אנו מתארים פלטפורמת בדיקה חיסונית שפותחה לאחרונה המבוססת על עקרונות הביולוגיה הסינתטית נטולת התאים וטכניקת כתמי הנקודות לזיהוי מותאם אישית של תגובת נוגדנים בבני אדם ובעלי חיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כתם נקודות נטול תאים כפלטפורמת בדיקה חיסונית מעשית וניתנת להתאמה לזיהוי תגובת נוגדנים בסרום של בני אדם ובעלי חיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
שרשרת ההתפרצויות הפתוגניות העולמיות בשני העשורים האחרונים הדגישה את החשיבות של אסטרטגיות מעקב סרולוגי. פלטפורמות בדיקה חיסונית המשמשות לאיתור נוגדנים ספציפיים למחלה בסרום של חולים נמצאות בליבת המעקב הסרולוגי. דוגמאות נפוצות כוללות מבחני אימונוסורבנט הקשורים לאנזים ומבחני זרימה רוחבית; עם זאת, בעוד שמדובר בשיטות סטנדרטיות זהב, הן דורשות חומרים מתכלים ספציפיים לפתוגן וציוד מיוחד, מה שמגביל את השימוש בהם מחוץ למעבדות בעלות משאבים טובים.
לאחרונה פיתחנו פלטפורמת בדיקה חיסונית חדשה בשם Cell-Free Dot-Blot (CFDB) ואימתנו אותה באמצעות נסיוב אנושי ובעלי חיים כנגד SARS-CoV-2. בניגוד לבדיקות אימונולוגיות קונבנציונליות, דגימות סרום של חולי CFDB משותקות לשלב מוצק (קרום ניטרוצלולוזה), בעוד אנטיגן המטרה מושעה בשלב הנייד של הבדיקה. כדי לשפר את הגישה ליכולות מעקב סרולוגי, אנטיגנים של CFDB מיוצרים לפי דרישה ועם תשתית עומס נמוכה באמצעות ביטוי חלבון במבחנה . כאן, האנטיגן מתמזג עם תג פפטיד שניתן לזהות באמצעות חלבון מדווח אוניברסלי יחיד עבור כל בדיקת CFDB. התוצאה היא שה-CFDB אינו דורש גישה לקורא צלחות מרובה בארות או לרכיבי בדיקה מולקולרית מסחריים מטוהרים. עם שיקולי תכנון אלה, CFDB מטפל בחסרונות של פלטפורמות הבדיקה החיסוניות הקיימות על ידי מתן נגישות למעבדות לא ריכוזיות, יכולת הסתגלות לפתוגנים מתעוררים ומחיר סביר לקהילות בעלות הכנסה נמוכה.
במאמר הנוכחי נספק פרוטוקול שלב אחר שלב להכנה וביצוע של בדיקת חיסון CFDB. באמצעות עבודתנו האחרונה על SARS-CoV-2 CFDB כדוגמה, נסקור תכנון DNA של אנטיגן לייצור נטול תאים לפי דרישה, ואחריו הכנת חלבון מדווח CFDB, קיבוע דגימות סרום בשלב המוצק, ולבסוף, שלבי קשירת אנטיגן וזיהוי של הבדיקה. אנו צופים כי על ידי ביצוע הוראות אלה, חוקרים יוכלו להתאים את בדיקת ה-CFDB כדי לזהות תגובות חיסוניות בנסיוב אנושי ובעלי חיים לכל פתוגן נתון.
מבוא
מגיפת COVID-19 חשפה את הצורך הקריטי בכלי אבחון זולים וניתנים להרחבה, במיוחד עבור סביבות דלות משאבים1. בדיקות אימונולוגיות קונבנציונליות כמו מבחני אימונוסורבנט מקושרים לאנזים (ELISAs) הוכחו כחיוניים לאיתור תגובות חיסוניות 2,3. עם זאת, עלותם הגבוהה, ההסתמכות על ריאגנטים מורכבים והתלות בציוד מיוחד מגבילים את נגישותם, במיוחד במהלך משברי בריאות עולמיים. בתגובה לאתגרים אלה, פיתחנו את כתם הנקודות ללא תאים (CFDB), פלטפורמת בדיקה חיסונית בעלות נמוכה וניתנת להתאמה המיועדת לזיהוי נוגדנים נגד SARS-CoV-2 בבני אדם ובבעלי חיים.
