מאמר שיטה

מבחנים התנהגותיים למניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים בדרוזופילה מלנוגסטר

DOI:

10.3791/67964

⸱

7 בפברואר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Neuroscience, Virginia Tech, 2Academy of Integrated Science, Virginia Tech, 3Fairfax County Public Schools, Westfield High School

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג שיטות למניפולציה אופטוגנטית ב-Drosophila melanogaster, תוך שימוש ב-CsChrimson ו-GtACR2 כדי להפעיל ולהשתיק נוירונים ספציפיים. ארבעה ניסויים מתוארים לשימוש באופטוגנטיקה כדי לחקור התנהגויות תרמוטקטיות וטעמיות, ומספקים תובנות לגבי המנגנונים העצביים הבסיסיים השולטים בתהליכים אלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אופטוגנטיקה הפכה לטכניקה בסיסית במדעי המוח, המאפשרת שליטה מדויקת בפעילות העצבית באמצעות גירוי אור. מחקר זה מציג הגדרות קלות ליישום ליישום שיטות אופטוגנטיות ב-Drosophila melanogaster. שני כלים אופטוגנטיים, CsChrimson, תעלת קטיון המופעלת באור אדום, ו-GtACR2, ערוץ אניונים המופעל באור כחול, הופעלו בארבע גישות ניסיוניות. שלוש מהגישות הללו כוללות ניסויים של זבוב יחיד: (1) בדיקת העדפה תרמו-טקטית אופטוגנטית באור כחול המכוונת לתאי חימום רגישים לטמפרטורה, (2) בדיקת העדפה אופטוגנטית באור אדום המפעילה נוירונים של חישה מרה, ו-(3) בדיקת תגובת הרחבת פרובוסקיס המפעילה את נוירוני החישה המתוקה. הגישה הרביעית (4) היא מערך מבוך זבובים להערכת התנהגויות הימנעות באמצעות זבובים מרובים. היכולת לתמרן את הפעילות העצבית באופן זמני ומרחבי מציעה תובנות עוצמתיות לגבי עיבוד חושי וקבלת החלטות, ומדגישה את הפוטנציאל של אופטוגנטיקה לקדם את הידע שלנו על תפקוד עצבי. שיטות אלו מספקות מסגרת נגישה וחזקה למחקר עתידי במדעי המוח כדי לשפר את ההבנה של מסלולים עצביים ספציפיים ותוצאותיהם ההתנהגותיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אופטוגנטיקה התגלתה כטכניקה רבת עוצמה המשלבת אופטיקה וגנטיקה במדעי המוח, ומספקת שליטה מדויקת ולא פולשנית על הפעילות העצבית באמצעות גירוי אור1. ב-Drosophila melanogaster, אורגניזם מודל בשימוש נרחב, כלים אופטוגנטיים מאפשרים הפעלה ועיכוב של נוירונים ספציפיים, ומאפשרים לחוקרים לווסת מעגלים עצביים. בין הכלים בהם נעשה שימוש, CsChrimson ו-GtACR (Guillardia theta anion channel rhodopsins) מספקים גישות משלימות למיקוד עצבי. CsChrimson channelrhodopsin, תעלת קטיון רגישה לאור אדום מאצות ירוקות, מקלה על הפעלה עצבית באמצעות דה-פולריזציה כאשר היא נחשפת לאור אדום, עם הפעלה שיא של כ-590 ננומטר....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. זנים, גידול זבובים ושואב זבוב

  1. זנים ותחזוקה
    1. הזנים ששימשו בניסויים כוללים HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136). החלק האחורי טס ב-25 מעלות צלזיוס על מדיום קמח תירס סטנדרטי במחזור אור של 12 שעות: 12 שעות חושך.
      הערה: 1 ליטר קמח תירס בינוני מכיל 1 ליטר dH2O, 79 גרם דקסטרוז, 7.5 גרם אגר, 24 גרם שמרים פתיתים, 57 גרם קמח תירס, 2.1 גרם מתיל-4-ה....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת העדפה תרמו-טקטית אופטוגנטית של אור כחול יחיד
נבדקו ארבעה מצבים: תאורת חדר ללא תוספת ATR (תאורת חדר, ATR -), תאורת חדר עם תוספת ATR (תאורת חדר, ATR +), אור כחול ללא תוספת ATR (כחול, ATR -) ואור כחול עם תוספת ATR (כחול, ATR +). שלושת התנאים הראשונים שימשו כבקרות. בניסויי ביקורת, הזבובים נמנעו מהצד של 31 מעלות צלזיוס. באור כחול עם תוספת ATR, זבובים לא הראו העדפה בין 25 מעלות צלזיוס ל-31 מעלות צלזיוס, מה שמצביע על עיכוב מוצלח של תאי העצב של HC על ידי הפעלת GtACR2 (איור 2A

