מאמר שיטה

מודל שלפוחית השתן במבחנה של זיהום בדרכי השתן הקשור לצנתר

DOI:

10.3791/67966

⸱

24 ביוני 2025

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט מודל מבחנה של דרכי השתן המצונתרות, שניתן להשתמש בו כדי לחקור אוכלוסיות תאי חיידקים פלנקטוניים וקשורים לביופילם בזיהומים מדומים בדרכי השתן הקשורים לצנתר. ניתן להשתמש במודל זה כדי לחקור את יעילותם של מוצרים אנטי-מיקרוביאליים שמטרתם לשלוט בדלקות בדרכי השתן.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהומים בדרכי השתן הקשורים לצנתר (CAUTIs) הם בין הזיהומים הנפוצים ביותר הקשורים לבריאות. היווצרות ביופילם על צנתרי שתן היא היבט מרכזי בפתוגנזה של זיהומים אלה, ולעתים קרובות מובילה לחסימת צנתרים ולסיבוכים חמורים כגון פיילונפריטיס ואלח דם. גישות למידול ולחקר היווצרות ביופילם בסביבה זו חיוניות הן להבנה בסיסית של המנגנונים העומדים בבסיס הפתוגנזה של CAUTI, כמו גם לפיתוח והערכה פרה-קלינית חזקה של אסטרטגיות טיפוליות יעילות לשליטה ב-CAUTI וחסימת צנתר. פרוטוקול זה מתאר מודל חוץ גופי של דרכי השתן המצונתרות, המשכפל את מערכת הניקוז הסגורה של הצנתר כפי שנעשה בו שימוש בפרקטיקה הקלינית, מה שמקל על חקר CAUTI והיווצרות ביופילם של קטטר בתנאים מייצגים. יתר על כן, פרוטוקול זה מפרט את היישום של מודל שלפוחית השתן במבחנה כדי להעריך את היעילות של מוצרי תחזוקת צנתרים אנטי-מיקרוביאליים, כולל מוצרים הזמינים כיום בשרשרת האספקה של NHS.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צנתרי שתן הם בין המכשירים הרפואיים הנפוצים ביותר, עם שכיחות מוערכת של 19% במתקני טיפול אקוטי 1,2,3. צנתרים נפרסים בעיקר כדי לסייע בניהול תפוקת השתן במקרים של תפקוד לקוי של שלפוחית השתן, ומוחדרים ישירות לשלפוחית השתן, ומאפשרים לשתן להתרוקן משלפוחית השתן דרך לומן מרכזי 2,3. ניתן להשתמש בצנתרי שתן לסירוגין, שם הם מוחדרים לשלפוחית השתן מעת לעת כדי לנקז שתן, או להשתמש בצנתרים שוכנים, שבהם צנתרים נותרים באתרם בשלפוחית השתן כדי לנקז שתן באופן רציף 3,4. למרות השימוש הנרחב בהם, צנתרי שתן הם גורם הסיכון הגדול ביותר להתפתחות דלקות בדרכי השתן (UTI), המהווים כחמישית מהזיהומים הקשורים לשירותי בריאות 5,6. ואכן, הצנתר עצמו משמש לעתים קרובות כאתר הראשוני של קולוניזציה מיקרוביאלית, ומספק משטח לאורופתוגנים להיצמד וליישב עוד יותר את דרכי השתן 1,6,7,8. כמעט כל החולים שעוברים צנתור רציף ארוך טווח (שבו הצנתר נשאר במקומו למשך ≥28 ימים) יחוו בקטריוריה, כאשר הסיכון עולה ב~5% עבור כל יום שהקטטר נמצא במקום 2,9,10,11. בהתאמה, כ-80% מדלקות בדרכי השתן קשורות לשימוש בצנתר שתן6.

זיהומים בדרכי השתן הקשורים לצנתר (CAUTIs) מהווים נטל משמעותי על שירותי הבריאות, ולעתים קרובות קשורים לתסמינים חמורים יותר של דלקת בדרכי השתן העליונה (כגון דלקת השופכן ופיאלונפריטיס) מאשר דלקות בדרכי השתן לא מסובכות, כמו גם סיכון מוגבר לזיהומים משניים בזרם הדם 1,7,12,13,14 . טיפולים סטנדרטיים ל-CAUTIs כוללים טיפול אנטיביוטי, עם זאת, זיהומים אלה לרוב סרבנים לטיפול אנטי-מיקרוביאלי כתוצאה מהתפתחות קהילות ביופילם מורכבות על פני הצנתר 15,16,17,18,19,20. ואכן, ההערכה היא כי ~80% מה-CAUTIs נובעים מפתוגנים בדרכי השתן היוצרים ביופילם19. היווצרות ביופילם מאופיינת בהצמדה של תאי חיידקים למשטחי צנתר והתפתחות קהילות המוטמעות במטריצה נרחבת של חומרים פולימריים חוץ-תאיים (EPS)21,22,23,24. ייצור ה-EPS הוא מאפיין מגדיר של קהילות ביופילם ואחראי לרבים מהתכונות המתעוררות המוצגות על ידי תאים הקשורים לביופילם, כגון עמידות מוגברת לחומרים אנטי-מיקרוביאליים ופינוי חיסוני 21,22,24. ה-EPS יכול למלא תפקיד ישיר בפנוטיפים אלה על ידי הגנה פיזית על תאים והגנה עליהם מפני אנטי-מיקרוביאלים או אפקטורים חיסוניים, כמו גם בעקיפין על ידי הקלה על התפתחותם של היבטים רחבים יותר של קהילות ביופילם כגון המיקרו-סביבה הפיזיקוכימית של הביופילם והיווצרות תאים מתמידים 23,24,25,26. יתר על כן, חלק מהאורופתוגנים כולל Proteus spp., המהווים ~11% מה-CAUTIs, מכילים אנזימי אוראז חזקים, המאפשרים להם להידרוליזה של האוריאה הקיימת בשתן וכתוצאה מכך עלייה כללית ב-pH בשתן 2,27,28,29,30. עליית pH זו מלווה במשקעים של גבישי סידן ומגנזיום פוספט, אותם ניתן לשלב בביופילם הגדל, וכתוצאה מכך ביו-מינרליזציה ויצירת מבני ביופילם גבישי צפופים שיכולים לחסום צנתרים. ביופילמים גבישיים אלה לא רק הופכים את הטיפול לבעייתי, אלא גם יכולים ליזום סיבוכים חמורים כגון פיילונפריטיס ואלח דם 2,28,31,32,33,34.

הנישה הסביבתית המורכבת בדרכי השתן המצונתרות, והתפקיד החשוב של היווצרות ביופילם בזיהומים אלה, מציבים אתגרים מיוחדים בחקר הפתוגנזה של CAUTI. מודלים מעבדתיים פשוטים ונמצאים בשימוש נרחב לחקר וכימות היווצרות ביופילם, כגון מבחנים מבוססי 96 בארות, אינם מספיקים לחקר היווצרות ביופילם ב-CATUI, במיוחד ביופילמים גבישיים. לדוגמה, מודלים כאלה אינם לוקחים בחשבון היבטים מרכזיים של נישת CAUTI, כגון הסביבה התזונתית המורכבת המסופקת על ידי שתן, כיצד משטח הצנתר משפיע על ההידבקות וייצור הביופילם שלאחר מכן, והזרימה המתמשכת של אמצעי השתן 35,36,37,38,39,40. בנוסף, מבחנים סטנדרטיים המשמשים לקביעת רגישות אנטי-מיקרוביאלית של אורופתוגנים לרוב אינם משקפים רגישות קלינית בעולם האמיתי. מבחני ריכוז מעכב מינימלי ובדיקות השעיה מיקרוביאליות משמשות לעתים קרובות כדי להסיק את הרגישות האנטי-מיקרוביאלית של פתוגנים של CAUTI, אך בדרך כלל אינן מדמות משתנים חשובים של סביבת CAUTI, כגון ההשפעה שעשויה להיות לנוכחות קטטר שתן וכל היווצרות ביופילם לאחר מכן על הרגישות האנטי-מיקרוביאלית 41,42,43.

מחקר זה מפרט את ההגדרה וההפעלה של מודל שלפוחית השתן במבחנה המדמה את הסביבה של דרכי השתן המצונתרות, ומשכפל מערכת ניקוז סגורה סטנדרטית של צנתר כפי שנעשה בה שימוש בפרקטיקה הקלינית, שתוארה לראשונה על ידי Stickler et al.44 בשנת 1999 (איור 1). מודל זה משתמש בצנתרי פולי בגודל סטנדרטי (הזמינים כיום בשרשרת האספקה של NHS), ואמצעי שתן מלאכותי (AUM) כפי שתואר בעבר על ידי Nzakizwanayo et al.45כדי לדמות היווצרות CAUTI וביופילם. דגם שלפוחית השתן במבחנה מורכב מתא זכוכית בעל דופן כפולה המשמש כ"שלפוחית השתן "ויש לו יציאה שדרכה ניתן להכניס קטטר פולי לתא הזכוכית המרכזי. בחלק העליון של תא הזכוכית המרכזי יש כניסה שדרכה ניתן לספק AUM ל"שלפוחית השתן" בקצב זרימה רלוונטי מבחינה ביולוגית באמצעות משאבה פריסטלטית, שתזרום דרך הקטטר דרך חורי הניקוז לתוך שקית אשפה. בנוסף, החדר החיצוני מחובר למעגל אמבט מים, המאפשר לשמור על הדגמים בטמפרטורה קבועה. ניתן לחסן את מודל שלפוחית השתן במבחנה דרך החדר המרכזי, מה שמאפשר לחקור פתוגנים של CAUTI בנישה מייצגת ביולוגית. יתר על כן, כאשר מודלים מצנתרים ומסופקים כל הזמן עם AUM טרי, ניתן לחקור את הצמיחה והדינמיקה של האוכלוסייה של תאים פלנקטוניים ותאים הקשורים לביופילם.