CFDB ממנף ביולוגיה סינתטית נטולת תאים לייצור מהיר לפי דרישה של אנטיגנים נגיפיים באמצעות תבניות DNA ליניאריות 4,5. זה מבטל את הצורך בתהליכי שיבוט, ביטוי וטיהור מסורתיים מבוססי תאים, ומאיץ משמעותית את ייצור האנטיגן תוך הפחתת עלויות. שיטת CFDB מפשטת את זיהוי הנוגדנים על ידי שימוש בפורמט כתם נקודות, שבו הסרום מזוהה ישירות על ממברנות הניטרוצלולוזה. מערכת זו מייתרת את הצורך בצלחות מרובות בארות יקרות וציוד מעבדה מיוחד, מה שמאפשר זרימת עבודה פשוטה של "טבילה" לשלבי הדגירה והשטיפה. הפלטפורמה משתמשת גם במערכת SpyCatcher-SpyTag, שבה כימרה של SpyCatcher2-Apex2 peroxidase פועלת כמגיב זיהוי משני אוניברסלי 5,6. זה מיוצר באמצעות ביטוי סטנדרטי מבוסס Escherichia coli, המבטל את התלות במצומדים מסחריים יקרים של נוגדנים. כתוצאה מכך, מערכת CFDB יכולה לבצע בדיקות סרולוגיות עם ביצועים דומים ל-ELISA בעלות נמוכה משמעותית - כ-3 דולר לבדיקת דגימה של 96 בהשוואה ליותר מ-300 דולר לערכת ELISA מסחרית5.
כדי להדגים את יעילותו של CFDB, בדקנו את יכולתו לזהות נוגדנים בסדרות אנושיות ובעלי חיים מוגדרות מראש. התוצאות שלנו היו בקורלציה הדוקה עם ELISA בזיהוי דגימות חיוביות ושליליות ל-COVID-19. בנוסף לאבחון אנושי, הערכנו את התועלת של CFDB במודלים של בעלי חיים, בדקנו סרום מאוגרים נגועים ב-SARS-CoV-2 וכאלה שחוסנו בחלבון נוקלאוקפסיד רקומביננטי. בדיקות אלו אישרו את הפוטנציאל של CFDB לשימוש באבחון אנושי ווטרינרי כאחד, מה שהופך אותו לכלי רב-תכליתי לניטור תגובות חיסוניות בין מינים. אחד היתרונות המרכזיים של CFDB הוא הגמישות שלו. פשוט על ידי שינוי תבנית ה-DNA המקודדת את האנטיגן המעניין, ניתן להתאים את הפלטפורמה במהירות לאיתור נוגדנים נגד פתוגנים שונים, מה שהופך אותה לבעלת ערך למוכנות למגיפה עתידית. העלות הנמוכה, זרימת העבודה הפשוטה ודרישות התשתית המינימליות שלו הופכים אותו למתאים במיוחד עבור מעבדות מבוזרות וסביבות דלות משאבים, שבהן הגישה לאבחון מסחרי מוגבלת.
בעבודה זו נספק הוראות שלב אחר שלב להכנה וביצוע בדיקת CFDB. ראשית, אנו מכסים את התכנון והסינתזה של תבניות DNA ליניאריות לייצור אנטיגנים ללא תאים, שהם ריאגנטים לזיהוי העיקריים של הבדיקה. לאחר מכן אנו מתארים שלבים להכנת מגיב הזיהוי המשני של הבדיקה SpyCatcher2-Apex2. לאחר מכן, אנו מספקים הוראות לייצור נטול תאים ובדיקת איכות של האנטיגנים עצמם. לבסוף, אנו מתארים בפירוט את התהליך לביצוע בדיקת CFDB על דגימות סרום של בני אדם או בעלי חיים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים באוגרים בוצעו במעבדה הלאומית למיקרוביולוגיה (NML) בסוכנות לבריאות הציבור של קנדה, באישור המרכז הקנדי למדע לבריאות האדם ובעלי החיים, ובהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. כל דגימות הסרום/פלזמה האנושיות הושגו באופן מסחרי לבדיקה פנימית או סופקו על ידי משתפי פעולה קליניים ל-NML לבדיקה עצמאית ב-NML.
1. תכנון והכנה של תבניות ביטוי ליניאריות אנטיגן (LETs)
- תכנן את הביטוי נטול התאים LETs עבור אנטיגן המטרה על סמך ההוראות ב-Norouzi et al.7 ומכיל מסוף N/C SpyTag כמתואר ב-Norouzi et al.5.
הערה: כאן אנו מספקים פרטים להכנת חלבון נוקלאוקפסיד SARS-CoV-2 (NP, חומצות אמינו 2-419).- ודא שה-LET עבור SARS-CoV-2 NP (איור 1 וקובץ משלים 1) מכיל אתרי 5' ו-3' Ter עם רצף מאגר של 50 זוגות בסיסים לפני מקדם T7 ואחרי קודון העצירה.
- סמן את חלבון ה-NP בקצה ה-N עם 6-SpyTag-TEV שלו.
- השג את רצף החלבון ממסד הנתונים של UniProt (קוד גישה P0DTC9) ובצע אופטימיזציה של קודון לביטוי מבוסס E. coli באמצעות כלי אופטימיזציה של קודון IDT8. הזמינו רצף זה לסינתזה מסחרית כמקטע DNA חד-גדילי התלוי במים ב-10 ננוגרם/מיקרוליטר.
הערה: אתר מחשוף הפרוטאז TEV ותג His6 אינם מאפיינים חיוניים בעיצוב ה-LET.
- PCR מגביר את שבר ה-DNA עם ה-Ter FW האוניברסלי (GGCTCCGAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCGGCC
ACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCG) ו-Ter RV (CCGAGGCAATAAGTATGTTGTAACTAAAGTGCTCAG
CTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCC) באמצעות ערכת DNA פולימראז בנאמנות גבוהה (ראה טבלת החומרים)- הגדר תגובה של 100 מיקרוליטר באופן הבא: 75 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז, 20 מיקרוליטר של מאגר DNA פולימראז פי 5, 2 מיקרוליטר של 10 מ"מ dNTPs (ריכוז סופי של 200 מיקרומטר), 0.5 מיקרוליטר של פריימר 100 מיקרומטר Ter-FW, 0.5 מיקרוליטר של פריימר 100 מיקרומטר Ter-RV, 1 מיקרוליטר של 10 ננוגרם/מיקרוליטר LET חד-גדילי, 1 מיקרוליטר (2U) של DNA פולימראז.
- השתמש בהגדרות ה-PCR הבאות: דנטורציה ראשונית ב-98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 35 מחזורים: 98 מעלות צלזיוס למשך 6 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות; יש להחזיק בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR מסחרית, לבדוק את איכותו על ידי הפעלת דגימה על ג'ל אגרוז 1%, ולמדוד את ריכוזו בספקטרופוטומטר UV-Vis.
הערה: ניתן להשתמש במוצרי PCR גולמיים גם ישירות לביטוי נטול תאים. עם זאת, הטיהור מאפשר הליך סטנדרטי יותר.
איור 1: תבנית ביטוי ליניארית עבור SARS-CoV-2-NP. סכמטי המייצג תכונות של תבנית ה-DNA הליניארית His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP. מרכיבי תבנית DNA מרכזיים מסומנים. רצף הקידוד של החלבון המבוקש, כאן ה-NP, ממוקם תחת בקרת השעתוק של מקדם T7 לביטוי יעיל. בקצה ה-N, חלבון ה-NP מצורף ל-SpyTag לזיהוי ספציפי באמצעות מגיב הזיהוי SpyCatcher2-Apex2. אתרי הפרוטאז x6His-tag ו-TEV, למרות שהם כלולים כחלק מעיצוב ה-LET הכללי, ניתנים לוויתור למטרות CFDB. בקצה תבנית ה-DNA הליניארית, אתרי Ter "במעלה הזרם" ו"במורד הזרם", שלכל אחד מהם קודמים 50 רצפי חיץ זוגות בסיסים בהתאמה, כלולים להגנה בתיווך Tus מפני פירוק DNA אקסונוקלאוליטי בליזאט נטול התאים. קיצורים: NP = חלבון נוקלאוקפסיד; LET = תבנית ביטוי ליניארית; TEV = וירוס תחריט טבק; CFDB = כתם נקודות נטול תאים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
2. טיהור חלבון המדווח SpyCatcher2-Apex2
- השתמש בפלסמיד pET24b-SpyCatcher2-Apex2, שנבנה במקור ב-Norouzi et al.5 (רצף מלא בקובץ משלים 2 ומפת פלסמיד באיור משלים S1) כדי להכין את חלבון המדווח SpyCatcher2-Apex-2.
- הכינו צלחות אגר ומרק ליזוגני (LB) המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין. הפוך תאי E. coli BL21 (DE3) עם הפלסמיד pET24b-SpyCatcher2-Apex2. יש לחסן מושבה בודדת לתרבית LB התחלתית של 15 מ"ל ולגדל בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-250 סל"ד.
- למחרת, הוסף 10 מ"ל של תרבית המתנע ל-500 מ"ל של מדיה LB טרייה המכילה 50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-250 סל"ד עד שהתרבית מגיעה לצפיפות אופטית ב-600 ננומטר של 0.6-0.8 (~3 שעות).
- לגרום לביטוי של SpyCatcher2-Apex2 על ידי השלמת התרבית עם 0.5 מ"מ isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside ו-1 mM 5-aminolevulinic acid hydrochloride. הפחיתו את טמפרטורת הגידול ל -30 מעלות צלזיוס ואפשרו לתרבות לדגור למשך 4 שעות נוספות.
- קצרו את החיידקים על ידי צנטריפוגה בחום של 8,000 × גרם למשך 15 דקות. המשך לליזה של תאים או לחילופין אחסן את הגלולה ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
- השהה מחדש את הגלולה ב-20 מ"ל של מאגר ליזה המכיל 50 מ"מ Tris-HCl (pH 7.8), 300 מ"מ NaCl, 1 מ"ג/מ"ל ליזוזים, טבלית מעכב פרוטאז ללא EDTA ו-1 מ"מ דיתיותרייטול (DTT). לייז את התאים על ידי סוניקציה במשרעת של 50% עם מרווחים של 5 שניות ON ו-10 שניות OFF למשך זמן ON כולל של 3 דקות.
- הבהירו את הליזאט על ידי צנטריפוגה ב -20,000 × גרם למשך שעה ב -4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר.
- הוסף המין כלוריד לריכוז סופי של 250 מיקרומטר לליזט המובהר ודגר למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. המשך לטיהור חלבון.
הערה: דגירה עם המין כלוריד ממקסמת את שילוב הם בפרוקסידאז Apex-2 לפעילות אנזימים מיטבית. - הוסף 2.5 מ"ל של שרף Ni לליזט המובהר ודגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין למשך 45 דקות. מרחו את התערובת על עמוד זרימת כוח הכבידה ושטפו את השרף עם 50 מ"ל של מאגר טריס (50 מ"מ Tris-HCl (pH 7.8), 300 מ"מ NaCl ו-1 מ"מ DTT).
- הסר את החלבון SpyCatcher2-Apex2 ב-25 מ"ל של מאגר Tris המכיל 400 מ"מ אימידזול. תרכיז וחוצץ מחליפים את הפליטה למאגר Tris באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלית, במטרה לנפח סופי של 0.5-1.0 מ"ל.
- השתמש במקדם ההכחדה המולרית של SpyCatcher2-Apex2 (27,390 M-1 cm-1) כדי לקבוע את ריכוז החלבון בספקטרופוטומטר UV-Vis. מוסיפים גליצרול לריכוז סופי של 40% ומאחסנים את המינונים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
הערה: פרוטוקול זה צפוי להניב כ-40 מ"ג של SpyCatcher2-Apex2 טהור ופעיל במיוחד, מספיק ל-400 ריצות CFDB בגודל כתם סטנדרטי של 96 דגימות. - לזיהוי חלבוני SpyTagged באמצעות כתם מערבי קונבנציונאלי9 ולניסויי CFDB, חסום תמיד ממברנות בחלב יבש ללא שומן 5% בתמיסת מלח 1x Tris-buffered המכילה 0.05% Tween-20 (TBST). השתמש בחלבון SpyCatcher2-Apex2 בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל בתמיסת חסימה.
הערה: מדווח SpyCatcher2-Apex2 דורש פתרון כימילומינסנציה משופר (ECL) לפיתוח אותות. ניתן להשיג את תמיסת ה-ECL באופן מסחרי או להכין אותה בבית על פי ההוראות ב-Mruk et al.10. תמיסת ה-ECL הסופית כאן מורכבת מ-0.4 מ"מ חומצה p-קומרית, 2.5 מ"מ לומינול ו-0.015% H2O2 ב-100 מ"מ Tris-HCl (pH 8.6).
3. ייצור ללא תאים ובדיקת איכות של אנטיגנים
- הכן והרכיב רכיבי ליזאט ותגובה נטולי תאים של E. coli BL21 על ידי ביצוע ההוראות ב- Levine et al.11 ו- Norouzi et al.5. השלם את תערובת התגובה הסופית עם 5 μM חלבון Tus ו-1.2 μM T7 RNA פולימראז כדלקמן לתגובה מייצגת של 100 מיקרוליטר: 14.6 מיקרוליטר של תמיסה A, 14 מיקרוליטר של תמיסה B, 33.3 מיקרוליטר של E. coli BL21 ליזאט, 2.5 מיקרוליטר של 200 מ"מ חלבון Tus, 1.2 מיקרוליטר של 100 מ"מ T7 RNA פולימראז, 1 מיקרוליטר של תבנית DNA ליניארית של 1.5 מיקרומטר, 33.4 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז.
הערה: ראה קובץ משלים 3 להוראות מפתח להכנת ליזט נטול תאים E. coli BL21 וטבלה משלימה S1 למתכון מפורט של פתרונות A ו-B. ניתן להכין את מערכת הביטוי ללא תאי E. coli גם באמצעות פרוטוקולים חלופיים או להשיג באופן מסחרי, כל עוד התגובה מתווספת ל-Tus ו-T7 RNA Polymerase. - בצע בדיקת ביטוי ראשונית בקנה מידה של 5 מיקרוליטר על ידי הוספת תוצר PCR גולמי של 10% (v/v) לתגובה נטולת התאים בשפופרת PCR. דגירה ללא ניעור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות.
- בדוק את איכות הביטוי של אנטיגן NP על ידי העמסת 1 מיקרוליטר של התגובה נטולת התאים על ג'ל פוליאקרילאמיד 12% נתרן דודציל סולפט (SDS-PAGE) ולאחר מכן העבר אותו לקרום ניטרוצלולוזה לכתם מערבי כמתואר בשלב 2.12. השתמש בחלבון המדווח SpyCatcher2-Apex2 לתיוג כתמים באמצעות SpyTag, ואופציונלי, נוגדן מסחרי ספציפי (כאן אנטי-SARS-CoV-2-NP) כנגד אנטיגן המטרה.
- הרכיבו תגובה נטולת תאים בקנה מידה של 1 מ"ל עם מוצר LET מטוהר של 15 ננומטר שישמש לבדיקת CFDB. דגרו את תערובת הביטוי בצינור חרוטי של 15 מ"ל עם ניעור ב-80 סל"ד למשך 15 שעות ב-30 מעלות צלזיוס. בדוק את איכות הביטוי באמצעות כתם מערבי ואחסן 50 מיקרוליטר ב-20 מעלות צלזיוס.
4. דגימות סרום
- השג דגימות סרום (או פלזמה) של בני אדם/בעלי חיים ממקורות מסחריים או משתפי פעולה קליניים או בתוך החברה תוך שימוש בנהלים סטנדרטיים ובהתאם להנחיות של ועדת אתיקה מוסדית למחקר בבני אדם או ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים. ודא שננקטו אמצעים מתאימים לטיפול מקדים בדגימה כדי להפחית את הסיכונים לזיהום.
הערה: אמצעי טיפול מקדים עשויים לכלול טיפול בחומר ניקוי ממס, השבתת חום ובדיקת סמני וירוסים הנישאים בדם. פרוטוקול שימושי לבידוד סרום ופלזמה מדם מלא זמין12. בדומה לפלטפורמות אחרות של בדיקות חיסוניות, דגימות סרום שנאספו מוקדם (<3 שבועות) לאחר הזיהום הראשוני או הופעת המחלה אינן צפויות להכיל רמות נאותות של תגובת נוגדנים ויש להתייחס לתוצאותיהן בזהירות. - לאימות איכות של ריאגנטים של SARS-CoV-2 NP CFDB, השתמש בפאנל הייחוס הבינלאומי של המכון הלאומי לתקנים ובקרה ביולוגיים (NIBSC) של ארגון הבריאות העולמי (WHO) לאימונוגלובולין נגד SARS-CoV-2, המכיל דגימות חיוביות ל-x1 לפני COVID-19 ו-x4 SARS-CoV-2 עם רמות שונות של אימונוגלובולינים נגד NP13. לחלופין, השתמש בדגימות סרום בריאות וחיוביות ממקורות אחרים.
- עבור ניסויי CFDB, השג או הכן דגימת בקרה שלילית על ידי איגום מספר (>3) דגימות סרום בריאות כדי להגביר את הדיוק ולהקל על הניתוח והפרשנות של התוצאות.
5. הליך כתם נקודות ללא תאים (CFDB).
- הורד והדפס את קובץ תמונת הרשת הראשית (איור משלים S2). רשת המאסטר היא תבנית בגודל 6X6 ס"מ המכילה 12X12 עיגולים בקוטר 2 מ"מ כל אחד ומספקת יכולת איתור הדומה לצלחת של 96 בארות.
- סנדוויץ' את הרשת בחוזקה בין שתי שכבות של סרט איטום לוחית PCR דביק וחתוך לגודל לאורך גבולות הרשת החיצונית. השתמש באגרוף ביופסיה של 2 מ"מ כדי לחלול כל עיגול מסומן.
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר ברשת ראשית זו מספר פעמים לאחר ניגוב עם 70% אתנול. - חותכים חתיכה של קרום ניטרוצלולוזה בגודל 6.5 על 6.5 ס"מ ומקמו אותה מתחת לרשת הראשית על משטח נקי, ואבטחו את ההתקנה באמצעות סרט דבק כפי שמוצג באיור 2 ובאיור משלים S3. השתמש בעט טוש כדי לסמן את מיקומי המעגל החיצוניים ביותר על קרום הניטרוצלולוזה שישמש כמדריך לחיתוך הממברנה לאחר איתור הדגימה.
- יש לדלל את דגימות הסרום 1/10 בתמיסת מלח 1x עם חוצץ פוספט (pH 7.4). השתמש במיקרופיפטה כדי להוציא נפחים משולשים של 0.4 מיקרוליטר מכל דגימה על קרום הניטרוצלולוזה במיקומי רשת שנקבעו מראש. זה ייקח בערך 15 שניות למקום לחלק.
הערה: הקפד לכלול דגימות בקרה שליליות וחיוביות בכל בדיקה, מכיוון שהדבר יידרש לניתוח התוצאות. - אפשר 10 דקות בטמפרטורת הסביבה עד שהדגימות המנוקדות נקשרות ומתייבשות. בעזרת פינצטה שולפים בזהירות את קרום הניטרוצלולוזה וחותכים לאורך העיגולים החיצוניים המסומנים.
- חסום את הממברנה ב-10 מ"ל של תמיסת חסימה (5% חלב יבש ללא שומן ב-TBST) בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, תוך ניעור עדין ב-100 סל"ד.
- הפשירו והוסיפו 50 מיקרוליטר של תערובת ביטוי האנטיגן נטולת התאים ל-5 מ"ל של תמיסת חסימה בצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ. העבירו את הממברנה ישירות לתמיסה המכילה אנטיגן זו ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה, תוך ניעור ב -100 סל"ד.
הערה: זה יהיה שלב הזיהוי העיקרי שבו האנטיגן SpyTagged ייקשר למיקומים נקודתיים המכילים נוגדנים, אם קיימים. - שטפו את הממברנה, שטפו במשך 5 דקות ושטפו שוב ב-TBST לפני שתמשיך לשלב הזיהוי המשני.
- דגרו את הממברנה ב-10 מ"ל של מאגר חוסם המכיל 10 מיקרוגרם/מ"ל של חלבון SpyCatcher2-Apex2 מטוהר, למשך שעה אחת תוך ניעור ב-100 סל"ד.
- שוטפים את הממברנה ושוטפים 2 x 5 דקות ב- TBST, עם שטיפה אחרונה ב- TBS.
- הדביקו ואבטחו פיסת פרפילם על אזור עבודה נקי קרוב למכשיר הדמיית הכתמים. הסר עודפי נוזלים על ידי הקשה על הממברנה באמצעות פינצטה והנח את הממברנה על גבי הפרפילם.
- מוסיפים מיד 3 מ"ל (100 מיקרוליטר/ס"מ2) של תמיסת ECL על גבי הממברנה ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 90 שניות בדיוק.
- יבש מיד את הממברנה והעביר למכשיר הדמיה תואם כימילומינסנציה להדמיה של התוצאות.
הערה: זמן ההדמיה האופטימלי עשוי להשתנות במכשירים שונים. מומלץ להשתמש בהגדרות ברירת המחדל של זמן הרכישה האוטומטית של המכשיר, ואם נעדר, השתמש בדגימות סרום מאופיינות מראש כדי לייעל את זמן רכישת התמונה. - השתמש בפונקציית ניתוח התמונה של המכשיר כדי להשיג עוצמות נקודתיות, כולל עבור שלושה מיקומים ריקים (רקע) על קרום הניטרוצלולוזה; שמור על נפח מדידה קבוע לכל נקודה. ייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני, וזכור לתייג נכון כל מיקום נקודתי.
- חשב את הממוצע וסטיית התקן (SD) של עוצמות נקודתיות משולשות. לאחר מכן, הפחיתו את רקע קרום הניטרוצלולוזה מכל הדגימות.
- השתמש במשוואה הבאה כדי לקבל ערך חיתוך לפירוש של תוצאות -/+:
(ממוצע של בקרות שליליות) + (3 x SD של הבקרות השליליות). קחו בחשבון דגימות חיוביות אם העוצמה הממוצעת שלהן יורדת מעל ערך החיתוך ושליליות אם העוצמה הממוצעת שלהן יורדת מתחת לערך החיתוך.
הערה: סכימה של נוהל CFDB מסופקת באיור 3.
איור 2: מכלול CFDB. סכמטי של רשת האב CFDB ומערך מכלול הממברנה NC. הרשת הראשית מונחת על קרום ה-NC כדי לספק דפוס קבוע וניתן להתייחסות לאיתור וקיבוע של דגימות סרום. קיצורים: CFDB = כתם נקודות נטול תאים; NC = ניטרוצלולוז. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה CFDB. בבדיקת CFDB, כמות קטנה (<0.4 מיקרוליטר) של דגימות סרום מדוללות פי 10 מופצת ידנית על קרום ניטרוצלולוזה חתוך מראש (פאנל שמאלי) במיקומים נפרדים וניתנים להתייחסות (פאנל אמצעי). הנחת דגימת סרום אחת לכל נקודה בכתמים משולשים וקיבוע תכולת החלבון, כולל מאגר הנוגדנים הכולל של הסרה, על מצע ה-NC המוצק (כתמים בז' בפאנל האמצעי). בדוגמה זו, נוגדנים נגד NP הכלולים בדגימות הסרום יכולים להיות קשורים תחילה על ידי מגיב הזיהוי הראשי של CFDB SpyTag-NP ולבסוף מזוהים על ידי מגיב הזיהוי המשני CFDB SpyCatcher2-Apex2 (בועה מוגדלת בפאנל הימני). נתון זה נלקח מ-Norouzi et al.5. קיצורים: CFDB = כתם נקודות נטול תאים; NP = חלבון נוקלאוקפסיד; LET = תבנית ביטוי ליניארית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הגברת PCR של תבנית הביטוי הליניארי עבור אנטיגן יעד
כדי להגביר את ה-PCR של SARS-CoV-2 NP LET, נעשה שימוש בפריימרים אוניברסליים של Ter קדימה ואחורה כמתואר בסעיף פרוטוקול 1.2 ו-1 מיקרוליטר של המוצר נבדק על ג'ל אגרוז (איור 4) לפני שהמשיכו לטיהור מוצר ה-PCR.
איור 4: PCR של תבנית ביטוי ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
COVID-19 הדגיש את החשיבות של אבחון נגיש וחזק לשליטה בהתפרצויות זיהום ואופטימיזציה של אסטרטגיות בריאות גלובליות. בדיקות סרולוגיות המגלות נוגדנים מגנים הוכחו כחיוניות למעקב אחר דפוסי הדבקה של וריאנטים חדשים, זיהוי נקודות חמות, הנחיית פיתוח חיסונים, מיון מקרים חשודים והגנה על אוכלוסיות פגיעות14. המגפה חשפה גם אי שוויון בנגישות הבדיקות, שהחמיר על ידי צבר ודרישות למתקנים עם ציוד מתוחכם15. לכן ההתמקדות כעת היא בחיזוק התגובה הגלובלית שלנו להתפרצוי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
M.N. ו-K.P. הם ממציאים שותפים של שיטת כתמי הנקודות נטולות התאים. הוגשה בקשת פטנט זמנית הקשורה לעבודה זו (PCT/CA2024/050097, הוגשה בינואר 2024).
תודות
ס.ס. ור.ז. נתמכים על ידי מימון מהסוכנות לפרויקטי מחקר מתקדמים של ההגנה (DARPA), חוזה מס' N66001-23-2-4042. הדעות, הדעות ו/או הממצאים המובעים הם של המחברים ואין לפרש אותם כמייצגים את העמדות או המדיניות הרשמית של משרד ההגנה או ממשלת ארה"ב. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ל-K.P. מתוכנית המענקים של קרן CIHR (201610FDN-375469), תוכנית קתדרת המחקר של CIHR קנדה (950-231075 ו-950-233107), יוזמת הרפואה של אוניברסיטת טורונטו, המקבלת מימון מקרן המצוינות במחקר הראשון של קנדה וכספים ל-K.P., מתוכנית המחקר והפיתוח הביטחוני הקנדית של קנדה (חוזה 39903-200137). איור 1 ואיור משלים S1 נוצרו באמצעות SnapGene Viewer.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סולם DNA 1 kb | NEB | N3232 | משמש כסמן גודל לג'ל אגרוז |
| 20 חומצות אמינו | Sigma-Aldrich | LAA21-1KT | רכיב של התגובה נטולת התאים תמיסה B |
| אגרוף ביופסיה 2 מ"מ | אינטגרה מילטקס | 33-31-P/25 | להכנת רשת מאסטר CFDB |
| 5-חומצה אמינולבולינית, הידרוכלוריד | Sigma-Aldrich | A3785 | Heme precursor לאינדוקציה של אבקת אגרוז SpyCatcher2-Apex2 |
| BioShop | AGA002 | לניתוח אלקטרופורטי של נוגדן | |
| DNA Anti-SARS-CoV2-Nucleocapsid | Sinobiological | 40588-T62 | לזיהוי WB של אנטיגן NP המיוצר ללא תאים |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | N/A | מכשיר הדמיית ג'ל |
| רכזים צנטריפוגליים | Cytiva | 28-9323-60 | לריכוז והחלפת חיץ של חלבונים |
| צנטריפוגה | Eppendorf | EP022628257 | לקצירת תרבית חיידקים |
| קואנזים הידרט מלח נתרן (CoA) | Sigma-Aldrich | C3144 | מרכיב של תמיסת התגובה נטולת התאים A |
| תקן חלבון מוכתם מראש בצבע (טווח רחב) | NEB | P7719 | משמש כסמן גודל עבור ג'ל SDS-PAGE פאנל |
| סרום Covid-19 | RayBiotech | CoV-PosSet | סרום מאופיין מראש לאימות ואופטימיזציה של ריאגנטים/תנאים |
| של CFDBD-(&מינוס;)-3-חומצה פוספוגליצרית מלח דיסודיום (3-PGA) | סיגמא-אולדריץ | P8877 | מרכיב של התגובה נטולת התאים תמיסה B |
| דיתיותרייטול (DTT) | סיגמא-אולדריץ' | 10197777001 | מרכיב של חוצצים |
| E. coli 5-alpha | NEB | C2987 | להכנת פלסמיד |
| אי קולי BL21 | NEB | C2530 | להכנת ליזטים נטולי תאים |
| אי קולי BL21 (DE3) | NEB | C2527 | לביטוי של SpyCatcher2-Apex2 |
| טבלית מעכב פרוטאז נטולת EDTA | Sigma-Aldrich | 11836153001 | מרכיב של מאגר ליזה E. coli |
| Eppendorf ניו ברונסוויק Innova 43/43R Incubator Shaker | Eppendorf | EPM1320 | Incubator לגידול תאי E. coli לביטוי חלבון והכנת ליזאט ללא תאים |
| חומצה פולינית | Sigma-Aldrich | 47612 | מרכיב של תמיסת התגובה נטולת התאים A |
| גליצרול | Sigma-Aldrich | G9012 | רכיב של מאגר אחסון SpyCatcher2-Apex2 |
| Hemin chloride | סיגמא-אולדריץ' | H9039 | לתוסף Heme של SpyCatcher2-Apex2 |
| מי חמצן 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | להכנת מגיב ECL |
| תוכנת מעבדת תמונות | Bio-Rad | 1709690 | תוכנה עבור ChemiDoc ג'ל מכשיר הדמיה |
| Isopropyl-b-D-1-thiogalactopyranoside | Bioshop | IPT001 | לאינדוקציה של SpyCatcher2-Apex2 expressikon |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | להכנת תרבית חיידקים SpyCatcher2-Apex2 |
| LB agar | BioShop | LBL406 | לגידול E. coli |
| מרק LB | BioShop | LBL407 | לגידול E. coli |
| לומינול | סיגמא-אולדריץ' | A4685 | להכנת מגיב ECL |
| ליזוזים | סיגמא-אולדריץ' | L6876 | לליזה של תאי חיידקים |
| מגנזיום אצטט | סיגמא-אולדריץ' | M5661 | מרכיב של התגובה נטולת התאים תמיסה B |
| NEBExpress שרף Ni | NEB | S1428S | לטיהור |
| חלב יבש ללא שומן | Bioshop | SKI400 | לחסימת ממברנות WB ו-CFDB |
| Parafilm | Bemis | 2099-1337410 | לדגירה של ECL של כתמי CFDB |
| חומצה p-coumaric | Sigma-Aldrich | C9008 | להכנת מגיב ECL |
| pET24b-SpyCatcher2-Apex2 מעבדת פלסמיד | Pardee | N/A | משמש לביטוי צלחת פטרי חלבון SpyCatcher2-Apex2 |
| Fisherbrand | FB0875712 | מיכל לדגירה של ממברנת WB ו-CFDB | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט 10% | BioShop | PBS405 | רכיב של חוצצים |
| אשלגן גלוטמט | סיגמא-אולדריץ' | G1501 | מרכיב בתמיסת התגובה נטולת התאים B |
| אשלגן אוקסלט מונוהידראט (חומצה אוקסלית) | סיגמא-אולדריץ' | 223425 | מרכיב של תמיסת התגובה נטולת התאים |
| ג'ל SDS-PAGE טרומי | BioRad | 4561036EDU | לאנליזה אלקטרופורטית של חלבון |
| Q5 DNA פולימראז בנאמנות גבוהה | נב | M0491 | להגברת PCR של LETs |
| QIAערכת טיהור PCR מהירה | Qiagen | 28106 | לטיהור LETs |
| סט תמיסת ריבונוקלאוטיד | NEB | N0450S | רכיב של תמיסת התגובה נטולת התאים |
| A אבקת חלב רזה | BioShop | SKI400 | משמש כחומר חוסם לכתם מערבי ו-CFDB |
| נתרן כלוריד | סיגמא-אולדריץ' | S9625 | רכיב של חוצצי טיהור חלבון |
| סוניקטור | Qsonica | Q500 | לליזה של תאי חיידקים |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | מרכיב של התגובה נטולת התאים תמיסה A |
| מסנן מזרק | Sigma-Aldrich | SLGSR33SS | לעיקור מאגרים ותמיסות |
| Thermocycler | BioRad | T100 | מכשיר לדגירת תגובות PCR |
| העברת RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8759 | מרכיב של תמיסת התגובה נטולת התאים A |
| Tris חוצץ מי מלח | Thermo Scientific | J60764. K2 | רכיב של מאגר כביסה WB ו-CFDB |
| בסיס Trizma | Sigma-Aldrich | T1503 | להכנת מאגר טריס |
| Tunair SS-5012 בקבוק שייק חצי מבלבל, 2.5 ליטר | Cole-Parmer | RK-01835-39 | כלי לגידול תאי E. coli לביטוי חלבון והכנת ליזאט ללא תאים |
| Tween-20 | BioShop | TWN510 | רכיב של מאגר כביסה WB ו-CFDB |
| פינצטה | אלמדיק | 7728-A10-100 | לטיפול בממברנת CDB NC |
| ספקטרופוטומטר UV-Vis | Thermo Scientific | 13400518 | משמש למדידת ריכוז חומצות גרעין ו-DNA ותרבית חיידקים OD |
| WHO International Reference Panel לאימונוגלובולין נגד SARS-CoV-2 | NISBC | 20/268 | סרום מאופיין מראש לאימות ואופטימיזציה של ריאגנטים/תנאים |
| של CFDB&בטא;-ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד הידראט (NAD) | סיגמא-אולדריץ' | 10127965001 | מרכיב של תמיסת התגובה נטולת התאים |
מקורות
- Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Cent Sci. 6, 591-605 (2020).
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nat Med. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Stadlbauer, D., et al. SARS-CoV-2 seroconversion in humans: A detailed protocol for a serological assay, antigen production, and test setup. Curr Protoc Microbiol. 57 (1), e100(2020).
- Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259.e12 (2016).
- Norouzi, M., et al. Cell-free dot blot: an ultra-low-cost and practical immunoassay platform for detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies in human and animal sera. Microbiol Spectr. 11 (2), e0245722(2023).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
- Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synth Biol. 10 (7), 1615-1624 (2021).
- IDT codon optimization tool. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2025).
- General protocol for western blotting. , Bio-Rad. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6376.pdf (2025).
- Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Enhanced chemiluminescence (ECL) for routine immunoblotting. Spermatogenesis. 1, 121-122 (2011).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J Vis Exp. (144), (2019).
- Plasma and serum preparation. , ThermoFisher Scientific. https://www.thermofisher.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/elisa-protocol/elisa-sample-preparation-protocols/plasma-and-serum-preparation.html (2025).
- Mattiuzzo, G., et al. WHO/BS.2020.2403 Establishment of the WHO International Standard and Reference Panel for anti-SARS-CoV-2 antibody. , (2020).
- Gong, F., Wei, H., Li, Q., Liu, L., Li, B. Evaluation and comparison of serological methods for COVID-19 diagnosis. Front Mol Biosci. 8, 682405(2021).
- Peeling, R. W., et al. Serology testing in the COVID-19 pandemic response. Lancet Infect Dis. 20 (9), e245-e249 (2020).
- Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. Biotechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
