מאמר שיטה

בידוד, קיבוע ואפיון של לויקוציטים של ראש דניס צעיר על ידי ציטומטריית זרימה

DOI:

10.3791/67978

⸱

9 במאי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Chemistry, NOVA School of Science and Technology, NOVA University of Lisbon, 2IPMA DivAV - Division of Aquaculture, Upgrading and Bioprospection, Portuguese Institute for the Sea and Atmosphere, 3CIIMAR - Interdisciplinary Centre of Marine and Environmental Research, University of Porto, 4UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, NOVA University of Lisbon, 5Associate Laboratory i4HB - Institute for Health and Bioeconomy, NOVA School of Science and Technology, NOVA University of Lisbon, 6Bioscience Core Lab, King Abdullah University of Science and Technology, 7CDG & Allies - Professionals and Patient Associations International Network (CDG & Allies - PPAIN), Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, NOVA University of Lisbon

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר את הבידוד והקיבוע של לויקוציטים המופקים מכליות הראש של דניס הזהב ואת הערכת כדאיותם על ידי זרימה ציטומטרית. עבודה זו תורמת לסטנדרטיזציה של פרוטוקולים וממנפת עיבוד של מספר גבוה יותר של דגימות מבלי לפגוע באיכות הדגימה, ומקדמת התקדמות בידע על אימונולוגיה של דגים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חסינות חיונית לוויסות הפיזיולוגי של אורגניזמים, ומשמשת כהגנה העיקרית מפני פתוגנים וגורמי לחץ סביבתיים. הבידוד והניתוח של תאי מערכת החיסון מספקים תובנות מפתח לגבי התגובות החיסוניות ללחצים חיצוניים. עם זאת, היעדר פרוטוקולים הרמוניים עבור מינים פחות נחקרים, כגון דגים ימיים, מוביל לעתים קרובות לאתגרים טכניים ואנליטיים המעכבים את פירוש הנתונים והבנה מעמיקה של תגובות חיסוניות ספציפיות למין. מחקר זה נועד להקים הליך אנליטי מבוסס ציטומטריית זרימה אופטימלית כדי לאפיין ולקבוע את הכדאיות של לויקוציטים מכליות הראש (האיבר ההמטופויאטי העיקרי בדגי טלאוסט) של דניס זהוב צעיר (Sparus aurata). ההליך החל בבידוד לויקוציטים בתהליך הומוגניזציה באמצעות תמיסת המלח המאוזנת של הנקס, ואחריו שיטת צנטריפוגה אופטימלית של שיפוע צפיפות פרקול כדי להבטיח שיעורי התאוששות גבוהים של לויקוציטים עם זיהום אריתרוציטים מינימלי הנדרש לניתוח יעיל של ציטומטריית זרימה לאחר מכן. בנוסף, נעשה שימוש בטכניקה חדשה המשתמשת בצבע תגובתי לתאים (LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit) כדי להבחין בין תאים ברי קיימא לתאים מתים על סמך דפוסי הצביעה הפלואורסצנטיים שלהם. קיבוע הושג עם פורמלדהיד 3.7%, תוך שמירה על מורפולוגיה של התא, כדאיות ויעילות הצביעה. ניתוח ציטומטריית זרימה זיהה בהצלחה שלוש אוכלוסיות לויקוציטים דומיננטיות: לימפוציטים, מונוציטים וגרנולוציטים. שיטה זו אפשרה לא רק בדיקות כדאיות אלא גם התמיינות מדויקת של סוגי תאים. השיפור בפרוטוקולי ציטומטריית הזרימה מייצג צעד קדימה באימונולוגיה של דגים על ידי הגדלת הדיוק והיעילות של ניתוח תאי חיסון. יתר על כן, על ידי מתן אפשרות לקיבוע תאים לניתוח מאוחר יותר, פרוטוקול זה מפחית משמעותית את הזמן והמאמץ הנדרשים להערכות חיסוניות, מה שהופך אותו לכלי רב ערך הן למחקר והן ליישומים מעשיים בתחומי מחקר שונים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חסינות ממלאת תפקיד מרכזי בוויסות הפיזיולוגי של אורגניזמים, ופועלת כהגנה ראשונית מפני מגוון רחב של פתוגנים וגורמי לחץ סביבתיים1. כמו בעלי חוליות אחרים, לדגים יש מערכת חיסון מורכבת, דינמית ומתואמת החיונית לבריאותם הכללית ולרווחתם1.

לדגי טלאוסט יש מערכת חיסון מולדת ונרכשת, המתפקדות בו זמנית כדי לזהות, להגיב ולנטרל פולשים מזיקים2. מערכת החיסון המולדת פועלת כקו ההגנה הראשון, ומספקת תגובות מיידיות ולא ספציפיות לפתוגנים2, בעוד שמערכת החיסון הנרכשת מתפתחת עם הזמן, ומציעה תגובה מיוחדת יותר המאפשרת לדגים לזהות פתוגנים ספציפיים ולבסס זיכרון חיסוני3. מערכת החיסון של הדגים מסתמכת על איברי לימפה ראשוניים מיוחדים (כלומר, בלוטת התימוס וכליות הראש) ואיברי לימפה משניים (למשל, רקמות לימפה הקשורות לטחול ולרירית (MALT)) כדי לתמוך בהגנה החיסונית ולשמור על הבריאות הכללית4. כליית הראש היא האיבר ההמטופויאטי העיקרי בדגי טלאוסט וממלאת תפקיד מכריע בהתפתחות ובהתבגרות של תאי חיסון, כולל לויקוציטים5.

בשנים האחרונות חלה התקדמות משמעותית בחקר התגובות החיסוניות של מספר מיני דגים2. אחד התחומים המרכזיים שבהם התמקדנו היה הבנת אוכלוסיות הלויקוציטים ופעילותן. לויקוציטים, הידועים גם כתאי דם לבנים, מסווגים בדרך כלל למונוציטים, לימפוציטים וגרנולוציטים וממלאים תפקיד מכריע בהגנה החיסונית של דגים. יש להם תאים פגוציטים, האחראים על בליעה והשמדה של פתוגנים ומשחררים מיני חמצן תגובתי קוטלי חיידקים, התורמים לחיסול מיקרואורגניזמים פולשים6. לויקוציטים מעורבים גם בתהליך הדלקתי, ועוזרים לבודד ולמגר זיהומים תוך קידום תיקון רקמות6. השפע והפעילות של אוכלוסיות הלויקוציטים הם אינדיקטורים חשובים למצב החיסוני בבריאות בעלי חיים ומחלות 7,8.

כמה מחקרים הראו שגורמי לחץ, כגון תנאים סביבתיים שליליים, יכולים לשנות את המספר והמורפולוגיה של אריתרוציטים ואת הרכב הלויקוציטים במחזור 9,10. לדוגמה, כפי שנסקר על ידי Franke et al. (2024), חיוני לחקור את המערכת החיסונית של דגים בתרחישי שינויי אקלים, שכן גורמי לחץ סביבתיים יכולים לפגוע בחסינות הדגים, להגביר את הרגישות למחלות ולשפר את ההדבקה של פתוגנים מסוימים, ובסופו של דבר להאיץ את התקדמות המחלה11. יתרה מכך, הבנת חסינות הדגים חיונית לא רק לקידום מחקר ביולוגי בסיסי אלא גם לתמיכה במגזרים שונים בחברה, כגון תעשיית החקלאות הימית. ככל שהחקלאות הימית ממשיכה להתרחב ברחבי העולם, הבטחת בריאותם ורווחתם של מיני דגים מעובדים הופכת חשובה יותר ויותר. עם זאת, רווחת הדגים נותרה תחום מחקר חדש יחסית, והתגובות החיסוניות של דגים מעובדים עדיין דורשות הערכות יסודיות וסטנדרטיות. יש חשיבות עליונה למתן עדיפות למחקרי תגובה חיסונית, שכן המידע שנרכש יכול לשפר את הקיימות והפרודוקטיביות של החקלאות הימית באמצעות גישות יעילות ומותאמות המשפרות את הרווחה והחוסן של חיות משק.

כימות וזיהוי לויקוציטים מבוצעים בדרך כלל בשיטות המטולוגיות, כגון ספירה ידנית עם Bürker, Neubauer או Thoma, כמו גם מריחות דם מוכתמות 7,10. כדי לסייע בהדמיה ובהתמיינות של תאי דם, ערכות צביעה, כגון רייט, מאי-גרינוולד-גימסה והמקולור, משמשות לעתים קרובות 7,12. עם זאת, טכניקות ספירת תאים ידניות אלו מייגעות, גוזלות זמן ונוטות לטעויות אנוש 8,10. מקורות שגיאות נפוצים כוללים ערבוב או דילול לא מספקים של הדם, בעיות צביעה וטעינה לא נכונה של תא ההמוציטומטר, כל אלה עלולים להוביל לספירת תאים לא מדויקת12. יתר על כן, ניתוח המטולוגי ידני דורש רמה גבוהה של מומחיות וניסיון כדי להבטיח את האמינות והשחזור של התוצאות7. ככל שהביקוש לכלי אבחון מדויקים ויעילים גובר, פיתוח שיטות חדשניות המספקות הבנה מעמיקה של המצב החיסוני של אוכלוסיות הדגים הופך לצעד חשוב יותר ויותר בקידום תחום זה.

ציטומטריית זרימה התגלתה ככלי רב עוצמה בהקשר זה, המציעה גישה כמותית בעלת תפוקה גבוהה לניתוח אוכלוסיות לויקוציטים וכדאיות תאים8. טכנולוגיית אבחון מודרנית זו מאפשרת זיהוי, ספירה ואפיון מהירים של תאים בודדים באוכלוסיות מעורבות בדיוק יוצא דופן13. יתר על כן, זרימה ציטומטרית מאפשרת מדידות רב-פרמטריות בו זמנית לאפיון פנוטיפי ופונקציונלי כאחד. למרות שנעשה בו שימוש נרחב במסגרות קליניות אנושיות וברפואה וטרינרית, יישומו בחקר לויקוציטים של דגים נותר מוגבל מאוד8. בעוד שכמה מחקרים נערכו על מיני דגים שונים 1,6,8,13,14,15,16,17, עדיין יש לטפל במספר אתגרים קריטיים. אתגר מרכזי אחד בניתוחים אלה הוא הצורך להשיג תרחיפים של לויקוציטים חיים המופקים מדם היקפי או רקמות לימפואידיות, כגון כליית הראש1. בידוד של לויקוציטים הוא לרוב קשה בגלל מאפיין ייחודי של דגי טלאוסט: נוכחותם של אריתרוציטים גרעיניים. הזיהום הלא מכוון באריתרוציטים יכול להפריע לניתוח לויקוציטים בשל גודלם, צורתם הביצית ונוכחותו של גרעין1. לכן, חובה לסלק אריתרוציטים ממתלי לויקוציטים כדי להשיג טוהר לויקוציטים גבוה ולחקור את המאפיינים הפנוטיפיים והתפקודיים של לויקוציטים על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה. ביונקים, בידוד לויקוציטים כולל בדרך כלל ליזה אוסמוטית של אריתרוציטים או הפרדת שיפוע צפיפות עם פיקול או פרקול1. עם זאת, ליזה אוסמוטית אינה יעילה הן עבור דגי ים והן עבור דגי מים מתוקים בשל אריתרוציטים גרעיניים שלהם, שלא ניתן ליז כראוי1. במקום זאת, הפרדת שיפוע צפיפות עדיפה לדגים מכיוון שהיא שומרת ביעילות על יציבות התא לאורך זמן1. למרות שכמה מחקרים בודדו בהצלחה לויקוציטים מדגים צעירים, מחקרים רבים עדיין מתמקדים בעיקר באוכלוסיות בוגרות17. עם זאת, שלבי החיים המוקדמים לא רק פגיעים יותר להתפרצויות מחלות, אלא גם קטנים יותר בגודלם, מה שהופך את תהליך הדגימה למורכב ומאתגר יותר. מגבלה נוספת היא שהשיטות הנוכחיות מוגבלות לרוב למספר מוגבל של דגימות או שכפולים בכל פעם, שכן הערכת כדאיות הלויקוציטים דורשת עיבוד מיידי. עיכובים בעיבוד הדגימה עלולים להשפיע לרעה על כדאיות התא, ובכך להכניס סיבוכים נוספים לתהליך הדגימה ולסכן את העבודה כולה.

למיטב ידיעתנו, אף אחת מהשיטות שפורסמו לא הצליחה לתקן תאי לויקוציטים לניתוח כדאיות לאחר מכן על ידי ציטומטריית זרימה. המחקר הנוכחי הוא חלוצי, שכן הוא מבסס שיטה יעילה לבידוד לויקוציטים מכליות הראש של דניס זהוב צעיר (Sparus aurata), מיני הדגים העיקריים המגודלים במדינות דרום אירופה, תוך שימוש במתודולוגיית הפרדת שיפוע צפיפות פרקול. אנו מציגים גם טכניקה משופרת מבוססת צביעה המבחינה בין תאים חיים לתאים מתים תוך זיהוי אוכלוסיות הלויקוציטים העיקריות (לימפוציטים, מונוציטים וגרנולוציטים) באמצעות ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול המשופר כרוך בקיבוע תאים, המאפשר ניתוח תאים בר-קיימא עד חודש לאחר ההליך. ליישום פרוטוקול ציטומטריית זרימה זה יש פוטנציאל להפחית משמעותית את הזמן והמאמץ הנדרשים בדרך כלל להערכות חיסוניות, מה שהופך אותו לטכניקה בעלת ערך הן למחקר והן ליישומים מעשיים יותר במגזר החקלאות הימית. יישום מתודולוגיה זו מספק יתרונות לניתוח מספר רב של דגימות, שימור התאים ומתן אפשרות לניתוח מושהה על ידי ציטומטריית זרימה. לכן, זה עשוי להיות מועיל מאוד לייצר תובנות חשובות לגבי מנגנוני חיסון של דגים וכיצד כדאיות התאים מושפעת מתנאים סביבתיים או ניסויים שונים. יתר על כן, ניתן לשלב בדיקת כדאיות זו עם אפיון פנוטיפי ותפקודי רב-פרמטרי של אוכלוסיות תאי חיסון ספציפיות. גישה זו מאפשרת ניתוח מקיף יותר של מספר פרמטרים אימונולוגיים, מקשרת אותם ישירות לסוגי התאים המתאימים ומספקת הבנה ברורה יותר של התגובות החיסוניות. ממצאים אלה יכולים לתרום לפיתוח אסטרטגיות יעילות יותר, כולל גישות משופרות לניהול מחלות בחקלאות ימית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה חייב להתבצע על ידי חוקרים מוסמכים בניסויים בבעלי חיים (פונקציות האיחוד האירופי A ו-B). כל ההליכים הקשורים לטיפול בבעלי חיים ואיסוף דגימות חייבים לעמוד בהנחיות ARRIVE (מחקר בבעלי חיים: דיווח על ניסויים in vivo ) ולעמוד בסטנדרטים אתיים לטיפול ושימוש בבעלי חיים בהתאם להמלצות הפדרציה האירופית של איגודי מדעי חיות המעבדה האירופיים (FELASA). המחקר הנוכחי עקב אחר כל הסטנדרטים הללו כמו גם החקיקה הפורטוגזית למדעי חיות מעבדה (EU Directive 2010/63; צו חוק מס' 113/2013). המחקר אושר על ידי הגוף לרווחת בעלי חיים ואתיקה של IPMA (ORBEA, LABVIVOS-002-AquaClimAdapt), בפיקוח הרשות הלאומית לשימוש בבעלי חיים חיים, הידועה בשם המנהל הכללי למזון ווטרינריה (DGAV), תחת האישור האתי מספר 20596/25-S.