מחקרים קודמים השתמשו במודלים של שלפוחית השתן במבחנה למספר יישומים, כולל המחקר הבסיסי של היווצרות ביופילם בפתוגנים בולטים של CAUTI, כולל Proteus mirabilis ו-Escherichia coli 43,45,46,47,48,49. בנוסף, נעשה שימוש במודל המבחנה כדי להעריך את היעילות של מוצרים המיועדים לשלוט ב-CAUTI או למנוע חסימה 50,51,52. לאחרונה, נעשה שימוש במודלים כדי לקבוע אם התאמות ומוטציות הקשורות ל-AMR משפיעות על היווצרות ביופילם ופתוגנזה של CAUTI ב-P. mirabilis43,46. מודל שלפוחית השתן במבחנה שימש גם לחקר טיפולים אנטי-מיקרוביאליים חדשים שמטרתם לטפל ב-CAUTI, כולל ציפוי צנתר תרנוסטי שנוסח לאחרונה וטיפולי טיפול בפאג'ים47,48. פרוטוקול זה מקיף את ההגדרה וההפעלה של מודלים של שלפוחית השתן במבחנה, ספירת תאים פלנקטוניים וקשורים לביופילם ברי קיימא מהמודל ומשטח צנתר השתן בהתאמה, ומדידת pH בשתן לניטור ייצור אוראז. פרוטוקולים מפורטים גם להערכת מוצרים אנטי-מיקרוביאליים שמטרתם לטפל או למנוע CAUTI, כולל תמיסות השקיה לשלפוחית השתן וג'ל סיכה אנטי-מיקרוביאלי, הזמינים כיום בשרשרת האספקה של NHS.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ייצוג סכמטי של מערך מודל שלפוחית השתן במבחנה מוצג באיור 1. דגמי שלפוחית השתן במבחנה מתוכננים להיות תואמים לצנתרי פולי סטנדרטיים (המידות המוצגות באיור 1 תואמות לצנתרים צרפתיים בגודל סטנדרטי 14). עקר את כל הציוד מדגם שלפוחית השתן במבחנה , והדק כל צינור סיליקון המשמש למעגל המדיה לפני השימוש. נדרשת הקפדה על הטכניקה האספטית לאורך כל ההתקנה של דגמי מבחנה , ומומלץ להרכיב את הדגם בתנאים סטריליים (כלומר בארון בטיחות מיקרוביאלי מקטגוריה II או קולט אדים למינר). מומלץ מינימום של n = 5 שכפולים כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית לניסויים במודל שלפוחית השתן במבחנה . הפרטים על הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת אמצעי שתן מלאכותי

הערה: אמצעי שתן מלאכותי (AUM) מומלץ לשימוש במודלים של שלפוחית השתן במבחנה בשל הכמויות הגבוהות של המדיה הנדרשת לניסויים, והשונות הקשורה לדגימות שתן אנושיות. פרוטוקול זה מפרט את הכנת AUM כפי שתואר קודם לכן ומותאם לשימוש במודל שלפוחית השתן במבחנה על ידי Nzakizwanayo et al. (כרך סופי של 5 ליטר) 43,45,46,48,53,54.

  1. הכן פתרון AUM 1
    1. שקלו את התרכובות הבאות והוסיפו לבקבוק בורוסיליקט בנפח 1 ליטר מלא ב-850 מ"ל מים נטולי יונים: 3.25 גרם מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl2.6H 2O), 23 גרם נתרן כלורי (NaCl), 11.5 גרם נתרן גופרתי נטול מים (Na2SO4), 3.25 גרם טריסודיום ציטראט (Na3C6H5O7), 0.1 גרם נתרן אוקסלט (Na2C2O4), 14 גרם מונופוטסיום פוספט (KH2PO4), 8 גרם אשלגן כלורי (KCl), 5 גרם אמוניום כלוריד (NH4Cl), 25 גרם ג'לטין ו-5 גרם מרק סויה טריפטון.
  2. תוך כדי ערבוב תמיסת ה-AUM, מדוד את ה-pH באמצעות מד pH והתאם ל-5.75 (± 0.02) על ידי הוספת 3 M NaOH או HCl לפי הצורך.
    הערה: יש להוסיף NaOH/HCl להתאמת pH ל-AUM טיפתית כדי למנוע משקעי מלח מהתמיסה.
  3. לאחר התאמת ה-pH של AUM, מלא את התמיסה לנפח סופי של 1 ליטר במים נטולי יונים ועיקור חיטוי.
    הערה: לאחר סטרילי, ניתן לאחסן את התמיסה עד שלושה חודשים בטמפרטורת החדר (יש להשליך את תמיסת AUM 1 אם נצפים משקעים או עננות).
  4. בנפרד, הכינו תמיסת AUM 2, על ידי הוספת 125 גרם אוריאה (CH4N2O) ו-2.45 גרם סידן כלורי (CaCl2) ל-400 מ"ל מים סטריליים ונטולי יונים בכוס סטרילית של 500 מ"ל.
    הערה: הכנת תמיסת סידן אוריאה 2 מביאה לתגובה אנדותרמית, לכן מומלץ לערבב ולחמם את תמיסת AUM 2 ל-~50 מעלות צלזיוס על פלטה חמה/מערבל מגנטי בזמן שהתרכובות מתמוססות כדי למנוע הקפאה.
  5. לאחר שהאוריאה והסידן הכלורי התמוססו, יש לסנן את תמיסה 2 באמצעות משאבת ואקום ויחידות סינון ניטרוצלולוזה של 0.45 מיקרומטר, לבקבוק זכוכית סטרילי של 500 מ"ל. לאחר העיקור, תמיסה 2 יציבה למשך שלושה חודשים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או חודש בטמפרטורת החדר
    הערה: יש להשליך את תמיסת AUM 2 אם נצפתה משקעים או עננות.
  6. בקולט אדים למינרי או בארון בטיחות מיקרוביולוגי מקטגוריה II, שלב באופן אספטי פתרונות AUM 1 ו-2 עם 3.6 ליטר מים סטריליים נטולי יונים בבקבוק שואב זכוכית סטרילי בנפח 5 ליטר. AUM צריך להיות בצבע צהוב בהיר ושקוף.
  7. בעזרת פיפטה סרולוגית, הסר 50 מ"ל מנפח ה-AUM הכולל והכניס לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, ושמור לשימוש מאוחר יותר.
  8. אטמו את בקבוק השואב בעזרת גומי או נייר אלומיניום והשאירו אותו בטמפרטורת החדר עד להרכבת דגמי מבחנה .
  9. הסר באופן אספטי 10 מ"ל של AUM ממנה של 50 מ"ל ושמור את שאר התמיסה להכנת החיסון. בעזרת מד pH, מדוד את ה-pH של 10 מ"ל AUM aliquot, שאמור להיות ~pH 6.1 (±0.2). AUM מוכן יציב בטמפרטורת החדר למשך כחודש, ויש להשליך אותו אם מתרחשים משקעים או עננות.

2. הגדרת מודל שלפוחית השתן במבחנה

  1. הכנס קטטר פולי לתא הזכוכית המרכזי של מודל שלפוחית השתן במבחנה (סכמטי מפורט באיור 1). אבטח את הקטטר במקומו על ידי ניפוח הבלון עם מזרק המים הסטריליים המצורף, וחבר את שקית הפסולת ליציאת הצנתר.
  2. חבר את מכשיר דגם שלפוחית השתן במבחנה 45 למאגר AUM באמצעות צינורות חיבור. חבר צינורות מעגל מדיה למשאבה הפריסטלטית לפי הוראות היצרן, וודא שלצינור יש מתח מספיק מבלי להימתח.
  3. חבר דגמי שלפוחית השתן במבחנה למעמדי מהדק, ואבטח שקיות פסולת במעמדים מתחת לדגמים כדי להבטיח זרימה דרך הדגמים באמצעות כוח הכבידה.
  4. חברו את החדר החיצוני של מודל שלפוחית השתן לאמבטיית מים במחזור באמצעות צינורות סיליקון (איור 1B). הגדר את אמבט המים לחימום של 37 מעלות צלזיוס והפעל את מחזורי המיכל.
    1. הפעל אמבטיות מים למשך 30 דקות לפני חיסון דגמי שלפוחית השתן במבחנה כדי להבטיח שהטמפרטורה יציבה על 37 מעלות צלזיוס, וודא שאמבט המים נשאר מלא עד למפלס המים המתאים למשך הניסוי.
  5. הסר את כל המהדקים מצינורות המדיה והגדר משאבות פריסטלטיות לפעול במהירות של כ-0.75 מ"ל לדקה כדי לשכפל את ייצור השתן האנושי (~1080 מ"ל ליום). קצבי הזרימה בפועל יחושבו במהלך הניסוי.
  6. הפעל AUM דרך מודלים של שלפוחית השתן במבחנה דרך המשאבה הפריסטלטית למשך 30 דקות לפני החיסון כדי לאשר שזרימת המדיה היא בקצב עקבי ושמערכת הניקוז הסטרילית שלמה.
  7. מסננים את כל המדיה שהצטברה משקית הפסולת לפני הניסוי. ניתן למדוד את נפח המדיה כדי לחשב את קצבי הזרימה המדויקים (מפורט בשלב 4).

3. חיסון של דגמי שלפוחית השתן במבחנה

  1. הכן תרביות לילה למודלים של שלפוחית השתן במבחנה על ידי השעיית לולאה של מושבות חיידקים הגדלות על אגר מוצק לתוך 10 מ"ל של מרק LB. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה.
    הערה: ניתן להשתמש במודל שלפוחית השתן במבחנה כדי לחקור מגוון פתוגנים של CAUTI, כולל זנים חיוביים לאוראז כגון Proteus mirabilis, וניתן לשנות את אמצעי הגידול המשמשים בהתאם.
  2. צנטריפוגה את כל נפח תרבית הלילה ב-4,500 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של AUM ומדדו את הספיגה ב-OD595 ננומטר באמצעות ספקטרומטר.
  3. נרמל את התרביות המושעות ל-OD595 ננומטר של 1.0 ונפח סופי של 10 מ"ל ב-AUM באמצעות המשוואה הבאה:
    figure-protocol-1
    כאשר, A1 הוא הספיגה ב-OD600 ננומטר של תרבית הלילה, A2 הוא הספיגה הרצויה ב-OD600 ננומטר של החיסון (1.0), V2 הוא הנפח הרצוי של החיסון (10 מ"ל), ו-V1 הוא הנפח הנדרש של תרבית לילה לנורמליזציה.
    הערה: 10 מ"ל של תרחיף OD595 ננומטר 1.0 יבטיח שהדגמים מחוסנים בכ-1010 CFU של רוב זני החיידקים (מאומתים עבור Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa ו-Staphylococcus aureus), המשכפלים זיהום מבוסס. ניתן לשנות את החיסון ההתחלתי בהתאם למין המשמש או לשלב ההדבקה המעוצב (כלומר, ניתן להשתמש בצפיפות חיסון נמוכה יותר כדי לדמות זיהום בשלב מוקדם)47.
  4. עקר מודלים של שלפוחית השתן במבחנה באמצעות 70% אתנול והסר את הפקק (כניסת המדיה) כך שהתא הפנימי יהיה נגיש. הסר 10 מ"ל של AUM מהנפח בתוך מודל שלפוחית השתן באמצעות פיפטה סרולוגית.
    הערה: בעת חיסון ודגימה של דגמי מבחנה מהתא המרכזי, ודא שהעבודה מהירה ואספטית, ללבוש תמיד PPE מתאים ולטהר באופן קבוע כפפות ומשטחים עם 70% אתנול.
  5. חסנו את דגמי שלפוחית השתן במבחנה דרך החדר המרכזי באמצעות כל התרחיף המנורמל של 10 מ"ל וערבבו היטב עם פיפטה סרולוגית. הסר 10 מ"ל מהתא המרכזי של דגמי שלפוחית השתן במבחנה באמצעות פיפטה סרולוגית ואליקוט לאוניברסלי של 15 מ"ל לחישובי CFU/mL מאוחרים יותר ומדידת pH.
  6. יש לטהר היטב את המשטחים החיצוניים של דגם שלפוחית השתן והבאנג עם 70% אתנול, ולהחליף את הפקק. המשך את זרימת המדיה לזמן קצר כדי להבטיח שרמת ה-AUM בתא המרכזי תגיע לחור העין, לפני הפסקת הזרימה.
  7. אפשר לתרביות להתבסס במודל שלפוחית השתן למשך שעה אחת לפני הפעלת זרימת המדיה דרך המשאבה הפריסטלטית ב-~0.75 מ"ל/דקה.
  8. בזמן שהחיסון מתבסס, הכינו דילולים מהדגימה שנלקחה מהתא המרכזי.
    1. יש לדלל באופן סדרתי 100 מיקרוליטר של דגימה ב-900 מיקרוליטר של PBS סטרילי עד שהדגימה מדוללת ל-10-7. צלחת 10 מיקרוליטר כתמים של הדילולים בשלוש פעמים על מצע מוצק מתאים, ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    2. לאחר הדגירה, ספרו את המושבות על כל צלחת דילול וחשבו את ה-CFU/mL המדויק של החיסון הראשוני.
      הערה: אם אתם משתמשים במינים שמתרוצצים, כלומר Proteus mirabilis, השתמשו באגר MacConkey ללא מלח (פפטון 20.0 גרם/ליטר, לקטוז 10.0 גרם/ליטר, מלחי מרה 5.0 גרם/ליטר, אדום ניטרלי 0.075 גרם/ליטר ואגר 12.0 גרם/ליטר) כדי להבטיח שמושבות בודדות עדיין נראות לעין כדי להקל על הספירה.
  9. לאחר הדגירה של שעה אחת, הפעל את זרימת המדיה דרך המשאבה הפריסטלטית כדי להתחיל לפעול בדגמי שלפוחית השתן במבחנה , תוך ציון הזמן בו הדגמים מופעלים.

