מאמר שיטה

הערכת RNA המכיל חזרה טלומרי מתוך קומפלקסים היברידיים של DNA/RNA

DOI:

10.3791/67984

⸱

5 בדצמבר 2025

 ,  ,  ,  , 
1Betul-Ziya Eren Genome and Stem Cell Center, Erciyes University, 2Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 3INSERM-CNRS, Université de Nice

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מאפשר בידוד של היברידים DNA:RNA וה-RNA הנלווה אליהם (כולל TERRA) ברקמות מרובות. בעוד שהגישה שלנו לוכדת תת-קבוצה של אינטראקציות היברידיות, יידרש מיפוי גנומי נוסף לאפיון גנומי מלא.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA טלומרי המכיל חזרה (TERRA) הוא RNA ארוך ולא מקודד שמועתק מכל הטלומרים באאוקריוטים גבוהים, ורק תת-קבוצה של מולקולות אלו יוצרת היברידים יציבים של DNA/RNA בטלומרים. הצגנו פרוטוקול מולקולרי מפורט לזיהוי וטיהור ההערכות ההיברידיות הללו. שיטה יעילה זו מאפשרת חילוץ ישיר של אינטראקציות היברידיות DNA/RNA שנוצרות באופן טבעי ב-vivo וניתן ליישם אותה לזיהוי כל האזורים הללו. על ידי מזעור צעדים פרוצדורליים, טכניקה זו יעילה מאוד בבידוד RNA המחובר ל-DNA, ומערכת את האמינות והשחזוריות של ריצוף במורד הזרם. תגובת גואנידין איזותיוציאנאט משמשת לניתוח תא מלא והומוגניזציה, תוך שמירה על שלמות חומצות גרעין (DNA ו-RNA), במיוחד היברידים DNA/RNA. הוספת כלורופורם מתחילה הפרדת פאזה באמצעות צנטריפוגציה (שלוש שכבות מובחנות): שלב פנול-כלורופורם תחתון, שלב אינטרפאזה ושלב מימי עליון. RNA, המשתחרר הן מהגרעין והן מהציטופלזמה, נשמר בשלב המימי, בעוד ש-DNA בעל משקל מולקולרי גבוה, כולל אזורי ההיבריד DNA/RNA, מוגבל לשלב הבין. עם אלכוהול איזופרופיל, ואחריו צנטריפוגה, מתאוששים השלב המימי (RNA חופשי), שלב הבין-פאזה וה-DNA, במיוחד היברידים DNA/RNA. כדי להסיר את שאריות החלבונים שנותרו, הדגימה מודגרת ב-Proteinase K. טיפול ב-DNase, חילוץ פנולים/כלורופורם, אלכוהול איזופרופיל וצנטריפוגציה משמש לשחרור RNA היברידי ל-DNA.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שעתוק הגנום מוביל להיווצרות מולקולות היברידיות זמניות, הידועות כלולאות R, המורכבות ממבנים תלת-גדיליים. מבנים אלו כוללים את הגדילים הלא-מקודדים והמקודדים של DNA, כאשר הגדיל הלא-מקודד הוסט על ידי יצירת היברידים עם ה-RNA המשלים1. במהלך שעתוק הגנום, מספר רב של RNA לא מקודד מיוצר בקצבים משתנים משני גדילי ה-DNA. רוב ה-RNA הללו משמשים כמתווכים קצרי מועד, אך חלקם ממלאים תפקידים קריטיים ברשתות הרגולציה השולטות בביולוגיית הגנום, במיוחד אלו שמקורם באזורים לא מקודדים כמו טלומרים וצנטרומרים1. התפלגות ההיברידים DNA/RNA בגנום עשויה גם היא לשקף את פעילות השעתוק של התאים בכל רגע נתון.

ככל שגוברת העניין בתפקודי הרגולציה של RNA שאינם מקודדים, גובר הסקרנות לעקוב אחר השעתוק וההתפוצה שלהם בגנום, במיוחד בצורת היברידים זמניים של DNA/RNA. כדי להתמודד עם זה, פיתחנו מבחן עצמאי לזיהוי היברידים יציבים של DNA/RNA, הרלוונטי לכל תא או רקמה ביולוגית. שיטה זו מאפשרת לבודד RNA משלים שמטהר יחד עם ה-DNA, ולאחר מכן ניתוח באמצעות משקעים או רצף PCR.

מחקרים ממודלים של תרבית תאים הראו כי במהלך שכפול ושעתוק DNA, עומס שכפול, נזק ל-DNA, התנגשויות מזלג שכפול והפסקת RNA פולימראז II יכולים להתרחש עקב אירועים טופולוגיים, מבניים והיברידיזציה. תהליכים אלו, במיוחד התפתרות הסליל הכפול של ה-DNA, יוצרים מתח טורסיונלי, שיכול להוביל להיווצרות מבנים חריגים, כגון לולאות R, במהלך שעתוק1.

