הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי מיקרוגליה ומקרופאגים חודרים היקפיים בחוט השדרה הפגוע באמצעות ציטומטריית זרימה

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/67967

⸱

24 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Laboratory Medicine, Bengbu Medical University, 3Anhui Province Key Laboratory of Immunology in Chronic Diseases, Bengbu Medical University, 4The Second Affiliated Hospital of South China University, 5Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-related Diseases, Bengbu Medical University

במאמר זה

סיכום

זיהוי מיקרוגליה (MG) ומקרופאגים חודרים היקפיים (Mø) בחוט השדרה הפגועים הוא קשה. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בזרימה ציטומטרית (FCM) לזיהוי MG דמוי M1, MG דמוי M2, M1 דמוי Mø ו-M2 דמוי Mø, בהתאמה. ניתן ליישם טכנולוגיה זו גם על מחלות אחרות של מערכת העצבים המרכזית כדי להבין את תפקידם של MG ו-Mø.

תקציר

בחוט שדרה בריא, מקרופאגים חודרים היקפיים כמעט ולא ניתנים לזיהוי, ומיקרוגליה (MG) משתתפת בשמירה על יציבות המיקרו-סביבה של חוט השדרה על ידי פגוציטוזיס, פינוי פסולת תאית וייצור גורמים נוירוטרופיים. לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI), MG מופעלים, ותאי חיסון היקפיים חודרים לחוט השדרה הפגוע. בין תאי החיסון הללו, MG מופעל ומקרופאגים חודרים היקפיים (Mø) ממלאים תפקידים מכריעים בתהליך הפתולוגי של SCI. ניתן להבחין בין תאים אלה לפנוטיפים פרו-דלקתיים (דמויי M1) ואנטי דלקתיים (דמויי M2); עם זאת, ההבחנה ביניהם מאתגרת בשל הדמיון שלהם במורפולוגיה ובסמנים תאיים רבים. ציטומטריית זרימה (FCM), טכניקה בשימוש נרחב בתחום הביו-רפואי, יכולה לזהות בו זמנית מספר פרמטרים תאיים כגון גודל התא, גודל החלקיקים, משטח התא וסמנים תוך-תאיים בניסוי יחיד. במשך שנים של מחקר, FCM ניסה לזהות MG ו-Mø בחוט השדרה ועבר אופטימיזציה מתמדת כדי לפתח בסופו של דבר שיטת זיהוי יציבה. שיטה זו מאפשרת זיהוי של MG דמוי M1/M2 ו-M1/M2 דמוי Mø לאחר SCI על ידי זיהוי פרופילי הביטוי של CD45, CD11b, CD68, CCR7 וסמנים אחרים. בפרוטוקול זה, CD11b+CD45−/CD68+CCR7+ נמוך, CD11b+CD45−/נמוךCD68+CCR7-, CD11b+CD45CD68+CCR7+ גבוה, ו-CD11b+CD45תאיCD68+CCR7- גבוהים כ-MG דמויי M1, MG דמויי M2, M1-like Mø ו-M2-like Mø, בהתאמה.

מבוא

פגיעה בחוט השדרה (SCI) היא תוצאה של נזק לחוט השדרה הנגרם מסיבות שונות. ל-SCI יש שיעור גבוה של נכות, ונכון לעכשיו, אין אפשרויות טיפול יעילות, מה שהופך אותו לאחת מבעיות בריאות הציבור החמורות ביותר בעולם 1,2. התהליך הפתופיזיולוגי של SCI הוא מורכב, ומחולק לשני שלבים. בתחילה, טראומה מכנית מהפגיעה גורמת מיד לתפקוד לקוי חריף של התאים ולמוות של תאים. לאחר מכן, נזק משני מוביל לתפקוד לקוי נוסף של התאים ולמוות של תאים במשך ימים, שבועות או אפילו חודשים. בתוך מנגנוני הפגיעה המשנית, דלקת הוכחה כגורם מפתח לחומרת הנזק המשני, ובסופו של דבר מכתיבה את מוות התאים ואת תפקוד התא3. המאפיינים של תגובות דלקתיות הם חדירה והפעלה של תאים דלקתיים בתוך חוט השדרה הפגוע, מה שמוביל לעלייה בתאים דלקתיים וגורמים דלקתיים, יוצר מיקרו-סביבה דלקתית, ובסופו של דבר גורם לתפקוד לקוי של חוט השדרה4.