4. חישוב קצב זרימה של מודל שלפוחית השתן במבחנה

  1. לאחר חיסון המודלים במבחנה והחלת זרימת המדיה, אפשר לדגמים לפעול במשך 4 שעות. השהה לזמן קצר את זרימת המדיה ואסוף את כל נפח ה-AUM הנותר משקית האשפה בבקבוק נפחי דרך יציאת הניקוז. שים לב לנפח שנאסף.
    הערה: ניתן לחשב את קצב הזרימה מנפח המדיה שנאספה בשלב 2.7., אולם ניתן להשיג קצבי זרימה מדויקים יותר על ידי הפעלת מודלים למשך זמן רב יותר (כלומר, מומלץ 4 שעות) מכיוון שהדבר מפחית את הסבירות לשאריות אוויר בצינורות מעגל המדיה המשפיעות על קצב הזרימה המחושב.
  2. המשך את זרימת המדיה דרך המשאבה הפריסטלטית, וודא שיציאת הניקוז של שקית האשפה סגורה, כדי לשמור על מערכת ניקוז סטרילית.
  3. כדי לחשב את קצב הזרימה בפועל של מודלים במבחנה , השתמש במשוואה הבאה:
    figure-protocol-2
    הערה: מומלץ להשתמש בקצבי זרימה בטווח של 0.55-1.0 מ"ל/דקה כדי לשכפל את ייצור השתן האנושי.
  4. אם קצב זרימת המדיה מחושב מחוץ לטווח המקובל, השלך את השכפול והתאם את הסל"ד במשאבה הפריסטלטית כך שיתאים לטווח המקובל.

5. דגימת תאים פלנקטוניים ממודל שלפוחית השתן במבחנה

הערה: יש לדגום מודלים של שלפוחית השתן במבחנה באופן שגרתי במהלך הניסויים כדי לנטר את הדינמיקה של האוכלוסייה. יש לדגום את כל הדגמים מיד לאחר החיסון, בנקודת הפעלת זרימת ה-AUM, 4 שעות לאחר החיסון (כאשר מחושב קצב הזרימה), ובנקודה, המודלים מסתיימים (או חסימה או נקודת קצה שנקבעה מראש). אם מריצים דגמים במשך >24 שעות, מומלץ לקחת דגימות כל 24 שעות כדי לנטר CFU/מ"ל, וניתן לקחת דגימות נוספות לפי דרישת המשתמשים.

  1. טהר את פקק דגם שלפוחית השתן ב-70% אתנול והסר אותו כדי לגשת לתא המרכזי.
  2. הימנע מקצה הקטטר והבלון, ערבב בעדינות את תכולת התא המרכזי באמצעות פיפטה סרולוגית.
  3. בעזרת פיפטה סרולוגית, הוציאו דגימה של 10 מ"ל מהתא והעבירו אותה לצינור סטרילי. יש לטהר מיד את הפקק ב-70% אתנול ולהחליף, להשלים את מעגל הניקוז הסטרילי והסגור.
  4. הסר 1 מ"ל מהדגימה באמצעות פיפטה, והכניס לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל לדילולים סדרתיים.
  5. מדוד את ה-pH של הדגימה הנותרת באמצעות מד pH, וודא שהדגימה מעורבבת היטב, ומד ה-pH מכויל לפני השימוש.
  6. יש לדלל באופן סדרתי את הכמות השמורה של 1 מ"ל מהדגימה, ולצלחת על מדיה מוצקה מתאימה כמתואר קודם לכן בשלב 3.8., תוך ציפוי כל הדילול.
    הערה: דגימות פלנקטוניות שנלקחו ממודל שלפוחית השתן מתאימות לניתוחים אחרים, כולל יישומים גנומיים או ביולוגיה מולקולרית (אופציונלי).

6. דגימת תאים הקשורים לביופילם ממודל שלפוחית השתן במבחנה

  1. הוצאת קטטר והכנתו
    הערה: דגימת ביופילם של מודלים של שלפוחית השתן במבחנה היא ניתוח נקודת קצה, הדורש השבתה של מודלים והסרת צנתרים לעיבוד.
    1. נתקו את שקית האשפה מהקטט ורוקנו את שאריות השתן מהדגם על ידי ניפוח הבלון. הסר את הקטטר מתחתית הדגם באמצעות מלקחיים סטריליים.
    2. הנח את הקטטר שהוסר על לוח סטרילי, ובעזרת אזמל סטרילי, חתוך את הקטטר בנקודות הנדרשות לחיתוך (מתואר באיור 2).
    3. ודא שקטעי הצנתר נחתכים לאורכם כדי לחשוף את הלומן; לאחר מכן, בעזרת מלקחיים סטריליים, טבלו את קטע הקטטר 3 פעמים ב-PBS סטרילי כדי להסיר תאים שאינם נצמדים.
      הערה: אם הדמיית קטעי קטטר במורד הזרם, כלומר באמצעות SEM, השאר חלקים של 1 ס"מ שלמים (אין לחתוך לאורך) ובמקום זאת הסר עודף לחות מהלומן בעזרת מגבת נייר סטרילית לפני הקיבוע.
  2. שיבוש ביופילם לספירת CFU/mL
    הערה: פרוטוקולים המפרטים את השיבוש של תאים הקשורים לביופילם עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת אם הביופילמים הם גבישיים או ריריים באופן נרחב.
    1. יש לדגור את קטע הצנתר המוכן ב-0.25% טריפסין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. נפח הטריפסין המשמש צריך להיות המינימום הנדרש לכיסוי הצנתר; למשל, עבור קטע קטטר של 1 ס"מ שנחתך בניצב, מספיק 1 מ"ל של 0.25% טריפסין.
    2. לאחר הדגירה, סוניקציה של התמיסה המכילה את הקטטר למשך 10 דקות. לאחר מכן ניתן להסיר את קטע הצנתר ולזרוק אותו. כדי לנטרל את הטריפסין, יש לדלל מיד את תמיסת התא ב-PBS סטרילי ולצבוע אותו לספירת CFU על מדיה מוצקה מתאימה, כפי שתואר קודם לכן בשלב 3.8.
  3. כימות ביופילם צנתר באמצעות צביעת קריסטל סגול
    1. הוסף את חלקי הצנתר המוכנים לבארות בצלחת באר בעלת תחתית שטוחה בגודל מתאים. השתמש בנפח מתאים של תמיסת סגול קריסטל של 0.1% כדי לטבול לחלוטין את קטע הצנתר, ולדגור באופן סטטי בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. ודא שמקטע צנתר סטרילי כלול גם כבקרת רקע.
    2. הסר את חלקי הקטטר מהצלחת והעביר לצלחת חדשה. שטפו כל קטע קטטר פעמיים במים מזוקקים.
    3. לאחר השטיפה מעבירים קטעי קטטר לצלחת חדשה, ומכסים בחומצה אצטית 33%. דוגרים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. הסר את קטע הצנתר מהצלחת, ולאחר מכן, באמצעות קורא צלחות, מדוד OD595 ננומטר עבור כל שכפול, תוך שימוש בבארות שהכילו את חלקי הצנתר הסטריליים כפקדי רקע.

7. בדיקת רגישות מיקרוביאלית במודל שלפוחית השתן במבחנה

הערה: רוב הטיפולים שמטרתם לשלוט בדלקת בדרכי השתן הקשורה לצנתר תואמים לצנתרי פולי סטנדרטיים, בדוק תאימות לפני תחילת ניסויים במודל שלפוחית השתן במבחנה .