1. לחקור מודל ותחזוקת אורגניזמים

הערה: מחקר זה תוכנן במיוחד עבור דניס זהוב צעיר (Sparus aurata), עם משקל ממוצע של 30.0 ±-5.0 גרם ואורך כולל של 12.0 ±-2.0 ס"מ. ייתכן ששיטה זו לא תחול ישירות על מיני דגים אחרים, שכן למינים שונים יש מאפיינים פיזיולוגיים ואימונולוגיים ייחודיים שעשויים להשפיע על בידוד הלויקוציטים, קיבוע התאים והערכת הכדאיות. ייתכן שיידרשו התאמות לפרוטוקול עבור מינים אחרים, ומומלץ לבצע מחקרים ראשוניים כדי לייעל את התנאים עבור כל מין מטרה.

  1. התאקלמות הדגים (תקופת הסגר)
    1. חלקו את הדגים באופן שווה במיכלים בעלי קיבולת גדולה (למשל, שני מכלים עם קיבולת כוללת של 660 ליטר כל אחד - ראו איור משלים 1).
      הערה: המיכלים לשימוש עשויים להיות חלק ממערכת חקלאות ימית מחזורית (RAS), המאפשרת שימוש יעיל במים ושליטה משופרת על איכות המים. ב-RAS, המים ממוחזרים ומטופלים באופן רציף בתוך המערכת, ומספקים סביבה יציבה ומבוקרת לדגים. מערך זה מסייע בשמירה על תנאים אופטימליים לבריאות וגדילת הדגים, הבטחת פיזור אחיד ומזעור הלחץ במהלך המחקר.
    2. שמור על תנאים אביוטיים אופטימליים.
      1. החזיקו את הדגים בהסגר למשך 3 שבועות בתנאים המדמים את בית הגידול הטבעי שלהם:
        טמפרטורה: 20.0 ± 0.5 מעלות צלזיוס;
        חמצן מומס: 7.2 ± 0.2 מ"ג/ליטר;
        מליחות: 35.0 ± 0.5 ‰;
        pH: 8.0 ± 0.1 יחידות;
        תקופת צילום: 14 שעות אור / 10 שעות חושך.
        הערה: תנאי התחזוקה האידיאליים עשויים להשתנות בין מיני דגים שונים. למינים אחרים עשויות להיות דרישות שונות, ולכן חשוב להתאים את התנאים האלה לצרכים הספציפיים של מיני היעד כדי להבטיח את בריאותם ורווחתם של האורגניזמים. בנוסף, טמפרטורת מי הים ותקופת האור יכולים להשתנות עם עונות השנה, ולכן יש לקחת בחשבון שינויים עונתיים בעת שכפול התנאים הטבעיים במעבדה.
  2. ליזום את המחקר הניסיוני.
    1. הגדר את מספר המיכלים והדגים הנדרשים על סמך תכנון מערך הניסוי של כל מקרה מבחן.
    2. לאחר תקופת ההסגר, העבירו את הדגים ל-RAS עצמאי (ראו איור משלים 2).
      1. ציידו כל מערכת ברחפני חלבון כדי להסיר תרכובות אורגניות מוגזמות מהמים; סינון פיזי (שקית סינון [400 מיקרומטר], ספוג פילטר וצמר זכוכית); סינון ביולוגי (כדורי ביו [1.5 אינץ'], מעקר מים אולטרה סגול ואבני אוויר שקועות); מערכות קירור אוטומטיות למי ים ותנורי חימום דיגיטליים שקועים, שניהם מחוברים למערכת בקרה ממוחשבת (ProfiLux) עם חיישני טמפרטורה להתאמת הטמפרטורה בכל מיכל; אבני אוויר שקועות בכל מיכל כדי לשלוט בחמצן מומס.
    3. התאקלמו את הדגים במשך שבועיים במערכות החדשות לפני שתמשיכו בניסוי.
    4. בצע תחזוקה יומיומית
      1. הסר צואת דגים מכל מיכל דגירה ובצע חידוש של 25% מי ים.
      2. מדוד טמפרטורה באמצעות מדחום דיוק נייד.
      3. עקוב אחר פרמטרים אביוטיים אחרים של מי ים (מליחות, חמצן מומס ו-pH) באמצעות מכשיר מדידה רב-פרמטרים.
      4. התאם פרמטרים אביוטיים של מי ים לפי הצורך כדי להבטיח יציבות לאורך כל הניסוי.
        הערה: התנאים האביוטיים במערכות הניסוי יכולים להשתנות בהתאם לדרישות הספציפיות של כל מקרה מקרה. לדוגמה, אם המחקר נועד לדמות שינויים עונתיים או גלי חום ימיים, יש להתאים את הטמפרטורה ותקופת האור בהתאם כדי לחקות שינויים עונתיים טבעיים. באופן דומה, אם המחקר מתמקד בהדמיית תנאים היפוקסיים או החמצת האוקיינוס, יש לבצע התאמות לרמות החמצן ול-pH של מי הים. זה מבטיח שתנאי הניסוי מציאותיים ורלוונטיים ככל האפשר, ומשפר את התוקף והישימות של ממצאי המחקר.
      5. להעריך את בריאותם ורווחתם של הדגים, לזהות ולנהל סימני לחץ או מחלה כמתואר בשלבים 1.2.4.6-1.2.4.8.
      6. חפש התנהגויות חריגות כגון שחייה לא יציבה, אובדן תיאבון, עייפות, תוקפנות או בידוד.
      7. יש לבדוק אם יש סימני מחלה, כולל נגעים, כיבים, שינוי צבע, סנפירים מהודקים, ליחה מוגזמת או תנועת זימים מהירה.
      8. רשום את כל התצפיות, תוך ציון התאריך והפעולות שננקטו.
    5. ערכו בדיקות איכות מים שבועיות.
      1. מדוד את רמות האמוניה (NH3/NH4), ניטריט (NO2-) וניטראט (NO3-) באמצעות בדיקות קולורימטריות.
        הערה: ודא שכל הפרמטרים הללו נמצאים מתחת לרמות הניתנות לזיהוי. אם הרמות חורגות מהמגבלות, בצע החלפת מים נוספת, הגדל את האוורור או התאם את הסינון.
    6. האכילו ועקבו אחר תזונת הדגים.
      1. לספק תזונה איכותית העונה על הדרישות התזונתיות הספציפיות של דגים צעירים (ראה טבלה משלימה 1 לדוגמא להרכב המפורט של התזונה).
        הערה: ודא שגודל כדורי ההזנה (2-3 מ"מ) מתאים לצעירים, מה שמקל על הבליעה והעיכול.
      2. התאם את כמות ההזנה כך שתתאים ל-2% ממשקל הגוף הממוצע של הדג ליום.
      3. האכילו את הדגים באופן ידני פעמיים ביום - פעם בבוקר ופעם אחר הצהריים (קבעו זמן ספציפי לשמירה על שגרת האכלה יציבה).

2. דגימת דגים, המתת חסד, דיסקציה ואיסוף כליות ראש

  1. טעמו את הדגים מהמיכלים.
    1. בחר דגים באופן אקראי מהמכלים כדי למנוע הטיית דגימה.
    2. השתמש ברשת כדי להעביר בעדינות את הדגים למיכל אחיזה זמני מלא במי מיכל.
      הערה: צמצם את זמן הטיפול כדי להפחית מתח.
  2. הכן את תמיסת המתת החסד.
    1. השתמש במיכל מתאים (למשל, דלי של 3 ליטר) המתאים להחזקת הדג.
    2. יש להמיס את הכמות המתאימה של טריקאין (MS-222) במי ים כדי להגיע לריכוז סופי של 200-300 מ"ג/ליטר18 (זהירות ראה טבלה משלימה 2 וקובץ משלים 1).
    3. חוצץ את התמיסה עם נתרן ביקרבונט ל-pH של 7.2-7.5.
  3. נהל את פתרון המתת החסד.
    1. מניחים את הדג בתמיסת המתת החסד למשך 10 דקות לפחות או עד שנצפים הפסקת התנועה האופרקולרית ואובדן רפלקסים (אשר המתת חסד על ידי בדיקת חוסר תגובה לגירויים חיצוניים).
    2. רשום את משקל גופו של הדג (גרם) ואת אורכו הכולל (ס"מ).
  4. בצע דיסקציה של דגים.
    הערה: כדי להבטיח איכות דגימה אופטימלית וכדאיות תאים, יש להשלים את תהליך הדיסקציה במהירות האפשרית, באופן אידיאלי תוך 5 דקות לאחר המתת חסד.
    1. ודא שטמפרטורת המעבדה נשמרת על 19 מעלות צלזיוס באמצעות מיזוג אוויר כדי למזער תנודות במהלך הדגימה והעיבוד.
    2. עקר את כלי החיתוך (רצוי מכשירי מתכת חיטוי במידת האפשר) והגדר סביבת עבודה נקייה עם 70% אתנול (זהירות, ראה טבלה משלימה 2).
    3. הניחו את הדג המומת על צדו על מגש דיסקציה סטרילי כשהראש פונה לכיוון היד הלא דומיננטית.
    4. בעזרת אזמל, בצע חתך זהיר לאורך קו האמצע הגחוני של הדג מהאוורור (פי הטבעת) כלפי מעלה לכיוון הזימים.
      הערה: היזהר לא לחתוך עמוק מדי כדי למנוע פגיעה באיברים פנימיים.
    5. השתמש בזהירות במספריים לדיסקציה כדי להאריך את החתך ולחשוף את האיברים הפנימיים. הרם בעדינות את דשי דופן הגוף כדי לספק תצוגה ברורה של האנטומיה הפנימית.
    6. אתר את כליית הראש: כליית הראש ממוקמת ממש מאחורי הזימים, ליד האזור הגבי הקדמי של חלל הגוף, ומשתרעת לאורך הצד העליון של חלל הגוף, מתחת לעמוד החוליות.
      הערה: כליית הראש בדרך כלל בצבע כהה יותר בהשוואה לרקמות שמסביב (איור 1).
    7. נקה בזהירות את כל הרקמות שמסביב, כגון שומן ורקמת חיבור, כדי לדמיין טוב יותר את כליית הראש.
      הערה: שלב זה דורש טיפול עדין כדי למנוע נזק לראש, הכליה.
    8. בעזרת מלקחיים ומספריים עדינים הרם בזהירות את כליית הראש ובצע חתכים מדויקים סביבה כדי לשחרר אותה מהרקמות שמסביב.
      הערה: טפל ברקמה בעדינות כדי למנוע נזק. בדג במשקל של כ-30 גרם, כליית הראש צפויה לשקול בסביבות 20-30 מ"ג.
    9. הנח מיד את האיבר שנכרת במסננת תאים (רשת ניילון 100 מיקרומטר) בתוך צלחת פטרי סטרילית כדי להבטיח סטריליות ולהקל על שלבי העיבוד הבאים.
      הערה: מנקודה זו ואילך, יש לבצע את כל השלבים במהירות האפשרית (תוך 5 דקות) כדי לשמור על כדאיות התא. כדי לשמור על הדגימה קרירה, בצע את השלבים הבאים כשצלחת הפטרי מונחת על מיכל מלא בקרח ומכוסה בנייר אלומיניום.

figure-protocol-1
איור 1: מיקום כליית הראש: (A) איור המתאר את המיקום הטיפוסי של כליית הראש מאחורי הזימים ולאורך האזור הגבי הקדמי של חלל הגוף; (B) תמונה מייצגת של כליית הראש בדניס, המדגישה את צבעה הכהה יותר בהשוואה לרקמות שמסביב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

3. בידוד לויקוציטים של כליות ראש (איור 2)

figure-protocol-2
איור 2: תיאור המחשה של בידוד לויקוציטים מהכליה הראשית. הפרוטוקול כולל מספר שלבים: החל מהומוגניזציה של הרקמה, ואחריו צנטריפוגה בשיפוע צפיפות, איסוף טבעת הלויקוציטים, שטיפת טבעת הלויקוציטים וכלה בהשעיה מחדש והתאמת ריכוז התאים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה. 

  1. הומוגניזציה של הרקמה.
    1. מניחים 2 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS) בצלחת פטרי סטרילית.
    2. ודא שהרשת של מסננת התאים (רשת ניילון 100 מיקרומטר) נמצאת במגע עם ה-HBSS אך לא שקועה במלואה.
    3. השרו את כליית הראש על מסננת התאים באמצעות בוכנה של מזרק. הפעל לחץ עדין כדי לאלץ את שברי האיברים דרך רשת הניילון, וליצור תרחיף תאים.
      הערה: אם מעבדים מספר דגימות, ניתן לאחסן את צלחת הפטרי המכילה את תרחיף התאים במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות עד לשלב הבא. תרחיף תאים זה ישמש לבידוד לויקוציטים.
  2. בצע צנטריפוגה של שיפוע צפיפות.
    1. הכן תמיסה בינונית בשיפוע צפיפות עם צפיפות של 1.077 גרם/מ"ל, אוסמולריות של 353 mOsm/kg ו-pH של 7.4 (ראה קובץ משלים 1).
      הערה: האוסמולריות עשויה להשתנות בין מיני דגים שונים, ולכן חיוני להתאים את האוסמולריות של תמיסת המדיום של שיפוע הצפיפות כדי לעמוד בדרישות הספציפיות של כל מין.
    2. בצינורות תחתונים עגולים מפוליסטירן בנפח 5 מ"ל, הוסף בזהירות 600 מיקרוליטר מתמיסת המדיום של שיפוע הצפיפות.
    3. קח את תרחיף התאים (2 מ"ל) והוסף אותו לאט לצינור המכיל את מדיום שיפוע הצפיפות. הטיפה הראשונה היא קריטית - הוסף אותה בעדינות רבה כדי למנוע ערעור היציבות של שיפוע הצפיפות.
      הערה: יש לעשות זאת ביחס של 3:10 (מדיום שיפוע צפיפות: מתלה תאים). השתמש בפיפטה פסטר סטרילית בנפח 1 מ"ל לתוספת מדויקת ועדינה. ודא שקצה הפיפטה נוגע בצד הצינור כדי למנוע הפרעה לשכבה הבינונית של שיפוע הצפיפות. הימנע מערבוב הדגימה עם מדיום שיפוע הצפיפות.
    4. צנטריפוגה את הצינורות ב-400 x גרם למשך 45 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כשהבלם כבוי. זה מבטיח שהשכבות יישארו שלמות במהלך התהליך.
      הערה: לאחר צנטריפוגה, שכבות ברורות צריכות להיות גלויות. לויקוציטים ייצרו טבעת בממשק בין תווך שיפוע הצפיפות לגלולת הפסולת התאית (איור 3).

figure-protocol-3
איור 3: לויקוציטים מצלצלים בממשק בין מדיום שיפוע הצפיפות לגלולת הפסולת התאית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה. 

  1. אוספים את טבעת הלויקוציטים.
    1. בעזרת פיפטה סטרילית של פסטר, שאבו בעדינות את טבעת הלויקוציטים (~100 מיקרוליטר) והעבירו אותה לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל.
      הערה: הקפד לא להפריע לשכבות באופן משמעותי כדי למנוע זיהום. אם נראה שטבעת הלויקוציטים מכילה פסולת או מתלים כהים, רצוי להעביר את תרחיף הלויקוציטים שנאסף דרך מסננת תאים מיני חדשה (100 מיקרומטר) כדי להבטיח טוהר. הנח את מסננת התאים המיני מעל צינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל והעביר בעדינות את מתלה הלויקוציטים דרך המסננת.
  2. שוטפים את טבעת הלויקוציטים.
    1. הוסף HBSS לצינורות המיקרו-צנטריפוגה המכילים את טבעת הלויקוציטים עד שהנפח מגיע ל -2 מ"ל והשהה בעדינות את התאים.
      הערה: שמור את הצינורות בכלי מלא בקרח ומכוסה בנייר אלומיניום כדי לשמור על הדגימה בטמפרטורה נמוכה. ודא שהצינורות אינם באים במגע ישיר עם הקרח. שמור על מערך קירור זה לאורך כל תהליך הכביסה.
    2. צנטריפוגה את הדגימות ב-400 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס (ניתן להפעיל את הבלם).
    3. לאחר צנטריפוגה, השליכו בזהירות את הסופרנטנט והשאירו את הגלולה בתחתית (שעשויה להיות כמעט בלתי נראית).
    4. חזור על שלבי הכביסה (הוספת HBSS, השעיה, צנטריפוגה והשלכת הסופרנטנט) עד שהגלולה נקייה מזיהומים.
  3. השעיה והתאמת ריכוז התאים.
    1. השעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של HBSS בתוך אותם צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל המשמשים לשטיפות.
    2. השג ריכוז תאים בין 1 × 104 ו- 1 × 106 תאים למ"ל. אם הגלולה הראשונית גדולה, ייתכן שיידרש HBSS נוסף כדי לדלל את ריכוז התא לטווח הרצוי. העבירו את תרחיף התאים לצינור של 15 מ"ל והוסיפו עוד HBSS לפי הצורך על סמך ספירת התאים שהתקבלו.
      הערה: מומלץ להשתמש במונה סלולרי אוטומטי כדי להקל על התהליך.

4. צביעה וקיבוע של לויקוציטים (איור 4)

הערה: ערכות כתמי התאים המתים הניתנים לתיקון LIVE/DEAD מספקות שיטה משופרת להערכת כדאיות התאים בתאים קבועים באמצעות ציטומטריית זרימה. בדיקות אלו משתמשות בצבע תגובתי פלואורסצנטי המקיים אינטראקציה עם אמינים תאיים. אם קרומי התאים נפגעים, הצבע יכול לחדור לתאים, להגיב עם אמינים חופשיים הן בתוך התא והן על פני התא, וכתוצאה מכך צביעה פלואורסצנטית עזה. לעומת זאת, בתאים ברי קיימא, רק האמינים על פני התא זמינים להגיב עם הצבע, מה שמוביל לצביעה עמומה יחסית. עוצמת הצביעה נשמרת לאחר קיבוע עם פורמלדהיד, המשמר גם את הדגימה על ידי מניעת צמיחה של מיקרואורגניזמים. ערכות כתמי התאים המתים הניתנים לתיקון LIVE/DEAD זהות למעט הצבע הפלואורסצנטי - זמין בכחול, סגול, אקווה, צהוב, ירוק, אדום, אדום רחוק או קרוב ל-IR (אינפרא אדום). במחקר זה, השתמשנו בצבע תגובתי פלואורסצנטי Near-IR. בנוסף, בדיקה בצבע יחיד זו מאפשרת בדיקה של פרמטרים אחרים במקביל בניסוי רב צבעוני.

  1. מכינים את הצבע.
    1. הביאו את הריאגנטים לטמפרטורת החדר (RT): אפשר לבקבוקון אחד של הצבע הריאקטיבי הפלואורסצנטי ולבקבוקון של דימתיל סולפוקסיד נטול מים (DMSO) להגיע ל-RT לפני הסרת המכסים.
    2. הרכיב מחדש את הצבע: הוסף 50 מיקרוליטר של DMSO לבקבוקון המכיל את הצבע הריאקטיבי. מערבבים היטב ומוודאים שהצבע נמס במלואו.
    3. השתמש בתמיסת הצבע המחודשת בהקדם האפשרי, רצוי תוך מספר שעות.
      הערה: כל ערכה כוללת חמישה בקבוקונים בודדים של צבע תגובתי, המספקים חומר מספיק כדי להכתים לפחות 40 דגימות תאים. עם זאת, לאחר הרכבה מחדש, תמיסת ה-DMSO של הצבע אינה יציבה יחסית, במיוחד כאשר היא נחשפת ללחות. ניתן לאחסן כל מנה שאינה בשימוש עד שבועיים בטמפרטורה של ≤-20 מעלות צלזיוס, מוגנת מפני אור ולחות.
  2. לצבוע ולתקן את התאים.
    הערה: חוצצים המתאימים לצביעה של תאים כוללים את תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS), תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) ו-PBS (D-PBS) של Dulbecco, כל עוד הם אינם מכילים חלבונים זרים כגון אלבומין בסרום בקר או סרום. בעת שימוש בצבע מגיב אמינו, הימנע ממאגרי Tris ותמיסות עם נתרן אזיד או חלבון זר להשעיית תאים ושטיפה. במחקר זה, השתמשנו ב-HBSS בשל הרכב היונים המאוזן שלו, המסייע בשמירה על איזון אוסמוטי ומספק יונים וגלוקוז חיוניים לתמיכה בחילוף החומרים של התאים ובכדאיות במהלך תהליך הצביעה. HBSS גם נקי מחלבונים זרים, מונע הפרעה לצבע הריאקטיבי ומבטיח הערכת כדאיות מדויקת.
    1. לאחר ספירת התאים והתאמת הצפיפות ל -1 x 106 תאים למ"ל עם HBSS, העבירו 1 מ"ל של תרחיף תאים זה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל.
      1. עבור כל יום, לגרום למוות תאים בדגימה אחת לפחות כדי לשמש כבקרה לקביעת סף עוצמת הקרינה בין תאים חיים ומתים. הכן את הדגימות בצינורות מיקרוצנטריפוגה באופן הבא:
        צינור 1: תאים חיים - לא מוכתמים
        צינור 2: תאים חיים - מוכתמים
        צינור 3: תאים מתים - לא מוכתמים
        צינור 4: תאים מתים - מוכתמים
        הערה: ארבעת הצינורות הללו צריכים להיות מוכנים רק לדגימה בודדת בכל ניסוי כבקרות. עבור הדגימות הנותרות, יש צורך בשני צינורות בלבד (צינור 1: דגימה - לא מוכתמת וצינור 2: דגימה - מוכתמת), מכיוון שהוא יספק מידע על התאים שהיו בחיים ואלה שהיו מתים.
    2. בקרה חיובית על מוות תאי: הנח את הצינור המסומן מת לא מוכתם (צינור 3) ומוכתם מת (צינור 4) באמבט מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות כדי לגרום למוות תאים על ידי טיפול בחום.
    3. צביעת התאים: הוסף 1 מיקרוליטר של הצבע הריאקטיבי הפלואורסצנטי המחודש (משלב 4.1.2) ל-1 מ"ל של תרחיף התא בצינורות 2 ו-4 (צינורות שיוכתמו) וערבב היטב.
    4. דגירה ב-RT למשך 30 דקות, מוגן מפני אור.
      הערה: אם אין צורך בקיבוע, תוכל לדלג על השלבים 4.2.5-4.2.7 להלן. במקום זאת, שטפו את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של HBSS עם 1% אלבומין בסרום בקר (ראה קובץ משלים 1) והשעו מחדש ב-1 מ"ל של HBSS עם 1% אלבומין בסרום בקר. בצע את הניתוח על ציטומטר הזרימה במהירות האפשרית; אחרת, כדאיות התאים עלולה להיפגע מכיוון שהתאים אינם קבועים.
    5. שטפו את התאים פעמיים עם 1 מ"ל HBSS והשעו מחדש את התאים ב 900 מיקרוליטר של HBSS.
    6. הוסף 100 מיקרוליטר של 37% פורמלדהיד (זהירות, ראה טבלה משלימה 2).
    7. דגירה למשך 15 דקות ב-RT.
    8. שטפו פעמיים עם 1 מ"ל HBSS עם 1% אלבומין בסרום בקר (BSA), ולאחר מכן השעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של HBSS עם 1% BSA.
    9. אחסן את הדגימות במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. נתח את התאים תוך חודש לאחר הקיבוע.
    10. נתח את מתלה התאים הקבועים על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות ערוץ העירור והזיהוי המתאים.
      הערה: ערוצי העירור והזיהוי הנכונים עשויים להשתנות בהתאם למכשיר שבו נעשה שימוש (ראה טבלה משלימה 3).

figure-protocol-4
איור 4: תיאור המחשה של צביעה וקיבוע של לויקוציטים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה. 

5. ציטומטריית זרימה

  1. השגת נתונים.
    הערה: ההליכים שיש לבצע על ציטומטר הזרימה עשויים להשתנות בהתאם לציטומטר הספציפי בו נעשה שימוש. במחקר זה נרכשו נתונים באמצעות ציטומטר הזרימה Attune NTx.
    1. הפעל את הדגימות.
    2. הנח את צינור הדגימה ביציאת הדגימה.
    3. התחל את הרכישה על ידי לחיצה על התחל ולאחר מכן לחץ על רשומה ברגע שקצב האירועים (אירועים/שנייה) מתייצב.
    4. רשום מינימום של 10,000 אירועים עבור כל דגימה בשער הסינגלטים לניתוח אמין.
    5. שמור את כל הנתונים עבור כל דגימה וגבה אותם בכוננים חיצוניים או באחסון בענן.
  2. נתח את הנתונים.
    הערה: לניתוח Flow Cytometry קיימות מספר אפשרויות תוכנה. במחקר זה, ניתוח הנתונים בוצע באמצעות FlowJo v10.8.119.
    1. טען קבצי נתונים: הפעל את תוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה והעלה את קבצי ה-.fcs שנרכשו מהניסוי.
    2. הדמיה של הנתונים (איור 5A): התוויית פיזור קדימה (FSC-A) (XX) לעומת פיזור צד (SSC-A) (YY) כדי להעריך את גודל התא ואת גרעיניותו.
      הערה: תרשים זה משמש בדרך כלל לזיהוי אוכלוסיות תאים ולהוצאת פסולת על סמך תכונות הפיזור שלהם.
    3. אי-הכללת שער תא יחיד ומכפילים (איור 5B): השתמש בתרשים שטח פיזור קדימה (FSC-A) לעומת גובה פיזור קדימה (FSC-H) כדי לא לכלול כפולות. צייר שער כדי לכלול את כל האירועים המיושרים בתרשים (תאים בודדים) ולא לכלול את האירועים הלא מיושרים (כפולות). אם לדגימה יש אירועים עם FSC נמוך מאוד, אל תכלול אותם על ידי אי הכללתם בשער התא הבודד, והשאר רק תאים בודדים.
    4. זיהוי אוכלוסיות לויקוציטים (איור 5C): הבחין בין 3 אוכלוסיות הלויקוציטים על סמך פרופיל FSC-A/SSC-A: FSC-Aגבוה/SSC-Aגבוה הם גרנולוציטים,מדיום FSC-A/מדיום SSC-A הם המונוציטים ו-FSC-Aנמוך/SSC-Aנמוך הם הלימפוציטים.
    5. שער כדאיות (איור 5D): הגדר את הסף לצביעת צבע כדאיות על תעלת הקרינה המתאימה (NIR, RL3-A). תאים חיים לעומת תאים מתים מוגדרים על סמך עוצמת הצביעה עם LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain: תאים מוכתמים עמומים מוגדרים כתאים חיים, והתאים המוכתמים חזק מוגדרים כתאים מתים.
    6. סטטיסטיקת אוכלוסייה: הסתכל על הנתונים הסטטיסטיים המסופקים על ידי התוכנה, כולל סך האירועים (תאים) בכל שער ואחוזים של תאים כוללים ומגודרים.
    7. ייצוא נתונים: ייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני והשתמש בתוכנה סטטיסטית מתאימה (GraphPad Prism או R) להמשך ניתוח סטטיסטי.
      הערה: בחירת שיטות הניתוח תהיה תלויה במטרות המחקר.

figure-protocol-5
איור 5: אסטרטגיית שער זרימה ציטומטרית להערכת כדאיות בתאי כליה ראשיים: (A) מייצג פרופיל FSC-A/SSC-A של כל האירועים שנאספו. (B) מייצג אי הכללת מכפילים בהתבסס על ההגדרה של אזור סינגלטים בהתבסס על ליניאריות בגרף פיזור קדימה (FSC-A)/פיזור קדימה (FSC-H). (C) מייצג את 3 האוכלוסיות העיקריות שהוגדרו על סמך FSC-A/SSC-A, לאחר אי הכללת מכפילים. (D) מייצג היסטוגרמה שמציגה צביעת צבע חי/מת. כדי להגדיר את הסף המאפשר להבחין בין תאים חיים ומתים, לויקוציטים הוגשו להלם חום קל (50 מעלות צלזיוס, 7 דקות) ולאחר מכן נצבעו בצבע כדאיות. תאים חיוביים בעוצמת צביעה גבוהה (++) הם התאים המתים, ותאים חיוביים בעלי צביעה נמוכה (+-) הם התאים החיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 6 מציג נתוני זרימה ציטומטרית מייצגים המראים אוכלוסיות לויקוציטים שבודדו מכליות הראש של דניס זהוב צעיר (Sparus aurata) ואת כדאיות התאים שלהם באמצעות הפרוטוקול המתואר במחקר זה. האיור משווה שתי דגימות: אחת עם כדאיות תאית גבוהה, שבה הדגים נחשפו לתנאים אופטימליים (איור 6A), ואחרת עם כדאיות תאית נמוכה, שבה התאים נחשפו לסטרס תרמי (איור 6B).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה שפותחה במחקר זה מייצגת התקדמות משמעותית במחקר האימונולוגיה של דגים ומבטיחה לשפר את ההבנה של התגובות החיסוניות של הדגים וקיימות המשאבים הימיים. S. aurata הוא מין דג ימי יקר ערך ממשפחת Sparidae המשמש כאורגניזם מודל אידיאלי מכמה סיבות, כולל הרלוונטיות האקולוגית והכלכלית שלו, כמו גם הרבגוניות שלו במחקר מעבדה במספר תחומי מחקר כגון פיזיולוגיה, אימונולוגיה, טוקסיקולוגיה וחקלאות ימית20. אחד היתרונות העיקריים של S. aurata הוא קלות הטיפול והגידול שלו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים כספיים, אישיים או מקצועיים שיכולים היו להשפיע על המחקר, הניתוח, פירוש הנתונים, הכתיבה או ההחלטה להגיש את כתב היד לפרסום.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי Fundação Portuguesa para a Ciência e Tecnologia (FCT I.P.), במסגרת הפרויקט Aqua-CLIMADAPT (PTDC/CTA-AMB/0592/2021, https://doi.org/10.54499/PTDC/CTA-AMB/0592/2021). אנו מודים ל-BioLab הנתמכת על ידי היחידה למדעים ביולוגיים מולקולריים יישומיים (UCIBIO) והמעבדה ליחידת המחקר לכימיה ירוקה – LAQV, הממומנות על ידי קרנות לאומיות מ-FCT/MCTES (UIDB/04378/2020 ו-UIDB/50006/2020, בהתאמה), כמו גם מכון המעבדה העמית לבריאות וביו-כלכלה – i4HB (LA/P/0140/2020). עבודה זו נתמכה גם על ידי הנציבות האירופית באמצעות פרויקט GLYCOTwinning (הסכם מענק מס' 101079417) ו-FCT באמצעות InnoGlyco (2022.04607.PTDC). איסה מרמלו גם מכיר ב-FCT I.P. על מענק הדוקטורט (2020.04413.BD, https://doi.org/10.54499/2020.04413.BD).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אייר סטונסלא ישים
 SPAROS, Lda., פורטוגלN/Aתזונה איכותית 
ציוד אוטומטי לספירת תאים NanoEnteK, קוריאהN/AEVE מונה תאים אוטומטי (NanoEnteK)
מערכות קירור מים אוטומטיות Foshan Weinuo ציוד קירור ושות', בע"מ, סיןN/A
Bio כדורים 1.5 אינץ' מסנן בריכת אקווריוםTMC איבריה, פורטוגלN/A
סרום בקר אלבומין (BSA)סיגמא-אולדריץ', גרמניהדלי A7906
(3 ליטר)N / AN / Aלהכנה וביצוע המתת חסד 
דליים (5 ליטר)N/AN/A להובלתבעלי החיים 
מסנני תאיםJetbiofil, סיןCSS-013-100מסננת תאים, 100 μ m רשת ניילון, סטרילית,
צנטריפוגהפישר סיינטיפיק, גרמניהN/AaccuSpin Micro 17 R
ערכת בדיקה קולורימטרית לאמוניה (NH4+/NH3)Tropic Marin, ארה"בN/A
ערכת בדיקה קולורימטרית עבור ניטראט (NO3-)Tropic Marin, ארה"בN/A
ערכת בדיקה קולורימטרית עבור ניטריט (NO2-)Tropic Marin, ארה"ב N/A
מחשב N/AN/Aלרכוש ולנתח את הנתונים המתקבלים ממערכת הבקרה הממוחשבת של ציטומטר הזרימה
(Profilux)GHL, גרמניהN/AProfiLux 3
Outdoor Deionized Water N/AN/Aצפיפות הציטומטר של הזרימה
: PercollCytiva, Sigma-Aldrich, גרמניה17-0891-01
משקל דיגיטליKERN & Sohn GmbH, גרמניהN/AKERN EMS 300-3
אתנול 70%Millipore, Supelco, פורטוגלEX0281כדי לשמור על סביבת העבודה נקייה
EVE שקופיות ספירת תאים NanoEnteK, קוריאהשפופרות בז
(15 מ"ל)pluriSelect Life Science, גרמניה05-00002-01
שקית סינון סטרילית TMC איבריה, פורטוגלN/A400 מיקרון
ספוג מסנןN/AN/A
ציטומטר זרימה ThermoFisher Scientific, ארה"בN/AAttune זרימה ציטומטר
FlowJo v10.8.1 תוכנהBD מדעי החייםN/A
פורמלדהיד 37%סיגמא-אולדריץ', גרמניה8.18708
צמר זכוכיתN/AN/A
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס Merck Life Science S.L, פורטוגלH6648מעובד, עם סודיום ביקרבונט, ללא פנול אדום, סידן כלורי ומגנזיום גופרתי, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאים
LIVE/DEAD ערכות כתמי תאים מתים הניתנים לתיקון Life Technologies Europe, הולנדL10119צבע תגובתי פלואורסצנטי קרוב ל-IR +
משאבות מים ראשיותEHEIM, גרמניהאוניברסליים 1200
(2 מ"ל)BRAND, Merck, גרמניהZ628034
קצות מיקרוצנטריפוגה סטריליים Sartorius, גרמניה790010, 790200, 791000תואם ל-Sartorius, 1-10 ומיקרו; L, 2-20 ומיקרו; L, 20-200 ומיקרו; L, 100-1000 ומיקרו; L
MicropipettesSartorius , גרמניה728020, 728030, 728060, 728070Sartorius ProlinePlus 1-10 ומיקרו; L, 2-20 ומיקרו; L, 20-200 ומיקרו; L, 100-1000 ומיקרו; מסנני
תאים מיני L pluriSelect Life Science Global Headoffice, גרמניה43-10100-50PluriStrainer 100 ומיקרו; m רשת ניילון,
מכשיר מדידה סטרילי רב פרמטרים WTW, גרמניהMulti 3420 SET G + תא מוליכות דיגיטלית IDS (TetraCon 925) + חיישן IDS DO אופטי (FDO 925) + אלקטרודה IDS pH (SenTix 940)
פיפטות פסטר (1 מ"ל, 5 מ"ל)Humeau Expert du laboratoire, צרפת248295
צלחות פטריSarstedt, גרמניה82.1194.50060 x 15 מ"מ, פוליסטירן,
מד pHHanna Instruments Inc., רומניהHANNA HI2211
צינורות פלקון עגולים מפוליסטירן (5 מ"ל)פישר סיינטיפיק, גרמניה14-959-2A
מדחום דיוק נייד סטרילי Ebro Electronic, גרמניהN/ATFX 430
רחפני חלבוןגמל שלמהN/Aטורנדו 120
חרוזי בקרת איכות / חרוזי בדיקת ביצועיםThermofisher Scientific, ארה"בN / A
מיכלי הסגר N/AN/A מיכלים בנפח כולל של 660 ליטר
מיכלי זכוכית/אקווריומים מלבנייםN/AN/Aמיכלים בנפח כולל של 200 ליטר
מקררN/AN/Aלאחסון הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות; סרגל C
30 ס"מN/AN/Aלמדידת אורך הדג נתרן
ביקרבונטHoneywell Fluka, גרמניה31437נתרן מימן פחמתי (NaHCO3)
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ', גרמניהS9888
כלי דיסקציה סטריליים N/AN/A(למשל אזמל, מספריים, מלקחיים בעלי קצה עדין, מגש/לוח ניתוח)
תנורי חימום דיגיטליים שקועים TMC איבריה, פורטוגל300 W, מזרקי מחממים דיגיטליים V2Therm
1 מ"לIVFSTORE, ארה"ב8300014579-MEAסטריליים, מזרקים רכים HSW  להשריית
חיישני טמפרטורתGHL, גרמניהPT 1000
טריקאין (MS-222) ThermoFisher Scientific, גרמניה118000500אתיל 3-אמינובנזואט, מלח חומצה מתאן-סולפונית, 98% (C10H15NO5S)
מעקר מים אולטרה סגול EHEIM, גרמניה5305010ClearUVC-36
nbsp;פישר סיינטיפיק, גרמניהN/AFisherbrand IsotempTM (P/N U01318)
גופי תאורה עמידים במיםN/AN/A
אקווה-פיד צהובה לניקוי מדיום שיפוע DMSO צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליות סטרילי ראש-כליה מרחצאות מים &

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Samaï, H. C., et al. Procedures for leukocytes isolation from lymphoid tissues and consequences on immune endpoints used to evaluate fish immune status: A case study on roach (Rutilus rutilus). Fish Shellfish Immunol. 74, 190-204 (2018).
  2. Mokhtar, D. M., Zaccone, G., Alesci, A., Kuciel, M., Hussein, M. T., Sayed, R. K. A. Main components of fish immunity: An overview of the fish immune system. Fishes. 8 (2), 93(2023).
  3. Lulijwa, R., et al. Characterisation of Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) blood and validation of flow cytometry cell count and viability assay kit. Fish Shellfish Immunol. 88, 179-188 (2019).
  4. Uribe, C., Folch, H., Enriquez, R., Moran, G. Innate and adaptive immunity in teleost fish: a review. Vet Med. 56 (10), 486-503 (2011).
  5. Bjørgen, H., Koppang, E. O. Anatomy of teleost fish immune structures and organs. Immunogenetics. 73 (1), 53-63 (2021).
  6. Santos, R. A., et al. In vitro modulation of gilthead seabream (Sparus aurata L.) leukocytes by Bacillus spp. extracellular molecules upon bacterial challenge. Fish Shellfish Immunol. 121, 285-294 (2022).
  7. Witeska, M., Kondera, E., Ługowska, K., Bojarski, B. Hematological methods in fish - Not only for beginners. Aquaculture. 547, 737498(2022).
  8. Titus, J., et al. Development and validation of a flow cytometry method to examine circulating leukocyte subpopulations in barramundi (Lates calcarifer). Comp Immunol Rep. 6, 200142(2024).
  9. Marmelo, I., et al. Eco-innovative aquafeeds biofortified with Asparagopsis taxiformis to improve the resilience of farmed white seabream (Diplodus sargus) to marine heatwave events. Heliyon. 10 (15), e35135(2024).
  10. Seibel, H., Baßmann, B., Rebl, A. Blood Will Tell: What Hematological Analyses Can Reveal About Fish Welfare. Front Vet Sci. 8, 616955(2021).
  11. Franke, A., Beemelmanns, A., Miest, J. J. Are fish immunocompetent enough to face climate change. Biol Lett. 20 (2), 20230346(2024).
  12. Fazio, F. Fish hematology analysis as an important tool of aquaculture: A review. Aquaculture. 500, 237-242 (2019).
  13. Fazio, F., Saoca, C., Costa, G., Zumbo, A., Piccione, G., Parrino, V. Flow cytometry and automatic blood cell analysis in striped bass Morone saxatilis (Walbaum, 1792): A new hematological approach. Aquaculture. 513, 734398(2019).
  14. Lulijwa, R., Alfaro, A. C., Merien, F., Meyer, J., Young, T. Advances in salmonid fish immunology: A review of methods and techniques for lymphoid tissue and peripheral blood leucocyte isolation and application. Fish Shellfish Immunol. 95, 44-80 (2019).
  15. Esteban, M. Á, Muñoz, J., Meseguer, J. Blood cells of sea bass (Dicentrarchus labrax l.). Flow cytometric and microscopic studies. Anat Rec. 258 (1), 80-89 (2000).
  16. Inoue, T., Moritomo, T., Tamura, Y., Mamiya, S., Fujino, H., Nakanishi, T. A new method for fish leucocyte counting and partial differentiation by flow cytometry. Fish Shellfish Immunol. 13 (5), 379-390 (2002).
  17. Ye, R. R., et al. Immune competence assessment in marine medaka (Orzyias melastigma)-a holistic approach for immunotoxicology. Environ Sci Pollut Res. 24 (36), 27687-27701 (2017).
  18. American Veterinary Medical Association. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL. (2020).
  19. FlowJoTM Software (for Windows). Version v10.8.1 (BD Life Sciences). , At https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/software/flowjo-v10-software (2023).
  20. Mhalhel, K., et al. Review on Gilthead Seabream (Sparus aurata) aquaculture: Life cycle, growth, aquaculture practices and challenges. J Mar Sci Eng. 11 (10), 2008(2023).
  21. Toni, M., Manciocco, A., Angiulli, E., Alleva, E., Cioni, C., Malavasi, S. Review: Assessing fish welfare in research and aquaculture, with a focus on European directives. Animal. 13 (1), 161-170 (2018).
  22. Kır, M. Thermal tolerance and standard metabolic rate of juvenile gilthead seabream (Sparus aurata) acclimated to four temperatures. J Therm Biol. 93, 102739(2020).
  23. Esteban, M. Á, Meseguer, J. Phagocytic defence mechanism in sea bass (Dicentrarchus labrax L.): An ultrastructural study. Anat Rec. 240 (4), 589-597 (1994).
  24. Esteban, M. Á, Mulero, V., Muñoz, J., Meseguer, J. Methodological aspects of assessing phagocytosis of Vibrio anguillarum by leucocytes of gilthead seabream (Sparus aurata L.) by flow cytometry and electron microscopy. Cell Tissue Res. 293 (1), 133-141 (1998).
  25. Rodríguez, A., Esteban, M. Á, Meseguer, J. Phagocytosis and peroxidase release by seabream (Sparus aurata L.) leucocytes in response to yeast cells. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272 (1), 415-423 (2002).
  26. Hamoutene, D., Payne, J. F., Volkoff, H. Effects of tebufenozide on some aspects of lake trout (Salvelinus namaycush) immune response. Ecotoxicol Environ Saf. 69 (2), 173-179 (2007).
  27. Pierrard, M. -A., Roland, K., Kestemont, P., Dieu, M., Raes, M., Silvestre, F. Fish peripheral blood mononuclear cells preparation for future monitoring applications. Anal Biochem. 426 (2), 153-165 (2012).
  28. Guardiola, F. A., Logothetis, P., Meseguer, J., Esteban, M. Á Evaluation of silver nanospheres on viability and innate cellular parameters of gilthead seabream (Sparus aurata L.) head-kidney leucocytes. Fish Shellfish Immunol. 69, 99-107 (2017).
  29. Campos-Sánchez, J. C., Guardiola, F. A., Esteban, M. Á In vitro effects of cantharidin on gilthead seabream (Sparus aurata) head-kidney leucocytes. Fish Shellfish Immunol. 123, 20-35 (2022).
  30. Korytář, T., Dang Thi, H., Takizawa, F., Köllner, B. A multicolour flow cytometry identifying defined leukocyte subsets of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 2017-2019 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Percoll

מאמרים קשורים