מיקרוגליה במערכת העצבים המרכזית (CNS) ומקרופאגים חודרים היקפיים ממלאים תפקיד קריטי בתגובה הדלקתית לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI)5,6. כמקרופאגים תושבים של מערכת העצבים המרכזית, מיקרוגליה מהווה 5%-10% מתאי מערכת העצבים המרכזית והם חיוניים להתאוששות SCI 7,8. מיקרוגליה יכולה לבלוע ולהסיר פסולת תאית לאחר SCI, ומתווכת היווצרות צלקות ריפוי 9,10. עם זאת, הפעלה מוגזמת של מיקרוגליה עלולה להוביל לתגובה דלקתית מתמשכת ולקדם היווצרות צלקות גליה, המעכבות התחדשות אקסונלית11. לאחר SCI, מיקרוגליה מופעלת מציגה בעיקר שני פנוטיפים: דמויי M1 ודמויי M2 12,13. הפנוטיפ דמוי M1 הוא פרו-דלקתי, ומקדם סינתזה של גורמים דלקתיים התורמים לאפופטוזיס של תאים ולפגיעה משנית. למיקרוגליה דמוית M1 יש גם השפעות נוירוטוקסיות, המחמירות פציעה ואפופטוזיס עצבי14,15. לעומת זאת, לפנוטיפ דמוי M2 יש תכונות אנטי דלקתיות ומקדם אנגיוגנזה, רמיאלינציה, צמיחה אקסונלית ותיקון רקמות16,17. מיקרוגליה דמוית M2 ממלאת תפקיד מכריע בוויסות דלקת ותהליכי תיקון.

מקרופאגים היקפיים חודרים לאתר הנגע לאחר SCI דרך מחסומי דם-חוט שדרה פגומים וכלי דם17,18, ומווסתים עוד יותר את התגובה הדלקתית, פגוציטוזיס, היווצרות צלקת והתחדשות רקמות עצביות 19,20. מקרופאגים חודרים היקפיים יכולים להפחית את התגובה הדלקתית לאחר SCI, פסולת רקמת פגוציטוז21, לקדם התחדשות עצבית ועיצוב מחדש של מטריצות. עם זאת, תגובה דלקתית מתמשכת המתווכת על ידי מקרופאגים חודרים היקפיים עלולה להוביל לפגיעה משנית, מה שמזיק להחלמה ארוכת טווח22,23. למקרופאגים חודרים היקפיים דמויי M1 יש יכולות פגוציטיות והצגת אנטיגן חזקות, המסוגלות לנקות תאים נמקיים24. עם זאת, הפרשה מוגזמת של ציטוקינים פרו-דלקתיים, מיני חמצן תגובתיים (ROS) ומיני חנקן תגובתיים (RNS) עלולה לפגוע בתאי עצב ובתאי גליה, מה שמוביל לאפופטוזיס עצבי חמור יותר25. לעומת זאת, מקרופאגים חודרים היקפיים דמויי M2 יכולים לעכב אפופטוזיס עצבי ולהפחית את התגובה הדלקתית לאחר SCI, ובכך לקדם את תיקון הרקמה העצבית26.

מיקרוגליה מופעלת ומקרופאגים חודרים היקפיים לאחר SCI מציגים דמיון מורפולוגי ומולקולרי בביטוי המקשה על ההבחנה ביניהם. זרימה ציטומטרית (FCM), טכניקה שאומצה באופן נרחב, משמשת לניתוח הביטוי של פני התא ומולקולות תוך-תאיות, זיהוי תת-אוכלוסיות תאים שונות ובו זמנית הערכה של פרמטרים מרובים של תאים בודדים. בדיקת FCM יציבה נמשכה כדי להבחין בין מיקרוגליה מופעלת לבין מקרופאגים חודרים היקפיים, מה שמקל על חקירת תפקידיהם ב-SCI. מאמר זה מתאר את שיטת הזיהוי היציבה שפותחה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה לטיפול בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית בנגבו (מס' 2020-050). הטיפול בבעלי חיים עמד בתקנות שנקבעו על ידי משרד המדע והטכנולוגיה של סין. בסך הכל 18 עכברי C57/BL6 נקבות בנות שמונה שבועות הושגו באופן מסחרי ונעשה בהן שימוש. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. ניסויים והכנת בעלי חיים

  1. שכן את העכברים בכלובים מאווררים לפני הניתוח. שמרו על מחזור אור/חושך של 12 שעות וספקו גישה חופשית למזון ומים. שמור על טמפרטורת החדר הסביבתית על 20-22 מעלות צלזיוס ועל הלחות על 30%-70% למשך שבוע של התאקלמות.
  2. עקר את המכשירים הכירורגיים לעכברים על ידי חיטוי וייבש אותם לפני השימוש. הכניסו את המכשירים ואת חדר הניתוחים לבעלי חיים לעיקור אולטרה סגול חצי שעה לפני הניתוח. קבץ ותייג את העכברים על פי עקרון הקיבוץ האקראי. רשום ורשום את המשקלים שלהם לשימוש מאוחר יותר.
  3. יש להרדים את העכברים עם קוקטייל של קטמין (80 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) על ידי הזרקה תוך-צפקית (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). לגלח את השיער בגב מחוליות T8 עד T10.