  1. ג'ל סיכה אנטי מיקרוביאלי
    הערה: כדי לדמות את השימוש בחומרי סיכה בעת החדרת הצנתר, יש לבצע שלב זה במהלך שלב 2.1, מיד לפני החדרת קטטר פולי. לאחר הכנסת הקטטר, יש לחבר את הדגם מיד, ושלב 2.6. יש להשמיט כדי שהג'ל לא ידולל ויתנקז לפני החיסון. החיסון צריך להתבצע באותו יום עם החדרת הצנתר. חומרי סיכה המיועדים לשימוש עם צנתרים נארזים כמזרקים בודדים, סטריליים, חד פעמיים בנפח של 6 מ"ל או 11 מ"ל. כ-5 מ"ל של חומר סיכה מספיקים כדי למלא גם את הצוואר של דגם שלפוחית השתן וגם לצפות את בסיס הדגם.
    1. בטכניקה אספטית, הכנס את קצה המזרק המכיל את חומר הסיכה לצוואר דגם שלפוחית השתן, והכנס 5 מ"ל ג'ל למילוי הצוואר וכניסה לבסיס החדר.
    2. סובב את הדגם כך שהבסיס יהיה מצופה באופן שווה בג'ל, ולאחר מכן הכנס קטטר פולי לדגם על ידי דחיפת קצה הקטטר דרך הג'ל ואבטח על ידי מילוי הבלון כרגיל.
    3. חבר את הדגם לשאר ההתקנה, ולאחר מכן מלא את לומן הדגם בשתן עד שהוא מתחיל להתנקז. ברגע שהשתן מתחיל להתנקז דרך חור העין של הצנתר, עצור את המשאבה כדי למנוע אובדן ג'ל לפני החיסון.
      1. דגרו מודלים למשך 30 דקות כדי לאפשר לשתן להגיע ל-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן חסנו מודלים כמתואר קודם כדי להבטיח אחידות של זמן הדיפוזיה של רכיבי הג'ל לנפח השתן.
    4. חסנו את המודל כמתואר בשלב 3.5 והשאירו אותו לדגור למשך שעה אחת לפני הפעלת משאבות פריסטלטיות. בנקודת הפעלת המשאבה, קח דגימה פלנקטונית של 1 מ"ל וצלח דילולים לספירת CFU כמתואר בשלב 3.8.
  2. פתרונות השקיה
    הערה: פתרונות השקיה זמינים לרוב בכמויות גדולות או כ"שקיות" בודדות, סטריליות לשימוש חד פעמי. אם אתה משתמש בתמיסות בודדות, ודא שהם תואמים ליציאות הניקוז של הצנתרים שישמשו לפני הניסוי. אם אתה משתמש בתמיסות השקיה בתפזורת, ודא שנעשה שימוש בצנתרים בעלי שלושה לומן, ויש לעקוב אחר הוראות היצרן כדי לקבוע נפח/מסגרת זמן של מתן המוצר.
    1. לפני הטיפול, הפעל מודלים במבחנה למשך 4 שעות לפחות כדי להבטיח שלקהילות הקשורות לביופילם היה מספיק זמן להתבסס. לאחר שהדגמים פעלו במשך 4 שעות, השהה את זרימת המדיה וקח דגימת טיפול מקדים מהתא הפנימי של דגמי המבחנה , כמפורט בשלב 5.
      הערה: אם אתה משתמש בתמיסות השקיה בתפזורת, המשך לשלב 7.2.5.
    2. אם אתה משתמש ב"שקית" השקיה אישית, נתק את שקית הפסולת מהקטטר והשתמש במכסה המצורף לשקית כדי לאטום את שקית האשפה. חבר מיד את שקית תמיסת ההשקיה לקטטר, ובעזרת לחץ קל, סחט את המוצר לתוך הלומן המרכזי. יש למרוח בהתאם להוראות היצרן (כלומר, 15 דקות שימוש).
    3. לאחר השלמת הטיפול המומלץ, אפשר לתמיסה הנותרת להתנקז מהתא הפנימי דרך חור עין הצנתר לתוך שקית ההשקיה, ולאחר מכן נתק את השקית. ניתן להשליך את תכולת השקית הנותרת או להשתמש בה ליישומים נוספים במורד הזרם.
    4. עקר את יציאת ניקוז הצנתר ואת יציאת חיבור שקית האשפה עם 70% אתנול, וחבר אותם מחדש, תוך השלמת מערכת ניקוז סטרילית וסגורה.
      הערה: המשך לשלב 7.2.7 אם אתה משתמש בשקיות השקיה.
    5. אם משתמשים בצנתר משולש לומן, יש לחטא את פתח לומן ההשקיה עם אתנול 70%, ולהתחיל מיד להשקות באמצעות מזרק סטרילי לפי הוראות היצרן.
      הערה: מדוד את נפח השתן הנותר בשקית הפסולת לפני ההשקיה כך שניתן יהיה להסביר זאת בכל זמן סתימה במורד הזרם או חישובי קצב זרימה.
    6. לאחר השלמת ההשקיה, השליכו את המזרק ואת כל שאריות תמיסת ההשקיה שנותרו בשקית האשפה.
    7. קח דגימה לאחר הטיפול מהתא המרכזי של מודל שלפוחית השתן במבחנה , כמפורט בשלב 5, והמשך את זרימת ה-AUM דרך המשאבה הפריסטלטית כדי להמשיך בניסוי.

8. סיום ניסויים במודל שלפוחית השתן במבחנה

הערה: אורגניזמים חיוביים לאוראז כגון P. mirabilis יכולים לגרום לחסימה של צנתרי שתן באמצעות היווצרות ביופילם גבישי. חסימה יכולה לשמש אפוא כנקודת קצה רלוונטית מבחינה ביולוגית עבור מודלים של שלפוחית השתן במבחנה , והיא מזוהה באופן גלוי על ידי חסימה מוחלטת של חורי העיניים בצנתר עם ביופילמים גבישיים ועלייה בנפח ה-AUM בתא המרכזי של "שלפוחית השתן" של הזכוכית (איור 3).

  1. לאחר שמודלים של שלפוחית השתן במבחנה רצו לנקודת הקצה שנקבעה מראש, שעשויה להיות חסימה או זמן ריצה מוגדר, כבה את זרימת ה-AUM דרך המשאבה הפריסטלטית וקח דגימת נקודת קצה מהתא המרכזי כמתואר בשלב 5.
  2. כבה את זרימת אמבט המים ונתק את מעגל המדיה וצינורות מעגל אמבט המים מדגמי שלפוחית השתן במבחנה .
  3. הסר פקקים מדגמי שלפוחית השתן במבחנה , והסר את כל נפח שאריות השתן באמצעות פיפטה סרולוגית. השליכו כל מדיה מזוהמת כראוי (כלומר, חיטוי חיטוי).
  4. רוקנו את שקיות האשפה והשליכו את כל שאריות המדיה. נתק שקיות פסולת קטטר מיציאת הצנתר והשליך אותן.
  5. בעזרת מזרק, רוקנו לאט בלוני קטטר לפני הסרת צנתרים מדגמים.
    הערה: אם משתמשים במיני חיידקים חיוביים לאוראז, צנתרים עלולים "להיתקע" לקירות הזכוכית של דגמי מבחנה . הימנע מהפעלת כמויות גדולות של כוח על צנתרים, ובמקום זאת, המשך לשלב 8.6.
  6. יש להשרות דגמי מבחנה בתמיסת ניקוי אנטי-מיקרוביאלית של 5% (ראו טבלת חומרים) למשך הלילה, ולאחר מכן לשטוף היטב במים כדי להבטיח הסרת שאריות חומר חיטוי. חיטוי לעיקור.
    הערה: אם משתמשים במינים חיוביים לאוראז, הוסף 5% w/v חומצת לימון לתמיסת החיטוי כדי לסייע בהמסת כל ביו-מינרליזציה בתא המרכזי. תמיסה חומצית זו גם תעזור לשחרר את כל הצנתרים שנדבקו למודלים על ידי פירוק משקעי ביופילם גבישי.
  7. נתק את צינורות מעגל המדיה ממאגר ה-AUM והשליך את כל שאריות המדיה. שטפו את הצינורות במים כדי להסיר שאריות AUM וחיטוי.
  8. כדי לחשב את זמן החסימה המדויק, שימו לב לנפח הסופי בשקית האשפה והשתמשו במשוואה בשלב 4.4 ובקצב הזרימה שחושב בעבר כדי לקבוע את זמן החסימה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פעולה מוצלחת של מודל שלפוחית השתן במבחנה תלויה בתרגול טכניקה אספטית טובה והתבוננות קפדנית בעכירות המדיה לאורך כל הניסויים (איור 3). לפני החיסון, AUM סטרילי היה בצבע צהוב חיוור ושקוף בתא המרכזי של מודל שלפוחית השתן במבחנה (איור 3A). AUM במאגר המדיה צריך להישאר ברור לאורך כל הניסוי, שכן כל שינוי עכירות שמתרחש עשוי להצביע על משקעים של מלחים מהתמיסה, או זיהום של המדיה. אם AUM במאגר המדיה או בצינורות מעגל המדיה הופך להיות עכור או מראה שינוי דרסטי בצבע, יש להשליך את השכפולים ולחזור עליהם. לאחר החיסון, עלייה בעכירות של ה-AUM בחדר המרכזי של מודל שלפוחית השתן במבחנה נראית בבירור (איור 3B). שינויים בעכירות הם לרוב בולטים יותר באורגניזמים חיוביים לאוראז כגון P. mirabilis, אך עדיין אמורים להיות גלויים לאחר החיסון באורגניזמים שליליים לאוראז. לאחר תחילת זרימת AUM, לעתים קרובות נצפית ירידה בעכירות AUM כאשר תאים פלנקטוניים נשטפים החוצה, ואינה מעידה על מחסור בתאים ברי קיימא במודל. התבוננות ברמת המדיה בתא המרכזי יכולה לשמש גם לקביעת זמן החסימה אם משתמשים באורגניזמים חיוביים לאוראז (איור 3C). כאשר הדגמים פועלים, חור העין והקצה של הצנתר צריכים להיות גלויים לחלוטין כדי להצביע על ניקוז תקין לשקיות האשפה. עם החסימה, רמת ה-AUM בתא המרכזי תעלה מעל חורי העיניים והקצה של הצנתר, מה שמצביע על כך שהניסוי מוכן לכל קריאות וסיום נקודות קצה. במהלך ניסויים, השפעות לחץ במעגל המדיה של מודל שלפוחית השתן במבחנה יכולות לגרום לדגמים להיראות חסומים. אם יש חשד לסתימה, בדוק שמעגל ה-AUM, הצנתר וצינורות שקית האשפה מתוחים לפני סיום הבדיקה, שכן כל בועות אוויר או קיפולים פוטנציאליים בצינור עלולים לגרום ל"נעילת אוויר" ולמנוע את ניקוז הצנתר.

במהלך ניסויים במודל שלפוחית השתן במבחנה , דגימה פלנקטונית יכולה לספק תובנה חשובה לגבי דינמיקת הצמיחה בתוך המודל כמו גם התקדמות CAUTI. ניתן לנטר את צמיחת התאים, ה-pH והיווצרות הביופילם במהלך הניסויים מבלי לדרוש סיום של מודלים (איור 4). אם משתמשים באורגניזמים חיוביים לאוראז, חישובי זמן חסימה יכולים לשמש כמדד לקצב היווצרות הביופילם ולהשתמש בהם כדי להשוות את המאפיינים של זני חיידקים שונים (איור 4). השוואה בין זן מסוג פרא של P. mirabilis ומוטנט LPS (החדרת mini-tn5 ל-waaC) הדגימה הארכת זמן לחסימה ובכך הפחיתה את היווצרות הביופילם במוטציה (איור 4). אורגניזמים שליליים לאוראז אינם חוסמים בדרך כלל מודלים של שלפוחית השתן במבחנה , ולכן מומלץ לקבוע נקודת קצה מוגדרת לפני הניסוי. במקרים מסוימים, אורגניזמים שליליים לאוראז עלולים לגרום לחסימת צנתר. לדוגמה, זנים שליליים לאוראז של Klebsiella pneumoniae יכולים לייצר ביופילמים נרחבים וריריים, עם זאת, אלה בדרך כלל לוקחים הרבה יותר זמן מביופילמים חיוביים לאוראז כדי לחסום את הניקוז, כך שעדיין מומלץ לקבוע נקודת קצה מוגדרת.

מדידת pH לאורך ניסויים במודל שלפוחית השתן יכולה גם לספק תובנה לגבי ההבדלים בין מתח למתח, כמו גם ההתקדמות של CAUTI. אם נעשה שימוש באורגניזמים שליליים לאוראז, ה-pH בתא המרכזי של מודל שלפוחית השתן במבחנה אמור להישאר יציב במידה רבה לאורך כל הניסוי, אם כי צפויות תנודות קטנות ב-pH ככל שהדינמיקה של האוכלוסייה משתנה במהלך הניסוי. חיסון של מודלים במבחנה עם אורגניזמים חיוביים לאוראז מביא לעלייה משמעותית ב-pH לאורך זמן, כאשר ה-pH הגבוה ביותר נצפה בדרך כלל בזמן החסימה, שם ניתן לצפות בקריאות pH גבוהות עד ~8-9 (איור 4B).

ספירה של CFU/mL פלנקטוניים היא מרכיב חשוב במודלים של שלפוחית השתן במבחנה , המאפשרת למפעילים להעריך אם החיסון הצליח ולעקוב אחר התקדמות הניסויים. מדידת CFU/mL בסוף הניסוי יכולה להדגיש את כל ההבדלים בקולוניזציה של שלפוחית השתן בין זני חיידקים שונים. כאשר משווים את הזן המוטנטי mini-Tn5 של P. mirabilis לסוג הבר, נצפתה ירידה משמעותית ב-CFU/mL בזמן החסימה (איור 4C). יתר על כן, ספירה של CFUs מביופילמים על פני הצנתר, וכימות ביומסה של ביופילם יכולים לספק תובנה לגבי יכולתם של פתוגנים שונים ליישב את דרכי השתן המצונתרות. כתמי קריסטל סגול שימשו לקביעת הבדלים בהיווצרות ביופילם בין זן P. mirabilis HI4320 מסוג בר לבין מבודדים שעברו בכלורהקסידין (איור 5). מדידות צפיפות אופטיות ב-595 ננומטר הראו כי מבודדים שעברו בכלורהקסידין הראו ירידה בהיווצרות ביופילם בהשוואה לסוג הבר ובקרות שעברו בהיעדר כלורהקסידין.

מכיוון שמטרת מודל שלפוחית השתן במבחנה היא לשכפל במדויק את נישת CAUTI, ניתן להשתמש במודלים גם כדי לחקור את ההשפעות של טיפולים אנטי-מיקרוביאליים שמטרתם לטפל ב-CAUTI בסביבה רלוונטית מבחינה קלינית. עבור אורגניזמים חיוביים לאוראז, השוואת זמני החסימה של מודלים מטופלים עם מודלים לא מטופלים יכולה לספק תובנה שימושית לגבי יעילות הטיפול. טיפול במודלים של שלפוחית השתן במבחנה שחוסנו ב-P. mirabilis בתמיסת השקיית שלפוחית השתן כלורהקסידין 0.02% האריך משמעותית את זמן החסימה בהשוואה למודלים שלא טופלו או טופלו בתמיסת מלח של 0.9% (איור 6A). יתר על כן, ניתן להשתמש במודל שלפוחית השתן במבחנה כדי לחקור את הפעילות החיידקית של טיפולים אנטי-מיקרוביאליים. ניטור שינויים ב-CFU/mL של תאים פלנקטוניים וקשורים לביופילם לאחר טיפול אנטי-מיקרוביאלי יכול להצביע על יעילותם של הטיפולים. טיפול במודלים של שלפוחית השתן במבחנה שחוסנו ב-P. mirabilis הראה ירידה של >7 לוג ב-CFU/mL פלנקטוניים מיד לאחר הטיפול, בהשוואה למודלים לא מטופלים ו-0.9% מושקים במי מלח כאשר מיושמים לפי הוראות היצרן (איור 6B).

figure-results-1
איור 1: סכמטי של המרכיבים העיקריים של מודל שלפוחית השתן במבחנה . (א) דגם שלפוחית השתן (מערכת ניקוז סגורה): (1) תא זכוכית בעל דופן כפולה המדמה את כניסת המדיה של שלפוחית השתן (2) כניסת מדיה, AU מסופק באמצעות משאבה פריסטלטית לתא הפנימי של שלפוחית השתן (3) כניסת מים המסופקת דרך אמבט מים במחזור לתא החיצוני (4) יציאת מים (5) צנתר פולי, מוכנס לתא הפנימי (6) נקודת חיבור לומן ניקוז; נקודת חיבור לשקית אשפה/שקיות השקיה (7) שקית ניקוז האוספת את יציאת השתן. (B) סכמטי המתאר את ההגדרה של מודל שלפוחית השתן במבחנה וכיוון זרימת המדיה והמים דרך המודל. שתן מלאכותי מאוחסן במאגר מדיה (1) בטמפרטורת החדר ומסופק לדגם באמצעות משאבה פריסטלטית (2) בקצב זרימה קבוע של ~ 0.75 מ"ל דקה-1 למשך הניסוי. המדיה זורמת לתוך החדר המרכזי של כלי הזכוכית בעל הדופן הכפולה המייצגת את שלפוחית השתן (3) ומתנקזת החוצה דרך חור העין של קטטר פולי (4) לתוך שקית ניקוז (5), ומשלימה את מערכת הניקוז הסגורה והסטרילית. דגם שלפוחית השתן במבחנה נשמר בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים במחזור (6), הזורם דרך החדר החיצוני של כלי הזכוכית בעל הדופן הכפולה. קווים מקווקווים מייצגים צינורות סיליקון וחצים מייצגים את כיוון הזרימה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: חתך של צנתרי שתן לעיבוד תאים הקשורים לביופילם. נקודות לדוגמה על קטטר שתן לדיסקציה לכימות ביופילם במורד הזרם. (A) צנתרים נחתכים תחילה באופן רוחבי באזור 8 ס"מ הפרוקסימלי לקצה/חורי העיניים (שם נצפית רוב היווצרות הביופילם). קטעים של 1 ס"מ מוסרים בעזרת אזמל, בדרך כלל נמנעים מהאזור המכיל את בלון הצנתר המנופח עקב קשיים בעיבוד השחזור (1-3). (B) ברגע שהצנתרים נחתכים בתחילה לחתיכות של 1 ס"מ, חתך אורכי נוסף נעשה במורד הלומן המרכזי כדי לחשוף כל ביופילם שקיים לכימות ביופילם נוסף, כלומר, ספירת CFU/mL של צביעה סגולה קריסטלית. קווים מקווקווים מייצגים נקודות חיתוך. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: שלבים של ניסוי מודל שלפוחית השתן במבחנה . תמונות של התא המרכזי של מודל שלפוחית השתן במבחנה , לאורך שלבים שונים של הניסוי. (A) AUM בתא המרכזי של מודל שלפוחית השתן במבחנה לפני החיסון. המדיה בתא המרכזי שקופה לחלוטין, מה שמעיד על עיקור מוצלח, וקצה הצנתר וחורי העיניים נראים מעל קו המדיה, מה שמעיד על ניקוז הצנתר בהצלחה. (B) מדיה בחדר המרכזי של מודל שלפוחית השתן במבחנה לאחר חיסון עם P. mirabilis (4 שעות לאחר החיסון). חיסון מוצלח מסומן על ידי העכירות המוגברת של המדיה. הנראות של קצה הצנתר וחורי העיניים מצביעים על כך ש-AUM מתנקז בהצלחה דרך הצנתר, ולא התרחשה סתימה. (C) דוגמה למודל של שלפוחית השתן חסומה במבחנה . חיסון עם P. mirabilis והיווצרות הביופילם והמינרליזציה שלאחר מכן גרמו לחסימה של חורי העיניים של הצנתר, מונעים ניקוז וגורמים לרמת המדיה בתא המרכזי לעלות מעל קצה הצנתר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: מדידות נקודת קצה עבור מודל שלפוחית השתן במבחנה פועלות עד לחסימה. דוגמה למדידות נקודת קצה בזמן החסימה ממודל שלפוחית השתן במבחנה שחוסן בזן קליני של P. mirabilis, RS47 (WT), וזן מוטנטי עם היווצרות ביופילם מוחלש, RS47-2 (מוטנט). (A) זמן חסימה (h) של WT וזנים מוטנטיים של P. mirabilis. (B) pH של מודלים של שלפוחית השתן במבחנה בזמן החסימה. (C) CFU/mL של תאים פלנקטוניים בתא מודל שלפוחית השתן במבחנה בזמן החסימה. כל הנתונים מייצגים את הממוצע של חמישה שכפולים ביולוגיים. קווי שגיאה מציגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). *עמ ' ≤ 0.05; **עמ' ≤ 0.01. נתון זה שונה מ-Clarke et al.46. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: מדידות תאים הקשורים לביופילם ממודל שלפוחית השתן במבחנה . כימות היווצרות ביופילם של P. mirabilis , השוואת זן HI4320 מסוג בר לאוכלוסיות מותאמות שעברו עם או בלי כלורהקסידין (CHD) באמצעות צביעה סגולה קריסטלית ומדידת צפיפות אופטית (OD) ב-595 ננומטר. משקל: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: בקרות מעבר ללא חשיפה ל-CHD; 2, 4, 6: HI4320 עבר ב-4 מיקרוגרם/מ"ל CHD. כל הנתונים מייצגים את הממוצע של חמישה שכפולים ביולוגיים. קווי שגיאה מראים SEM. *p ≤ 0.05; **עמ' ≤ 0.01. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: מדידות ממודלים של שלפוחית השתן במבחנה לאחר טיפול אנטי-מיקרוביאלי. דגימות פלנקטוניות נלקחו ממודל שלפוחית השתן במבחנה שחוסן ב-P. mirabilis, לאחר השקיה בתמיסה אנטי-מיקרוביאלית של כלורהקסידין 0.02% (100 מ"ל) או בקרת מי מלח של 0.9%. (A) זמן חסימה של מודלים של שלפוחית השתן במבחנה לאחר השקיה. (B) CFU/מ"ל פלנקטוניים מיד לאחר טיפול בהשקיה. כל הנתונים מייצגים את הממוצע של חמישה שכפולים ביולוגיים. קווי שגיאה מראים SEM. *p ≤ 0.05; **עמ' ≤ 0.01; *עמ ' ≤ 0.0001. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דרכי השתן המצונתות מייצגות נישה ביולוגית מורכבת שיכולה להיות מאתגרת לשכפול בסביבת מעבדה. מודל שלפוחית השתן במבחנה תוכנן לצורך הדמיית CAUTI, ומשתמש בצנתרי שתן סטנדרטיים כדי לשכפל את מערכת הניקוז הסטרילית והסגורה המשמשת בפרקטיקה הקלינית. דרכי השתן המצונתות רגישות מאוד לזיהום, כפי שמעידים צנתרי שתן שהם גורם הסיכון הגדול ביותר להתפתחות CAUTI 6,55. בהתאם, טכניקה אספטית זהירה היא קריטית להצלחת ריצה במודלים של שלפוחית השתן במבחנה. עכירות של AUM היא אינדיקטור ברור לסטריליות, מכיוון שמדיה מזוהמת או שפג תוקפה תהפוך לעכורה עם הזמן, ותחייב את השלכת כל השכפולים. יש להשתמש בטכניקה אספטית זהירה גם בעת חיסון ודגימה של מודל שלפוחית השתן במבחנה, שכן פתיחת החדר המרכזי להוספת החיסון המוכן שוברת את מערכת הניקוז הסטרילית והסגורה, מה שהופך את מודל שלפוחית השתן במבחנה לרגיש לזיהום. כדי למנוע זיהום של החדר המרכזי, ניתן להשתמש בצנתרים בעלי שלושה לומן כדי לדגום את אוכלוסיית התאים הפלנקטוניים (על ידי הידוק לומן הפסולת וניקוז דרך הלומן הנוסף). שטיפה מסוימת צפויה בנקודת הזמן של 4 שעות, אך ייתכן שיידרש פתרון בעיות אם לא נמנו תאים פלנקטוניים ברי קיימא בשלב זה. אם לא נספרים תאים ברי קיימא לאחר 4 שעות, ייתכן שיהיה צורך לבצע אופטימיזציה של צפיפות החיסון או ניסוח AUM כדי לתמוך טוב יותר בהתיישבות חיידקים. בנוסף, שטיפת חיסון עשויה להצביע על בעיה במעגל המדיה; קיפולים בתוך הצינור עלולים למנוע ניקוז נאות, וכתוצאה מכך הצטברות של מטבוליטים רעילים שעלולים לעכב את צמיחת החיידקים, בעוד שכל חומר חיטוי שיורי המשמש לשטיפה דרך צינורות מדיה עלול להיות בעל השפעה חיידקית.

פרוטוקול זה מפרט את הכנת AUM כפי שתואר בעבר על ידי Nzakizwanayo et al., שכן הוא אומת בעבר לשימוש במודל שלפוחית השתן במבחנה עם פתוגנים בולטים של CAUTI, כולל Proteus mirabilis ו-Escherichia coli 43,45,46,48 . עם זאת, יש מקום לשנות את ניסוח ה-AUM המשמש בפרוטוקול כדי לבחור לצמיחה של פתוגנים אחרים. ניסוחים רבים ומגוונים של AUM פורסמו ובמקום זאת ניתן להשתמש בהם במעגל המדיה 28,56,57,58,59,60. בנוסף, ניתן להשלים AUM במאגר המדיה עם חומרים מזינים או אנטיביוטיקה כדי לבחור לצמיחה של פתוגנים ספציפיים. מבחינה היסטורית, מודלים של שלפוחית השתן במבחנה סופקו גם עם שתן אנושי מאוחד, עם זאת, הכמויות הגדולות של המדיה הנדרשות להפעלת שכפול מודל שלפוחית השתן במבחנה יכולות להפוך את איסוף הדגימות האנושיות לבלתי מעשי53,54. יתר על כן, הרכב השתן האנושי יכול להשתנות מאוד בין דגימות המטופלים, מה שמשפיע על שחזור הניסוי, שכן הבדלים בריכוז ההורמונים, המלחים והחלבונים כמו גם מצב ההידרציה, הוכחו כמשפיעים על צמיחת חיידקים והיווצרות ביופילם 38,39,61,62.

הפרוטוקול לעיל מפרט את החיסון של מודל שלפוחית השתן במבחנה עם ~1010 CFU/mL המשכפל CAUTI בשלב מאוחר. עם זאת, ניתן לשנות את אתר החיסון של מודל שלפוחית השתן במבחנה במבחנים עתידיים כדי לשכפל טוב יותר את השלבים המוקדמים יותר של CAUTI, כלומר, קולוניזציה ראשונית של קטטר השתן ועלייה לשלפוחית השתן. זיהום ידני של צנתרי פולי בחיסון חיידקי ידוע לפני ההתקנה של מודלים במבחנה יכול לספק תובנה לגבי השלבים המוקדמים של CAUTI. ואכן, צפיפות החיסון שונתה בעבודות קודמות כדי לשכפל זיהום בשלב מוקדם יותר; לדוגמה, Nzakizwanayo et al. מחוסנים בדגמי שלפוחית השתן במבחנה עם CFU/mL התחלתי נמוך יותר (ca. 103 CFU/mL) כדי לשכפל זיהום בשלב מוקדם יותר47. עם זאת, ראוי לציין כי שינוי צפיפות החיסון עלול לגרום לזמן ממושך לחסימה ודורש אימות נוסף לפני הניסוי.

בנוסף, בעוד שהפרוטוקול מפרט חיסון של מודל המבחנה במונוקולטורה חיידקית, יש מקום לחסן מודלים עם פתוגנים פטרייתיים. עבודות קודמות הציעו כי עד 8% מה-CAUTIs נובעים מזיהום ב-Candida spp., המסוגלים לייצר ביופילמים שלעתים קרובות אינם ניתנים לטיפול אנטי-פטרייתי27,63. יתר על כן, ניתן לשנות את מודל שלפוחית השתן במבחנה כדי להתאים למחקר של CAUTI פולימיקרוביאלי. ואכן, הוצע כי עד 86% מה-CAUTIs הם פולימיקרוביאליים, וזיהומים אלה קשורים לעתים קרובות לתסמינים חמורים יותר ולשיעור תמותה גבוה יותר מאשר זיהום חד-מיני 27,64,65,69. ניתן לחסן מודלים במבחנה עם מינים מרובים כדי לחקור את היווצרותם של ביופילמים פולימיקרוביאליים ואת התקדמות CAUTI, אך יש לבצע אימות קפדני של קהילות פולימיקרוביאליות ושינוי צפיפות החיסון לפני החיסון. מחקרים קודמים השתמשו במודל שלפוחית השתן במבחנה כדי לנטר את ההבדלים בהיווצרות ביופילם במין יחיד P. mirabilis CAUTI בהשוואה לשני מינים CAUTI עם E. faecalis, תוך הדגשת האינטראקציה המטבולית בין הזנים, מה שהביא להיווצרות ביופילם משופרת בהשוואה לזיהום של מין בודד70.

יתרון מרכזי בשימוש במודל שלפוחית השתן במבחנה לחקר CAUTI, הוא היכולת לצפות בהיווצרות ביופילם על פני צנתר שתן רגיל. היווצרות ביופילמים ב-CAUTI מתחילה לרוב על ידי היווצרות סרטי התניה על לומן הצנתר, המורכבים ממרכיבים אורגניים של שתן שאליהם יכולים להיצמד אורופתוגנים לפני שהם מתרבים ויוצרים ביופילמים בוגרים 2,18,71,72,73. מבחנים סטנדרטיים המשמשים לחקר היווצרות ביופילם משתמשים לרוב באמצעי גידול חיידקים סטנדרטיים ולא ב-AUM ולעתים קרובות מבוססים על היצמדות למיקרו-לוחות או יתדות פוליסטירן, כלומר מכשיר קלגרי; עם זאת, עבודות קודמות הציעו כי סביבת התזונה, ה-pH ורמות החמצן של המערכת, כמו גם תכונות פיזיקליות כגון זרימה והבדל במבנה פני השטח (סיליקון לעומת פלסטיק), יכולים להשפיע על היווצרות ביופילם 36,37,74,75,76,77,78. בנוסף, תרבית חיידקים עם פעילות אוראז נרחבת, כגון P. mirabilis במערכת סגורה ב-AUM, עלולה לגרום להצטברות של מטבוליטים רעילים, מה שעלול לגרום למוות תאים78,79. זה מתמתן במודל שלפוחית השתן במבחנה מכיוון שה-AUM בתא המרכזי מוחלף כל הזמן במדיה טרייה דרך מעגל המדיה, מה שמאפשר לחקור ביופילמים של CAUTI בתנאים רלוונטיים יותר מבחינה קלינית45. הריצה היומיומית של מודל שלפוחית השתן במבחנה ונקודת הקצה שנבחרה למודלים תלויים במידה רבה בשאלה אם המודלים מחוסנים באורגניזמים חיוביים או שליליים. תיאורטית, מודלים במבחנה יכולים לפעול ללא הגבלת זמן אם הם מסופקים עם נפח מספיק של AUM ואם הסטריליות של המודל נשמרת; עם זאת, מומלץ לבחור נקודת קצה לפני הניסוי, בין אם זו חסימה או מספר שרירותי של ימים. בדרך כלל מומלץ להריץ מודלים במבחנה המחוסנים באורגניזמים שליליים לאוראז במשך ≤7 ימים כדי לדמות את הסביבה הקלינית, מכיוון שבדרך כלל זה מספיק כדי לצפות בהיווצרות ביופילם ברוב האורגניזמים, תוך שמירה על התערבויות קליניות, שכן שיטות העבודה המומלצות הסטנדרטיות מצביעות על כך שיש להחליף צנתרים לאחר נגועים גלויים 1,2, 3,47,48. למרות שאורגניזמים חיוביים לאוראז עשויים לייצר ביופילמים גבישיים, יש שונות רבה בין זנים חיוביים לאוראז בזמן לחסימת מודל שלפוחית השתן במבחנה, כאשר זנים מסוימים של Proteus mirabilis גורמים לחסימת קטטר תוך פחות מ-10 שעות, ולאחרים לוקח יותר מ-30 שעות לחסום39,46. ניתן להשתמש בבדיקת אוראז סטנדרטית לפני ניסויים במודל שלפוחית השתן במבחנה כדי לקבוע אם להריץ מודלים לחסימה או לנקודת קצה מוגדרת מראש80.

אולי המגבלה העיקרית של שימוש במודל שלפוחית השתן במבחנה לחקר היווצרות ביופילם היא שמדידות ביופילם הן קריאת נקודת קצה, מכיוון שהן מחייבות הסרה ודיסקציה של קטטר השתן. לעומת זאת, ניתן לקחת דגימות פלנקטוניות ממודל שלפוחית השתן במבחנה בכל נקודה במהלך הניסוי. בנוסף, ברגע שנלקחות דגימות ביופילם ממודלים של שלפוחית השתן במבחנה, ניתן להשתמש בטכניקות רבות נוספות במורד הזרם כדי לכמת טוב יותר את ייצור הביופילם. מחקרים קודמים השתמשו בפוטומטריית להבה כדי לכמת את כמות הסידן והמגנזיום הקיימים בביופילמים גבישיים, וניתן להשתמש בכתמים מורכבים יותר כדי לזהות במדויק רכיבים של מטריצת EPS של ביופילמים שליליים לאוראז 45,73,81,82,83,84.

עבודה זו מתארת גם את היישום של מודל שלפוחית השתן במבחנה כדי לחקור את ההשפעות של טיפולים שמטרתם לטפל ב-CAUTI. מודל שלפוחית השתן במבחנה מדמה היבטים חשובים של נישת CAUTI, כגון שימוש ב-AUM, כמו גם היווצרות ביופילם רלוונטית מבחינה קלינית ועומס אורגני מוגבר הנראה ב-CAUTI. ניתן להוסיף תרופות כגון אנטיביוטיקה ישירות למיכל ה-AUM כדי לדמות זמינות ביולוגית של תרופות רלוונטיות מבחינה קלינית, ומחקרים קודמים השתמשו בתרופות ייעודיות כמו תיורידזין ופלואוקסטין כדי להדגים אפקט אנטי-ביופילם81. בנוסף, בדיקות ריכוז מעכבות מינימליות ובדיקות השעיית חיידקים משמשות לעתים קרובות כדי להסיק את הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ביוצידים, אם כי יש מעט ראיות המצביעות על כך שבדיקות מתואמות לרגישות לביוצידים בעולם האמיתי 41,85,86,87,88. מודל שלפוחית השתן במבחנה הוא יתרון לבדיקת מוצרים ביוצידיים שמטרתם לטפל או למנוע CAUTI, שכן נוכחות קטטר השתן וסימולציה מייצגת יותר של נישת CAUTI פירושה שניתן לבדוק מוצרים כגון ג'ל סיכה אנטי מיקרוביאלי ותמיסות השקיה לפי הוראות היצרן. מחקרים קודמים השתמשו גם במודל שלפוחית השתן במבחנה כדי לקבוע את יעילות הטיפול בפאג'ים, והראו שטיפול בפאג'ים יכול להאריך את הזמן של P. mirabilis לחסום את מודל שלפוחית השתן במבחנה ביותר מ-100 שעות47. השימוש בצנתר פולי בגודל סטנדרטי במודל שלפוחית השתן במבחנה פירושו גם שניתן לבחון צנתרים חדשים ומצופים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית. עבודות קודמות של Slate et al. הוכח כי צנתרים המצופים בציפוי ציפרופלוקסצין תרנוסטי יכולים להאריך את זמן החסימה של P. mirabilis ב~60 שעות במודל שלפוחית השתן במבחנה 48. זה מדגיש את היישום הפוטנציאלי של מודל שלפוחית השתן במבחנה במחקר של טיפולים חדשים שמטרתם לטפל ב-CAUTI, ומאפשר הערכה מדויקת יותר של אנטי-מיקרוביאלים בנישת CAUTI מדומה רלוונטית מבחינה ביולוגית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר ג'ונתן נזקיזוואניו ולד"ר אנתוני ג'יי סלייט על המומחיות המשותפת שלהם בפיתוח פרוטוקול זה. העבודה באוניברסיטת באת' מומנה על ידי מועצת המחקר הרפואי GW4 Biomed DTP כמלגה ל-V.B. (MR/N0137941/1). B. V. J. נתמך גם על ידי מימון מהקרן הרפואית Dunhill (RPGF1906\171). המחקר של O.E.C. מומן על ידי Kidney Research Northwest (RCN: 1144798). איור 1 נוצר עם Biorender.com.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
313 הארכת ראש משאבה מהירווטסון-מרלו313משאבה פריסטלטית - הארכת ראש משאבה נוספת 
323S / D בקרה ידנית משאבת מהירות משתנהווטסון-מרלו323S / Dמשאבה פריסטלטית
3 ליטר שקיות מיטה, סטריליות עם ברזי מנוף Great Bear Healthcare GDW173
3 מ"מ צינורות סיליקון מרפאים פלטינה בקוטר פנימיפישר10111801צינורות מעגל AUM קטנים (חבר צינורות משאבה לדגמים)
צינורות סיליקון מרפאים פלטינה בקוטר 5 מ"מפישר10539201צינורות מעגל AUM בינוניים (חבר צינורות משאבה למאגר AUM)
אמוניום כלוריד (NH4Cl)פישר11473713
נתרן גופרתי נטול מים (Na2SO4)Fisher11498717
Azlon מחבר מחודד פישר10712807משמש לחיבור אורכים שונים של צינורות במעגל AUM
מתלי תיקי מיטה Great Bear Healthcare 10705P
מהדקי צינור זין קמצוץ Bochem, קוטר 25 מ"מפישר11805101
סידן כלורי (CaCl2)פישר10021681
חומצת לימון מונוהידרט MerckC1909-500Gמשמש להסרת ביופילם גבישי ממודלים לאחר ניסויים 
פישרברנד  זכוכית בוגרת Class B סוג 1 פיפטותפישר11992168משמש לאספקת דגמי להב במבחנה עם AUM באמצעות
ג'לטיןVWR24360.233
Graphpad prism 10GraphPadV10.0תוכנה אנליטית המשמשת לגרפים בתוצאות מודל שלפוחית השתן במבחנה וניתוח סטטיסטי.
Hanna HI 2211-02 מד pH ספסלפיליפ האריס PP00057414
In vitro שלפוחית השתן --ציוד בהתאמה אישית כפי שתואר בעבר על ידי Nzakizwanayo et al. (2019).
ג'ל סיכה Instillagel 6 מ"לmydoctorshop.co.uk 40-006ג'לי סיכה המשמשים בסעיף 7.1.; ספקים אחרים זמינים.
Kartell Plastilab מחבר מחודד לא אחידFisher 11914289משמש לחיבור צינורות בקטרים שונים מקונקי
אגר ללא מלח (מיובש)פישר10472643לספירת מושבות בודדות של חיידקים נחילים, כלומר Proteus mirabilis
מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl2.6H2O)פישר10386743
מונופוטסיום פוספט (KH2PO4)פישר10573181
נלג'ן מחבר בצורת Yפישר10186070משמש להפעלת מעגלי AUM מרובים ממאגר AUM אחד (1-4 דגמים לכל מיכל) 
אשלגן כלורי (KCl)פיירקס פישר10375810
עם שקע צד מזכוכית טחונה, קיבולת: 5000 מ"לפקקי גומי של מאגר פישר11347884AUM
עם קדח, קוטר חיצוני: 37 מ"מ, אדום, קוטר: 37 מ"מפישר11517612משמש במאגר AUM ולאספקת דגמי מבחנה עם AUM
גודל 14 צרפתי 100% סיליקון קטטר פולי עם מזרק סטרילי של מים לניפוח Great Bear Healthcare 4833-0514
נתרן כלורי (NaCl)נתרן
(Na2C2O4)Fisher10442211
Teknon Biocleanse תרכיז מנקה ביוצידי, 5L פישר12447580משמש לעיקור מודלים לאחר ניסוי
טריסודיום ציטראט (Na3C6H5O7)פישר11434993
טריפטון מרק סויהפישר10198002
אוריאה (CH4N2O)פישר10404185
Uro-Tainer M NaCl 0,9%B.BraunFB99833שקית השקיית שלפוחית השתן המלוחה המשמשת בסעיף 7.2. 
Watson-Marlow Pumpsil 1.6 מ"מ צינורות סיליקון מרפאים פלטינה בקוטר פנימיפישר12406280צינורות מעגל AUM עבים (לשימוש במשאבה פרסטלטית)
באנג משועמם בקבוק שואב אוקסלט 10735921 פישר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. R., et al. Epidemiology and health-economic burden of urinary-catheter-associated infection in English NHS hospitals: A probabilistic modelling study. J Hosp Infect. 103 (1), 44-54 (2019).
  2. Stickler, D. J. Bacterial biofilms in patients with indwelling urinary catheters. Nat Clin Pract Urol. 5 (11), 598-608 (2008).
  3. Feneley, R. C., Hopley, I. B., Wells, P. N. Urinary catheters: History, current status, adverse events and research agenda. J Med Eng Technol. 39 (8), 459-470 (2015).
  4. Lapides, J., Diokno, A. C., Silber, S. J., Lowe, B. S. Clean, intermittent self-catheterization in the treatment of urinary tract disease. J Urol. 107 (3), 458-461 (1972).
  5. Suetens, C., et al. Prevalence of healthcare-associated infections, estimated incidence and composite antimicrobial resistance index in acute care hospitals and long-term care facilities: Results from two European point prevalence surveys, 2016 to 2017. Euro Surveill. 23 (46), 1800516(2018).
  6. Nicolle, L. E. Catheter associated urinary tract infections. Antimicrob Resist Infect Control. 3, 23(2014).
  7. Jacobsen, S. M., Stickler, D. J., Mobley, H. L., Shirtliff, M. E. Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis. Clinical Microbiol Rev. 21 (1), 26-59 (2008).
  8. Trautner, B. W., Darouiche, R. O. Role of biofilm in catheter-associated urinary tract infection. Am J Infect Control. 32 (3), 177-183 (2004).
  9. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. N Engl J Med. 291 (5), 215-219 (1974).
  10. Warren, J. W., et al. Fever, bacteremia, and death as complications of bacteriuria in women with long-term urethral catheters. JInfect Dis. 155 (6), 1151-1158 (1987).
  11. Walker, J. N., et al. High-resolution imaging reveals microbial biofilms on patient urinary catheters despite antibiotic administration. World JUrol. 38 (9), 2237-2245 (2020).
  12. Chant, C., Smith, O. M., Marshall, J. C., Friedrich, J. O. Relationship of catheter-associated urinary tract infection to mortality and length of stay in critically ill patients: A systematic review and meta-analysis of observational studies. Crit Care Med. 39 (5), 1167-1173 (2011).
  13. Clarke, K., et al. Catheter-associated urinary tract infections in adults: Diagnosis, treatment, and prevention. J Hosp Med. 15 (9), 552-556 (2020).
  14. Tambyah, P. A., Maki, D. G. The relationship between pyuria and infection in patients with indwelling urinary catheters: A prospective study of 761 patients. Arch Intern Med. 160 (5), 673-677 (2000).
  15. Flemming, H. C., et al. Biofilms: An emergent form of bacterial life. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 563-575 (2016).
  16. Stewart, P. S., Costerton, J. W. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet. 358 (9276), 135-138 (2001).
  17. Stewart, P. S. Mechanisms of antibiotic resistance in bacterial biofilms. Int J Med Microbiol. 292 (2), 107-113 (2002).
  18. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  19. Sabir, N., et al. Bacterial biofilm-based catheter-associated urinary tract infections: Causative pathogens and antibiotic resistance. Am JInfect Control. 45 (10), 1101-1105 (2017).
  20. Touzel, R., Sutton, J., Wand, M. Establishment of a multi-species biofilm model to evaluate chlorhexidine efficacy. JHosp Infect. 92 (2), 154-160 (2016).
  21. Luo, Y., Yang, Q., Zhang, D., Yan, W. Mechanisms and control strategies of antibiotic resistance in pathological biofilms. J Microbiol Biotechnol. 31 (1), 1-7 (2021).
  22. Dincer, S., Uslu, F. M., Delik, A. Antibiotic resistance in biofilm. Bacterial biofilms. , IntechOpen. (2020).
  23. Soto, S. M. Importance of biofilms in urinary tract infections: New therapeutic approaches. Adv Biol. 2014 (1), 543974(2014).
  24. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends Microbiol. 13 (1), 34-40 (2005).
  25. Otto, S. B., et al. Privatization of biofilm matrix in structurally heterogeneous biofilms. MSystems. 5 (4), e00425-e00520 (2020).
  26. Wood, T. K., Knabel, S. J., Kwan, B. W. Bacterial persister cell formation and dormancy. Appl Environ Microbiol. 79 (23), 7116-7121 (2013).
  27. Gaston, J. R., Johnson, A. O., Bair, K. L., White, A. N., Armbruster, C. E. Polymicrobial interactions in the urinary tract: Is the enemy of my enemy my friend. InfectImmun. 89 (4), (2021).
  28. Griffith, D. P., Musher, D. Á, Itin, C. Urease. The primary cause of infection-induced urinary stones. Invest Urol. 13 (5), 346-350 (1976).
  29. Armbruster, C. E., Mobley, H. L. T., Pearson, M. M. Pathogenesis of Proteus mirabilis infection. EcoSal Plus. 8 (1), 1128(2018).
  30. Jacobsen, S. M., Shirtliff, M. E. Proteus mirabilis biofilms and catheter-associated urinary tract infections. Virulence. 2 (5), 460-465 (2011).
  31. Mobley, H. L., Warren, J. W. Urease-positive bacteriuria and obstruction of long-term urinary catheters. J Clin Microbiol. 25 (11), 2216-2217 (1987).
  32. Wasfi, R., Hamed, S. M., Amer, M. A., Fahmy, L. I. Proteus mirabilis biofilm: Development and therapeutic strategies. Front Cell Infect Microbiol. 10 (414), (2020).
  33. Broomfield, R. J., Morgan, S. D., Khan, A., Stickler, D. J. Crystalline bacterial biofilm formation on urinary catheters by urease-producing urinary tract pathogens: A simple method of control. J Med Microbiol. 58 (10), 1367-1375 (2009).
  34. Stickler, D. J. Clinical complications of urinary catheters caused by crystalline biofilms: Something needs to be done. J Intern Med. 276 (2), 120-129 (2014).
  35. Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Pseudomonas methods and protocols. , 631-641 (2014).
  36. Ceri, H., et al. The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clin Microbiol. 37 (6), 1771-1776 (1999).
  37. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J Microbiol Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  38. Bouatra, S., et al. The human urine metabolome. PloS one. 8 (9), e73076(2013).
  39. Holling, N., et al. Elucidating the genetic basis of crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Infect Immun. 82 (4), 1616-1626 (2014).
  40. Lawrence, E., Turner, I. Materials for urinary catheters: A review of their history and development in the UK. Med Eng Phys. 27 (6), 443-453 (2005).
  41. Stickler, D. J. Chlorhexidine resistance in Proteus mirabilis. J Clin Pathol. 27 (4), 284-287 (1974).
  42. Fraise, A. P. Biocide abuse and antimicrobial resistance-a cause for concern. J Antimicrob Chemother. 49 (1), 11-12 (2002).
  43. Pelling, H., et al. Derepression of the smvA efflux system arises in clinical isolates of proteus mirabilis and reduces susceptibility to chlorhexidine and other biocides. Antimicrob Agents Chemother. 63 (12), e01535(2019).
  44. Stickler, D. J., Morris, N. S., Winters, C. Simple physical model to study formation and physiology of biofilms on urethral catheters. MethodsEnzymol. 310, 494-501 (1999).
  45. Nzakizwanayo, J., Pelling, H., Milo, S., Jones, B. V. An in vitro bladder model for studying catheter-associated urinary tract infection and associated analysis of biofilms. Proteus mirabilis: Methods and Protocols. , 139-158 (2019).
  46. Clarke, O. E., et al. Lipopolysaccharide structure modulates cationic biocide susceptibility and crystalline biofilm formation in Proteus mirabilis. Front Microbiol. 14, 1150625(2023).
  47. Nzakizwanayo, J., et al. Bacteriophage can prevent encrustation and blockage of urinary catheters by proteus mirabilis. Antimicrob Agents Chemother. 60 (3), 1530-1536 (2015).
  48. Slate, A. J., et al. Infection-responsive coatings to reduce biofilm formation and encrustation of urinary catheters. J Appl Microbiol. 134 (6), lxad121(2023).
  49. Maierl, M., Jörger, M., Rosker, P., Reisner, A. In vitro dynamic model of a catheterized bladder and biofilm assay. Bio Protoc. 5 (2), e1381(2015).
  50. Stickler, D., Clayton, C., Chawla, J. The resistance of urinary tract pathogens to chlorhexidine bladder washouts. J Hosp Infect. 10 (1), 28-39 (1987).
  51. King, J., Stickler, D. An assessment of antiseptic bladder washout solutions using a physical model of the catheterized bladder. J Hosp Infect. 18 (3), 179-190 (1991).
  52. King, J., Stickler, D. The effect of repeated instillations of antiseptics on catheter-associated urinary tract infections: A study in a physical model of the catheterized bladder. Urol Res. 20, 403-407 (1992).
  53. Morris, N., Stickler, D. Encrustation of indwelling urethral catheters by Proteus mirabilis biofilms growing in human urine. J Hosp Infect. 39 (3), 227-234 (1998).
  54. Stickler, D., Morgan, S. Observations on the development of the crystalline bacterial biofilms that encrust and block foley catheters. J Hosp Infect. 69 (4), 350-360 (2008).
  55. Stamm, W. E. Catheter-associated urinary tract infections: Epidemiology, pathogenesis, and prevention. Am J Med. 91 (3, Supplement 2), S65-S71 (1991).
  56. Sarigul, N., Korkmaz, F., Kurultak, I. A new artificial urine protocol to better imitate human urine. Sci Rep. 9 (1), 20159(2019).
  57. Brooks, T., Keevil, C. A simple artificial urine for the growth of urinary pathogens. Lett Appl Microbiol. 24 (3), 203-206 (1997).
  58. Ipe, D. S., Horton, E., Ulett, G. C. The basics of bacteriuria: Strategies of microbes for persistence in urine. Front CellI Infect Microbiol. 6 (14), 3389(2016).
  59. Ipe, D. S., Ulett, G. C. Evaluation of the in vitro growth of urinary tract infection-causing gram-negative and gram-positive bacteria in a proposed synthetic human urine (SHU) medium. J Microbioll Methods. 127, 164-171 (2016).
  60. Chutipongtanate, S., Thongboonkerd, V. Systematic comparisons of artificial urine formulas for in vitro cellular study. Anal Biochem. 402 (1), 110-112 (2010).
  61. Saude, E. J., Adamko, D., Rowe, B. H., Marrie, T., Sykes, B. D. Variation of metabolites in normal human urine. Metabolomics. 3, 439-451 (2007).
  62. Andersen, S., et al. Proteomes of uropathogenic Escherichia coli growing in human urine and in j82 urinary bladder cells. Proteomes. 10 (2), 15(2022).
  63. Uppuluri, P., Dinakaran, H., Thomas, D. P., Chaturvedi, A. K., Lopez-Ribot, J. L. Characteristics of Candida albicans biofilms grown in a synthetic urine medium. J Clin Microbiol. 47 (12), 4078-4083 (2009).
  64. Gaston, J. R., et al. Enterococcus faecalis polymicrobial interactions facilitate biofilm formation, antibiotic recalcitrance, and persistent colonization of the catheterized urinary tract. Pathogens. 9 (10), 835(2020).
  65. Warren, J. W., Tenney, J. H., Hoopes, J. M., Muncie, H. L., Anthony, W. C. A prospective microbiologic study of bacteriuria in patients with chronic indwelling urethral catheters. The JI Infect Dis. 146 (6), 719-723 (1982).
  66. Armbruster, C. E., et al. Genome-wide transposon mutagenesis of Proteus mirabilis: Essential genes, fitness factors for catheter-associated urinary tract infection, and the impact of polymicrobial infection on fitness requirements. PLoS Pathog. 13 (6), e1006434(2017).
  67. Armbruster, C. E., et al. The pathogenic potential of Proteus mirabilis is enhanced by other uropathogens during polymicrobial urinary tract infection. Infect Immun. 85 (2), e00808(2017).
  68. Siegman-Igra, Y., Kulka, T., Schwartz, D., Konforti, N. Polymicrobial and monomicrobial bacteraemic urinary tract infection. J Hosp Infect. 28 (1), 49-56 (1994).
  69. Nye, T. M., et al. Microbial co-occurrences on catheters from long-term catheterized patients. Nat Commun. 15 (1), 61(2024).
  70. Hunt, B. C., et al. Metabolic interplay between Proteus mirabilis and Enterococcus faecalis facilitates polymicrobial biofilm formation and invasive disease. mBio. 15, e02164(2024).
  71. Stickler, D., Ganderton, L., King, J., Nettleton, J., Winters, C. Proteus mirabilis biofilms and the encrustation of urethral catheters. Urol Res. 21, 407-411 (1993).
  72. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  73. Habash, M., Reid, G. Microbial biofilms: Their development and significance for medical device-related infections. J Clin Pharmacol. 39 (9), 887-898 (1999).
  74. Ommen, P., Zobek, N., Meyer, R. L. Quantification of biofilm biomass by staining: Non-toxic safranin can replace the popular crystal violet. J Microbiol Methods. 141, 87-89 (2017).
  75. Wilson, C., et al. Quantitative and qualitative assessment methods for biofilm growth: A mini-review. Research and Reviews: J Eng Technol. 6 (4), 30214915(2017).
  76. Niebergall, A. K., et al. Influence of polymerized siloxane coating on growth and biofilm formation of aerobic grown nosocomial bacteria. J Cell Biotechnol. 3 (2), 107-115 (2018).
  77. Ionescu, A., Brambilla, E., Sighinolfi, M. C., Mattina, R. A new urinary catheter design reduces in vitro biofilm formation by influencing hydrodynamics. J Hosp Infect. 114, 153-162 (2021).
  78. Pelling, H., et al. Bacterial biofilm formation on indwelling urethral catheters. Lett Appl Microbiol. 68 (4), 277-293 (2019).
  79. Schaffer, J. N., Pearson, M. M. Proteus mirabilis and urinary tract infections. Microbiol Spectr. 3 (5), 1128(2015).
  80. Konieczna, I., et al. Bacterial urease and its role in long-lasting human diseases. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 789-806 (2012).
  81. Nzakizwanayo, J., et al. Fluoxetine and thioridazine inhibit efflux and attenuate crystalline biofilm formation by Proteus mirabilis. Sci Rep. 7 (1), 12222(2017).
  82. Strathmann, M., Wingender, J., Flemming, H. C. Application of fluorescently labeled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in biofilms of Pseudomonas aeruginosa. J Microbiol Methods. 50 (3), 237-248 (2002).
  83. Van Den Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. J Microbiol Methods. 98, 31-34 (2014).
  84. Trafny, E. A., Lewandowski, R., Zawistowska-Marciniak, I., Stępińska, M. Use of MTT assay for determination of the biofilm formation capacity of microorganisms in metalworking fluids. World J Microbiol Biotechnol. 29, 1635-1643 (2013).
  85. Chapman, J. S. Biocide resistance mechanisms. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (2), 133-138 (2003).
  86. Cloete, T. E. Resistance mechanisms of bacteria to antimicrobial compounds. Int Biodeterior Biodegrad. 51 (4), 277-282 (2003).
  87. Maillard, J. Y. Resistance of bacteria to biocides. Microbiol Spectr. 6 (2), 1128(2018).
  88. Maillard, J. Y. Bacterial resistance to biocides in the healthcare environment: Should it be of genuine concern. J Hosp Infect. 65, 60-72 (2007).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים