מאמר שיטה

תהליך חישובי דו-לשוני לזיהוי מעכבי PLK1 פוטנציאליים בשפת הסימנים והאנגלית האמריקאית

DOI:

10.3791/67979

⸱

3 באפריל 2026

 ,  ,  ,  , 
1Drug Discovery Lab, School of Science, Technology, Accessibility, Mathematics, and Public Health (STAMP), Gallaudet University, 2University of Connecticut

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול דו-לשוני זה מספק תהליך חישובי לגילוי תרופות שמעריך אינטראקציות חלבון-ליגנד של קינאזות דמויי פולו 1 עד 3 (PLK1–3) ותכונות ספיגה, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה, רעילות ויציבות (ADMET-S) של מולקולות טבעיות שמקורן במסדי נתונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קינאז 1 דמוי פולו (PLK1) ממלא תפקידים חיוניים בשלבי S, G2 ו-M במחזור התא, והביטוי המוגזם שלו נצפה לעיתים קרובות במספר סוגי סרטן, כולל סרטן השד, שם הוא תורם לחוסר יציבות גנומית ולאפופטוזיס לא מבוקר. בניגוד למעכבים תחרותיים קונבנציונליים ל-ATP שמכוונים לתחום הקינאז, עיכוב סלקטיבי של תחום הפולו-בוקס (PBD) של PLK1 מציע אסטרטגיה מבטיחה להפרעת אינטראקציות חלבון-ליגנד הקריטיות להתקדמות המיטוזה, ובכך לגרום לאפופטוזיס בתאי סרטן. עם זאת, הדמיון המבני הגבוה בין PLK1 לבין ההומולוגים שלו (PLK2 ו-PLK3), החיוניים לתפקוד נוירולוגי ולתגובה למאמץ, בהתאמה, מחייב סלקטיביות יוצאת דופן כדי למנוע השפעות לא מדויקות. כדי להתמודד עם אתגר זה, הפרוטוקול כולל זרימת עבודה חישובית דו-לשונית (שפת הסימנים האמריקאית והאנגלית) המשלבת סינון וירטואלי, אשכולות מבניים, עגינת חלבון-ליגנד, חיזוי זיקה לקישורים, פרופילינג ADMET-S וניתוח יציבות קוונטית (QM). החל ממאגר המוצרים הטבעיים SuperNatural 3.0, התרכובות סיננו לפי קריטריוני רלוונטיות לסרטן השד ודמיון תרופתי, אוחסנו כדי להבטיח גיוון כימימי, והעריכו את האינטראקציות שלהן עם מבני PLK1-, PLK2 ו-PLK3-PBD. בעוד שעגינה וירטואלית והערכות ADMET-S בסיליקו אינן יכולות לאשר באופן חד-משמעי סלקטיביות או מנגנון פעולה, מחקר זה מייצר השערות ניתנות לבדיקה ומעדיף מערך ממוקד של מועמדים שמקורם במוצר טבעי לסימולציות דינמיקה מולקולרית עתידית, אימות ביוכימי או סקר ניסוי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קינאזות דמויי פולו (PLKs) הן משפחה של קינאזות חלבון המורכבות מבנית מדומיין N-טרמינלי וקצה C המורכב מדומיינים או שניים של קופת פולו-בוקס (PBD)1,2.  המספר והמגוון הפונקציונלי של תחומי הפולו-בוקס משתנים בין חברי משפחת PLK שונים. PLK1 מעורב בשלבים S, G2 ו-M של חלוקת התא. במחזור התא, PLK1 משמש כנקודת ביקורת לנזק DNA בשלב S וכמווסת של עיבוי כרומוזומים והתבגרות צנטרוזומים בשלב G2. PLK1 גם מעודד כניסה מיטוטית לשלב M, ואחריה הרכבת הציר, כניסה לאנפאזה וציטוקינזיס 3,4. ביטוי יתר של PLK1 מוביל לחוסר יציבות גנטית עקב יצירת צנטרוזומים לא תקינה, מה שמוביל למחזורי תאים לקויים שמונעים מהתאים לווסת אפופטוזיס.  ביטוי יתר כזה נצפה בסרטן הריאות, הראש והצוואר, סרטן הוושט, הקיבה, המעי הגס והשד4. לכן, עיכוב PLK1 באמצעות תרופות המכוונות ל-PBD עלול לגרום לאפופטוזיס 5,6. זרימת עבודה זו שואפת להשיג סלקטיביות גבוהה כדי למנוע עיכוב PLK2 ו-PLK3, שהם חיוניים לתפקוד נוירולוגי ולניהול לחץ גנוטוקסי3.

PLK2 פועל כמדכא גידולים בהקשרים מסוימים, מווסת את המעבר בין G1 ל-S ומקדם את פירוק הציקלין E כדי למנוע התרבות תאים בלתי מבוקרת. PLK3 מפגין תפקיד מורכב הן בוויסות מחזור התא והן בתגובה ללחץ גנוטוקסי, ותורם לשמירה על שלמות הגנום באמצעות מעורבותו בהפעלת נקודות ביקורת לנזק DNA ובהשראה לאפופטוזיס. חשוב לציין, בעוד שעיכוב PLK1 הפך לאסטרטגיה טיפולית מבטיחה לטיפול בסרטן, התפקידים החיוניים של PLK2 ו-PLK3 בתפקוד הנוירולוגי ובתגובה ללחץ מחייבים פיתוח מעכבים סלקטיביים מאוד כדי למזער השפעות לא מטרה על קינאזות קריטיותאלו. הקשר ביולוגי זה והדמיון המבני מעל 38%3 מדגישים את חשיבות זיהוי תרכובות המיועדות במיוחד לתחום הפולו-בוקס (PBD) של PLK1 מבלי להפריע לתפקודי ההגנה של PLK2 ו-PLK3 בפיזיולוגיה תאית תקינה.

מעכבי קינאז דמויי פולו (PLK) ידועים, במיוחד אלו המיועדים ל-PLK1, נחקרו בהרחבה בשל יישומי טיפול פוטנציאליים בטיפול בסרטן. מספר תרכובות, כולל BI 2536, volasertib (BI 6727), onvansertib (NMS-1286937) ו-GSK461364, פותחו והתקדמו לניסויים קליניים, לעיתים כמעכבים תחרותיים ל-ATP 8,9,10. סוגים אחרים של מעכבים מכוונים ל-PBD, כולל תימוקינון (TQ)11,12, פולוקסין13,14 ואלופול-A15. למרות שלפי הדיווחים מבטיחים, נכון לעכשיו אין מעכבים ספציפיים ל-PBD או ניסויים קליניים בשלבים מאוחרים בשל אתגרים, כולל תכונות ADMET-S לא אופטימליות והשפעות לא מטרה6. לדוגמה, מספר מעכבי PLK1-PBD הם לפי הדיווחים אלקילטורים חלבונים לא ספציפיים16, מה שמגביל את היישום הקליני שלהם. לכן, שיפור הסלקטיביות ופרופילי ADMET-S של מעכבי PLK1-PBD פוטנציאליים נותר מטרה מרכזית בגילוי תרופות.

מטרת המחקר היא לחקור מעכבי PLK1-PBD פוטנציאליים עם תכונות ADMET-S באמצעות סינון וירטואלי, סינון דמיון מבני, עגינה, חישובי אנרגיית קישור והערכת ADMET-S. PLK2 ו-PLK3 היו נתונים לאותם פרוטוקולים להערכת סלקטיביות פוטנציאלית. בעוד שקיימים צינורות חישוביים רבים לגילוי מעכבי קינאז, מעטים משלבים סקר סלקטיביות מקבילי בין PBDs PLK1–3 עם ניתוחי ADMET-S ויציבות קוונטית, במיוחד באמצעות ספריות מוצרים טבעיים. תהליך העבודה מבוסס על פרדיגמות סינון וירטואליות מבוססות, אך מותאם לנגישות חינוכית וליצירת השערות בשלבים מוקדמים. הפרוטוקול דורש רק מחשב נייד סטנדרטי (8GB RAM), תוכנה אקדמית חינמית וללא ניסיון תכנותי קודם, מה שהופך אותו למתאים לסביבות תיכון, תואר ראשון ותארים מתקדמים, כולל חוויות מחקר מבוססות קורסים לתואר ראשון (CUREs).

המסלול החישובי לעבודה זו מתחיל בהכנת חלבונים, שבו מבנים של PLK1-PBD, PLK2-PBD ו-PLK3-PBD נשלפים מבנק נתוני החלבונים (PDB) או מודלים ומעובדים כדי לפתור פערים מבניים. לאחר מכן בוצע סקר במאגר מוצרים טבעיים, שסינן תרכובות בהתבסס על פוטנציאל כאנטי-סרטן השד ועמידה בכלל החמשת של ליפינסקי. השלבים הבאים הם קיבוץ ל-50 מבנים מייצגים המבוססים על טביעת אצבע מולקולרית ודמיון. נציגים אלו עברו חישובי עגינת חלבון-ליגנד וחישובי זיקה קשות, ויצרו נתוני אינטראקציה עבור שלושת ה-PLKs. בהמשך, תכונות ADMET-S מוערכות באמצעות שלושה שרתי אינטרנט שונים לחיזוי פרמקוקינטיקה, דמויות תרופות, רעילות ויציבות מטבולית. חישובי QM שימשו להערכת יציבות מולקולרית באמצעות ניתוח האורביטל המולקולרי הגבוה ביותר (HOMO) והאורביטלי המולקולרי הלא תפוס הנמוך ביותר (LUMO) של פער HOMO–LUMO. לבסוף, נתוני ADMET-S נותחו כדי לסנן ולדרג תרכובות על בסיס קריטריונים פיזיקוכימיים, ספיגה, התפלגה, חילוף חומרים, הפרשה, רעילות ויציבות כמעכבי PLK1-PBD פוטנציאליים וסלקטיביים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מזהי משאבי המחקר (RRIDs) ומספרי הגרסאות של כל כלי התוכנה בהם נעשה שימוש מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת חלבון ממוקדת

  1. צור תיקיית עבודה לפרויקט זה שבה ניתן לאחסן קבצים מבניים ותוצאות חישוביות.
  2. בקרו במאגר הנתונים של חלבונים כדי לאסוף את המזהה של חלבון המטרה PLK1-PBD (4HCO11) ועקבו עם כימיה ב-HARvard מכניקה מולקולרית - ממשק משתמש גרפי (CHARMM-GUI 17,18) כדי לפתור כל אי-התאמה מבנית.
    1. בקרו ב-CHARMM-GUI והירשמו לחשבון אקדמי. בעת הרשמת חשבון אקדמי, לחץ על מחולל הקלט, ואז על קורא PDB, הזן את מזהה PDB 4HCO ולחץ על השלב הבא.
    2. בעמוד הבא, ודאו שרק PROA – שרשרת חלבונים A נבחרה ולחצו על השלב הבא בשני העמודים הבאים.
    3. הורידו את step1_pdbreader.pdb לתיקיה, שנו את שם הקובץ ל-4hco או preferred, והשתמשו בעורך טקסט או קוד לשינוי שם של הופעות של histidine (HSD) ל-(HIS).
  3. חזור על ההליך עבור PLK2-PBD (מזהה PDB: 4XB019) באמצעות CHARMM-GUI.
    הערה: למבנים ללא מזהי PDB, כמו PLK3-PBD, השתמשו במבנים מודלים בהומולוגיה או ב-Alphafold20. וודא דיוק רצף מ-Uniprot21.

2. סינון מאגר מוצרים טבעיים

  1. בקרו במסד הנתונים של ספריית SuperNatural 3.0 של מוצרים טבעיים ובחרו בעמוד המשנה של המחלות22.
    1. בחרו סרטן שד עם כל מגבלת ביטחון או ללא הגבלת אמון, שכן כל התוצאות יצטרכו לעבור סינון תכנותי, ולחצו על 'מצא'. לחצו על Download the full result file כדי לשמור את התוצאות בתיקיית הבחירה המועדפת כ-.csv. לאחר מכן, השתמש בקוד לסינון עבור אלו עם מגבלות ביטחון של 0.900–1.000 (n = 1,193 מתוך 73,406).
      הערה: לחלופין, ניתן להזין את מזהה האנציקלופדיה של קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) לסרטן השד בעמוד המשנה23 של המסלולים.
    2. גשו לתת-עמוד השאלות הנפוצות , בתחתית, מצאו את כל מאגר הנתונים הזמין להורדה כקובץ .csv. הורידו זאת והשתמשו בסקריפט כדי להתאים את מחרוזות Simplified Molecular Input Line System (SMILES) מהנתונים למזהי Supernatural של 1,193 המולקולות והכינו רשימה של מחרוזות SMILES שלהן (smiles.csv).

3. דגימת אשכולות

  1. הורידו הפצת אנקונדה (https://www.anaconda.com/download) שמכילה כמעט את כל חבילות הקוד הפתוח, או הורידו בנפרד סביבת פיתוח משולבת (IDE) כמו RStudio (RStudio Desktop - Posit) או Jupyter (Jupyter Notebook). התקן את RDKit24, חבילת קוד פתוח לכימינפורמטיקה ולמידת מכונה באמצעות Conda.
    הערה: הוראות להתקנת קונדה ויצירת סביבת קונדה ניתן למצוא בתיעוד conda 25.9.2.dev31. להתקנת RDKit והגדרת מודולים בסביבה, ראו התקנה — תיעוד RDKit 2025.03.6.
  2. שים את הסקריפט "Lipinski.py" בקובץ המשלים 1 באותה תיקייה עם "smiles.csv" והפעיל אותו. הסקריפט פותח את סביבת קונדה, טוען מודולים, קורא את קובץ מחרוזות SMILES, מיישם פילטר המבוסס על כלל 5 של ליפינסקי להערכת זמינות ביולוגית וספיחה (n = 999 מתוך 1,193), ושומר רשימה של מחרוזות SMILES כ"all.csv".
    הערה: אשר ש"all.csv" נוצר ומכיל ~999 תרכובות (תת-קבוצה מסוננת). פתח את הקובץ כדי לוודא שכל ערך מכיל מחרוזת SMILES תקפה. פייתון רץ ב-RStudio לאחר ביצוע הדברים הבאים בקונסולה: library(reticulate); רשת::use_condaenv(nameofcondaenv)
  3. שים את סקריפט ה"Clustering.py" (קובץ משלים 1) באותה תיקייה כמו "all.csv" והרץ אותו ב-IDE המועדף. הסקריפטים טוענים מודולי אשכולות, קוראים את קובץ מחרוזות SMILES, ומקבצים תרכובות ל-50 אשכולות בהתבסס על טביעת אצבע מולקולרית ודמיון בטנימוטו.
    הערה: 50 מבנים מייצגים (rep_struct.csv, בקובץ המשלים 1) נשמרים בתיקייה כרשימת מחרוזות SMILES. דמיון טנימוטו (המכונה גם אינדקס ז'אקארד בכימינפורמטיקה) הוא מדד המשמש לכימות הדמיון המבני בין שתי מולקולות בהתבסס על טביעות האצבע המולקולרית שלהן, כאשר מקדם טנימוטו נע בין 0 (ללא דמיון) ל-1 (טביעות אצבע זהות). ודא של-"rep_struct.csv" יש בדיוק 50 רשומות SMILES ייחודיות המייצגות כל אשכול.

4. חישוב אפיניות וחיבור חלבון-ליגנד

  1. בקרו בשרת אינטרנט Blind Docking מבוסס AutoDock Vina (CB-Dock2)26.
    1. לך ללשונית העגינה והעלה את חלבון 4HCO.
    2. כדי להעלות את הליגנד, לחצו על draw ligand והדביקו ליגנד מתוך רשימת מחרוזות SMILES (rep_struct.csv, קובץ משלים 1). הזן כתובת אימייל בשדה הבא לאיסוף נתונים עם דחוס קל יותר, ואז לחץ על עגינה עיוורת אוטומטית. חזור על כך עבור 49 נציגי אשכולות מולקולות קטנות שנותרו, תוך סימון lig1, lig2, ..., lig50.
  2. עבור לתוצאה שנשלחה במייל והורד את תיקיות ה-zip לתיקיית משנה בשם 4HCO, תוך כותרות רגילות (4hco_lig1, 4hco_lig2, ..., 4hco_lig50).
    1. פתח את התיקיות והסר את כל הקבצים פרט לקבצים מורכבים של חלבון-ליגנד שמסתיימים ב-".complex.pdb".
      הערה: ודאו שכל תיקיית ליגנד (4hco_lig1 ל-4hco_lig50) מכילה את הקובץ ".complex.pdb" המתאים.
    2. פתח קובץ דוגמה .complex.pdb עם עורך טקסט כדי לציין בקפידה את מזהה שרשרת החלבונים: P ואת מזהה הליגנד: A:UNL ודחס מחדש את התיקיות באמצעות כלי דחיסת קבצים.
    3. בקרו בשרת האינטרנט PROtein binDing enerGY (PRODIGY) להערכת סלקטיביות וזיקה בין חלבון-ליגנד27.
      1. לחץ על לשונית PRODIGY-lig (מולקולה קטנה של חלבון) כדי להעלות תיקייה מרוכזת עם מספר קומפלקסים של חלבון-ליגנד בו זמנית (כמו 4hco_lig1). הזן את מזהי שרשרת החלבונים והליגנד, השלים את אימות הקפצ'ה, והמשך ללחוץ על 'שלח פרודיג'י-ליגנד'.
      2. לאחר עיבוד הנתונים, לחצו על קובץ הארכיון של כל הפלטים (.zip) כדי להוריד תוצאות. חזור על השלב הקודם ואיסוף התוצאות לכל תתי-התיקיות עד 4hco_lig50.
    4. חזור על כל השלבים עבור חלבונים 4XB0 ו-PLK3 עם תשומת לב זהירה לנומנקלטורה של הקבצים (כמו 4xb0_lig1 או plk2_lig1).
      הערה: ודאו ש-CSV של פלט עבור כל קומפלקסי חלבון-ליגנד הורדו ומכילים גם את עמודות הנתונים של ΔG וגם את עמודות שאריות הממשק.

5. הערכת ADMET-S

  1. בקרו בפלטפורמת ADMETlab3 3.028.
    1. לחצו על GET START תחת "ADMET Screening" והזינו רשימת SMILES.
      1. פתח rep_struct.csv בתיקייה כדי להדביק את כל רשימת מחרוזות SMILES לשדה הטקסט ולשלח.
      2. העריכו את הפרמקוקינטיקה ותכונות הדמיון לתרופות באמצעות מערכת הניקוד הצבעונית של הפלטפורמה והורידו את תוצאות ההערכה כקובץ .csv לניתוח נוסף.
      3. עבור לכלי SwissADME29.
  2. הדביק את רשימת מחרוזות SMILES לכל 50 המולקולות לשדה הקלט.
    1. לחצו על Run כדי לחשב תכונות זמינות ביולוגית וחדירה, כולל חדירת BBB.
    2. הורד את הפלט כקובץ .csv לאינטגרציה עם תוצאות ADMET אחרות.
  3. הורידו והתקינו את ToxTree30 (הערכת סיכון רעילה בגישת עץ החלטות) התואמת למערכת ההפעלה של המשתמש.
    1. פתח את התוכנה דרך הטרמינל באמצעות הפקודה: sh Toxtree.sh
    2. הזן את חוטי SMILES בנפרד ל-ToxTree כדי לסווג רעילות לפי חוקי קריימר.
    3. ייצא את התוצאות כקובץ .csv לאינטגרציה עם נתוני ADMET אחרים.
      הערה: בדוק שה-CSV של ADMETLab3 ו-SwissADME תואמים למספר הליגנדים (n = 50) ושתוצאות Toxtree מסווגות כל תרכובת לפי כללי קריימר (I–III).
  4. לאחר התקנת ORCA31, צור תיקייה בשם stability בתיקיית העבודה ובתת-תיקיות לכל מולקולה (למשל, plk1_lig1, plk1_lig2, ..., plk1_lig50).
    1. השתמש ב-Avogadro (Avogadro) כדי לבנות כל מולקולה מתוך מחרוזת SMILES שלה: גש ללשונית Extensions ולחץ על Optimize Geometry כדי לאופטימיזציה של המולקולה. יצירת קבצי קלט של ORCA באמצעות הרחבות > ORCA > יצירת קלט ORCA ויישום ההגדרות הבאות:
      ! B3LYP OPT FREQ def2-TZVP
      %maxcore 4000
      %pal
      nprocs 1
      סוף
    2. שנו את קובץ המשרה .sh שהורד לכל ליגנד כך שיכלול שמות תפקידים ייחודיים וכתובת דוא"ל. לאחר מכן, העבר את תיקיית ה"יציבות" למערכת חישוב ביצועית (HPC) באמצעות הפקודות הבאות:
      שש xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu
      MKDIR ~/4HCO
      SCP -r /local/path/to/stability xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu:~/4hco
    3. בצע את העבודות דרך Simple Linux Utility for Resource Management (מנהל עומס עבודה SLURM לאשכולות HPC) עם סקריפט לולאה:
      עבור i ב-{1..50}; עשה
      CD ~/4hco/stability/plk1_lig${i}
      chmod +x job_lig${i}.sh
      sbatch job_lig${i}.sh
      סיימתי
    4. לאחר קבלת מיילים להשלמת עבודה, יש לנווט לתיקיות הליגנד ולפתוח קבצי פלט כדי לבדוק נתונים ולציין את ערכי HOMO ו-LUMO:
      CD ~/4HCO/stability/plk1_lig1
      nano lig1.out

6. ניתוח נתוני ADMET-S

  1. שלבו את נתוני התכונות הפיזיקוכימיות שמקורם בתרשימי מכ"ם ביו-זמינות וחדירות של SwissADME לקובץ .csv.
    1. שמור את קובץ ה-.csv מ-SwissADME וקרא לו "Physiochemical.csv".
    2. הנח את סקריפט "Physiochemical.py" (קובץ משלים 1) באותה תיקייה כמו "Physiochemical.csv" והריץ אותו.
    3. יישם את הקריטריונים הבאים: nHD: 0–7, nHA: 0–12, nStereo: <2, LogP: 0–3, LogD: 1–3, LogS: –4 עד 0.5, Fsp3: >0.41, ו-nHet: 1–15.
  2. הסקת נתוני הספיגה וההפצה מ-SwissADME.
    1. תמונת מצב ושמרו את טבלת BLED-Egg32 ב-SwissADME.
    2. יש ליישם את הקריטריונים הבאים: המולקולות חייבות להיות באזור "הביצה" ולשמש כמעכבי p-גליקופרוטאינים, שכן הנקודות האדומות מועדפות.
  3. הסקת נתוני חילוף החומרים מ-ADMETlab3.0 עבור מצע ומעכבים של ציטוכרום (CYP).
    1. שמור .csv קובץ מ-ADMETlab3.0 וקרא לו "Metabolism.csv".
    2. ערוך את קובץ ה-.csv ושמר רק את העמודות של CYP-inh ו-CYP-sub.
    3. שים את סקריפט "Metabolism.R" (קובץ משלים 1) באותה תיקייה כמו "Metabolism.csv" והריץ אותו.
    4. יש ליישם את הקריטריונים הבאים: מעכב CYP p450 וחומר לא-סובסטרט כקטגוריה 0 מועדפים.
  4. הסקת נתוני ההפרשה מ-ADMETlab3.0 לפינוי פלזמה ומחצית חיים.
    1. שמור .csv קובץ מ-ADMETlab3.0 וקרא לו "Excretion.csv".
    2. ערוך את קובץ ה-.csv ושמור רק את העמודות של cl-plasma ו-t0.5.
    3. שים את סקריפט "Excretion.py" (קובץ משלים 1) באותה תיקייה כמו "Excretion.csv" והפעיל אותו.
    4. יש ליישם את הקריטריונים הבאים: ניקוי פלזמה: 0.01–5 מ"ל/דקה/ק"ג.
    5. nנתוני רעילות מ-Toxtree עבור מחלקת הרעילות ו-ADMETlab3.0 עבור מספר הטוקסופורים.
      1. שמור .csv מ-ADMETlab3.0 וקרא לו "Toxicity.csv".
      2. ערוך את קובץ .csv, תוך שמירה רק על העמודה Toxicophore, והוסף עמודה חדשה שמקליטה את כל מחלקת רעילות של כל ליגנד מ-Toxtree.
      3. הנח את סקריפט ה"Toxicity.py" (קובץ משלים 1) באותה תיקייה כמו "Toxicity.csv" והריץ אותו.
      4. יש ליישם את הקריטריון הבא: מספר הטוקסופורים יהיה 0–2.
    6. לגזור נתוני יציבות מקבצי פלט של ORCA. ("אנרגיות אורביטליות", במיוחד ערכי האנרגיה HUMO ו-LUMO).
      1. צור תרשים אקסל המתעד את אנרגיות ה-HUMO וה-LUMO של כל ליגנד כעמודות נפרדות.
      2. הוסף עמודה חדשה לחישוב פער הפס (HUMO–LUMO = פער פס).
      3. שמור את טבלת האקסל כ"Stability.csv".
      4. שים את סקריפט ה"Stability.py" (קובץ תוסף 1) באותה תיקייה עם "Stability.csv" והריץ אותו.
      5. יש ליישם את הקריטריונים הבאים: הפרש פערי הפסים יהיה בין 3.6–5 eV.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מבנה חלבון היעד מבטיח שקובץ החלבון היעד מותאם לניתוח ועגינה מבוססת מבנה. קובץ המבנה המתקבל, בפורמט PDB, נקי משייריות ומימן חסרים, סוגי אטומים חסרים, ורכיבים מיותרים כמו מולקולות מים וליגנדים מתגבשים במשותף. איור 1A,B מציגים הבדלים ויזואליים (המחוישים על ידי Mol* Viewer33) במבנים לפני ואחרי ההכנה. אם נותרו בעיות עיצוב שארית (כמו שמות אטומים לא מזוהים או שאריות לא שלמות), CB-Dock2 בדרך כלל יוציא שגיאה בעת ההעלאה. בנקודה זו, ניתן לבצע תיקונים ידניים קלים, כמו שינוי שם HSD ל-HIS או הסרת שאריות לא סטנדרטיות, לפני הניסיון מחדש של שלב העגינה.

איור 2 מציג את תוצאות האשכול באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) בהתבסס על טביעת אצבע מולקולרית ודמיון לטנימוטו. באיור, כל אשכול מקובץ על ידי אליפסה בגוון אפור המכילה נקודות בצבע דומה, המייצגות את המולקולות שבאותם אשכולות.  רכיבי PCA 1 ו-2 על הצירים מספקים ייצוג ליניארי דו-ממדי של ההפחתה מאלמנטים בעלי ממד גבוה במטריצות טנימוטו. במחקר זה, הדמיון לטנימוטו משמש במהלך שלב דגימת האשכול כדי להפחית יתירות ולהגביר את המגוון הכימי בין 999 המוצרים הטבעיים התואמים לליפינסקי. על ידי חישוב דמיון זוגי של טנימוטו באמצעות טביעות אצבע מולקולריות, מערך הנתונים מחולק ל-50 אשכולות של תרכובות קשורות מבנית. לאחר מכן נבחרת מולקולה מייצגת אחת מכל אשכול, מה שמבטיח שקבוצת 50 הליגנדים הסופית תופסת מרחב כימי רחב תוך מזעור הרדונדנסיות החישובית בניתוחי עגינה במורד הזרם וניתוחי ADMET-S. אסטרטגיה זו משפרת את היעילות והייצוגיות של סקר וירטואלי, במיוחד בעבודה עם ספריות מוצרים טבעיים גדולות כמו Supernatural 3.0. (ראו איור 2).

תנוחות אופטימליות לכל קומפלקס חלבון-ליגנד מדומות, בליווי זיקות חזויות בצורת ציוני Vina בין חמש תנוחות CurPocket של חלבון PLK1 ב-CB-Dock2, תוך התחשבות בכוחות ואן דר ואלס וקשרי מימן.  דוגמה לסימולציה של ליגנד 1 באיור 3 מראה את הקישור הטוב ביותר לתנוחת CurPocket השנייה (C2), עם ציון Vina הנמוך ביותר של –7.5 קקלורי/מול, בהשוואה לארבע התנוחות העליונות האחרות. עגינה מולקולרית עם CB-Dock2 מתבצעת באמצעות פונקציית ניקוד המבוססת על פרמטרים אמפיריים ואלגוריתם אופטימיזציה גלובלית סטוכסטית. CB-Dock2 עבר אימות קפדני והוכח ביצועים מעולים בהשוואה לכלי עגינה עיוורים מתקדמים אחרים, מה שהופך אותו לבחירה מצוינת למחקרי עגינה 26,34. השרת משיג שיעור הצלחה של כ-85% בחיזוי תנוחה (RMSD <2 Å), וטוב יותר מכלים פופולריים, כולל גרסת CB-Dock הראשונה, SwissDock, COACH-D ו-MTiAutoDock34. דיוק גבוה זה מיוחס לשילוב החדשני של CB-Dock2 בין שתי שיטות עגינה משלימות: גישות מבוססות מבנה ושיטות מבוססות תבניות.

איור 4 ממחיש מפת חום של הזיקה הממוצעת החזויה לכל שילוב חלבון-ליגנד באמצעות זיקות חזויות שרת אינטרנט של PRODIGY.  זיקות גבוהות יותר, המסומנות באנרגיות מולריות נמוכות יותר (kcal/mol) וגווני מפת חום ירוקים יותר, הן זיקות קשירה מועדפות. לעומת זאת, זיקות נמוכות יותר, המסומנות באנרגיות מולריות גבוהות יותר וגווני מפת חום אדומים יותר, פחות מועדפות. מבחינת סלקטיביות, אידיאלי שיהיו תרכובות עם זיקות חיוביות לחלבון המטרה (PLK1) ביחס להומולוגים (PLK2–3). לדוגמה, ליגנד 27 הוא ליגנד סלקטיבי PLK1-PBD ביחס לליגנד 45, שמראה זיקות דומות בין שלושת החלבונים. למרות שפגיעות 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 ו-49 מראות זיקה גבוהה יותר ל-PLK1-PBD מאשר PLK2/3, הן מגוונות כימית במרחב טביעת האצבע הדו-ממדית (ממוצע ECFP4 Tanimoto ≈ 0.135, ללא זוג ≥ 0.50), מה שמרמז שכל ספציפיות רחבה יותר נובעת ככל הנראה מגאומטריית כיס PBD משומרת ודפוסי פרמקופור/אינטראקציה תלת-ממדיים משותפים, ולא על ידי זהות פיגום. ההמלצות כוללות השוואת אינטראקציה-טביעת אצבע ומיפוי פרמקופורים לזיהוי הגורמים המבניים לזיהוי PLK1-PBD.

תוצאות הערכת התכונות הפיזיקוכימיות מוצגות בתרשים רדאר (איור 5). התכונות שנבדקו כוללות אינטראקציות אטומיות, מסיסות וזמינות ביולוגית. חלק מהתרכובות בולטות בתכונות הפיזיקוכימיות הרצויות יותר שלהן עם טווחים מקובלים: nHD = 0–7, nHA = 0–12, nStereo < 2, LogP = 0–3, LogD = 1–3, LogS = –4 עד 0.5, Fsp3 > 0.41, ו-nHet = 1–15. תרשים רדאר זה מספק הדמיה מקיפה ורב-ממדית של התכונות הפיזיקוכימיות של 50 הליגנדים המייצגים שזוהו בתהליך הסינון החישובי. הוא נועד להעריך עד כמה כל תרכובת עומדת בקריטריונים המוגדרים מראש ל"דמוי תרופה" על ידי מיפוי תכונותיה מול גבולות תחתונים ועליונים שנקבעו. התרשים מציג עשרה תיאורים מולקולריים מרכזיים המסודרים סביב הציר הקוטבי, כולל pKa חומצי ו-pKa בסיסי. השטח המוצל בין הפוליגון הירוק (גבול תחתון) לפוליגון הכחול (הגבול העליון) סימן את הטווח האידיאלי או המקובל לכל תכונה, בהתבסס על הספים שסופקו בפרוטוקול. הגבולות העליונים והתחתונים של חומצת pKa (2–12 ובסיס pKa (3–10) הוקצו על פי סקירות ספרות 35,36,37, שכן אין גבול עליון ותחתון יחיד ל-pKa בגילוי תרופות. כל קו צבעוני מייצג אחד מ-50 הליגנדים. הצורה שנוצרת על ידי חיבור נקודות הנתונים של ליגנד יחיד מציגה את הפרופיל שלו על פני עשרת התכונות שנבחרו בו-זמנית. רוב מוחלט של 50 הליגנדים נמצאים בתוך או קרוב מאוד לאזור המקובל שמוגדר על ידי הפוליגונים הירוקים והכחולים. דבר זה מצביע על כך ששלבי הסינון הראשוניים, במיוחד יישום חוק החמישה של ליפינסקי והאשכולות המבוסס על דמיון לטנימוטו, היו יעילים מאוד בהעשרת מאגר הנתונים עם מולקולות בעלות תכונות תרופות מועדפות. מומלץ להציג את כל טווח הערכים המתועדים לכל הפרמטרים.

איור 6A–C מציג רכיבים של נתוני ADME מ-ADMETlab3.0 ו-SwissADME. מתחילים בספיגה ובהפצה, מודל BOILED-Egg38 באיור 6A מ-SwissADME מייצג את הספיגה וההפצה של התרופה באמצעות ליפופיליות וחדירה, כפי שמוצג על ידי האליפסות הצהובות והלבנות בגרף. הוא כולל מצעים ומעכבים של P-gp, המיוצגים בנקודות כחולות ואדומות, בהתאמה, כאשר עיכוב P-gp הוא קריטי לשיעורי ספיגה גבוהים יותר. באיור 6B, מפת החום של חילוף החומרים מציגה את העיכוב והמצע של כ-7 זנים של אנזימי CYP ציטוכרום p450. התוצאה הרצויה לליגנדים היא לשמש כ-CYP לא-מעכבים ולא סובסטרטים (ירוק), כאשר תוצאות מועדפות מאשרות פרופיל בטיחות תרופתית בטוח ללא אינטראקציות בין תרופות או נמוכות. איור 6C מציג נתוני הפרשה של ניקוי התרופה ומחצית החיים שלה. ניתן להבחין בהפרשה לפי פינוי הפלזמה האופטימלי (<5 מ"ל/דקה/ק"ג). מחצית החיים של התרופה לכל תרופות אנטי-סרטן תלויה במנגנון הפעולה של התרופה, ברעילות ובמטרה. מחצית החיים האידיאלית מאזנת בין שמירת ריכוזי התרופות בתוך חלון טיפולי לבין הפחתת רעילות ומתן לוחות מינון נוחים39,40.

השילוב של שני סוגים של הערכות רעילות. באיור 7A, מספר הטוקסיקופורים שזוהה על ידי ADMETlab3.0 מוצג עבור כל ליגנד.  אין סף ברור או מידע על טווחי הטוקסיקופורים המקובלים.  באיור 7B, יישום Toxtree מספק מידע הקשור לקטגוריית רעילות (I-III) וכן להפרות כללי קריימר והקפדה עליו. תוצאת הדגימה של ליגנד 1 מציגה את תוצאות הרעילות ואת קוד SMILES שלה בסרגל העליון, כאשר המבנה נמצא בחלון השמאלי התחתון. זיהוי רעילות מחלקת החלון בפינה הימנית העליונה מצביע על רעילות גבוהה (מחלקה III) בהתבסס על כללי קריימר לליגנד 1, ולא על אפשרויות אחרות כמו מחלקה II (רעילות בינונית) או מחלקה I (רעילות נמוכה).  החלון הימני התחתון מציג את ההיגיון הכתוב של זיהוי מחלקה בהתבסס על עץ ההחלטות של Cramer's Rule Rule.

חישובי ORCA QM של תדר רטט למבנים אופטימליים מחשבים ערכי אנרגיה מסלוליים לקביעת פער הרצועה. איור 8 מציג את פער הרצועה (eV) של כל ליגנד שנגזר מההבדל בין ה-HOMO ל-LUMO. טווח הסף מיוצג באזור המוצל בין 3.6 eV ל-5.0 eV, שבו כל נקודה באזור המוצל מקיימת את רמות האנרגיה הקשורות ליציבות ותגובתיות רצויה יותר. סקירה של כל תהליך העבודה החישובית מסוכמת באיור 9, שממחיש את השלבים העוקבים מהכנת חלבונים מטרה וסינון מסדי נתונים של מוצרים טבעיים ועד להערכת ADMET-S, שנועדה לזהות מעכבי PLK1-PBD סלקטיביים תוך שמירה על תכונות דמויות תרופה ויציבות כימית. מפת דרכים ויזואלית זו מדגישה את מודולריות הפרוטוקול, הנגישות וההתאמה ליישום חינוכי.

טבלה 1 מפעילה את הפרוטוקול על ידי הפיכתו מרצף ליניארי של פקודות לצינור חזק ומודע לשגיאות, המתאים לשימוש בכיתה ובמחקר עצמאי. הוא מתמודד במפורש עם שחזוריות, אתגר ידוע בגילוי תרופות חישובי, על ידי הטמעת קריטריוני אימות בנקודות מעבר מרכזיות. לדוגמה, אישור ששאריות היסטידין מסומנות באופן אחיד כ"HIS" לאחר עיבוד CHARMM-GUI מונע תקלות שקטות בעגינה במורד הזרם, בעוד שאימות שלמות SMILES לפני האשכולות מונע שגיאות מדורגות בחיזוי ADMET. הטבלה מדגישה גם עיצוב פדגוגי, כאשר כל טיפ לפתרון תקלות ניתן לפעולה עם רקע חישובי מינימלי (למשל, "open .complex.pdb in a text editing to check chain-ids"), בהתאם למטרת כתב היד לנגישות ללומדים חירשים, לתואר ראשון/תארים מתקדמים ולומדים בתיכון. יתרה מזאת, על ידי סימון שלבים שבהם התוצאות משפיעות באופן לא פרופורציונלי על התוצאות, כמו הערכת סלקטיביות באמצעות ניקוד השוואתי של PRODIGY, הטבלה מסייעת למשתמשים לתעדוף תשומת לב ומשאבים.

חוזקה מרכזית של תהליך עבודה משולב זה היא יכולתו לחשוף פערים בין תחזיות חישוביות משלימות, ולחשוף מקרים קיצונים המדגישים את המגבלות של כל שיטה בודדת. לדוגמה, ליגנד 5 עבור PLK1-PBD הציג ציון CB-Dock2 Vina חזק (−7.9 קקלורי/מול) וזיקה חיובית ל-PRODIGY (ΔG = −9 קקלורי/מול, איור 4) אך נכשל במספר מסנני ADMET. הוא לא התאים למודל הספיגה וההתפלגות של ביצה מבושלת, הציג ערך ניקוי פלזמה פחות רצוי (9.3 מ"ל/דקה/ק"ג, איור 6), מה שמרמז על הסרה מהירה, וסווג כ-Cramer Class III (רעילות גבוהה) על ידי Toxtree שכלל חמישה טוקסיקופורים (איור 7A). לעומת זאת, ליגנד 33 הציג זיקה מתונה ל-PLK1 שנחזה על ידי PRODIGY (−5.4 קקלורי/מולה) אך עמד בכל קריטריוני ADMET, עם רעילות נמוכה (מחלקה I), LogP אופטימלי (0.7), והתפלגות ספיגת וניקוי פלזמה מיטבית. למרות הזיקה החלשה שלו, ליגנד 33 הוא מועמד דומה יותר לתרופה. ניגוד זה ממחיש עיקרון יסודי בגילוי תרופות בשלבים מוקדמים: זיקת קשירה גבוהה לבדה אינה מספקת ללא פרמקוקינטיקה ובטיחות חיובית. במקביל, תרכובות כמו ליגנד 5, אף על פי שביצועי ADMET ירודים, עשויות עדיין לספק רעיונות חשובים לאופטימיזציה עתידית לשיפור הבטיחות או היציבות המטבולית מבלי לפגוע בעוצמה.

למרות שמסננים מוקדמים בזרימת עבודה זו מיועדים למיון ותעדוף, לא להדרה קבועה, ייעול נוסף של 50 המועמדים מגדיר חלק מהם כ"להיטים מובילים" על ידי יישום מגבלות רצויות הזמינות מכלי ADMET והספרות. מתוך 50 הליגנדים שנבדקו ונבדקו ב-114 תיאורים אלקטרוניים הקשורים ל-ADMET, 13 עמדו לפחות ב-95 מקריטריוני התכונה הרצויים. מתוכן, שישה תרכובות (10, 13, 14, 32, 43 ו-47) הראו פרופילי ADMET-S חיוביים וזיקות קשירה גבוהות יותר ל-PLK1-PBD לעומת PLK2/3 ולכן מוגדרות כמעכבות המועמדות המובילות (איור 10). ניתוחי הדמיון המבניים-פונקציונליים והכמותיים השוואתיים חשפו כי הפגיעות שזוהו חולקות תכונות פרמקופוריות מרכזיות עם מעכבי PLK1-PBD ידועים, מה שמרמז על התכנסות אפשרית בהתנהגות הקישר. כל הפגיעות הכילו פיגומים ארומטיים או הטרוארומטיים המשקפים את מערכות הטבעות ההידרופוביות של TQ, Poloxin ו-Allopole-A, ומאפשרים אינטראקציות π–π והידרופוביות בתוך כיס PBD. חפיפה פונקציונלית הייתה ברורה דרך מוטיבים שמורים של קשרי מימן (קבוצות קרבוקסיל, אמיד וקרבוניל) בדומה לאלו המתווכים את המגעים הפולבריים המרכזיים במעכבי הייחוס. מקשרים גמישים אליפטיים ומחזוריים הקיימים במספר פגיעות מקבילים לגמישות הקונפורמציה של אנלוגים של פולוקסין, ומסייעים להתכוונת לכיוון שאריות קישור חיוניות. כמותית, ציוני הדמיון בטנימוטו (0.36–0.54) אישרו דמיון מבני בינוני בין הפגיעות למעכבים הידועים, כאשר פגיעות 10, 13 ו-14 דומות ביותר לפולוקסין, פגיעה 32 ל-TQ, ומפגיעות 43 ו-47 לאלופול-A. ביחד, תוצאות אלו מדגישות חפיפה מבנית ותפקודית ברורה, ומצביעות על כך שהמפגעים ככל הנראה מחקים את טופולוגיית הקשר ודפוסי האינטראקציה של מעכבי PLK1-PBD מאומתים, תוך שמירה על חידוש מספק לאופטימיזציה נוספת (איור 10).

כדי להעריך את עמידות זרימת העבודה החישובית, נותחו מעכבי PLK1-PBD ידועים (Poloxinpan14 ו-Allopole-A15) כביקורת חיובית, כאשר מטפורמין ואימגלימין (שני תרופות אנטי-סוכרתיות שאינן קשורות מבנית ללא פעילות PLK1-PBD מדווחת) היו ביקורות שליליות בניתוחי ADMET-S, עגינה וזיקה קשירה. הביקורות החיוביות הציגו זיקות קשירה של –5.8 ו–5.6 קקלורי/מול, בהתאמה, בעוד שבבקרים השליליים היו זיקות חלשות יותר של –5.1 קקלורי/מול (מטפורמין) ו–4.8 קקלורי/מול (אימגלימין), בהתאם לחוסר פעילות הקשירה ל-PBD. מעניין לציין כי הערכת ADMET-S גילתה כי הביקורות השליליות עמדו בתיאורים רצויים יותר (88 מתוך 114 תכונות) מאשר הביקורות החיוביות (80 מתוך 114), ובכך אישרה את יכולת זרימת העבודה להבחין בין העדפה פרמקוקינטית לפוטנציאל קישור ספציפי למטרה. קישורים אלו מחזקים את חשיבות שמירה על פרספקטיבה מאוזנת: תרכובות לא צריכות להישלח מוקדם רק על בסיס תחזיות ADMET לא אופטימליות אם הן מראות זיקה חזקה למטרה – שכן פיגומים כאלה עשויים עדיין להציע נקודות התחלה חשובות לאופטימיזציה. לעומת זאת, מולקולות עם תכונות פרמקוקינטיות מצוינות אך קישור חלש עשויות לשמש כתבנית בסיכון נמוך להתפתחות אנלוגית. נדרש אימות ביוכימי ותאי נוסף כדי לאשר את התצפיות החישוביות הללו ולחדד את קריטריוני העדיפות.

figure-results-1
איור 1: השוואות מבניות בין מבנה 4HCO לא מוכן למבנה 4HCO שהוכן ב-CHARMM-GUI. (A) מבנה 4HCO שהועלה ישירות מ-PDB, ומדגיש את השאריות החסרות. (B) מבנה 4HCO לאחר פרוטוקול הכנת CHARMM-GUI. 4HCO (PLK1-PBD הקשור ל-TQ) נבחר משום שהוא בין גבישי PLK1-PBD הבודדים עם קישור אורגני ליגנד, מה שהופך אותו לרלוונטי ישירות לגילוי מעכב מולקולות קטנות מבוסס מבנה זה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-2
איור 2: ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) של 999 מוצרים טבעיים תואמי ליפינסקי לאחר קיבוץ ממוצעים K בהתבסס על טביעת אצבע מולקולרית ודמיון בטנימוטו. כל נקודה מייצגת תרכובת, צבועה לפי אשכול שהוקצה לה (1–50), כאשר אשכולות מקובצים לפי אליפסות אפורות כדי להדגיש דמיון כימי. הקיבוץ ההדוק בתוך אשכולות וההפרדה ביניהם מעידים כי אשכולות מבוססי טנימוטו הצליחו להפחית את היתירות המבנית תוך שמירה על המגוון הכימי בכל מאגר הנתונים. גיוון זה מבטיח ש-50 הליגנדים המייצגים שנבחרו לעגינה במורד הזרם יכנסו לאזור רחב של מרחב כימי, מה שמגביר את החוסן וההכללה של תוצאות הסינון הווירטואלי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-3
איור 3: עגינה עיוורת ב-CB-Dock2 מזהה עמדת קישור בעלת זיקה גבוהה של ליגנד 1 בתוך דומיין הפולו-בוקס PLK1 (PBD). קונפורמציית CurPocket C2 המוצגת (ציון Vina = −7.5 קקלורי/מול) מייצגת את התנוחה האופטימלית בין חמישה אתרי קישור צפויים, המאופיינת במגעי ואן דר ואלס חיוביים ובקשרי מימן עם שאריות PBD מרכזיות (Trp414, His538 ו-Lys540). תוצאה זו מאשרת את השימוש בעגינה עיוורת מבוססת מבנה לאיתור כיסי קישור ביולוגיים רלוונטיים בהיעדר ליגנד קו-קריסטליזציה, ומדגימה כיצד זרימת העבודה מעדיפה פוזות עם אנרגיית קישור חזויה חזקה ביותר לניתוח סלקטיביות במורד הזרם. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-4
איור 4: מפת חום של שרת האינטרנט PRODIGY שחזו זיקות באמצעות שילובי חלבון-ליגנטי. מפת החום מתייחסת ישירות לחפיפה בין הליגנדים כאשר הם קשורים ל-PLK1, PLK2 ו-PLK3. בעוד שחלק מהליגנדים (כולל ליגנד 45) מראים זיקות קשירה דומות בין שלושת האיזופורמים של PLK, מה שמרמז על סלקטיביות נמוכה, אחרים (במיוחד ליגנדים 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 ו-49) מציגים העדפה חזקה ל-PLK1 (ΔΔG ≥ 3.0 קקלו/מול לעומת PLK2/PLK3), מה שמתאים למטרה של עיכוב סלקטיבי ל-PBD. כמותית, 20 מתוך 50 הליגנדים מציגים סלקטיביות כמעט כפולה עבור PLK1 לעומת PLK2 ו-PLK3, בהתבסס על ערכי ΔG שחזו PRODIGY. קישור דיפרנציאלי זה מיוחס לשינויים עדינים בכיסי הקישור של PBD, אותם תופס פרוטוקול העגינה העיוורת. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-5
איור 5: ייצוג של תכונות פיזיקוכימיות משולבות מ-ADMETlab3.0 ו-SwissADME. הפרמטרים הם nHD = מספר תורמי המימן, nHA = מספר מקבלי מימן, pKa בסיסי, pKa חומצי, nStereo = מספר מרכזי סטריאו, LogP = מקדם התפלגות n-אוקטנול/מים, LogD = מקדם התפלטות n-אוקטנול/מים ב-pH=7.4, LogS = ערך מסיסות מימית, Fsp3 = מספר הפחמנים ההיברידיים sp3/ספירת הפחמן הכוללת, ו-nHet = מספר ההטרואטומים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-6
איור 6: שילוב של תוצאות ADME מ-ADMETlab3.0 ו-SwissADME. (א) טבלת ביצים מבושלות של ויילדמן-קריפין LogP (WLOGP) מול שטח פנים קוטבי טופולוגי (TPSA) מ-SwissADME המייצג חדירות ספיגה והפצה של מחסום דם-מוח (BBB) באזור הצהוב (חלמון), ספיגה דרך מערכת העיכול (HIA) באליפסה הלבנה, תת-P-גליקופרוטאין ולא-סובסטרטים בנקודות כחולות ואדומות בהתאמה. מולקולות שנמצאות מחוץ ל"ביצה" נחשבות לספיגה וחלוקה לקויה. (ב) מפת חום של חילוף החומרים עם מזהי ציטוכרום P450 (CYPs) שונים הקשורים ליציבות מטבוליזם כבד אנושי (HLM), כאשר אדום משמש כמעכבים/תת-קרקעים והירוק משמש כלא מעכבים/לא-סובסטרטים, כך שהירוק הוא הרצוי. (ג) הפרשה כוללת את הפרמטרים, פינוי הפלזמה ומחצית חיים. הקו האדום המנוקד מציין פינוי פלזמה רצוי (<5 מ"ל/דקה/ק"ג), בעוד 5-15 מ"ל/דקה/ק"ג ו->15 מ"ל/דקה/ק"ג מסמנים מרווח בינוני וגבוה, בהתאמה.  אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-7
איור 7: פרופיל רעילות משולב חושף סיכונים בטיחותיים קריטיים בקרב ליגנדים שנבדקו. (א) הפצת ספירות הטוקסופור על פני 50 המוצרים הטבעיים המייצגים, כפי שחזה ADMETlab3.0. (B) תוצאות מדגם רעילות לליגנד 1, המצביעות על רעילות מחלקה III מודגשת באדום, עם הסבר מפורט של כללי קריימר הקשורים המופיע בתיבת הטקסט למטה. גישה זו של הערכה כפולה (טוקסיקופורים + מחלקת קרמר) מאפשרת מיון מוקדם של תרכובות בסיכון גבוה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-8
איור 8: אנרגיות פער פס HOMO–LUMO (ב-eV) עבור 50 הליגנדים הנגזרים מהמכפלה הטבעית הייצוגית, מחושבת באמצעות ORCA ברמת התיאוריה B3LYP/def2-TZVP. האזור המוצל (3.6 עד 5.0 eV) מציין את חלון היציבות האופטימלי: פערי רצועות מתחת ל-3.6 eV מצביעים על תגובתיות כימית גבוהה או פוטנציאל לפירוק פוטוגרפי, בעוד שערכים מעל 5.0 eV עשויים להעיד על קיטוב אלקטרוני ירוד וגמישות קישירה מופחתת. ליגנדים שנמצאים בטווח זה מציגים איזון חיובי בין יציבות קינטית לתגובה מולקולרית, התומך בעדפותם כמועמדים פוטנציאליים למעכבי PLK1-PBD. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-9
איור 9: תרשים זרימה של תהליך גילוי תרופות חישובי דו-לשוני. הצינור מתחיל בהכנת מבני PBD של PLK1-PLK3, ואחריו סקר ממוקד מחלות של מאגר הנתונים Supernatural 3.0 וסינון באמצעות חוק החמישה של ליפינסקי (משקל מולקולרי ≤ 500 דלטון, תורמי קשרי מימן ≤ 5, מקבלים ≤ 10, LogP ≤ 5). תרכובות מייצגות נבחרות לאחר קיבוץ ואז מוערכות באמצעות חיבור חלבון-ליגנד, חיזוי זיקה לקישור ופרופיל ADMET-S מקיף, הכולל ספיגה, הפצה, מטבוליזם, הפרשה, רעילות והערכת יציבות QM. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

figure-results-10
איור 10: חפיפה מבנית-פונקציונלית השוואתית בין ליגנדים מועמדים מובילים למעכבי PLK1-PBD ידועים. התרשים מדגיש את שש התרכובות המועמדות המובילות (10, 13, 14, 32, 43 ו-47) שזוהו מתוך ניתוחי סקר וירטואלי, אשכולות, זיקה לקישור ופרופיל ADMET-S. ליגנדים אלו עמדו לפחות ב-95 מתוך 114 תיאורים פיזיקוכימיים ופרמקוקינטיים רצויים והראו זיקות קשירה גבוהות יותר ל-PLK1-PBD ביחס ל-PLK2/3. כדי להעריך התכנסות מבנית ותפקודית פוטנציאלית, כל ליגנד הושווה עם מעכבי PLK1-PBD ידועים TQ, Poloxin ו-Allopole-A, בהתבסס על מוטיבים פרמקופוריים משותפים ומקדמי דמיון טנימוטו זוגיים (טביעות אצבע ECFP4). ציוני דמיון בינוניים (0.36–0.54) וקבוצות פונקציונליות נפוצות כגון טבעות ארומטיות או הטרוארומטיות, זוגות תורם/מקבל קשרי מימן, וקישורים הידרופוביים מצביעים על חפיפה חלקית בתכונות הקשירה. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

שלב זרימת העבודהנקודת ביקורת ביניים (איך לאשר הצלחה)שלב קריטי (למה הוא קובע הצלחה/כישלון)בעיות נפוצות והכוונה לפתרון תקלות
1. הכנת חלבון מטרה• קובץ PDB נטען ללא שגיאות בתצוגת Mol*.
• אין שאריות חסרות בכיס הקישור (בדיקה ויזואלית).
• שאריות היסטידין המסומנות כ"HIS" (לא HSD/HSE)		מבנה חלבוני לא מדויק → כיסי קישור שגויים → תנוחות עגינה מטעות. CHARMM-GUI מבטיח פרוטונציה נכונה, מיקום מימן והסרת מים/ליגנדים.בעיה: CB-Dock2 דוחה את קובץ ה-PDB. תיקון: הסרת שאריות לא סטנדרטיות, ודא שרק שרשרת החלבונים קיימת, וסטנדרטיזציה של שמות אטומים/שאריות באמצעות עורך טקסט.
2. סינון מוצרים טבעיים (כלל 5 של ליפינסקי)• "all.csv" מכיל רק SMILES תקפה (לא ריקה, ניתנת לניתוח כימית).
• ספירת משחקים צפויה (למשל, 999/1,193).		SMILES לא תקין קורס את RDKit, שרתי עגינה וכלי ADMET. הסינון חייב לשמור על תקפות כימית.בעיה: הסקריפט נכשל במהלך אשכולות. תיקון: הוספת אימות SMILES באמצעות Chem.MolFromSmiles(smiles, sanitize=True) בפייתון; רשם והסר רשומות לא תקינות לפני ההמשך.
3. דגימת אשכולות• 50 חיוכים ייחודיים ב"rep_struct.txt".
• גרף PCA (איור 2) מראה הפרדה ברורה בין אשכולות.		קיבוץ לקוי → נציגים מיותרים או לא מגוונים → סינון לא יעיל.בעיה: כל המולקולות מתאספות לקבוצה אחת.
תיקון: אימות סוג טביעת האצבע (למשל, Morgan/ECFP4), סף Tanimoto וסטנדרטיזציה של SMILES. שקול להגדיל את מספר האשכול אם המגוון נמוך.
4. עגינת חלבון-ליגנד (CB-Dock2)• כל ליגנד מחזיר ≥קובץ ".complex.pdb" אחד.
• ציוני וינה שליליים (למשל, ≤ −5 קקלוריות/מול).
• הליגנד ממוקם ב-CurPocket (לא על פני השטח).		עגינה מגדירה את תנוחת הקישור והזיקה (affinity). תנוחה שגויה→ תחזיות שגויות של PRODIGY.בעיה: העבודה נכשלה, או הליגנד לא מחובר. תיקון: משיכת ליגנד מחדש ב-CB-Dock2 באמצעות SMILES; להבטיח שאין תווים מיוחדים בשם הקובץ; בדוק את המייל לגבי מצב המשרה. אם זה מתמיד, נסה את SwissDock כגיבוי.
5. זיקה קשורה (PRODIGY)• PRODIGY מחזיר ערכי ΔG לכל הקומפלקסים.
• זיקות מתואמות עם ציוני CB-Dock (Vina) (עקביות מגמות).		הערכת הסלקטיביות תלויה ב-ΔG מדויק עבור PLK1 לעומת PLK2/PLK3. מזהי שרשרת/ליגנד שגויים → תחזיות שגויות.בעיה: שגיאת "שרשרת לא נמצאה". תיקון: פתח .complex.pdb בעורך טקסט; מאשר מזהה שרשרת חלבונים (למשל, "P") ושם שאריות הליגנד (למשל, "UNL"); קלט נכון ב-PRODIGY.
6. הערכת ADMET-S• כל 50 תוצאות SMILES מחזירות תוצאות ב-SwissADME, ADMETlab3.0 ו-ToxTree.
• אין שורות "N/A" או "Error" ב-CSV ביציאה.		נתוני ADMET לא עקביים → דירוג מועמדים פגום. פלטפורמות עלולות להיכשל על פיגומים של מוצרים טבעיים אקזוטיים.בעיה: ADMETlab3.0 דוחה את SMILES. תיקון: להפוך את החיוכים לקאנוניקלים באמצעות RDKit (MolToSmiles(MolFromSmiles(...))). עבור ToxTree, הזן מולקולה אחת בכל פעם ווודא את רינדור המבנה.
7. יציבות קוונטית (ORCA)• כל משימת ORCA מסתיימת ללא "SCF לא התכנס" או "שגיאת גיאומטריה".
• ערכי HOMO/LUMO הנמצאים בקובץ output (.out).		פער הרצועה קובע יציבות/תגובתיות כימית. משימות שנכשלו = נתונים חסרים עבור מסנן מפתחות.בעיה: קריסות עבודה ב-ORCA. תיקון: אופטימיזציה מחדש של הגיאומטריה באבוגדרו; להבטיח שלא יהיו אטומים כפולים; להגדיל את %maxcore או לעבור לבסיס def2-SVP למולקולות גדולות.
8. סינון משולב של ADMET-S• הרשימה הסופית של הליגנדים עומדת בכל הקריטריונים (למשל, LogP 0–3, פער רצועה 3.6–5 eV, Cramer Class I/II).
• ליגנד ≥1 מראה סלקטיביות PLK1 (ΔΔG ≥ 2 קקלור/מול לעומת PLK2/3).		ספים מחמירים מדי או לא עקביים מבטלים לידים ברי קיימא; ספים רכים מדי מקדמים תרכובות רעילות/לא יציבות.בעיה: אין ליגנדים שעוברים את כל המסננים.
תיקון: הרך קריטריון אחד בכל פעם (למשל, לאפשר LogP ≤ 4 או 3 טוקסיקופורים) ותעד פשרות. השוו לתרופות ידועות להשוואת ביצועים.

טבלה 1: נקודות ביקורת קריטיות לבקרת איכות, נקודות החלטה בעלות השפעה גבוהה, ואסטרטגיות פתרון תקלות לאורך זרימת העבודה החישובית הדו-לשונית בת שמונה שלבים לזיהוי מעכבי PLK1-PBD סלקטיביים. כל שורה מתייחסת לשלב פרוטוקול מרכזי מהכנת חלבונים ועד סינון משולב ADMET-S ומפרטת (i) כיצד לאמת השלמה מוצלחת (נקודת ביקורת ביניים), (ii) מדוע השלב הוא קריטי להצלחה או כישלון כולל (היגיון קריטי), ו-(iii) פתרונות מעשיים לכשלים טכניים נפוצים (הנחיות פתרון תקלות). טבלה זו משמשת הן כמפת דרכים לאימות והן ככלי עזר ללימוד עבור סטודנטים וחוקרים המיישמים את הפרוטוקול בסביבות אקדמיות או במסגרת מוגבלת משאבים.

קובץ משלים 1: סקריפטים בפייתון. מכיל את סקריפט פייתון ליישום כללי ליפינסקי; סקריפט פייתון המשמש לניתוח אשכולות; הכתב פייתון לחישובי תכונות פיזיקוכימיות; כתב R לניתוח חילוף חומרים; סקריפט פייתון לניתוח הפרשה; סקריפט פייתון לחיזוי רעילות; סקריפט Python להערכת יציבות; ומחרוזות SMILES של 50 התרכובות המנותחות. אנא לחצו כאן להורדת הקובץ הזה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתמקד בזרימת עבודה חישובית חקרנית לזיהוי והערכת מעכבי PLK1-PBD פוטנציאליים באמצעות סינון וירטואלי, עגינה וניתוח ADMET-S. הצינור למעשה נותן עדיפות לתרכובות בהתבסס על מגמות קישור צפויות ותכונות פרמקוקינטיות. בפרוטוקול זה, מזוהה סט של מעכבי PLK1 אפשריים, ומוערכים תכונות ADMET שלהם וזיקות הקשר שלהם לחלבוני PLK1–3. הפרוטוקול משתמש בגישה ממוקדת מחלות לזיהוי 50 מולקולות מתוך מאגר נתונים של כ-73,400 (איור 9). לאחר מכן, 50 המולקולות הללו עברו הערכה של ADMET-S, שבמהלכה חושבו התכונות הפרמקוקינטיות והפרמקודינמיות שלהן, דמותן לתרופה ויציבותן. בנוסף, הזיקה שלהם לחלבוני PLK1–3 חושבה כדי להעריך את עוצמתם המעכבת מול PLK1 ואת הסלקטיביות. בהתבסס על התוצאות, מספר מולקולות הראו תכונות רצויות יותר. מחקרי גילוי תרופות מאוחרים יותר עשויים לבחור להסיר מולקולות מסוימות ולהתמקד בכמה מהחקירה הזו, או להימנע מהסרה מוקדמת ולהשתמש בתוצאות אלו מאוחר יותר בתהליך עיצוב התרופה כדי לייעל את תכונות ADMET.

ההיגיון הביולוגי להתמקדות ב-PLK1, PLK2 ו-PLK3 תוך החרגת PLK4 ו-PLK5 מבוסס על שיקולים מבניים ופונקציונליים כאחד. PLK4 ו-PLK5 אינם כלולים במחקר זה בשל ההבדלים המבניים והפונקציונליים הבולטים שלהם מ-PLK1 והרלוונטיות המוגבלת שלהם לטיפול בסרטן. PLK1, המאופיין בדומיין הקינאז ובתחום הפולו-בוקס (PBD), ממלא תפקיד קריטי בוויסות אירועים מיטוטיים, מה שהופך אותו למטרה מרכזית לטיפול בסרטן41. לעומת זאת, PLK4 ו-PLK5 הם מבניים נפרדים: PLK4 מכיל תיבת פולו קריפטית (CPB) במקום PBD קנוני ופועל בעיקר בשכפול צנטריולים. במקביל, ל-PLK5 חסר תחום קינאז פונקציונלי והוא מתבטא כמעט בלעדית במוח3. בהינתן החפיפה המבנית המינימלית שלהם עם PLK1-PBD והרלוונטיות המוגבלת לדיסרגולציה מיטוטית בסרטן, הכללתם לא תשפיע באופן משמעותי על סלקטיביות עבור מעכבי PLK1-PBD. לכן, אסטרטגיית הסינון מציעה מסגרת ביולוגית רלוונטית וניתנת לפתרון חישובית להערכת סלקטיביות. חשוב לציין כי ששת הליגנדים המועמדים המובילים (10, 13, 14, 32, 43 ו-47) הציגו אנרגיות קישור ופרופילים של ADMET-S אף מועדפים יותר מאשר המעכבים הידועים TQ ו-Allopole-A, מה שהדגיש אותם כמודולטורים פוטנציאליים ל-PLK1-PBD.

כדי לתמוך ביישום חזק, במיוחד על ידי סטודנטים או חוקרים חדשים בכלי גילוי תרופות חישוביים, מסופק בטבלה 1 סיכום של נקודות ביקורת מרכזיות (גם בסעיף הפרוטוקול), צעדים קריטיים והנחיות לפתרון תקלות לזרימת העבודה. הטבלה תומכת בהסתגלות; לדוגמה, אם למשתמש אין גישה ל-HPC, הוא יכול לציין שניתוח יציבות ORCA ניתן לדחייה, ואם שרת אינטרנט לא פעיל, מוצעות חלופות כמו SwissDock. גמישות זו מבטיחה שתהליך העבודה יישאר בר קיימא בהקשרים מוסדיים מגוונים, תוך שמירה על קפדנות מדעית וחיזוק החידוש של המחקר כתרומה מכלילה, דו-לשונית וממוקדת חינוך לגילוי תרופות בשלבים מוקדמים. למרות שכל תהליך העבודה מעוצב כצינור משולב, מספר שלבים קריטיים קובעים באופן יסודי את הצלחתו או כישלונו (ראו טבלה 1). כמו כן, הווידאו המצורף כולל כיתובים באנגלית מסונכרנים וסימן לשפת הסימנים האמריקאית (ASL), שנועד לספק גישה שוויונית ללא הסחות דעת. הוראות החותם מיושרות זמנית עם פעולות על המסך, לדוגמה, סימון "הבא", ואז עצירה כשהסמן לוחץ על כפתור "הבא". במהלך שלב ההכנה ל-4HCO, החותם משתמש בסימון אצבע ("A" ו-"B") כדי להנחות את בחירת השרשרת, המשתקפת בדיוק בהקלטת המסך. בקטע ההקרנה של SuperNatural 3.0, החלון של החותם משנה את גודלו ועובר לפינה הימנית העליונה תוך שהוא מפנה את תשומת הלב לסמל "שביל", כשהסמן עוקב אחריו. בחירות עיצוב אלו מבטיחות שצופים חירשים וכבדי שמיעה יקבלו את אותה הדרכה משולבת בזמן אמת כמו משתמשי שמיעה, ובכך משחזרות חוויית מעבדה פרונטלית בהובלת מדריכים.

מלבד היתרונות, ישנן דרכים רבות לשפר את תהליך העבודה. ראשית, ניתן לשנות את הסינון ההתחלתי; במקום שיטות דגימה ממוקדות מחלות ואשכולות, ניתן להתחיל בסימולציות עגינה של כל המולקולות במאגר המוצרים הטבעיים כדי לזהות אילו תרכובות מתאימות ביותר לקשירת חלבונים למטרות ליגנד. בנוסף, נדרשות הערכות מפורטות יותר לחיזוי מדויק של זיקת קשר.  החישובים של PRODIGY של "ללא אלקטרוסטטיות" של זיקת חלבון-ליגנד כוללים התאמת ספירות של סוגי מגעים אטומיים מסווגים המעורבים באינטראקציה (פחמן-פחמן, חנקן-חנקן, חמצן-חמצן ואטומים אחרים) במודל רגרסיה ליניארית מרובה מאומן עם אימות צולב של 4 פעמים, ושיטה זו הייתה מתואמת משמעותית עם זיקות ניסיוניות במקרים שונים 42,43.  ניתן להשתמש בגישות חלופיות, כגון FoldX44, fastDRH45, מודלים ללמידהעמוקה 46 ו-MD עם דגימה מתקדמת, וצפויות דרגות שונות של הסכמה בתחזיות בהתאם לדיוק של כל שיטה47.

היבט נוסף הוא שכלי התוכנה השונים בהם השתמשו בהערכת ADMET-S מייצרים מדדים רבים, והבנת כל מדד המשמש להערכת מועמדות לתרופות היא חיונית. דרך אחת להבטיח דיוק יכולה להיות להעמיד כמה תרופות בשוק לפרוטוקול כדי לקבוע כיצד הן עומדות בסף.  בהקשר זה, רעילות דורשת מחקר נוסף, שכן מולקולות אינן נזרקות רק על בסיס פרופילי רעילות מעצי החלטה מעודנים כמו כללי קריימר, שכן תרופות רבות לשימוש נושאות סיווגים דומים.  מספר הטוקסיקופורים גם אינו מספק מידע מלא על רעילות, אפילו בשילוב עם פרופילי רעילות.  בהקשר זה, הרחבה של תהליך עבודה זה תהיה ביצוע סקירות השוואתיות של דגימות מולקולות קטנות עם תרופות זמינות כדי להנחות פרשנויות.  לדוגמה, חוקרים פנו לספרות קודמת שתיעדה את היישום והתבוננות בחישובי DFT בתרופות עכשוויות לסרטן השד כגון Tamoxifen48, Letrozole49 ו-Cisplatin50, בעת פירוש יציבות שנקבעה על ידי חישובי QM של ערכי פערי תחום HOMO–LUMO. בעבר, אומצו זרימות עבודה דומות לזיהוי מעכבים פוטנציאליים ליעדי מחלה/הפרעה שונים51. לאחרונה, סטאפורד ואחרים סקרו אסטרטגיות עיצוב מעכבי PLK1-PBD והזדמנויות טיפוליות בסרטן. המחקרים האחרונים זיהו מעכבים בעלי מטרה כפולה נגד PLK1-PBD ו-PLK4-PB3 באמצעות מודלים מונחי מבנה, סקר וירטואלי, עגינה מולקולרית, סימולציית דינמיקה מולקולרית (MD) והערכה ביולוגית52. ג'ואו ואחרים זיהו גם מעכבי PLK1-PBD מספריית המוצרים הטבעיים הימיים באמצעות פרמקופור QSAR תלת-ממדי, ADMET, קפיצה על פיגומים, עגינה מולקולרית ו-MD53.

בסך הכול, החידוש של מחקר זה הוא בארבעה היבטים. ראשית, זהו פרוטוקול חישובי דו-לשוני, המועבר הן בשפת הסימנים האמריקאית והן באנגלית, ובכך מקדם נגישות והכללה בתחומי STEM, במיוחד עבור תלמידים וחוקרים חירשים וכבדי שמיעה. מתן דו-לשוני זה נדיר בגילוי תרופות חישובי ומתיישב עם משימת אוניברסיטת גלאודט לחלוץ בחינוך מדעי שוויוני. שנית, בעוד ש-PLK1 נשאר יעד אנטי-סרטני משכנע, מחקרים חישוביים קפדניים שהעריכו סלקטיביות בין PLK1, PLK2 ו-PLK3 באמצעות קריטריונים משולבים של מבנים, אנרגטיים ו-ADMET-S נדירים. רוב המאמצים הקודמים מתמקדים אך ורק בעיכוב בתחום הקינאז או חסרים פרופיל סלקטיביות השוואתית. עבודה זו מתמודדת עם פער זה על ידי מתן פרוטוקול סינון מקבילי ראשוני וחקרני נגד שלושה PLK-PBDs, עם מסננים שמעדיפים תרכובות על בסיס זיקה גבוהה ל-PLK1 ומינימום קישור מחוץ למטרה. שלישית, זרימת העבודה תוכננה מתוך מחשבה על יעילות ושימושיות, במיוחד עבור סביבות חינוכיות ומשאבים מוגבלים. כל התהליך מסינון מסדי נתונים ועד הערכת ADMET-S יכול להתבצע תוך שבועיים על חומרה אקדמית סטנדרטית (מחשב נייד עם 8GB RAM), תוך ניצול תוכנה חינמית מבוססת רשת (CB-Dock2, PRODIGY, SwissADME, ADMETlab). חישובי זיקה בעגינה וקישור אינם שלבים שדורשים זמן רב (~30 שניות לליגנד). השלב הדורש זמן רב ביותר הוא ניתוח יציבות מכניקת הקוונטים עם ORCA, שניתן לדחות לשלבים מאוחרים יותר או להריץ על משאבי מחשוב בעלי ביצועים גבוהים, כפי שהודגם. הסקריפטים מודולריים ודורשים רק עריכות בסיסיות בשורת פקודה או Jupyter Notebook, מה שמאפשר אינטגרציה חלקה בתכניות הלימודים הקיימות. זמן הריצה צנוע עם סינון מסדי נתונים ותאימות לליפינסקי שנמשכים דקות; אשכולות ~1,000 מולקולות מסתיימת בפחות מ-30 דקות על שולחן עבודה טיפוסי. כל כלי התוכנה זמינים בחינם לשימוש אקדמי, חוצה פלטפורמות (Windows, macOS, Linux), ואינם דורשים רישיונות מסחריים, מה שמפחית משמעותית את חסמי הכניסה. רביעית, הליגנדים שזוהו מראים זיקות קשירה מבטיחות התואמות אינטראקציות בטווח ננומולרי, בשילוב עם דמיון תרופתי חיובי, יציבות מטבולית ופרופילי רעילות נמוכים. מספר מועמדים מתגלים כקושרי PLK1-PBD חזקים וסלקטיביים עם תכונות ADMET-S רצויות, מה שדורש אימות נוסף באמצעות סימולציות דינמיקה מולקולרית או בדיקות מבחנה .

לכן, מעבר לשימושיות המתודולוגית שלו, מחקר זה מדגים כיצד כלים חישוביים נגישים, קוד פתוח ויעילים יכולים לשמש כנקודת התחלה להתמודדות עם אתגר ביו-רפואי בעל ערך גבוה תוך טיפוח הכשרה מדעית מכלילה. ככל שמעכבי PLK1-PBD ממשיכים לצבור תאוצה באונקולוגיה, תהליך זה מספק תכנית שחזורית וידידותית לחינוך לגילוי תרופות בשלבים מוקדמים. הרב-גוניות שלו הופכת אותו למתאים לסביבות תיכון, תואר ראשון ותארים מתקדמים, והוא מספק בסיס מצוין ל-CUREs המציעים לסטודנטים הזדמנויות מחקר אותנטיות ומעשיות. בניגוד לצינורות המתבססים אך ורק על עגינת תחום קינאז או סקר חלבון יחיד, הגישה מעריכה במקביל את סלקטיביות PBD על פני PLK1–3, הכרח לאור ההומולוגיה המבנית של >38% והתפקידים הביולוגיים השונים שלהם. יתרה מזאת, על ידי שילוב אשכולות, ADMET-S ויציבות מכניקת קוונטים במסגרת גישה פתוחה, סיכון היתירות והשחיקה הופחת ביחס לסינון וירטואלי בכוח גס.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך במימון המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית, המכונים הלאומיים לבריאות (1R15GM148942-01), הספרייה הלאומית לרפואה (R25LM014208), ומענק Momentum מאוניברסיטת פיטסבורג. עבודה זו השתמשה ב-DARWIN ב-Udel (darwin.hpc.udel.edu) באמצעות הקצאה [MED230016] מתוכנית Advanced Cyberinfrastructure Coordination Program: Services & Support (ACCESS) הנתמכת על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע #2138259, #2138286, #2138307, #2137603 ו-#2138296.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ADMETLab3סימולציות פלוס. בע"מV3.0תכונות ADMET
אלפאפולדחפש בגוגל DeepMind & מעבדות איזומורפיות (חברות בת של אלפבית)V3.0.1מידול חלבונים תלת-ממדיים
אנקונדה/קונדהאנקונדה, בע"מ.V24.9.2מערכת ניהול חבילות בקוד פתוח 
CB-Dock2מעבדת יאנג צאוV2.0עגינה עיוורת בין חלבון-ליגנד
צ'ארם-גויאוניברסיטת ליהייV3.8מניפולציה ביומולקולרית וסימולציה
דרווין בגישהאוניברסיטת דלאוורלא זמיןמחשוב ביצועים גבוהים
ORCAFAccTs GmbHV6.1.0חבילת כימיה קוונטית
מאגר נתוני חלבוןמאגר נתוני חלבונים עולמיRRID:SCR_006555מאגר חלבונים
RDKitקוד פתוחRRID:SCR_014274תכנים כימינפורמטיים
Supernatural 3.0המכון לפיזיולוגיה ומדע-IT (ברלין)V3.0ספריית מולקולות טבעיות
SwissADMEהמכון השווייצרי לביואינפורמטיקהRRID:SCR_017865תכונות ADME
טוקסטריאידאקונסט' בע"מV3.1.0סיווג רעילות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eckerdt, F., Yuan, J., Strebhardt, K. Polo-like kinases and oncogenesis. Oncogene. 24 (2), 267-276 (2005).
  2. Dube, D. Polo-like kinases: An antimitotic drug target for cancer therapy. Protein Kinase Inhib. 2022, 457-477 (2022).
  3. de Cárcer, G., Manning, G., Malumbres, M. From PLK1 to PLK5: Functional evolution of polo-like kinases. Cell Cycle. 10 (14), 2255-2262 (2011).
  4. Lee, S. Y., Jang, C., Lee, K. A. Polo-like kinases (Plks), a key regulator of cell cycle and new potential target for cancer therapy. Dev Reprod. 18 (1), 65-71 (2014).
  5. Park, J. E., Hymel, D., Burke, T. R. Jr, Lee, K. S. Current progress and future perspectives in the development of anti-polo-like kinase 1 therapeutic agents. F1000Res. 6, 1024(2017).
  6. Stafford, J. M., Wyatt, M. D., McInnes, C. Inhibitors of the PLK1 polo-box domain: Drug design strategies and therapeutic opportunities in cancer. Expert Opin Drug Discov. 18 (1), 65-81 (2023).
  7. Feng, Y. B., et al. Overexpression of PLK1 is associated with poor survival by inhibiting apoptosis via enhancement of survivin level in esophageal squamous cell carcinoma. Int J Cancer. 124 (3), 578-588 (2009).
  8. Gutteridge, R. E. A., Ndiaye, M. A., Liu, X., Ahmad, N. PLK1 inhibitors in cancer therapy: From laboratory to clinics. Mol Cancer Ther. 15 (7), 1427-1435 (2016).
  9. Steegmaier, M., et al. BI 2536, a potent and selective inhibitor of polo-like kinase 1, inhibits tumor growth in vivo. Curr Biol. 17 (4), 316-322 (2007).
  10. Vanden Bossche, J., et al. Spotlight on volasertib: preclinical and clinical evaluation of a promising PLK1 inhibitor. Med Res Rev. 36 (4), 749-786 (2016).
  11. Yin, Z., Song, Y., Rehse, P. H. Thymoquinone blocks pSer/pThr recognition by PLK1 polo-box domain as a phosphate mimic. ACS Chem Biol. 8 (2), 303-308 (2013).
  12. Reindl, W., Yuan, J., Krämer, A., Strebhardt, K., Berg, T. Inhibition of polo-like kinase 1 by blocking polo-box domain-dependent protein-protein interactions. Chem Biol. 15 (5), 459-466 (2008).
  13. Scharow, A., et al. Optimized PLK1 PBD inhibitors based on poloxin induce mitotic arrest and apoptosis in tumor cells. ACS Chem Biol. 10 (11), 2570-2579 (2015).
  14. Reindl, W., Yuan, J., Krämer, A., Strebhardt, K., Berg, T. A pan-specific inhibitor of the polo-box domains of polo-like kinases arrests cancer cells in mitosis. ChemBioChem. 10 (7), 1145-1148 (2009).
  15. Park, J. E., et al. Specific inhibition of an anticancer target, polo-like kinase 1, by allosterically dismantling its mechanism of substrate recognition. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (35), e2305037120(2023).
  16. Archambault, V., Normandin, K. Several inhibitors of the PLK1 polo-box domain turn out to be non-specific protein alkylators. Cell Cycle. 16 (12), 1220-1224 (2017).
  17. Jo, S., Kim, T., Iyer, V. G., Im, W. CHARMM-GUI: A web-based graphical user interface for CHARMM. J Comput Chem. 29 (11), 1859-1865 (2008).
  18. Park, S. J., Kern, N., Brown, T., Lee, J., Im, W. CHARMM-GUI PDB manipulator: Various PDB structural modifications for biomolecular modeling and simulation. J Mol Biol. 435 (14), 167995(2023).
  19. Kim, J. H., Ku, B., Lee, K. S., Kim, S. J. Structural analysis of the polo-box domain of human polo-like kinase 2. Proteins. 83 (7), 1201-1208 (2015).
  20. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  21. UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D523-D531 (2023).
  22. Gallo, K., et al. SuperNatural 3.0—A database of natural products and natural product-based derivatives. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D654-D659 (2023).
  23. Du, J., et al. KEGG-PATH: Kyoto encyclopedia of genes and genomes-based pathway analysis using a path analysis model. Mol Biosyst. 10 (9), 2441-2447 (2014).
  24. Bento, A. P., et al. An open source chemical structure curation pipeline using RDKit. J Cheminform. 12 (1), 51(2020).
  25. Chung, N. C., Miasojedow, B., Startek, M., Gambin, A. Jaccard/Tanimoto similarity test and estimation methods for biological presence-absence data. BMC Bioinformatics. 20 (Suppl 15), 644(2019).
  26. Liu, Y., et al. CB-Dock2: Improved protein–ligand blind docking by integrating cavity detection, docking and homologous template fitting. Nucleic Acids Res. 50 (W1), W159-W164 (2022).
  27. Vangone, A., et al. Large-scale prediction of binding affinity in protein–small ligand complexes: the PRODIGY-LIG web server. Bioinformatics. 35 (9), 1585-1587 (2019).
  28. Fu, L., et al. ADMETlab 3.0: An updated comprehensive online ADMET prediction platform enhanced with broader coverage, improved performance, API functionality and decision support. Nucleic Acids Res. 52 (W1), W422-W431 (2024).
  29. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: A free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 7 (1), 1-13 (2017).
  30. Patlewicz, G., Jeliazkova, N., Safford, R., Worth, A., Aleksiev, B. An evaluation of the implementation of the Cramer classification scheme in the Toxtree software. SAR QSAR Environ Res. 19 (5-6), 495-524 (2008).
  31. Neese, F. Software update: The ORCA program system—version 5.0. Wiley Interdiscip Rev Comput Mol Sci. 12 (5), e1606(2022).
  32. Daina, A., Zoete, V. A BOILED-Egg to predict gastrointestinal absorption and brain penetration of small molecules. ChemMedChem. 11 (11), 1117-1121 (2016).
  33. Sehnal, D., et al. Mol* Viewer: Modern web app for 3D visualization and analysis of large biomolecular structures. Nucleic Acids Res. 49 (W1), W431-W437 (2021).
  34. Liu, Y., Cao, Y. Protein–ligand blind docking using CB-Dock2. Comput Drug Discov Des. 2023, 113-125 (2023).
  35. Manallack, D. T. The pKa distribution of drugs: application to drug discovery. Perspect Med Chem. 1, 25-38 (2007).
  36. Manallack, D. T., Prankerd, R. J., Yuriev, E., Oprea, T. I., Chalmers, D. K. The significance of acid/base properties in drug discovery. Chem Soc Rev. 42 (2), 485-496 (2013).
  37. Charifson, P. S., Walters, W. P. Acidic and basic drugs in medicinal chemistry: A perspective. J Med Chem. 57 (23), 9701-9717 (2014).
  38. Wildman, S. A., Crippen, G. M. Prediction of physicochemical parameters by atomic contributions. J Chem Inf Comput Sci. 39 (5), 868-873 (1999).
  39. Pasha, T., et al. Therapeutic importance of biological half-life of antineoplastic agents – A review. Adv Pharmacol Pharm. 10, 265-272 (2022).
  40. Smith, D. A., Beaumont, K., Maurer, T. S., Di, L. Relevance of half-life in drug design. J Med Chem. 61 (10), 4273-4282 (2018).
  41. Sharma, P., et al. A cryptic hydrophobic pocket in the polo-box domain of the polo-like kinase PLK1 regulates substrate recognition and mitotic chromosome segregation. Sci Rep. 9 (1), 1-15 (2019).
  42. Kurkcuoglu, Z., et al. Performance of HADDOCK and a simple contact-based protein–ligand binding affinity predictor in the D3R Grand Challenge 2. J Comput Aided Mol Des. 32 (1), 175-185 (2018).
  43. Gaieb, Z., et al. D3R Grand Challenge 2: Blind prediction of protein–ligand poses, affinity rankings, and relative binding free energies. J Comput Aided Mol Des. 32 (1), 1-20 (2018).
  44. Delgado, J., Radusky, L. G., Cianferoni, D., Serrano, L. FoldX 5.0: Working with RNA, small molecules and a new graphical interface. Bioinformatics. 35 (20), 4168-4169 (2019).
  45. Wang, Z., et al. fastDRH: A webserver to predict and analyze protein–ligand complexes based on molecular docking and MM/PB (GB) SA computation. Brief Bioinform. 23 (5), bbac201(2022).
  46. Wang, H., Liu, H., Ning, S., Zeng, C., Zhao, Y. DLSSAffinity: Protein–ligand binding affinity prediction via a deep learning model. Phys Chem Chem Phys. 24 (17), 10124-10133 (2022).
  47. Schöning-Stierand, K., et al. Proteins Plus: A comprehensive collection of web-based molecular modeling tools. Nucleic Acids Res. 50 (W1), W611-W615 (2022).
  48. Flores-Holguín, N., Glossman-Mitnik, D. CDFT-based chemical reactivity properties analysis of the fluorine substitution in the selective estrogen receptor modulator (SERM) tamoxifen. Theor Chem Acc. 142 (8), 79(2023).
  49. Akçay, H. T., Bayrak, R. Computational studies on the anastrozole and letrozole, effective chemotherapy drugs against breast cancer. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 122, 142-152 (2014).
  50. Georgieva, I., Trendafilova, N., Dodoff, N., Kovacheva, D. DFT study of the molecular and crystal structure and vibrational analysis of cisplatin. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 176, 58-66 (2017).
  51. Lawal, M. M., Kucukkal, T. G. Evaluation of small molecule binding to the polo-box domain of PLK1 at the molecular level. J Comput Biophys Chem. 25 (5), 751-768 (2026).
  52. Zhao, C., et al. Discovery of novel dual-targeting inhibitors against PLK1-PBD and PLK4-PB3: structure-guided pharmacophore modelling, virtual screening, molecular docking, molecular dynamics simulation, and biological evaluation. J Enzyme Inhib Med Chem. 40 (1), 2522810(2025).
  53. Zhou, N., Zheng, C., Tan, H., Luo, L. Identification of PLK1-PBD inhibitors from the library of marine natural products: 3D QSAR pharmacophore, ADMET, scaffold hopping, molecular docking, and molecular dynamics study. Mar Drugs. 22 (2), 83(2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PLK1 InhibitorsPolo Box DomainVirtual ScreeningProtein Ligand DockingBinding Affinity PredictionADMET EvaluationQuantum Mechanical AnalysisNatural Product DatabaseK Means ClusteringBreast Cancer

מאמרים קשורים