2. הכנת מודל עכבר SCI

  1. חיטוי אזור הניתוח באמצעות ספוגית יוד מכף רגל ועד ראש, שבמרכזה T9, ולאחר מכן חיטוי עם ספוגית אלכוהול 75%. בצע חתך של 1 ס"מ בעור שבמרכזו T9. נתח את הפאשיה, השריר והרצועות המקיפים את T9 למשך 1 ס"מ.
    1. נתק את השריר הסמוך לתהליך הקוצני T9 כדי לחשוף את T9. השתמש במספריים עיניים כדי לחשוף ולהסיר את הלמינה בין T9 ל- T10, תוך חשיפה מלאה של חוט השדרה הממוקם ב- T9, שקוטרו כ -2 מ"מ.
      הערה: בעת הרמת למינה T9, ודא שהמספריים אינם נוגעים בחוט השדרה.
  2. ייצב את עמוד השדרה על ידי הידוק התהליכים הקוצניים של T7 ו- T11. צור מודל SCI מתון באמצעות מוט בקוטר 1.3 מ"מ וכוח של 0.5 N. התבונן בזנב מתכרבל כלפי מעלה ובגפה האחורית מתעוותת לאחר SCI. עבור עכברים המופעלים בדמה, בצע כריתת למינקטומיה בלבד ללא חבלה.
  3. השג המוסטזיס במקום החתך. בצע סגירה שכבתית באמצעות תפרים כירורגיים סטריליים 5-0. לקירוב שרירי, אחוז בפאשיה העמוקה עם מלקחיים של אדסון עם שיניים ותפור את שכבת הפניקולוס קרנוסוס באמצעות מונופילמנט נספג 5-0, החדרת המחט בניצב 2 מ"מ מקצה הפצע כדי להשיג נשיכות סימטריות בעובי מלא (עומק 2-3 מ"מ) במרווחים של 3 מ"מ זה מזה.
    1. קשרו קשרים מרובעים במתח מבוקר כדי ליישר את המישורים הפשיאליים מבחינה אנטומית. מקם מחדש את קצוות העור באמצעות מספריים מיקרו איריס ליצירת היפוך אפידרמיס של 1 מ"מ. יישר את הדרמיס במדויק עם מלקחיים של השען ואבטח אותו באמצעות תפרים פשוטים 5-0 שאינם נספגים במרווח של 2 מ"מ זה מזה, מה שמבטיח התאמה אחידה ללא שטח מת תת עורי.
    2. חיטוי קו התפרים בעזרת ספוגיות יוד באמצעות משיכות חד כיווניות ממרכז הפצע כלפי חוץ. יש לטפוח בעדינות את שאריות הדם בגזה לחה במי מלח ולמרוח שכבה דקה של משחה אנטיביוטית משולשת לאורך החתך.
  4. לאחר הניתוח, הכניסו את העכברים לכלוב שנשמר בטמפרטורה ולחות מתאימים. לספק טיפול במתן שתן פעמיים ביום (בוקר וערב) כדי לסייע לעכברים עד שהם יחזרו למתן שתן עצמאי.
  5. הזרקו לכל עכבר תת עורי 0.5 מ"ל מי מלח ואנטיביוטיקה (גנטמיצין, 2000-2500 U/עכבר) מדי יום כדי למנוע זיהום.

3. בידוד רקמת חוט השדרה מעכברי C57/BL6

  1. להרדים את העכברים לפני הניתוח (שלב 1.3). לאחר הרדמה מלאה, קבע אותם על שולחן הניתוחים במצב שכיבה. עכברים שעברו דמה זוכים ליחס דומה.
  2. בצע חתך רוחבי בחלל בית החזה, מתחת לעצם החזה ולאורך הסרעפת כדי לחשוף את הלב. ייצב בעדינות את הלב עם המוסטטים והכנס את צינורית הזלוף לחדר השמאלי האפיקלי, וקדם אותה לתוך אבי העורקים.
    1. חותכים מיד את האפרכסת הימנית ומתחילים בזלוף בקצב של 250 מ"ל לשעה עם 10 מ"ל של תמיסת PBS. זלוף נחשב למוצלח כאשר הנוזל המתנקז מהאפרכסת הימנית הופך מאדום מדמם לצלול וחסר צבע, או כאשר הכבד עובר מאדום ללבן27.
  3. לחצות את עמוד השדרה בקצה הזנב של העכבר כדי לחשוף את הנקב החולייתי. בעזרת מספריים עיניים, נתח בזהירות את רקמת חוט השדרה 0.5 ס"מ מעל ומתחת לאתר הפגיעה. הנח את רקמת חוט השדרה המבודדת בצלחת תרבית סטרילית ונטולת אנזימים המכילה 5% מאגר צביעה, ואחסן אותה על קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר בצנטריפוגה שיפוע צפיפות פוליוויניל פירולידון (PVP) מצופה סיליקה קולואידית.
    הערה: בעת ניתוח חוט השדרה ליד מרכז הפציעה, ודא את שלמות הרקמה כדי למנוע קרע או נזק לחוט השדרה במקום הפציעה. 5% מאגר צביעה (SB) מורכב מ-2.5 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) ו-47.5 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS).

4. צנטריפוגה של שיפוע צפיפות באמצעות סיליקה קולואידית מצופה בפוליוויניל פירולידון

  1. הנח את רקמת חוט השדרה במסננת תאים של 300 רשת וטחן אותה באמצעות הבוכנה של מזרק חד פעמי של 5 מ"ל/10 מ"ל. לאחר הטחינה, סנן את מתלה התא דרך מסננת 300 רשת לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל לצנטריפוגה (5 דקות, 110 x גרם, טמפרטורת החדר).
    1. לאחר הצנטריפוגה, הוסף 1 מ"ל של תמיסת עיכול תאי טריפסין למשקע התא, ודגר אותו בחממת תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. עצור את העיכול על ידי הוספת 1.5 מ"ל סרום בקר עוברי, ואז שוב צנטריפוגה (110 x גרם, 5 דקות, טמפרטורת החדר). השעו מחדש את משקעי התא ב-1 מ"ל של מאגר צביעה של 5% (SB).
  2. הוסף ברצף 4 מ"ל של תמיסת פוליוויניל פירולידון מצופה סיליקה קולואידית 70%, 4 מ"ל של תמיסת פוליוויניל פירולידון מצופה סיליקה קולואידית 30%, ו-1 מ"ל של תמיסת התאים המושעה 5% SB לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה את התערובת (300 x גרם, 30 דקות, 20 מעלות צלזיוס).
    הערה: הכן את מגיב הפרדת הפוליוויניל פירולידון המצופה סיליקה קולואידית כתערובת של 9:1 של פוליוויניל פירולידון מצופה סיליקה קולואידית ו-10× PBS. לדלל את תמיסת הפוליוויניל פירולידון המצופה סיליקה קולואידית של 70% עם 1× PBS ואת תמיסת הפוליוויניל פירולידון המצופה סיליקה קולואידית 30% עם מדיום תרבית תאים DMEM או RPMI 1640.
  3. אחרי הצנטריפוגה, התאים ייצרו שכבות בצינור הצנטריפוגה (איור 1). השלך את פסולת התא ושכבות הטסיות מעל סימן הכיול של 8 מ"ל. שאפו בזהירות את התמיסה שנותרה (עד לסימן הכיול של 1.5 מ"ל) והשליכו את המשקעים מתחת לסימן.
    1. העבירו את התמיסה הנותרת לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל והוסיפו 1× PBS כדי להביא את הנפח הכולל ל-15 מ"ל לצנטריפוגה (400 x גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
  4. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את משקעי התא ב-5% SB. העבירו את התמיסה לצינור ציטומטריית זרימה (FCM) לשטיפה וצנטריפוגה (110 x גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס). השעו מחדש את משקעי התא בצינור FCM עם 200 מיקרוליטר של 5% SB.

5. מכתים FCM

  1. חלקו 200 מיקרוליטר של תרחיף התא באופן שווה לשני צינורות ציטומטריית זרימה חדשים. סמן צינור אחד כ"בקרת איזוטיפ" והשני כ"צביעה ספציפית".
  2. הליך מכתים
    1. לצינור "בקרת איזוטיפ", הוסף את הנוגדנים הבאים המותאמים לאיזוטיפ: Rat IgG2b kappa עם תווית PE, Rat IgG2b kappa עם תווית FITC, Rat IgG2b kappa עם תווית APC, ו-Rat IgG2b kappa עם תווית APC-eFluor 780.
    2. לצינור "צביעה ספציפית", הוסף את הפאנל הבא של נוגדנים עם תווית פלואורסצנטית בהתאם ליחסי הדילול המומלצים: חולדה נגד עכבר CD45 APC, חולדה נגד עכבר CD11b PE, חולדה נגד עכבר CD68 FITC וחולדה נגד עכבר CCR7 APC-eFluor 780.
    3. דגרו את הצינורות בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור, למשך 30 דקות.
  3. שטפו את התאים המוכתמים פעמיים על ידי הוספת 1 מ"ל SB בכל פעם. צנטריפוגה של התאים (110 x גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס). לבסוף, תקן את התאים עם 2% פרפורמלדהיד (PFA) לניתוח ציטומטריית זרימה.

6. זיהוי FCM

הערה: לפרטים על הנוהל, עיין בדוחות קודמים27,28.

  1. נתח דגימות באמצעות ציטומטר הזרימה עם התוכנה התואמת (ראה טבלת חומרים).
    1. ראשית, נתח את צינור הבקרה של האיזוטיפ כדי לקבוע את הגרף הראשוני (FSC על ציר ה-x ו-SSC על ציר ה-y). כוונן את מתחי הפיזור קדימה (FSC) ופיזור הצד (SSC) כדי למקם את אוכלוסיית התאים בטווח מתאים.
    2. הגדר שני גרפים נוספים: אחד עם IgG-APC על ציר ה-x ו-IgG-PE על ציר ה-y. אחר עם IgG-FITC על ציר ה-x ו-IgG APC-Cy7 (הערה: APC-eFluor 780 זוהה בערוץ זה) על ציר ה-y.
    3. כוונן את מתחי ערוץ הקרינה עבור IgG-APC, IgG-PE, IgG-FITC ו-IgG APC-Cy7 כדי למקם את אוכלוסיית התאים בתוך 103 של האזור השלילי הכפול.
  2. לאחר שמתחי ה-FSC וה-SSC, כמו גם מתחי ערוץ הקרינה, הותאמו ועברו אופטימיזציה באמצעות צינור הבקרה של האיזוטיפ, הגדרות אלו צריכות להישאר ללא שינוי. המשך לנתח את צינורות הניסוי המוכתמים בנוגדנים.
    1. צור גרף ראשי עם CD11b-PE על ציר ה-x ו-SSC על ציר ה-y. הגדר גרף נוסף עם CD68-FITC על ציר ה-x ו-CCR7 APC-Cy7 על ציר ה-y. השתמש בצינור בקרת האיזוטיפ כהפניה, הגדר את ערכי הבסיס ותאר את "האזור" עבור תאי CD11b+ . בגרף הראשי, שער את אזור התא CD11b+ והגדר אותו כ"שער P1 ".
    2. לאחר מכן, בחר את הגרף עם CD68-FITC על ציר ה-x ו-CCR7 APC-Cy7 על ציר ה-y. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר הצג אוכלוסייה ולאחר מכן בחר P1. זה יציג את אוכלוסיות התאים בקבוצת CD11b+ המבטאות CD68+/CCR7+ או CD68+/CCR7-. אסוף 50,000 אירועים לכל דגימה.
    3. לאחר רכישת הנתונים, התאם את פיצוי הקרינה לפי הצורך. נתח וקבע את אחוז תאי CD11b+ CD68+ CCR7+ (דמויי M1) ותאי CD11b+ CD68+ CCR7- (דמויי M2). האחוז הממוצע של תאים בעלי סימן חיובי מבוטא כאחוז מכלל אוכלוסיית המדגם.
  3. באמצעות פרמטרי המתח המותאמים היטב מצינור הבקרה של האיזוטייפ, המשך בניתוח צינורות הניסוי.
    1. ראשית, קבע גרף עם CD45-APC ו-CD11b-PE, ואחריו שני גרפים עם CD68-FITC ו-CCR7 APC-Cy7. אסוף 50,000 אירועים לכל דגימה, ולאחר רכישת הנתונים, התאם את פיצוי הקרינה.
    2. בעלילות הפסאודו-צבע CD45/CD11b, נתח את ה"אזורים" עבור תאיםגבוהים CD11b+ CD45−/נמוך ו-CD11b+ CD45 עבור כל דגימה. לאחר מכן, נתח את תאי CD68+ CCR7+ ותאי CD68+ CCR7- בשני האזורים הללו.
    3. שלב את הניתוחים כדי לקבוע את האחוזים של אוכלוסיות התאים הבאות: CD11b+ CD45−/CD68+ CCR7+ נמוך (מיקרוגליה דמוית M1), CD11b+ CD45−/נמוך CD68+ CCR7- (מיקרוגליה דמוית M2), CD11b+ CD45 CD68+ CCR7+ גבוה (מקרופאגים דמויי M1), CD11b+ CD45high CD68+ CCR7- (מקרופאגים דמויי M2).
      הערה: האחוז הממוצע של תאים בעלי סימן חיובי מבוטא כאחוז מכלל אוכלוסיית המדגם.

7. ניתוח נתוני FCM

  1. הפעל את תוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה וגרור את קבצי הניסוי של ציטומטריית הזרימה לקטע "כל הדגימות" בממשק. ניסויי ציטומטריית הזרימה יוצגו מתחת ל"כל הדגימות" בממשק. התחל בניתוח צינור הבקרה של האיזוטיפ כדי לקבוע את הסף בין אותות פלואורסצנטיים חיוביים ושליליים.
    1. לחץ פעמיים על דגימת צינור הבקרה של האיזוטיפ כדי להעלות חלון גרפי המציג עלילת נקודות דו מימדית. בחר FSC-A עבור ציר ה-x ו-SSC-A עבור ציר ה-y. לחצו על כפתור השער המלבני בחלק העליון של הממשק והשתמשו במלבן כדי לבחור את האזור לאחר הסרת פסולת סלולרית (איור 2A).
    2. לחץ פעמיים על האזור שנבחר כדי ליצור חלון גרפי חדש. בחר FITC עבור ציר x והיסטוגרמה עבור ציר y. לחץ על כפתור שער האזור בחלק העליון של הממשק כדי להגדיר שער בהיסטוגרמה של פרמטר יחיד כדי לקבוע את הסף בין אותות פלואורסצנטיים שליליים וחיוביים. שער האזור יגדיר את האזור החיובי (איור 2A).
      הערה: האזור עם ערכי FSC קטנים יותר מייצג פסולת סלולרית.
    3. עבור כל אחד מארבעת הנוגדנים הפלואורסצנטיים ששימשו בניסוי, קבע את הסף בין אותות שליליים וחיוביים באמצעות דגימת צינור הבקרה של האיזוטייפ. על ציר ה-x, שנה ברצף את הפלואורוכרומים ל-PE, APC ו-APC-Cy7, תוך שמירה על ציר ה-y כהיסטוגרמה.
    4. השתמש בכלי שער האזור בהיסטוגרמה של פרמטר יחיד כדי להגדיר שערים ולקבוע את הסף בין אותות שליליים וחיוביים עבור כל אחד מארבעת הנוגדנים הפלואורסצנטיים (איור 2A).
  2. כדי לנתח את הפרופורציות של תאים דמויי M1 ודמויי M2:
    1. לחץ פעמיים על דגימת צינור הניסוי כדי להעלות תרשים נקודות דו מימדי. בחר FSC-A עבור ציר ה-x ו-SSC-A עבור ציר ה-y. לחצו על כפתור השער המלבני בחלק העליון של הממשק והשתמשו במלבן כדי לבחור את האזור לאחר הסרת פסולת סלולרית (איור 2B).
    2. לחץ פעמיים על האזור שנבחר כדי ליצור חלון גרפי חדש. בחר CD11b-PE עבור ציר ה-x ו-SSC-A עבור ציר ה-y. לחצו על כפתור השער המלבני בחלק העליון של הממשק, ותוך שימוש בסף החיובי/שלילי PE שנקבע על ידי בקרת האיזוטיפ כהפניה, הגדירו את שער + CD11b (איור 2B).
    3. לחץ פעמיים על אזור השער CD11b+ כדי ליצור חלון גרפי חדש. בחר CD68-FITC עבור ציר ה-x ו-CCR7 APC-Cy7 עבור ציר ה-y. לחץ על כפתור Cross Gate. באמצעות הספים החיוביים/שליליים של FITC ו-APC-Cy7 שנקבעו על ידי בקרת האיזוטיפ כהפניות, השתמש בשער הצלב כדי לסווג את התאים, תוך קביעת הפרופורציות של תאי CD11b+ CD68+ CCR7+ (דמויי M1) ותאי CD11b+ CD68+ CCR7- (דמויי M2) (איור 2B).
      הערה: עקרונות השער לניתוח הפרופורציות של מקרופאגים דמויי M1 (Mø דמוי M1), מקרופאגים דמויי M2 (Mø דמוי M2), מיקרוגליה דמוית M1 (MG דמוי M1) ומיקרוגליה דמוית M2 (MG דמוית M2) עקביים עם אלה המשמשים לניתוח תאים דמויי M1 ודמויי M2. הספים להבחנה בין אותות פלואורסצנטיים חיוביים ושליליים מבוססים על צינור הבקרה האיזוטיפי, המשמש כהתייחסות להגדרת השערים. תהליך פעולת התוכנה מתואר באיור 2B, ופרופילי ביטוי הסמן המשמשים לקביעת פרופורציות התא מתוארים בפירוט בסעיף התוצאות המייצגות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תאי החיסון מרקמת חוט השדרה מופרדים באמצעות סיליקה קולואידית המצופה בצנטריפוגה של שיפוע צפיפות פוליוויניל פירולידון. במהלך תהליך הצנטריפוגה, התאים מפוזרים לשכבות שונות בהתאם לצפיפות הציפה שלהם, ובכך משיגים הפרדת תאים (איור 1). מלמעלה למטה, ההתפלגות היא כדלקמן: פסולת סלולרית, שכבה עשירה בתאים חד-גרעיניים, שכבה עשירה בלימפוציטים, ובתחתית, שכבת האריתרוציט והגרנולוציטים.

ניתוח FCM של תאים דמויי M1 ודמויי M2 משתמש בפרופיל ביטוי סמן תאים המורכב מ-CD68, CD45, CD11b ו-CCR7...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יצירה מוצלחת של מודל חיות SCI היא חיונית. מודל ה-SCI הוקם על ידי חשיפת חוט השדרה במקטע T9 לכוח של 0.5 N. ההצלחה של המודל החייתי הודגמה על ידי זנב העכבר המתכרבל, שתי הגפיים האחוריות חוות עוויתות, והגפיים האחוריות משותקות, מה שלא מאפשר לעכבר ללכת אחרי ה-SCI (ראה שלב 2.3). טיפול לאחר הניתוח הוא קריטי להישרדות העכבר. טיפול במתן שתן ניתן עד שהעכבר יכול להשתין באופן עצמאי. כמו כן, יש צורך למנוע דם בשתן הנגרם על ידי זיהום. יש למנוע נפיחות וזיהום בגפיים האחוריות של העכבר לאחר הניתוח, ולנקוט באמצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוכרזו ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 82072416); וקרן צוות החדשנות המדעית והטכנולוגית ברמה הגבוהה של בית החולים המסונף הראשון של המכללה הרפואית בנגבו (BYYFY2022TD001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 ופעמים; PBS  סולארביועמ' 1020
10 פעמים; PBS  סולארביועמ' 1022
18 עכברים נקבות C57/BL6 בנות שמונה שבועות Cavens Laboratory Animal Ltd, צ'אנג ג'ואו, סין
APC-eFluor 780 עם תווית Rat Anti-Mouse CCR7 (IgG2b kappa)Invitrogen47-1971-820.25μ גרם/מבחן
APC-eFluor 780 עם תווית Rat IgG2b kappa  בקרת איזוטיפInvitrogen47-4321-820.25μ גרם/מבחן
חולדה נגד עכבר CD45 עם תווית APC (IgG2b kappa)Invitrogen17-0451-820.125μ גרם/מבחן
חולדה עם תווית APC IgG2b kappa  בקרת איזוטיפInvitrogen17-4031-820.125μ גרם/מבחן
DMEMג'יבקו11965092
סרום בקר עוברילונסרהS711-001
חולדה נגד עכבר CD68 עם תווית FITC (IgG2b kappa)Invitrogen  MA5-166760.25μ גרם/מבחן
חולדה עם תווית FITC IgG2b kappa  בקרת איזוטיפInvitrogen11-4031-820.25μ גרם/מבחן
פרפורמלדהידביושארפ23319084
CD11b נגד עכברים עם תווית PE (IgG2b kappa)Invitrogen12-0112-810.25μ גרם/מבחן
חולדה עם תווית PE IgG2b kappa  בקרת איזוטיפInvitrogen12-4031-820.25μ גרם/מבחן
פרקול  סולארביועמ' 8370
תמיסת טריפסיןביושארפBL526א

מקורות

  1. Rubiano, A. M., Carney, N., Chesnut, R., Puyana, J. C. Global neurotrauma research challenges and opportunities. Nature. 527 (7578), S193-S197 (2015).
  2. Fehlings, M., Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clin Epidemiol. 6, 309-331 (2014).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. Immune response following traumatic spinal cord injury: Pathophysiology and therapies. Front Immunol. 13, 1084101(2023).
  4. Sun, X., et al. Multiple organ dysfunction and systemic inflammation after spinal cord injury: A complex relationship. J Neuroinflammation. 13 (1), 260(2016).
  5. Brockie, S., Zhou, C., Fehlings, M. G. Resident immune responses to spinal cord injury: Role of astrocytes and microglia. Neural Regen Res. 19 (8), 1678-1685 (2024).
  6. Wang, Z., Zhou, W., Zhang, Z., Zhang, L., Li, M. Metformin alleviates spinal cord injury by inhibiting nerve cell ferroptosis through upregulation of heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 19 (9), 2041-2049 (2024).
  7. Li, F., et al. Lupenone improves motor dysfunction in spinal cord injury mice through inhibiting the inflammasome activation and pyroptosis in microglia via the nuclear factor kappa B pathway. Neural Regen Res. 19 (8), 1802-1811 (2024).
  8. Zhou, H. -Y., et al. Dynamic development of microglia and macrophages after spinal cord injury. Neural Regen Res. 20 (12), 3606-3619 (2024).
  9. Hakim, R., et al. Spinal cord injury induces permanent reprogramming of microglia into a disease-associated state which contributes to functional recovery. J Neurosci. 41 (40), 8441-8459 (2021).
  10. Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096(2022).
  11. Zeng, F., et al. Microglia overexpressing brain-derived neurotrophic factor promote vascular repair and functional recovery in mice after spinal cord injury. Neural Regen Res. , (2024).
  12. Tang, Y., Le, W. Differential roles of M1 and M2 microglia in neurodegenerative diseases. Mol Neurobiol. 53 (2), 1181-1194 (2015).
  13. Butovsky, O., Weiner, H. L. Microglial signatures and their role in health and disease. Nat Rev Neurosci. 19 (10), 622-635 (2018).
  14. Wang, J., He, W., Zhang, J. A richer and more diverse future for microglia phenotypes. Heliyon. 9 (4), e14713(2023).
  15. Zeng, F., et al. Knockout of TNF-α in microglia decreases ferroptosis and convert microglia phenotype after spinal cord injury. Heliyon. 10 (17), e36488(2024).
  16. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  17. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
  18. Hao, D., et al. Trends of epidemiological characteristics of traumatic spinal cord injury in China, 2009-2018. Eur Spine J. 30 (10), 3115-3127 (2021).
  19. Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell Mol Life Sci. 72 (21), 4111-4126 (2015).
  20. Kong, X., Gao, J. Macrophage polarization: A key event in the secondary phase of acute spinal cord injury. J Cell Mol Med. 21 (5), 941-954 (2016).
  21. Lech, M., Anders, H. -J. Macrophages and fibrosis: How resident and infiltrating mononuclear phagocytes orchestrate all phases of tissue injury and repair. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1832 (7), 989-997 (2013).
  22. Mosley, R. L., et al. The glial scar-monocyte interplay: A pivotal resolution phase in spinal cord repair. PLoS One. 6 (12), e27969(2011).
  23. Zhu, Y., et al. Hematogenous macrophage depletion reduces the fibrotic scar and increases axonal growth after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 74, 114-125 (2015).
  24. Hou, C., et al. Mono-macrophage-derived MANF protects against lipopolysaccharide-induced acute kidney injury via inhibiting inflammation and renal M1 macrophages. Inflammation. 44 (2), 693-703 (2020).
  25. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. -S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  26. Zhang, J., et al. The effects of the M2a macrophage-induced axonal regeneration of neurons by arginase 1. Biosci Rep. 40 (2), BSR20193031(2020).
  27. Li, J. L., et al. The polarization of microglia and infiltrated macrophages in the injured mice spinal cords: A dynamic analysis. PeerJ. 11, e14929(2023).
  28. Gratama, J. W., et al. Analysis of variation in results of flow cytometric lymphocyte immunophenotyping in a multicenter study. Cytometry. 30 (4), 166-177 (1997).
  29. Delarasse, C., Fontaine, B., El-Behi, M., Martin, E. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. (124), e55781(2017).
  30. Chen, Y. J., et al. Temporal kinetics of macrophage polarization in the injured rat spinal cord. J Neurosci Res. 93 (10), 1526-1533 (2015).
  31. Chen, Y. -Q., et al. CRID3, a blocker of apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ameliorates murine spinal cord injury by improving local immune microenvironment. J Neuroinflammation. 17 (1), 255(2020).
  32. Vijay, S., Nair, R. R., Sharan, D., Jakkala, K., Ajitkumar, P. Percoll discontinuous density gradient centrifugation method for the fractionation of the subpopulations of Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis from in vitro cultures. MethodsX. 11 (7), 102344(2023).
  33. Sharma, A., et al. Successful transplantation of transfected enriched buffalo spermatogonial stem cells to homologous recipients. Theriogenology. 142, 441-449 (2020).
  34. Sims, N. R., Anderson, M. F. Isolation of mitochondria from rat brain using Percoll density gradient centrifugation. Nat Protoc. 3 (7), 1228-1239 (2008).
  35. Maurer, F., et al. Continuous Percoll gradient centrifugation of erythrocytes: Explanation of cellular bands and compromised age separation. Cells. 11 (8), 1296(2022).
  36. Gamboa-Suárez, B. A., Lotta-Arévalo, I. A., Sarmiento-Salazar, F., Matta, N. E. Finding a needle in a haystack: DNA Haemoproteus columbae enrichment using percoll density gradient and flow cytometry. Vet Parasitol. 328, 110170(2024).
  37. Cao, Y., et al. Paeoniflorin suppresses kidney inflammation by regulating macrophage polarization via KLF4-mediated mitophagy. Phytomedicine. 116, 154901(2023).
  38. Nishihara, T., et al. Chronic constriction injury of the sciatic nerve in rats causes different activation modes of microglia between the anterior and posterior horns of the spinal cord. Neurochem Int. 134, 104672(2020).
  39. Durafourt, B. A., et al. Comparison of polarization properties of human adult microglia and blood-derived macrophages. Glia. 60 (5), 717-727 (2012).
  40. Wachholz, S., et al. Microglia activation is associated with IFN-alpha induced depressive-like behavior. Brain Behav Immun. 55, 105-113 (2016).
  41. Chen, X., et al. Correlations between macrophage polarization and osteoinduction of porous calcium phosphate ceramics. Acta Biomater. 103, 318-332 (2020).
  42. Guo, S. D., et al. Nasal delivery of Fasudil-modified immune cells exhibits therapeutic potential in experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurosci Ther. 25 (6), 783-795 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CD11bCD68CCR7M1 M2
זיהוי מיקרוגליה ומקרופאגים חודרים היקפיים בחוט השדרה הפגוע באמצעות ציטומטריית זרימה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.