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מניפולציה אופטוגנטית שינתה את תחום מדעי המוח בכך שהיא מאפשרת שליטה מדויקת במעגלים עצביים עם דיוק מרחבי-זמני27. מעגל עצבי כולל אוכלוסיות של נוירונים המחוברים ביניהם על ידי סינפסות, המבצעים פונקציות ספציפיות עם ההפעלה. הקונקטום של המוח השלם של דרוזופילה הושלם, ומציע תובנות מקיפות על המסלולים הסינפטיים בתוך מוח הדרוזופילה 28,29. בעוד שהקונקטום יכול לחזות מנגנוני מעגל פוטנציאליים העומדים בבסי.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים בנוגע לפרסום מאמר זה. כל המחברים חשפו כל קונפליקט פוטנציאלי ומאשרים שאין להם קשרים פיננסיים או אישיים שיכולים להשפיע על העבודה המוצגת במחקר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיאגרמות סכמטיות לכל הדמויות נוצרו עם Biorender.com. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) ל-L.N. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח הנתונים, החלטת הפרסום או הכנת כתבי היד.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1000 mA LED דרייברLuxeon Star3021-D-E-1000
5 מ"ל VWR צינורות תרבית, פלסטיק, עם כובעים דו-מיקומייםVWR60818-664
780 מסנן Longpass / IR 780 ננומטר 100 מ"מ x 100 מ"מלי מסנניBH #LE8744חתוך לכ 47 x 100 מתאים לכיסוי הפלסטיק
Agfabric 6.5 רגל x 15 רגל חרקים רשת גינה להגנה על צמחים ירקות פרחים פירותהום דיפוEIBNW6515
אלומיניום טרנס רשתיתSigma-Aldrich116-31-4
(30.5 ס"מ x 30.5 ס"מ x 0.6 ס"מ)אמזוןנרכש מאמזון
קופסת פלסטיק שחורהLI-COR929-97101
סידן כלוריד אנהידרו 25 גרםתרמו פישר מדעי 
CX405 Handycam עם חיישן Exmor R CMOSSONYHDR-CX405
Elmer' s “ דבק בית ספר"אלמר
, טהור (200 הוכחה)Sigma-AldrichE7023
Fisherbrand Isotemp Hot Plate StirrerFisher ScientificSP88850200
קו זבוב: Gr5a-Gal4בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר57592
קו זבוב: Gr66a-Gal4בלומינגטון דרוזופילה סטוק סנטר57670
קו זבוב: HC-Gal4 (II)ד"ר מרקו גליומתנה חביבה
קו זבובים: UAS-CsChrimsonBloomington Drosophila Stock Center55136
קו זבוב: UAS-GtACR2/TM6Bמעבדת ד"ר קוונטין גודרימתנה אדיבה
Flystuff 62-107 שמרים יבשים לא פעילים, 10 ק"ג, פתיתים תזונתיים, 10 ק"ג ליחידהGenesee Scientific62-107
Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 רשת, 5 ק"ג (11.02 פאונד) ליחידהGenesee Scientific66-103
FreeMascot OD 8+ 190 nm– 420 ננומטר / 600 ננומטר– משקפי בטיחות לייזר באורך גל 1100 ננומטר קמע חופשי B08LGMQ65Sנרכש מ- Amazon
GoPro Hero8 BlackGoPro6365359
LEE מסננים 100 ופעמים; 100 mm אינפרא אדום #87 אינפרא אדום פוליאסטר פילטרB& H PhotoLE8744
מסנן Longpass, זכוכית צבעונית, 50.8 x 50.8 מ"מ, 830 ננומטר חיתוך, RG830NewportFSQ-RG830
מתיל 4-הידרוקסיבנזואט, 99%, Thermo Scientific ChemicalsThermo Fisher Scientific 
MicroWell Mini Tray 60 Well, פרופיל נמוך NS PSThermal Scientific NUNC 439225המכסים משמשים כ"כיסוי פלסטיק"
אולימפוס פלסטיק 24-160RS, 1000 ומיקרו; L Olympus טיפים ארגונומיים כריכה נמוכה, מתלה, סטרילי, 8 מתלים של 96 טיפים / יחידהEppendorf24-160RS
Parafilm M איטום סרטהית'רו סיינטיפיקHS234526B4 אינץ' x 125 רגל
אשלגן כלורי, ACS, 99.0-100.5%, תרמו פישר סיינטיפיק 
PrismGraphPadגרסה 9תוכנת ניתוח נתונים
Samco Graduated Transfer PipettesThermo Fisher Scientific 2253 מ"ל
שקופיותפישר סיינטיפיק12-544-2  5 מ"מ x 75 מ"מ x 1.0 מ"מ
מיקרוסקופ סטריאוOLYMPUSCZ61
קופסת קלקר (27 ס"מ גובה וזמנים 22 ס"מ; 22 ס"מ רוחב וזמנים 16 ס"מ)
סוכרוזפישר סיינטיפיק225911
בדיקת טמפרטורת פני השטחFluke80PK-3A
מזרקBD Integra305270
טייט & לייל 457 דקסטרוז, טייט & לייל, פו, טייט & לייל 457 דקסטרוז, טייט & Lyle, אבקה, 50 ק"ג ליחידהGenesee Scientific62-113
מדחום צמד תרמי מכויל בעל ספרות גדולות ניתןלמעקב על ידי cple-parmer  UX-91210-07Fisherbrand ניתן למעקב BigDigit Type K מדחום
משולש כחול LED ימניLEDSupply07007-PB000-D470 ננומטר
משולש אדום LED ימניLEDSupply07007-PD000-F627 ננומטר
Tygon PVC צינורות שקופים 1/4 אינץ' ID, 3/8 אינץ' OD, 5 רגל אורך חברת האספקה מקמאסטר קאר 6516T21 
Univivi IR Illuminator, 850nm 12 נוריות זווית רחבה IR Illuminator לראיית לילהUnivivi4331910725
Wakefield Thermal 25.4 מ"מ גוף קירור עגול Star LED Board - 882-100ABWakefield-Vette882-100AB
Wireless PresenterDinoFire StoreB01410YNAMנרכש מאמזון
כל צלחת AC297150250אלכוהול אתילי מעבדת Flystuff 62-101 קמח תירס צהוב (11.3 ק"ג), צהוב, 11.3 ק"ג/יחידה Genesee Scientific 62-101 126960025AA1159530

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  2. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  3. Mauss, A. S., Busch, C., Borst....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CsChrimsonGtACR2

מאמרים קשורים