמצעות תוכנת ניתוח נתונים מתאימה.

4. תגובת הרחבת פרובוסקיס אופטוגנטית באור אדום

זני דרוזופילה וגידול זבובים
1. חצו את קו הנהג Gr5a-Gal4²⁰ ל-UAS-CsChrimson², וכתוצאה מכך הגנוטיפ הניסיוני המכונה Gr5a>CsChrimson. זבובי Gr5a>CsChrimson מבטאים CsChrimson בתאי עצב של קולטני טעם מתוק.
  הערה: ודא שנעשה שימוש במספר שווה של זבובים זכרים ונקבות לכל מצב.
2. רעב טס במשך 16-24 שעות עם ATR (ATR +) או בלי (ATR -) לפני הבדיקה.
  הערה: ייתכן שיידרשו תקופות רעב ארוכות יותר כדי לעורר תגובה חזקה.
הגדרה וביצוע של בדיקות ניסיוניות
1. הרדמת זבובים על ידי קירור על קרח (איור 1E).
  הערה: הימנע ממגע ישיר בין זבובים לקרח. הגבל את זמן הקירור לכדקה; קירור ממושך עלול לגרום לבעיות התאוששות ותמותה.
2. השתמש בקצה של קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי למרוח 7-10 נקודות דבק קטנות על שקופיות הזכוכית.
  הערה: טיפות קטנות של דבק על המגלשה מבטיחות שהזבוב לא ישקע ועוזרות למנוע מהדבק להידבק לחוטם או לרגליים שלו.
3. מקם זבוב אחד, צד הגחון כלפי מעלה, על כל נקודת דבק. ודא שבית החזה והכנפיים באים במגע עם הדבק כדי למזער את התנועה. אווררו את הכנפיים לכל צד כדי להגדיל את שטח הפנים של הדבק.
  הערה: הימנע מהצבת זבובים קרוב מדי זה לזה, מה שעלול להפעיל בטעות זבובים מרובים במהלך חשיפה לאור.
4. הניחו לדבק להתייבש כ -10 דקות.
5. העבירו את השקופיות לקופסת לחות (קופסת פלסטיק עם מגבות נייר רטובות) ואפשרו לזבובים להתאושש למשך שעתיים.
6. הנח את השקופית מתחת למיקרוסקופ. השתמש במזרק כדי לספק טיפת מים כדי להשביע את הזבובים, ולמנוע הארכות פרובוסקיס הנגרמות על ידי צמא.
7. החזק ידנית מצביע לייזר אדום כדי להאיר אור אדום על החוטם/ראש של זבוב בודד (700 לוקס) תוך התבוננות בתגובת ה-PER דרך המיקרוסקופ.
  הערה: הגנה על העיניים שיכולה לסנן לייזר/אור אדום חיונית בעת התבוננות באור האדום דרך המיקרוסקופ.
8. התבונן ורשום את הארכת הפרובוסקיס בתוך חלון של 30 שניות. ציין כל זבוב באמצעות מערכת ההקלטה הבאה: 0 מציין שאין הארכה, 0.5 מציין הארכה של 1-2 שניות, 1 מציין שההארכה נמשכת מעל 3 שניות.
9. לאחר בדיקת הארכת פרובוסקיס המושרה על ידי אור, בדוק את התגובה לסוכרוז 4% באמצעות מזרק. הוצא טיפת סוכרוז בקצה המחט וקירב אותה לחרטום הזבוב.
  הערה: השלך את הנתונים מזבובים שאינם מגיבים לטיפות הסוכרוז.
ניתוח התנהגותי וסטטיסטי
1. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנת ניתוח נתונים מתאימה.
  הערה: פרטים סטטיסטיים על הניסויים מסופקים באגדות האיור.

5. בדיקת מבוך זבובים אופטוגנטית באור אדום

זני דרוזופילה וגידול זבובים
1. חצו את קו הנהג Gr66a-Gal4²¹ ל-UAS-CsChrimson², וכתוצאה מכך הגנוטיפ הניסיוני Gr66a>CsChrimson. זבובי Gr66a>CsChrimson מבטאים CsChrimson בנוירונים של טעם מר.
  הערה: ודא שכל קבוצה מכילה מספר שווה של זבובים זכרים ונקבות.
מכלול מבוך זבוב
1. צרו את מבוך הזבובים כפי שמוצג באיור 1F.
  הערה: לחלופין, הדפס בתלת מימד את רכיבי מבוך הזבובים, והרכבה כפי שפורט קודם לכן²⁵.
2. חותכים שלושה צינורות תרבית פלסטיק של 5 מ"ל לאורכים המתאימים כדי ליצור צינור טעינה, מבחנה שקופה חשופה ומבחנה מכוסה בנייר כסף. חבר צינורות למבוך הזבובים כפי שמוצג באיור 1F.
  1. בהתאם לחומר המבוך, חתוך את המבחנות כדי להבטיח מרחק שווה לכל תנאי בדיקה. בהתבסס על אורך תא ההחזקה, קצר את המבחנה החשופה במבוך שקוף, תוך קיצור המבחנה המכוסה בנייר כסף אם המבוך אטום.
הגדרה וביצוע של בדיקות ניסיוניות
1. בתנאי חושך או תאורה חלשה, הכניסו 10 זכרים ו-10 נקבות לצינור הטעינה. חבר את צינור הטעינה לתא האחיזה. הטה את המעלית והקש בעדינות על הצינור כדי להעביר את הזבובים לתא ההחזקה.
  הערה: הורד את המעלית כך שרק מחצית מתא האחיזה יהיה פתוח. מניפולציה זו מקלה על העברת זבובים מצינור הטעינה לתא ההחזקה.
2. לאחר העברת הזבובים לתא ההחזקה, השתמש במעלית כדי להוריד את הזבובים בין צינור הטעינה לחורי צינור הבדיקה. לאחר מכן, הסר את צינור הטעינה.
3. מקם את מבוך הזבובים במרחק של כ-13 ס"מ ממקור האור האדום (1000 mA) מבלי להדליק את האור.
4. הורד את המעלית עד שתא האחיזה יתיישר עם חורי מבחנה הבדיקה, מה שמאפשר לזבובים לנוע בחופשיות בין המבחנות העטופות בנייר כסף לבין המבחנות החשופות. במקביל, הפעל את האור האדום כדי להפעיל את CsChrimson. ודא שעוצמת האור האדום על פני המבחנה החשופה היא כ-40 kLux.
  הערה: אל תדליק את האור האדום עד שתא האחיזה מונמך ומיושר עם חורי צינור הבדיקה. מומלצת הגנה מתאימה לעיניים שיכולה לסנן לייזר/אור אדום בשל הבהירות העזה של האור האדום.
5. הזבובים בוחרים בין הצינור החשוף לאור האדום לבין הצינור המוצלל למשך דקה אחת.
6. לאחר דקה אחת, הרם את המעלית בין צינור הטעינה לחורי צינור הבדיקה. ספרו את הזבובים בכל צינור.
  הערה: רק זבובים פעילים ולא פצועים נספרים.
7. נקה את מעלית הזבובים ומבוך הזבובים באמצעות dH₂O לאחר כל ניסיון.
ניתוח נתונים וסטטיסטיקה
1. חשב את מדד ההעדפה (PI) כיחס בין ההבדל במספר הזבובים בין צינורות חשופים ומכוסים למספר הזבובים הכולל, כפי שמוצג בנוסחה הבאה:
  
  הערה: פרטים סטטיסטיים על הניסויים מסופקים באגדות האיור. ניתוח הנתונים מתבצע באמצעות תוכנת ניתוח נתונים מתאימה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת העדפה תרמו-טקטית אופטוגנטית של אור כחול יחיד
נבדקו ארבעה מצבים: תאורת חדר ללא תוספת ATR (תאורת חדר, ATR -), תאורת חדר עם תוספת ATR (תאורת חדר, ATR +), אור כחול ללא תוספת ATR (כחול, ATR -) ואור כחול עם תוספת ATR (כחול, ATR +). שלושת התנאים הראשונים שימשו כבקרות. בניסויי ביקורת, הזבובים נמנעו מהצד של 31 מעלות צלזיוס. באור כחול עם תוספת ATR, זבובים לא הראו העדפה בין 25 מעלות צלזיוס ל-31 מעלות צלזיוס, מה שמצביע על עיכוב מוצלח של תאי העצב של HC על ידי הפעלת GtACR2 (איור 2A

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מניפולציה אופטוגנטית שינתה את תחום מדעי המוח בכך שהיא מאפשרת שליטה מדויקת במעגלים עצביים עם דיוק מרחבי-זמני²⁷. מעגל עצבי כולל אוכלוסיות של נוירונים המחוברים ביניהם על ידי סינפסות, המבצעים פונקציות ספציפיות עם ההפעלה. הקונקטום של המוח השלם של דרוזופילה הושלם, ומציע תובנות מקיפות על המסלולים הסינפטיים בתוך מוח הדרוזופילה ^28,29. בעוד שהקונקטום יכול לחזות מנגנוני מעגל פוטנציאליים העומדים בבסי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים בנוגע לפרסום מאמר זה. כל המחברים חשפו כל קונפליקט פוטנציאלי ומאשרים שאין להם קשרים פיננסיים או אישיים שיכולים להשפיע על העבודה המוצגת במחקר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיאגרמות סכמטיות לכל הדמויות נוצרו עם Biorender.com. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) ל-L.N. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח הנתונים, החלטת הפרסום או הכנת כתבי היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1000 mA LED דרייבר	Luxeon Star	3021-D-E-1000
5 מ"ל VWR צינורות תרבית, פלסטיק, עם כובעים דו-מיקומיים	VWR	60818-664
780 מסנן Longpass / IR 780 ננומטר 100 מ"מ x 100 מ"מ	לי מסנני	BH #LE8744	חתוך לכ 47 x 100 מתאים לכיסוי הפלסטיק
Agfabric 6.5 רגל x 15 רגל חרקים רשת גינה להגנה על צמחים ירקות פרחים פירות	הום דיפו	EIBNW6515
אלומיניום טרנס רשתית	Sigma-Aldrich	116-31-4
(30.5 ס"מ x 30.5 ס"מ x 0.6 ס"מ)	אמזון		נרכש מאמזון
קופסת פלסטיק שחורה	LI-COR	929-97101
סידן כלוריד אנהידרו 25 גרם	תרמו פישר מדעי
CX405 Handycam עם חיישן Exmor R CMOS	SONY	HDR-CX405
Elmer' s “ דבק בית ספר"	אלמר
, טהור (200 הוכחה)	Sigma-Aldrich	E7023
Fisherbrand Isotemp Hot Plate Stirrer	Fisher Scientific	SP88850200
קו זבוב: Gr5a-Gal4	בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר	57592
קו זבוב: Gr66a-Gal4	בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר	57670
קו זבוב: HC-Gal4 (II)		ד"ר מרקו גליו	מתנה חביבה
קו זבובים: UAS-CsChrimson	Bloomington Drosophila Stock Center	55136
קו זבוב: UAS-GtACR2/TM6B	מעבדת ד"ר קוונטין גודרי	מתנה אדיבה

Flystuff 62-107 שמרים יבשים לא פעילים, 10 ק"ג, פתיתים תזונתיים, 10 ק"ג ליחידה	Genesee Scientific	62-107
Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 רשת, 5 ק"ג (11.02 פאונד) ליחידה	Genesee Scientific	66-103
FreeMascot OD 8+ 190 nm– 420 ננומטר / 600 ננומטר– משקפי בטיחות לייזר באורך גל 1100 ננומטר	קמע חופשי	B08LGMQ65S	נרכש מ- Amazon
GoPro Hero8 Black	GoPro	6365359
LEE מסננים 100 ופעמים; 100 mm אינפרא אדום #87 אינפרא אדום פוליאסטר פילטר	B& H Photo	LE8744
מסנן Longpass, זכוכית צבעונית, 50.8 x 50.8 מ"מ, 830 ננומטר חיתוך, RG830	Newport	FSQ-RG830
מתיל 4-הידרוקסיבנזואט, 99%, Thermo Scientific Chemicals	Thermo Fisher Scientific
MicroWell Mini Tray 60 Well, פרופיל נמוך NS PS	Thermal Scientific	NUNC 439225	המכסים משמשים כ"כיסוי פלסטיק"
אולימפוס פלסטיק 24-160RS, 1000 ומיקרו; L Olympus טיפים ארגונומיים כריכה נמוכה, מתלה, סטרילי, 8 מתלים של 96 טיפים / יחידה	Eppendorf	24-160RS
Parafilm M איטום סרט	הית'רו סיינטיפיק	HS234526B	4 אינץ' x 125 רגל
אשלגן כלורי, ACS, 99.0-100.5%,	תרמו פישר סיינטיפיק
Prism	GraphPad	גרסה 9	תוכנת ניתוח נתונים
Samco Graduated Transfer Pipettes	Thermo Fisher Scientific	225	3 מ"ל
שקופיות	פישר סיינטיפיק	12-544-2	5 מ"מ x 75 מ"מ x 1.0 מ"מ
מיקרוסקופ סטריאו	OLYMPUS	CZ61
קופסת קלקר (27 ס"מ גובה וזמנים 22 ס"מ; 22 ס"מ רוחב וזמנים 16 ס"מ)
סוכרוז	פישר סיינטיפיק	225911
בדיקת טמפרטורת פני השטח	Fluke	80PK-3A
מזרק	BD Integra	305270
טייט & לייל 457 דקסטרוז, טייט & לייל, פו, טייט & לייל 457 דקסטרוז, טייט & Lyle, אבקה, 50 ק"ג ליחידה	Genesee Scientific	62-113
מדחום צמד תרמי מכויל בעל ספרות גדולות ניתן	למעקב על ידי cple-parmer	UX-91210-07	Fisherbrand ניתן למעקב BigDigit Type K מדחום
משולש כחול LED ימני	LEDSupply	07007-PB000-D	470 ננומטר
משולש אדום LED ימני	LEDSupply	07007-PD000-F	627 ננומטר
Tygon PVC צינורות שקופים 1/4 אינץ' ID, 3/8 אינץ' OD, 5 רגל אורך	חברת האספקה מקמאסטר קאר	6516T21
Univivi IR Illuminator, 850nm 12 נוריות זווית רחבה IR Illuminator לראיית לילה	Univivi	4331910725
Wakefield Thermal 25.4 מ"מ גוף קירור עגול Star LED Board - 882-100AB	Wakefield-Vette	882-100AB
Wireless Presenter	DinoFire Store	B01410YNAM	נרכש מאמזון

כל צלחת AC297150250אלכוהול אתילי מעבדת Flystuff 62-101 קמח תירס צהוב (11.3 ק"ג), צהוב, 11.3 ק"ג/יחידה Genesee Scientific 62-101 126960025AA1159530

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
Mauss, A. S., Busch, C., Borst, A. Optogenetic neuronal silencing in drosophila during visual processing. Sci Rep. 7 (1), 13823(2017).
Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., Spudich, J. L. Neuroscience. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. 349 (6248), 647-650 (2015).
Castaneda, A. N., et al. Functional labeling of individualized postsynaptic neurons using optogenetics and trans-tango in drosophila (flipsot). PLoS Genet. 20 (3), e1011190(2024).
Fischer, F. P., et al. Drosophila melanogaster as a versatile model organism to study genetic epilepsies: An overview. Front Mol Neurosci. 16, 1116000(2023).
Aragon, M. J., et al. Multiphoton imaging of neural structure and activity in drosophila through the intact cuticle. Elife. 11, e69094(2022).
Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of drosophila behaviors through channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. Eur J Neurosci. 26 (9), 2405-2416 (2007).
Kono, M., Goletz, P. W., Crouch, R. K. 11-cis- and all-trans-retinols can activate rod opsin: Rational design of the visual cycle. Biochemistry. 47 (28), 7567-7571 (2008).
Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. The coding of temperature in the drosophila brain. Cell. 144 (4), 614-624 (2011).
Ni, L., et al. A gustatory receptor paralogue controls rapid warmth avoidance in drosophila. Nature. 500 (7464), 580-584 (2013).
Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
Dethier, V. G. The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1976).
Shiu, P. K., Sterne, G. R., Engert, S., Dickson, B. J., Scott, K. Taste quality and hunger interactions in a feeding sensorimotor circuit. Elife. 11, e79887(2022).
Kim, H., Kirkhart, C., Scott, K. Long-range projection neurons in the taste circuit of drosophila. Elife. 6, e23386(2017).
Sayeed, O., Benzer, S. Behavioral genetics of thermosensation and hygrosensation in drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 6079-6084 (1996).
Coya, R., Martin, F., Calvin-Cejudo, L., Gomez-Diaz, C., Alcorta, E. Validation of an optogenetic approach to the study of olfactory behavior in the t-maze of drosophila melanogaster adults. Insects. 13 (8), 662(2022).
Chu, L. A., Tai, C. Y., Chiang, A. S. Thirst-driven hygrosensory suppression promotes water seeking in drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (34), e2404454121(2024).
Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (Suppl 2), 14526-14530 (2003).
Dunipace, L., Meister, S., Mcnealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the drosophila gustatory system. Curr Biol. 11 (11), 822-835 (2001).
Ratnayake, K., et al. Blue light excited retinal intercepts cellular signaling. Sci Rep. 8 (1), 10207(2018).
Huda, A., Omelchenko, A. A., Vaden, T. J., Castaneda, A. N., Ni, L. Responses of different drosophila species to temperature changes. J Exp Biol. 225 (11), jeb243708(2022).
Tyrrell, J. J., Wilbourne, J. T., Omelchenko, A. A., Yoon, J., Ni, L. Ionotropic receptor-dependent cool cells control the transition of temperature preference in drosophila larvae. PLoS Genet. 17 (4), e1009499(2021).
Fu, Z., Huda, A., Kimbrough, I. F., Ni, L. Using drosophila two-choice assay to study optogenetics in hands-on neurobiology laboratory activities. J Undergrad Neurosci Educ. 22 (1), A45-A50 (2023).
Joseph, R. M., Heberlein, U. Tissue-specific activation of a single gustatory receptor produces opposing behavioral responses in drosophila. Genetics. 192 (2), 521-532 (2012).
Riemensperger, T., Kittel, R. J., Fiala, A. Optogenetics in drosophila neuroscience. Methods Mol Biol. 1408, 167-175 (2016).
Dorkenwald, S., et al. Neuronal wiring diagram of an adult brain. Nature. 634 (8032), 124-138 (2024).
Schlegel, P., et al. Whole-brain annotation and multi-connectome cell typing of drosophila. Nature. 634 (8032), 139-152 (2024).
Talay, M., et al. Transsynaptic mapping of second-order taste neurons in flies by trans-tango. Neuron. 96 (4), 783-795.e4 (2017).
Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (per) assay in drosophila. J Vis Exp. (3), e193(2007).
Pulver, S. R., Hornstein, N. J., Land, B. L., Johnson, B. R. Optogenetics in the teaching laboratory: Using channelrhodopsin-2 to study the neural basis of behavior and synaptic physiology in drosophila. Adv Physiol Educ. 35 (1), 82-91 (2011).
Titlow, J. S., Johnson, B. R., Pulver, S. R. Light activated escape circuits: A behavior and neurophysiology lab module using drosophila optogenetics. J Undergrad Neurosci Educ. 13 (3), A166-A173 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CsChrimson GtACR2

מבחנים התנהגותיים למניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים בדרוזופילה מלנוגסטר

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים