$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
אופטוגנטיקה התגלתה כטכניקה רבת עוצמה המשלבת אופטיקה וגנטיקה במדעי המוח, ומספקת שליטה מדויקת ולא פולשנית על הפעילות העצבית באמצעות גירוי אור1. ב-Drosophila melanogaster, אורגניזם מודל בשימוש נרחב, כלים אופטוגנטיים מאפשרים הפעלה ועיכוב של נוירונים ספציפיים, ומאפשרים לחוקרים לווסת מעגלים עצביים. בין הכלים בהם נעשה שימוש, CsChrimson ו-GtACR (Guillardia theta anion channel rhodopsins) מספקים גישות משלימות למיקוד עצבי. CsChrimson channelrhodopsin, תעלת קטיון רגישה לאור אדום מאצות ירוקות, מקלה על הפעלה עצבית באמצעות דה-פולריזציה כאשר היא נחשפת לאור אדום, עם הפעלה שיא של כ-590 ננומטר2. CsChrimson מציע חדירת רקמות טובה יותר מאשר תעלות רודופסינים קודמים ומפחית חפצים התנהגותיים המושרים על ידי אור במחקרי דרוזופילה 2. לעומת זאת, GtACR, הכולל גרסאות כמו GtACR2, הוא ערוץ כלוריד מגודר אור שמשתיק נוירונים באמצעות היפרפולריזציה 3,4. GtACR2 מוליך אניונים ומופעל על ידי אור כחול עם הפעלת שיא בסביבות 470 ננומטר4. CsChrimson ו-GtACR2 מופעלים על ידי אורכי גל מובחנים של אור, מה שמבטיח שליטה מדויקת ועצמאית בפעילות העצבית ללא הפעלה צולבת5.
דרוזופילה היא מודל יעיל למחקר במדעי המוח בשל עלות-תועלת, קלות הגידול והתגובות ההתנהגותיות החזקות לגירויים סביבתיים, כולל התנהגויות אטרקטיביות והימנעות6. גודלו הקטן והקוטיקולה השקופה למחצה משפרים את חדירת האור, במיוחד אור אדום באורך גל ארוך, ומאפשרים מניפולציה אופטוגנטית יעילה 7,8. בעוד שתאי דרוזופילה אינם יכולים לייצר מספיק רשתית, גורם משלים חיוני לפונקציונליות של תעלות רודופסינים, הוספת רשתית לתזונה שלהם מפצה על מגבלה זו, ומבטיחה הפעלה יעילה של כלים אופטוגנטיים9.
כדי לחקור את ההשפעות של מניפולציה אופטוגנטית בדרוזופילה, אנו מתארים ארבעה ניסויים המכוונים למעגלים עצביים והתנהגויות שונות, כל אחד מהם משתמש בשיטות שונות כדי להעריך הימנעות או תגובות אטרקטיביות, החל ממבחני זבוב יחיד ועד להערכות מבוססות קבוצות. תאי חימום (HC) בדרוזופילה הם נוירונים תרמו-סנסוריים הממוקמים באריסטה, ומגיבים לעליית טמפרטורה10. נוירונים אלה מבטאים תעלות יונים רגישות לחום המעוררות התנהגות הימנעות, ומכוונות זבובים הרחק ממקורות חום10,11. בגישה 1, השתמשנו במבחן העדפה תרמו-טקטית אופטוגנטית של אור כחול יחיד כדי לתפעל נוירונים של HC. על ידי ביטוי GtACR2 בתאי עצב אלה, עיכבנו את פעילותם בעת חשיפה לאור כחול. הזבובים נחשפו לשתי אפשרויות טמפרטורה: 25 מעלות צלזיוס ו-31 מעלות צלזיוס. תחת אור החדר, הזבובים נמנעו מהצד של 31 מעלות צלזיוס, מה שמדגים תגובה תרמו-טקטית טיפוסית. עם זאת, הפעלת אור כחול של GtACR2 השתיקה את תאי העצב של ה-HC. כתוצאה מכך, הזבובים לא הראו העדפה משמעותית לטמפרטורה, מה שמרמז על עיכוב אופטוגנטי מוצלח. בנוסף להערכת תפקודם של נוירונים חושיים, הביטוי של GtACR2 בנוירונים חושיים במורד הזרם מאפשר מניפולציות אופטוגנטיות דומות לחקר המעגלים העצביים הדרושים לשיטות חושיות ספציפיות5.
קולטן הטעם GR66a בדרוזופילה מתבטא במישוש השפתיים בקצה הדיסטלי של הפרובוסקיס וברגליים, ומתווך זיהוי טעם מר12,13. נוירונים אלה מעוררים התנהגויות הימנעות בתגובה לחומרים מרים. בגישה 2, השתמשנו במבחן העדפה אופטוגנטית אופטוגנטית באור אדום של זבוב יחיד כדי לתפעל נוירונים המבטאים GR66a. על ידי ביטוי CsChrimson בתאי עצב אלה, הפעלנו אותם בחשיפה לאור אדום. זבובים הוצבו בזירה כאשר חצי אחד חשוף לאור אדום והחצי השני מסנן אור אדום. בהיעדר אור אדום, הזבובים לא הראו העדפה. עם זאת, הפעלת אור אדום של CsChrimson עוררה את תאי העצב החושבים מר, וכתוצאה מכך הימנעות משמעותית מהאזור המואר, מה שאישר הפעלה אופטוגנטית מוצלחת של נוירונים GR66a. גישות דומות שימשו לזיהוי המעגלים במורד הזרם של תאי חימום המספיקים להתנהגות ההימנעות5.
התמקדנו בהפעלה אופטוגנטית של התנהגות תיאבון בגישה 3. נוירונים המבטאים GR5a, הממוקמים בתחושת הטעם על התווית והרגליים, מזהים סוכרים ומניעים התנהגות האכילה. הפעלת נוירונים אלה מעוררת את תגובת הארכת הפרובוסקיס (PER)14. השתמשנו בבדיקת תגובת הרחבה אופטוגנטית של פרובוסקיס באור אדום כדי להפעיל נוירונים GR5a. על ידי ביטוי CsChrimson בתאי העצב האלה, גירינו אותם באור אדום. זבובים לא הרחיבו את החרטום שלהם בתנאי תאורה בחדר. עם זאת, הפעלת אור אדום של CsChrimson הובילה להארכת פרובוסקיס ללא גירוי מתוק, והדגימה הפעלה אופטוגנטית מוצלחת של נוירונים GR5a. גישה זו שימשה לחקירת המעגל העצבי, כולל נוירונים חושיים טעמיים, נוירונים של הקרנת טעם ונוירונים מוטוריים פרובוסקיס15,16.
בגישה 4, חקרנו הפעלה אופטוגנטית של התנהגויות הימנעות בקבוצות זבובים, באמצעות בדיקת מבוך זבובים אופטוגנטית באור אדום המכוונת לתאי עצב GR66a. זבובים הוצבו בצומת של שני צינורות: האחד מואר באור אדום והשני מוצל. ביטוי CsChrimson בנוירונים GR66a עורר הימנעות. בהיעדר אור אדום, הזבובים לא הראו העדפה, אך הפעלת אור אדום הובילה את הזבובים המבטאים GR66a להימנע מאור אדום, מה שמרמז על הפעלה מוצלחת של המסלול. מבחני מבוך זבובים היו בשימוש נרחב לחקר שיטות חושיות שונות, כולל טמפרטורה, לחות וחוש הריח. בשילוב עם אופטוגנטיקה, גישה זו רבת עוצמה לחקירת התנהגויות אטרקטיביות והימנעות 17,18,19.
שיטות אלו מספקות מסגרת ניתנת לשחזור לחקר הפעלה ועיכוב אופטוגנטיים של מעגלים עצביים של דרוזופילה . על ידי שימוש בשילוב של תעלות רודופסינים שונים ומבחנים התנהגותיים נגישים, מחקר הוכחת היתכנות זה מדגים את היעילות של מניפולציה אופטוגנטית, ומספק שיטות פשוטות למניפולציה של פונקציות מעגלים עצביים עם יישומים רחבים יותר פוטנציאליים במחקר מדעי המוח.