רוב נתוני לולאת R נוצרו באמצעות שמרים או תאי סרטן מתורבתים, בהתבסס על נוגדן מונוקלונלי ייחודי להיברידי DNA-RNA S9.6. מחקרים מבניים הראו כי קטע הקישור לאנטיגן (Fab) של S9.6 נקשר במיוחד לדופלקס היברידי RNA-DNA 1 באורך 13בסיסים. זיהוי מבוסס נוגדנים של לולאות R זיהה בעיקר היברידים הנוצרים באזורים עשירים בגואנין במהלך השעתוק, שבהם סביר להניח שהכלאה מוגברת של RNA-DNA. מחקרים חוץ-גופניים המשתמשים בנוגדן S9.6 מצביעים על כך ש-RNA המכילים ארבעה גואנינים רצופים או יותר בקצה ה-5′ שלהם מזוהים בקלות רבה יותר, וזה קשור לעלייה ביצירת לולאת R1. אנזימים שונים, כגון הליקאזים, טופויזומרזים, RNase H1 ו-RNase H2, מסייעים לשמור על איזון לולאת R במהלך השעתוק. הפרעה בהומאוסטזיס של לולאת R קשורה לעלייה באי-יציבות גנומית, התורמת למחלות כמו סרטן והפרעות ניווניות עצבית.

טלומרים, שבעבר נחשבו לשקטים מבחינה שעתוקית, נמצאו כמעתיקים RNA ארוכים שאינם מקודדים הידועים כ-RNA טלומרי חוזר-מכיל (TERRA)3. תמלולים אלו מגיעים מאזורים סובטלומריים ומכילים חזרות טלומריות, הממלאות תפקידים חיוניים בשמירה על הומאוסטזיס טלומרים4. במאמר זה, אנו מתייחסים ל'RNA היברידי של TERRA' כמולקולות ה-RNA המשתחררות ממתחמים היברידיים של DNA/RNA באמצעות טיפול ב-DNase I, ומניחים שיכללו רצפי TERRA המבוססים על תכונות החילוץ וספציפיות הפריימר.

שעתוק TERRA מתרחש בכיוון הצנטרומר לטלומר ואורכו משתנה, נע בין 100 ל-9 קילובלים, כאשר רוב ה-TERRA מתקבל בשלב המימי כמולקולת RNA חופשי. חלק קטן נשאר מחובר ל-DNA והוא קשור לתהליכים ביולוגיים מרכזיים, כגון סרטן והזדקנותבגיל 4,5. רמות ה-TERRA משתנות בהתאם ללוקוס הסובטלומרי ומוסדרות על ידי מצב הטרוכרומטי של הטלומרים6. מחקרי תרביות תאים מצביעים גם על כך שתמלילי TERRA מאזורים תת-טלומריים שונים מציגים הטרוגניות באורך. בחלק ממחקרי תרביות תאים שמקורם בגידולים, חוקרים מצאו כי האזור הסובטלומרי 20q הוא המקור העיקרי לתמלילי TERRA, ואזור זה לעיתים קרובות מתילציה באיי CpG 7,8,9. בעכברים, האזור הסובטלומרי של כרומוזום 18 הוא אתר מרכזי לייצור TERRA10,11. בנוסף, PAR-TERRAs, שהם תמלילי TERRA שמקורם באזורים סובטלומריים פסאודו-אוטוזומליים בתאים עובריים, הוכחו כבעלי TERRA פי 200 יותר מאשר כרומוזום 18 11,12.

השעתוק של TERRA נשלט על ידי מתילציה של DNA ושינויים בהיסטונים כגון H3K9 ו-H4K20 טרימתילציה, המדכאים את TERRA, בעוד שהאצטילציה של היסטונים מתואמת באופן חיובי עם שעתוק TERRA 6,13,14. TERRA נקשר גם לאזורים אקסטרטלומריים, כולל אתרים בין-גניים ואינטרונים, מה שמעיד על תפקיד רחב יותר בוויסות הגנום2.

בנוסף, דלדול ה-TERRA מוביל לחוסר ויסות של גנים רבים, במיוחד אלו הסמוכים לאתרי הקישור שלו, מה שמרמז על תפקידו בוויסות אפיגנטי של כרומטין וביטוי גנים2. הצטברות TERRA בטלומרים מקוצרים מעודדת הארכת טלומרים מבוססת רקומבינציה הומולוגית (HR), ותורמת להומאוסטזיס אורךהטלומרים 15,16.

כדי לטפל בתפקיד של TERRA והיברידים אחרים של DNA/RNA, השתמשנו במבחן שתוכנן במיוחד לבידוד מולקולות RNA שנוצרו באופן יציב עם DNA. לזמן קצר, גרעינים בודדו וטופלו ב-RNase ללא DNase להסרת RNA לא מוגן. היברידים DNA/RNA הופקו לאחר מכן באמצעות עיכול סלקטיבי של DNase, שמשחרר RNA שהיה במקור היברידי ל-DNA. חלק זה, שנקרא "RNA היברידי-מקושר ל-DNA/RNA", נותח לאחר מכן על ידי RNA-seq והושווה ל-RNA המסיס הכולל שהושג באמצעות הפקת פנול-כלורופורם סטנדרטית17. גישה זו אפשרה לנו לזהות אתרים טלומרי ולא טלומרי של היווצרות RNA-DNA היברידי, ולהשוות את הפרופילים הטרנסקריפטומיים של מאגרי RNA קשורים ל-DNA מסיסים. בעבר נחשב TERRA כתוצר לוואי בלבד של שעתוק טלומרים, וכיום מוכר בתפקידו הכפול בתחזוקת הטלומרים, משפיע על פעילות הטלומרז ורקומבינרציה הומולוגית, שהם חיוניים להומאוסטזיס אורך הטלומרים. יתרה מזאת, התקדמות בבדיקות גילוי אפשרה הבנה מפורטת יותר של האינטראקציות הדינמיות בין RNA ל-DNA ברחבי הגנום. ידע זה פותח את הדרך לחקירה נוספת של ההשלכות של היברידים DNA/RNA, כגון TERRA, בתהליכים תאיים והקשרים הפוטנציאליים שלהם למחלות כמו סרטן והפרעות ניווניות עצבית. המחקר המתמשך בתחום זה בוודאי יעמיק את הבנתנו לגבי ויסות גנומי ורלוונטיותו לבריאות ולמחלות.

השיטה המשמשת לזיהוי מולקולות TERRA והיברידים DNA/RNA במחקר זה היא אותו פרוטוקול מיצוי אופטימלי של גואנידיניום תיוציאנט-פנול-כלורופורם המפורט כאן. פרוטוקול זה פותח כדי לאפשר בידוד מקביל של היברידים של RNA-DNA/RNA, רנ"א כולל ו-DNA גנומי במסגרת זרימת עבודה מאוחדת. על ידי שינוי אסטרטגי של שיטת ההפרדה התלת-פאזית הקלאסית, פרוטוקול זה מקל על שמירה סלקטיבית של היברידים DNA/RNA בשלב הביניים של פנול, ובכך מצמצם את האובדן שלהם – מגבלה מובנית בטכניקות חילוץ קונבנציונליות.

מסורתית, גילוי ובידוד של היברידים DNA/RNA התבססו על אימונופרציפיטציה עם הנוגדן המונוקלונלי S9.6, שמזהה במיוחד את מבני ה-DNA/RNA ההיברידיים18,19. גישה מבוססת S9.6 זו, אף שהיא נפוצה מאוד, יכולה להיות מוגבלת על ידי נגישות נוגדנים, עלות ופוטנציאל לתגובתיות צולבת. לעומת זאת, הפרוטוקול שלנו מציע חלופה חסכונית, בלתי תלויה בנוגדנים, שמתאימה בקלות הן לדגימות תאיות והן לדגימות שמקורן ברקמה.

כדי לשפר עוד יותר את הטוהר והשלמות המבנית של חלק ה-DNA וה-RNA ההיברידי המבודד, שילבנו דה-פרוטניזציה בתיווך פרוטנאאז K, ואחריה טיפול ב-DNase I. שלב DNase I מעכל באופן סלקטיבי את גדיל ה-DNA של ההיברידים DNA/RNA, ובכך משחרר את ה-RNA ההיברידי לבידוד ולניתוח מולקולרי בהמשך20. גישה זו מבטיחה שמיני ה-RNA שנמצאו הם ספציפיים כאלה שעברו היברידיות יציבות ל-DNA ב-vivo. בזכות התצורה המודולרית והיכולת להרחבה, הפרוטוקול שלנו גמיש באופן רחב להקשרים ביולוגיים מגוונים, ומספק לחוקרים כלי חזק לחקירת ביולוגיה היברידית של DNA/RNA במגוון רחב של מערכות ניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים הניסיוניים שעסקו בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של אוניברסיטת ארסייס (מספר רישיון 19-07-2019, החלטה מס' 19/127). עכברי Balb/c שימשו במחקר זה: חמש נקבות בריאות, בנות 6 שבועות (25 גרם), וחמישה זכרים, בני 8 שבועות (30 גרם). העכברים טופלו וטופלו בהתאם לעקרונות טיפול בבעלי חיים במעבדה (הכללים האירופיים). המחקר שהוצג כאן השתמש בדגימות דם מ-13 נבדקים בריאים לביקורת, שנגזרו מפרויקט מחקר קודם שקיבל אישור אתי מוועדת האתיקה האנושית של אוניברסיטת ארסייס (החלטה מס' 17/002). תקציר גרפי לפרוטוקול זה מסופק באיור 1. השתמש בחומרים ללא RNase ובטכניקות אספטיות לאורך כל השלבים כדי למזער את התדרדרות ה-RNA.

1. גידול עכברים

  1. כדי לקבוע את מינון ההרדמה המתאים להמתת חסד, שקלו כל עכבר ונתנו קטמין במינון של 60 מ"ג/ק"ג וקזילזין במינון של 10 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית.
  2. לאחר מתן הרדמה, יש לאשר הרדמה מלאה בהיעדר רפלקס גמילה של הדוושה (צביטת האצבע) וחוסר תגובה לגירוי מישושי. לאחר אישור ההרדמה, יש לבצע המתת חסד באמצעות ניתוק צוואר הרחם.

2. דגימות אנושיות

  1. בחרו משתתפים כבקרים בריאים לאחר הסקר כדי להוציא כל היסטוריה של מחלות כרוניות (כגון סוכרת, מחלות לב וכלי דם, יתר לחץ דם או סרטן), זיהומים חריפים, הפרעות אוטואימוניות או דלקתיות, מצבים נוירולוגיים או פסיכיאטריים, ושימוש עדכני בתרופות מרשם17.
  2. אסוף דגימות ביופסיה מהעור מהאזור מאחורי הברך (פופיליאט פוזה) של כל מתנדב באמצעות כלי אגרוף בקוטר 2 מ"מ. מתן הרדמה מקומית תת-עורית לפני ההליך, וביצוע כל הביופסיות בתנאים סטריליים.

3. חילוץ היברידי DNA/RNA מכל סוגי התאים

  1. איסוף רקמות וליזיס
    1. לכל הוצאה, השתמשו ב-500 מיקרוליטר דם לב, קומפלקס היפותלמי-היפופיזה שלם, בלוטת יותרת הכליה שלמה, או דגימת זרע שנאספה מעכבר אחד.
    2. העבר את כל הדגימות שנאספו לצינורות סטריליים של 1.5 מ"ל. הוסף 500 מיקרוליטר פנול לכל צינור. דגימות דם של וורטקס לערבוב יסודי.
      1. לדגימות רקמה, יש להומוגניזציה מלאה באמצעות מזרק בקוטר 2 מ"מ עד שלא יישארו שברים נראים לעין.
    3. הניחו את הצינורות על בלוק קירור לשמירה על שלמות הדגימה.
      הערה: תמיד יש לעקוב אחרי הנחיות בטיחות במעבדה בעת טיפול בתגובות מסוכנות כגון פנול, כלורופורם ואמוניום אצטט.
  2. הפרדת פאזה
    1. הוסף 180 מיקרולטר כלורופורם לכל צינור ומערבולת לזמן קצר לערבוב. דגרו צינורות על קרח למשך 15 דקות כדי לאפשר הפרדת פאזה.
    2. בדוק את הדגימות - וודא שהשלב המימי נראה נקי. אם הפאזה מעוננת, חזור למערבולת וחזור לקרח לעוד 5 דקות.
    3. דגימות צנטריפוגה ב-12,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  3. משקעי RNA
    1. העבר בזהירות את הפאזה המימית השקופה לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי חדש בנפח 1.5 מ"ל המונח על בלוק קירור.
    2. מוסיפים נפח שווה (1:1) של איזופרופנול לשלב המימי, מערבבים לזמן קצר, ודגרו על קרח למשך 15 דקות.
    3. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      הערה: כדור ה-RNA צריך להיות גלוי בתחתית הצינור.
  4. שטיפת כדור ה-RNA
    1. הפוך בזהירות את הצינור כדי להשליך את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
    2. הוסיפו 1.5 מ"ל של 70% אתנול לכדור. טפח בעדינות על הצינור במשך 5 שניות לכביסה.
    3. צנטריפוגה ב-7,500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    4. הפוך את הצינור כדי להשליך את הסופרנטנט. חזור על שטיפת האתנול פעמיים (סך הכל שלוש שטיפות נוספות).
  5. טיהור RNA
    1. לאחר שטיפת האתנול הסופית, הפכו את הצינור ואפשרו לכל שאריות אתנול להתייבש באוויר או להסיר בזהירות עם פיפטה.
    2. הוסף 100 מיקרוליטר מים ללא RNase לכדור ה-RNA והפיפט בעדינות למעלה ולמטה או להזיז את הצינור כדי להחזיר את ה-RNA במלואו.
      הערה: תמיד שמרו דגימות RNA על קרח או על מתקן/בלוק קירור מקורר כדי למנוע התדרדרות.
  6. כימות ואחסון RNA
    1. מניחים את הצינור המכיל RNA תלוי על קרח.
    2. למדוד ריכוז וטוהר RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. רשמו את הספיגה ב-260 ננומטר (A260) כדי לקבוע את ריכוז ה-RNA. הערך טוהר על ידי חישוב היחסים A260/A280 ו-A260/A230.
    3. השתמש רק בדגימות RNA עם יחס A260/A280 בין 1.9 ל-2.1 ליישומים במורד הזרם.
      הערה: במחקר זה, ריכוזי ה-RNA הטיפוסיים נעו בין 100 ל-180 ng/μL.
    4. אחסן דגימות RNA בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  7. הסרת חלבונים ובידוד DNA
    1. לאחר בידוד ה-RNA, יש לשמור על האינטרפאזה משלב חילוץ הפנול.
      הערה: שלב זה הכרחי כי האינטרפאזה מכילה DNA, שניתן לעבד אותו לבידוד DNA לאחר הוספת פנולים וצנטריפוגה.
    2. המשך בהפקת ה-DNA על ידי שלבים 3.2.1-3.4.1, החל מהאינטרפאזה כחומר ההתחלה. העבר בזהירות את כל האינטרפאזה (המכילה DNA) מהפקת הפנול לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בנפח 1.5 מ"ל שמוחזק על מדף קירור.
    3. עיכול חלבון: הוסף 0.5 מ"ל של בופר ליזיס (20 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0; 100 מ"מ EDTA; 0.1% SDS; 400 מיקרוגרם/מ"ל פרוטינאז K) לצינור. דגרו לילה בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס לעיכול חלבונים.
    4. משקעים במלח ב-DNA
      1. ביום הבא, הוסף 100 מיקרוליטר של אצטט אמוניום 5 M לכל דגימה וערבב לזמן קצר. צנטריפוגה ב-1,788 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. העבר בזהירות את הפאזה המימית השקופה לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי חדש בנפח 1.5 מ"ל. הוסף נפח שווה של איזופרופנול בדרגת ביולוגיה מולקולרית (יחס 1:1) לשלב המימי, ערבב בהיפוך עדין, וצנטריפוגה ב-1,788 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. להשליך את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור ה-DNA.
      3. שטפו את כדור ה-DNA עם 1 מ"ל של 70% אתנול, ואז צנטריפוגה ב-1,788 × גרם למשך 10 דקות.
      4. הסר והשליך את שטיפה האתנולית. תן לכדור ה-DNA להתייבש באוויר לזמן קצר.
      5. החזירו את כדור ה-DNA היבש ל-50 מיקרו-ליטר מים ללא נוקלאז.
  8. הסרת חומצה גרעינית חופשית לניקוי DNA:
    1. טעין את ה-DNA המומס על עמודת ספין DNA. צנטריפוגה בעוצמה של 15,000 × גרם למשך 15 שניות, והשליכו את הזרימה.
    2. שטוף את העמודה פעמיים עם 70% אתנול, וצנטריפוגה כל פעם דקה ב-15,000 × גרם. זרוק את הזרימה אחרי כל שטיפה.
    3. העבר את עמוד הסיבוב לצינור איסוף נקי בנפח 1.5 מ"ל. הוסיפו 30 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז למטריצת העמודה, דגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, ואז צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-15,000 × גרם כדי להוציא את ה-DNA.
    4. הנח את ה-DNA המשוחרר על קרח. חלק את הדגימה לשני צינורות: אחד לאחסון DNA בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, והשני לחילוץ משולב של DNA/RNA לאחר מכן.
  9. חילוץ RNA מחובר ל-DNA (היברידים DNA/RNA)
    1. טיפול ב-DNase
      1. הכינו תערובת עיכול DNase על ידי שילוב של 5 מיקרוליטר (15 U) של DNase I ו-75 מיקרוליטר של 10x בופר עיכול DNase.
      2. הוסף 80 מיקרו-ליטר מתערובת ה-DNase לגלגור ה-DNA היבש. דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    2. הפקת פנול-כלורופורם
      1. הוסף 300 מיקרוליטר פנול לדגימה ודגר בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
      2. הוסיפו 180 מיקרוליטר כלורופורם לתערובת ודגרו עוד 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      3. צנטריפוגה במהירות מקסימלית (למשל, 15,000 × גרם) למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להפריד בין הפאזות. העבר בזהירות את הפאזה המימית העליונה (המכילה היברידים של RNA:DNA) לצינור חדש.
  10. בידוד היברידי בין DNA/RNA
    1. השלמו את הבידוד של היברידים DNA/RNA משלבים 3.3 עד 3.5.2.
    2. מוסיפים נפח שווה (1:1) של איזופרופנול לשלב המימי, מערבבים לזמן קצר, ודגרו על קרח למשך 15 דקות.
    3. צנטריפוגה ב-12,000 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. חפש את כדור ה-RNA בתחתית הצינור. הפוך בזהירות את הצינור כדי להשליך את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
    4. הוסיפו 1.5 מ"ל של 70% אתנול לכדור. טפח בעדינות על הצינור במשך 5 שניות לכביסה. צנטריפוגה ב-7,500 × גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הפוך את הצינור כדי להשליך את הסופרנטנט. חזור על שטיפת האתנול פעמיים (סך הכל שלוש שטיפות נוספות).
  11. טיהור RNA:
    1. לאחר שטיפת האתנול הסופית, הפכו את הצינור ואפשרו לכל שאריות אתנול להתייבש באוויר או להסיר בזהירות עם פיפטה.
    2. הוסיפו 30 מיקרוליטר מים ללא RNase לכדור ההיברידי DNA/RNA והפיפט בעדינות למעלה ולמטה או להזיז את הצינור כדי להחזיר את ה-RNA למושך במלואו.
    3. יש לאחסן דגימות היברידיות DNA/RNA בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

4. סינתזת cDNA

הערה: ודאו שלמות RNA, cDNA ו-DNA על ידי שימוש בחומרים נטולי RNase/DNase ושמירת דגימות על הקרח לאורך כל ההליך.

  1. לכל דגימה, השתמשו ב-6 מיקרוליטר (20 ng של RNA; כפי שמבודד בשלב 3.6.5 ל-RNA חופשי או בשלב 3.13.3 ל-RNA היברידי DNA/RNA). העבר את נפח ה-RNA הנדרש לצינורות PCR מסומנים.
  2. הכן את תערובת הסינתזה של cDNA לפי הוראות יצרן הערכה. לכל תגובה, יש לוודא שהתערובת הראשית מכילה טרנסקריפטאז הפוך, dNTPs, פריימרים, בופר ומעכבי RNase. לכל תגובה, שלבו 14 מיקרו-ליטר של מיקס מאסטר עם 6 מיקרוליטר של דגימת RNA בצינור PCR (נפח כולל: 20 מיקרו-ליטר לכל תגובה). כלול לפחות בקרת טרנסקריפטאז ללא הפוכה (-RT) על ידי הכנת תגובה מקבילה ללא הוספת אנזים טרנסקריפטאז הפוך, תוך שימוש באותה כמות RNA.
  3. בצע סינתזת cDNA במחזור תרמי באמצעות תוכנית הטמפרטורה המוגדרת בטבלה 1.
  4. מדלל את ה-cDNA המתקבל ביחס 1:5 עם מים ללא נוקלאז ואחסן בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס עד לניתוח qPCR.

5. קביעת רמות הביטוי של TERRA באמצעות Q-PCR

  1. הכינו את תערובת התגובה של qPCR באמצעות ערכת qPCR מבוססת SYBR Green, בהתאם להוראות היצרן. לכל תגובה, יש לשלב 1 מיקרוליטר של SYBR Green Master Mix, 0. μL של פריימר קדמי ל-TERRA (ראו טבלה 2), 0. μL של פריימר הפוך עבור TERRA (ראו b), ו-μL מים ללא נוקלאז.
  2. זרקו 16 מיקרוליטר מתערובת התגובה לכל באר של לוח qPCR עם 96 בארים.
  3. הוסף 4 מיקרו-ליטר של cDNA מדולל (משלב 4.6) לכל באר, לנפח תגובה סופי של 20 מיקרוליטר.
    הערה: לכל דגימה, כלול לפחות שני שכפולים טכניים ושני שכפולים ביולוגיים. כלול בקרות ללא תבנית (NTCs) לבדיקת זיהום ובקרות ללא תעתיק הפוך כדי להבטיח דיוקיות לאותות שמקורם ב-RNA.
  4. בצע qPCR באמצעות תוכנית הטמפרטורה שצוינה בטבלה 3.
  5. נרמול ביטוי TERRA ל-β-אקטין (גן ניקיון בית) באמצעות שיטת 2-ΔΔCt .

6. קביעת אורך הטלומרים

  1. הכינו את תערובת ה-qPCR למדידת אורך הטלומרים 21. לכל תגובה, יש לשלב 1 מיקרוליטר של SYBR Green Master Mix, 0. μL של פריימר קדמי של טלומרים (ראו טבלה 2]), 0. μL של פריימר הפוך של טלומרים (ראו טבלה 2), ו-μL של מים ללא נוקלאז.
  2. יש לחלק 16 מיקרוליטר מתערובת תגובת הטלומרים לכל באר של לוח qPCR עם 96 בארים.
  3. הוסף 4 מיקרוליטר DNA גנומי (משלב 3.10.5) לכל באר, לנפח תגובה סופי של 20 מיקרוליטר.
  4. בצע qPCR בהתאם לפרמטרי התוכנית המתאימים שנקבעו על ידי היצרן (ראו טבלה 3).
  5. במקביל, הקמים תגובות לגן ייחוס עותק יחיד (36B4) תוך שימוש בריכוזים ובנפח סופי זהים.
  6. עקומות סטנדרטיות נוצרו באמצעות דילול סדרתי של אוליגונוקלאוטיד טלומרי סינתטי (טבלה 2) להערכת שפע יחסי ויעילות הגברה. לא בוצעה כימות מוחלט. אורך הטלומרים היחסי מחושב כיחס T/S (מספר עותק חוזר של טלומר למספר גן של עותק יחיד) באמצעות שיטת ΔCt21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה כמתנו והשווינו את רמות ה-TERRA החופשי, ה-TERRA ההיברידי DNA/RNA, ואורך הטלומרים ברקמות עכברים מרובות (דם, זרע, עור, היפותלמוס, יותרת המוח, יותרת הכליה) וכן בדגימות דם ועור אנושיות, כדי לחקור דינמיקה ספציפית לרקמה והקשר לביולוגיית הטלומרים. TERRA החופשי בודד מהשלב המימי לאחר הפקת פנול-כלורופורם (שלבי פרוטוקול 3.6.1-3.6.5), והועשר עבור RNA ציטופלזמי ונוקלאופלזמי כולל מולקולות TERRA שאינן קשורות לכרומטין או DNA. TERRA ההיברידית, המי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חוזק מרכזי של הפרוטוקול המוצג כאן טמון בחילוץ והבחנה הדרגתית של TERRA חופשי ו-DNA ו-RNA היברידי מדגימות רקמה מורכבות. צעדים קריטיים כוללים הפרדה זהירה של החלקים המימיים והבין-פאזיים במהלך הפקת פנול-כלורופורם, שכן זיהום צולב עלול לבלבל את ההבחנה בין TERRA חופשי להיברידי. הטיפול הבא ב-DNase I בשבר הבין-פאזה הוא גם הוא מכריע: עיכול לקוי עלול להשאיר את ה-RNA הקשור ל-DNA בלתי נגיש, בעוד שעיכול יתר עלול לפרק היברידים. השימוש בבקרות אנזימטיות מאומתות, ספציפיות להיברידיות – כגון טיפול ב-RNase H ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ליחידת המחקר המדעי של אוניברסיטת ארסייס על תמיכתה בעבודה זו עם מספרי מענקים TYL-2019-9224 ו-TSA-2022-11929.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות PCR בנפח 0.2 מ"לגריינר671201
צינורות פלקון בנפח 15 מ"למעבדת הבידוד078.02.001
מזרק 2 מ"לחיאתלא זמין
96- לוח מולטיוולגריינר50-720-3203
אתנול מוחלטמרק1070172511
אצטט אמוניוםסיגמא238074-500G
ערכת סינזיס cDNAרוש07 912 439 001
כלורופורםמרק1024451000
DNAse I Kit זימוE1010
EDTAסיגמאE9884-1KG
בקבוק זכוכיתמעבדת הבידודLB. IS.061.01.901
גליל מדורגמעבדת הבידוד  015.01.901
גואנידין איזותיוציאנט  סיגמאG9277-100G
איזופרופונלימרק1096342511
לייט סייקלר 480 IIרוש5015278001
צינורות מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)גריינר616201
מיקרופיפטות (10 ומיקרו; L)גילסוןFD10001
מיקרופיפטות (100 ומיקרו; L)גילסוןFD10004
מיקרופיפטות (1000 ומיקרו; L)גילסוןFD10003
מיקרופיפטות (2 ומיקרו; L)גילסוןGFAM00064
ננודרופשימאדזוC101-E112
טאבלט PBSסיגמאP4417-50TAB
מכשיר PCRסנסוקווסטT3-0140
וקטור בסיסי PGL3פרומגה #212936
טיפים של פיפטה (10 ומיקרו; L, 200 ומיקרו; L, 1000 ומיקרו; L)גריינר772352
צלחות פטרי מפלסטיקגריינר627102
פרוטאנאז KסיגמאP6556-10MG
SDSסיגמא8170342500
פיפטה סרולוגיתגריינר760107
סיבובגילסוןPMC880
מאסטר סיבר גריןרוש4707516001
תרמומיקסראפנדורף#5355
בסיס טריזמהסיגמא1503-1KG         
טריזולביוראד7326890
שייקר Unimax 1010 DTהיידולף543-12310-00-6
מערבולתהיידולף541-10000-00-1
עמודי זימו-ספין IזימוC1003-50

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, D. F., Wang, G. G. R-loops: formation, function, and relevance to cell stress. Cell Stress. 3, 38-46 (2019).
  2. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdiscip Rev RNA. 5, 407-419 (2014).
  3. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat-containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  4. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  5. Oliva-Rico, D., Herrera, L. A. Regulated expression of the lncRNA TERRA and its impact on telomere biology. Mech Ageing Dev. 167, 16-23 (2017).
  6. Azzalin, C. M., Lingner, J. Telomeres: the silence is broken. Cell Cycle. 7, 1161-1165 (2008).
  7. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  8. Xu, Y., et al. Finding a human telomere DNA-RNA hybrid G-quadruplex formed by human telomeric 6-mer RNA and 16-mer DNA using click chemistry: a protective structure for telomere end. Bioorg Med Chem. 22, 4419-4421 (2014).
  9. Montero, J. J., López De Silanes, I., Graña, O., Blasco, M. A. Telomeric RNAs are essential to maintain telomeres. Nat Commun. 7, 1-13 (2016).
  10. Cusanelli, E., Chartrand, P. Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology. Wiley Interdiscip Rev RNA. 5, 407-419 (2014).
  11. De Silanes, I. L., et al. Identification of TERRA locus unveils a telomere protection role through association to nearly all chromosomes. Nat Commun. 5, 4723(2014).
  12. Azzalin, C. M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., Lingner, J. Telomeric repeat containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science. 318, 798-801 (2007).
  13. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  14. Pfeiffer, V., Lingner, J. TERRA promotes telomere shortening through exonuclease 1-mediated resection of chromosome ends. PLoS Genet. 8, e1002747(2012).
  15. Balk, B., Dees, M., Bender, K., Luke, B. The differential processing of telomeres in response to increased telomeric transcription and RNA-DNA hybrid accumulation. RNA Biol. 11, 95-100 (2014).
  16. Yu, T. Y., Kao, Y. W., Lin, J. J. Telomeric transcripts stimulate telomere recombination to suppress senescence in cells lacking telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 3377-3382 (2014).
  17. Mehmetbeyoglu, E., et al. Decrease in RNase HII and accumulation of lncRNAs/DNA hybrids: a causal implication in psoriasis. Biomolecules. 12 (3), 368(2022).
  18. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. J Immunol Methods. 89, 123-130 (1986).
  19. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. J Mol Recognit. 26, 376-381 (2013).
  20. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chédin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Mol Cell. 45, 814-825 (2012).
  21. O'Callaghan, N. J., Fenech, M. A quantitative PCR method for measuring absolute telomere length. Biol Proced Online. 13, 1-10 (2011).
  22. Arora, R., Azzalin, C. M. Telomere elongation chooses TERRA ALTernatives. RNA Biol. 12, 938-941 (2015).
  23. Balk, B., et al. Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence. Nat Struct Mol Biol. 20, 1199-1206 (2013).
  24. Roake, C. M., Artandi, S. E. Approaching TERRA Firma: genomic functions of telomeric noncoding RNA. Cell. 170, 8-9 (2017).
  25. Luke, B., Lingner, J. TERRA: telomeric repeat-containing RNA. EMBO J. 28, 2503-2510 (2009).
  26. Cañas, J. C., Aguilera, A., Gómez-González, B. Detection of R-loops by in vivo and in vitro cytosine deamination in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 2528, 39-53 (2022).
  27. Cerritelli, S. M., Sakhuja, K., Crouch, R. J. RNase H1, the gold standard for R-loop detection. Methods Mol Biol. 2528, 91-114 (2022).
  28. Skourti-Stathaki, K. Detection of R-loop structures by immunofluorescence using the S9.6 monoclonal antibody. Methods Mol Biol. 2528, 21-29 (2022).
  29. Kianmehr, L., et al. Analysis of RNA/DNA hybrid profiles in blood from autistic patients reveals differences in mRNA and non-coding RNA regions. bioRxiv. , (2024).
  30. Yilmaz Sukranli, Z., et al. Experimentally altering microRNA levels in embryos alters adult phenotypes. Sci Rep. 14, 19014(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNADNA RNATERRARNAProteinase KDNase

מאמרים קשורים