מאמר שיטה

פרוטוקול ציטומטריית אלקטרופורציה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים באמצעות תרבית תאים U2 OS

DOI:

10.3791/68005

⸱

13 ביוני 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan University, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (iBEST), a partnership between St. Michael's Hospital, a site of Unity Health Toronto, and Toronto Metropolitan University, 3Keenan Research Centre for Biomedical Science at St. Michael's Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלקטרופורציה היא שימוש בשדות חשמליים פועמים (PEFs) ליצירת נקבוביות חולפות בתרביות תאים כדי להכניס מטען מולקולרי. טכניקה זו הפכה לאחרונה לשימוש נרחב במחקר ובמסגרות קליניות. כאן, אנו מתארים טכניקות אלקטרופורציה באמצעות "מערכת ציטומטריית אלקטרופורציה" שפותחה לאחרונה לביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לשדות חשמליים פועמים (PEFs) יש מגוון רחב של יישומים במחקר רפואי ויישומים קליניים. תחום מחקר מרכזי מתמקד באלקטרופורציה (הפיכה או בלתי הפיכה). אלקטרופורציה הפיכה משמשת כבר כמה עשורים להעברת מולקולות דרך ממברנות התאים כגון DNA פלסמיד, המכונה בדרך כלל העברה חשמלית של גנים (GET). לעומת זאת, אלקטרופורציה בלתי הפיכה הפכה לטכניקה פופולרית בטיפול בסרטן, ומספקת אלטרנטיבה לא רעילה על ידי קריעת תאים לצמיתות באמצעות PEFs. ניתן לשלב זאת עם סוגים שונים של תרופות או ריאגנטים כדי לשפר את האפקט שנודע בשם אלקטרוכימותרפיה (ECT). עם זאת, למרות ההצלחה הרחבה ביישומים מעשיים, נדרשת תמיכה נוספת בטכנולוגיה ובמחקר כדי לשפר את הטכניקות הקיימות. כדי לטפל בכך, פותחה מערכת ציטומטריה אלקטרופורציה לתמיכה בניסויי PEF של תאים חיים עם היכולת לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ארוכת טווח. זה היה בשילוב עם קו תאים FUCCI(CA)5 U2-OS המתבטא ביציבות להערכת שינויים במחזור התא בתגובה לחשיפה ל-PEF. בכך הושגה מיקרוסקופיה של עד 30 שעות, המספקת שינויים בזמן אמת בפעילות התא בהתבסס על מדווח FUCCI(CA)5. כתוצאה מכך, שינויים ספציפיים לפאזה היו ניתנים לכימות לניתוח במורד הזרם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שדות חשמליים פועמים (PEFs) גדלו והפכו לכלי נפוץ למגוון יישומים בביולוגיה ויישומים קליניים1. ניתן לסווג אותם באופן כללי על ידי אלקטרופורציה (EP) וגירוי חשמלי (ES). לאלקטרופורציה יש שני תת-תחומים המכונים אלקטרופורציה הפיכה ובלתי הפיכה. אלקטרופורציה הפיכה (RE) שימשה במשך עשרות שנים ככלי יעיל להעברת מטען מולקולרי כגון DNA פלסמיד לתאים מסוגים שונים כגון יונקים, חיידקים ושמרים2. לאחרונה, אלקטרופורציה בלתי הפיכה (IRE) גדלה כחלופה לא רעילה לטיפולי הסרטן הנוכחיים3. תת-תחום מתפתח מכונה אבלציה של שדה פועם (PFA), המתמקד בהסרת רקמות לא תרמיות, במיוחד לטיפול בהפרעות מסוימות בתפקוד הלב4. בשילוב עם תרופות וריאגנטים אחרים, הדבר הוביל לפיתוח אלקטרוכימותרפיה (ECT). עם זאת, ההבנה הנוכחית של טיפולי PEF עולה על ידי יישומים קליניים5. כאן אנו מציגים מערכת ציטומטריה אלקטרופורציה לחקירת אלקטרו-כימותרפיה. מחזור התא מייצג אינדיקטור מרכזי לכדאיות התא, ושינויים יכולים לזהות השפעות ספציפיות לשלב. על ידי פיתוח כלים אלה, ניתן להתאים פרוטוקולים מהר יותר, ולספק טיפולים יעילים יותר למגוון רחב יותר של סוגי סרטן.

מערכת האלקטרוציטומטריה המותאמת אישית שלנו (איור 1) כוללת תא עם אלקטרודות לוחות מקבילים מאלומיניום ותחתית זכוכית כיסוי כמו גם מחולל פולסים דעיכה מעריכיים פשוטים. החדר בנוי מתא מודפס בתלת מימד ותחתית זכוכית כיסוי #1.5 מודבקת על ידי דבק רגיש ללחץ בדרגה רפואית. אלקטרודות נוצרות מסרט אלומיניום דביק המונח על תומכים המובנים בתא, ומספק שתי אלקטרודות מקבילות במרחק של 0.4 ס"מ זו מזו. זוהי תצורה נפוצה לאלקטרודות מסחריות ומספקת עיצוב חזק שיכול להתאים במהירות את הפרוטוקולים הנוכחיים. התא יכול להתאים למארזים סביבתיים המיועדים לשקופיות של 25 מ"מ על 55 מ"מ, שהוא גם פורמט שקופיות נפוץ הנתמך על ידי ספקי מיקרוסקופים מסחריים. מחולל הפולסים מספק פולסי דעיכה מעריכיים של עד 330 וולט, המאפשרים להשיג מגוון רחב של ניסויים, כולל אלקטרופורציה הפיכה ובלתי הפיכה.

כדי לחקור את ההשפעות של PEFs על מחזור התא, השתמשנו בקו תאי אוסטאוסרקומה אנושי טרנסגני (U2 OS) המבטא את אינדיקטור מחזור התא הפלואורסצנטי (CA)5 (FUCCI(CA)5), מבנה מדווח מחזור תא חי פלואורסצנטי. המערכת מציגה שתי צורות פלואורסצנטיות וקטומות של ג'מינין ו-Cdt1, המיוצרות וממוחזרות בקצבים ספציפיים במהלך מחזור התא. בנוסף, ניתן לנטר אפופטוזיס באופן ישיר במהלך הניסוי באמצעות קו FUCCI(CA)5 המתבטא ביציבות של תאי U2-OS. במהלך מחזור התא, המדווח פועל באופן צפוי עם כל שלב מכיוון שאלו מיוצרים ומתפרקים באותם שיעורים כמו הגרסאות הפונקציונליות המתבטאות באופן טבעי בתא. כאשר מתרחשת אפופטוזיס, מחזור זה מופרע כאשר מחזור התא נסגר במהירות. בדרך כלל, זה יתבטא חזותית כקרינה מתעקשת בתוך מחזור התא, ואחריה שינויים מורפולוגיים דרמטיים בגרעין, הנראים בבירור עקב לוקליזציה של המדווחים לגרעין6. זה מאפשר זיהוי חזותי של כל שלב בתאים בודדים לאורך זמן (איור 2). אלקטרופורציה הפיכה גורמת לשינויים בתנאים התוך-תאיים ודופק דעיכה אקספוננציאלי של 180 וולט נבחר למחקר. פולס זה נבחר כדי להגביל ככל האפשר את מוות התאים, תוך הבטחת אלקטרופורציה ברוב האוכלוסייה. זה נקבע על סמך מחקר קודם שבדק פרמטרים אופטימליים של דופק אלקטרופורציה עבור שישה קווי תאים של יונקים. צפיפות האנרגיה של פולס 180 וולט הייתה מעט נמוכה מפרמטרי הטרנספקציה האופטימליים, מה שסיפק כדאיות תאים טובה יותר עם נקבוביותגבוהה 7. השפעת הפולס נחקרה בתאים לא מסונכרנים ובתאים מסונכרנים בשלב S באמצעות בלוק כפול תימידין עם ובלי יישום PEF (איור 3). התוצאות הצביעו על ירידה באורך הממוצע של S ו-G2 בהשוואה לביקורת. זה הצביע על כך ששלב ה-S היה רגיש לחשיפה ל-PEF וכתוצאה מכך מחזור תאים מהיר יותר. זה הוכיח שמערכת הציטומטריה של אלקטרופורציה הצליחה לשלב אספקת PEFs עם הדמיית תאים חיים לטווח ארוך לחקר מחזור התא. בעוד שהשתמשנו בפלטפורמה זו כדי לצפות בהתקדמות התאים במחזור התא בתגובה ל-PEFs, זהו כלי שימושי לחקר מגוון יישומים ותנאים עבור PEFs ותרבית תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תרבית תאים

  1. הכן את הקו היציב באמצעות אלקטרופורציה הפיכה עם הפרמטרים הבאים: 100 מיקרוליטר של תאי U2 OS תלויים (6 × 106 תאים/מ"ל) עם 5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד בקובטה של 0.4 ס"מ, ודופק גל מרובע של 180 וולט למשך 10 אלפיות השנייה.
  2. הדפס את עיצוב החדר המותאם אישית באמצעות כל מדפסת תלת מימד מתאימה ופלסטיק תואם ביולוגית כגון חומצה פולילקטית (PLA) (ראה קובץ משלים 1). יש לחטא את החדר שהושלם באמצעות אתנול (70%), ולאחסן בכלי סטרילי לפני השימוש.
  3. תרבית U2-OS FUCCI(CA)5 תאים בצלחת של 10 ס"מ עם 10 מ"ל של Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) - גלוקוז גבוה המכיל 10% סרום בקר עוברי ו-1% PenStrep ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
  4. כאשר התרבית מגיעה למפגש של 80%, שאפו את המדיה, שטפו את תרבית התאים עם מי מלח עם פוספט (PBS), ונתקו את התאים באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין למשך 1.5 דקות.
  5. לנטרל את הטריפסין על ידי השעיית תרבית התאים ב-5 מ"ל של גלוקוז גבוה DMEM (המכיל 10% FBS ו-1% PenStrep).
  6. מתרבית התאים המושעה, השג דגימה של 100 מיקרוליטר והנח אותה בתא מערכת הציטומטריה של האלקטרופורציה על כיסוי הזכוכית התחתון. ודא שהתא מתכנס ב-30% לאחר הכנסת הדגימה. אם נראה שהדגימה מתכנסת יתר על המידה לפני הדגירה, שאפו את הדגימה והנמיכו את נפח הדגימה.
  7. לאט, הוסף 4 מ"ל של גלוקוז גבוה DMEM (המכיל 10% FBS ו-1% PenStrep) לקצה הרחוק של החדר, ולמנוע מהנוזל לשטוף את הדגימה.
  8. הנח שקופית מיקרוסקופ סטנדרטית על גבי החדר ודגר את החדר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 שעות, כדי להבטיח שהתרבית נדבקה במלואה לתחתית החדר. לחלופין, השתמש ב-Hoechst 33342 (1 מיקרוגרם/מ"ל) כדי לצבוע גרעיני תאים לכימות קל יותר של תאים במורד הזרם, כמו גם לאפופטוזיס. בצע את הכתם 30 דקות לפני מיקרוסקופיית זמן-lapse.

2. הכנת מיקרוסקופ

  1. ראשית, הפעל מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם בקרות סביבתיות ותא המאפשר לתנאים להתייצב לפני ביצוע אלקטרופורציה.
    הערה: כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם מערכת סביבתית שיכולה לקבל את שקופית החדר בגודל 25 מ"מ x 55 מ"מ x 16 מ"מ. העיצוב תוכנן במקור לעבוד על המיקרוסקופ ההפוך המוזכר (ראה טבלת חומרים) והמערכת הסביבתית המתאימה.
    חימום הבמה עלול לגרום לסחף בתמונה עקב התרחבות מתכת.
  2. בזמן שהמערכת הסביבתית מגיעה לטמפרטורה האופטימלית, חבר מולטימטר דיגיטלי לקבל מחולל הדופק ולמתג מתח גבוה באמצעות כבלים חשמליים מתאימים. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בכבלי קליפס "תנין" כדי לאפשר הרכבה ופירוק מהירים עם תא האלקטרופורציה.
  3. לאחר מכן, בחר הגדלה פי 20 ובאמצעות תוכנת המיקרוסקופ, ודא שתעלות FITC (GFP) ו-A594 (TexRed/mCherry) (אופציונלי, ערוץ DAPI עבור Hoechst 33342) נבחרו המתאימים לשני החלבונים הפלואורסצנטיים במערכת FUCCI(CA)5. השתמש בהגדרות חשיפה נמוכה (בדרך כלל <0.05 שניות) כדי למנוע נזק לתמונה בקיטועי זמן ארוכים.
  4. מטב את המיקוד והאיכות של התמונה על ידי צילום תמונות מבחן לפני תחילת קיטועי הזמן.
    הערה: הקרינה צריכה להיות בהירה רק לפי הצורך להדמיית צבע.
  5. תכנת את זמן-lapse כדי ללכוד 3 - 6 נקודות מבט כל 10 דקות למשך 24 שעות כדי להשיג נפח גבוה של נתוני מחזור תא לכל זמן-lapse תוך הפחתת נזק לצילום.
    הערה: משך הזמן עשוי להשתנות בהתאם לציר הזמן של הפעילות התאית.
  6. ודא שהמיקוד האוטומטי מופעל עבור ערוץ A594 לקבלת התוצאות הטובות ביותר במעקב אחר תרבית התאים במהלך קיטועי הזמן.
  7. השאר את התוכנה במצב המתנה עד לביצוע אלקטרופורציה. לאחר מסירת הדופק, הפעל מיד את קיטועי הזמן כדי להבטיח את דיוק הנתונים הגבוה ביותר האפשרי.

3. אלקטרופורציה

  1. הנח את תא הציטומטריה של האלקטרופורציה במיקרוסקופ עם תא סביבתי מתאים. לפני האלקטרופורציה, השאר את התא סגור כשהמערכת הסביבתית פועלת כדי להבטיח שמחזור התא לא יושפע.
  2. חבר מולטימטר דיגיטלי למחולל הדופק וחבר את מחולל הדופק לאלקטרודות התא באמצעות כבלי קליפ תנין על ידי פתיחת התא הסביבתי.
  3. טען את הקבל בגנרטור הדופק ל -180 וולט ושחרר במהירות את הדופק לתא עד שהמולטימטר הדיגיטלי קורא 0 וולט.
  4. הסר את החיבורים החשמליים לתא והחלף את המכסה במהירות האפשרית כדי להבטיח תנאי תרבות נאותים.
  5. הפעל מיד את זמן-lapse ברגע שהמערכת הסביבתית של המיקרוסקופ נמצאת במקומה.

4. רכישת נתונים בזמן-lapse

  1. לאחר השלמת ה-Time-lapse, השתמש בתוכנת המיקרוסקופ כדי לשמור את ה-Time-lapse כסרטון יחיד על סמך התמונות שצולמו לאורך ה-Time-lapse. שפר את איכות הראייה בשלב זה כדי לסייע בכימות ידני.
    הערה: ניתן לבחור כל קצב פריימים; עם זאת, 6 פריימים לשנייה מספקים מהירות הפעלה חוזרת מתונה עם שנייה אחת של וידאו וכתוצאה מכך שעה אחת של זמן אמת.
  2. לאחר הכנת סרטון ה-Time-lapse, עקוב אחר שלבי התא לאורך זמן על ידי התבוננות בשינויים באותות FITC ו-A594

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות מערכת FUCCI (איור 2), נתוני מחזור תא חזותי התקבלו על ידי מדידת משך הזמן שבו כל צבע התבטא על ידי התא כתוצאה מביטוי חלבון וביטול ביקוויטינציה. בהתבסס על תוצאות הניסויים הלא מסונכרנים והמסונכרנים (איור 3), היה ברור כי חשיפה ל-PEF בשלב S מווסתת את מחזור התא. עדות לכך הייתה הירידה באורך הפאזה הממוצע, מה שמעיד על מחזור תאים מהיר יותר. יתר על כן, הוא גם הדגים את ההשפעה ארוכת הטווח של תימידין על מחזור התא. נתוני הבקרה עבור האוכלוסייה המסונכרנת הראו מחזור תאים ממ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר מבוצעים כהלכה, ניתן לכמת נתוני פאזה של מחזור התא עבור נפחים גבוהים של תאים בודדים לתקופות של עד 24 שעות. פרוטוקול זה הניב נתוני מחזור תא דומים לשיטות חלופיות כגון FAC. זוהי שיטה נפוצה לפיה תאים מסומנים באופן פלואורסצנטי ככל שהם מתקדמים במחזור התא. לאחר דגירה של 24 שעות לפחות, הם ממוינים לפי עוצמת פלואורסצנט, בקורלציה לכמות האוכלוסייה בשלב8 מסוים. מחקר קודם שהשתמש בשיטה זו הראה שתאי U2 OS מבצעים את מחזור התא שלהם תוך כ-23-24 שעות9. זה ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו רוצים להודות גם למעבדת Gupta וגם לחברי קבוצת Rackus על תמיכתם המתמשכת במעבדה ומחוצה לה. מימון מענקים ניתן בנדיבות באמצעות שותפות עם Mitacs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שקופית קאמרית (מודפסת/מוערכת בתלת מימד) N/AN/A
צלחת תרבית (10 ס"מ)Sarstedt83.3902
Delta VisionOlympusN/Aניתן להשתמש גם במודלים של מיקרוסקופים חלופיים. ודא שה-stage והמערכת הסביבתית יכולים להכיל את תא האלקטרופורציה (55 מ"מ x 
DMEM – סרוםג'יבקו11965092
 תרמו-פישרA5256701 
מדפסת תלת מימד i3 MK3SPrusaN/Aניתן להשתמש בדגמי מדפסות חלופיים שיכולים להשתמש בקבצי STL. 
Pen StrepThermoFisher15070063
פוספט חוצץמלח Gibco10010031
tFUCCI(CA)5Addgene153521
TrypsinSigma-Aldrich9002-07-07
U2-OS קו תאיםATCCHTB-96
בקר עוברי עם גלוקוז גבוה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  2. Kandušer, M., Miklavčič, D. Electroporation in biological cell and tissue: An overview. Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials. Food Engineering Series. , Springer. New York. (2009).
  3. Cemazar, M., Sersa, G. Recent advances in electrochemotherapy. Bioelectricity. 1 (4), 204-213 (2019).
  4. Iyengar, S. K., Iyengar, S., Srivathsan, K. The promise of pulsed field ablation and the challenges ahead. Front Cardiovasc Med. 10, 1235317(2023).
  5. Miklavčič, D., Mali, B., Kos, B., Heller, H., Serša, H. Electrochemotherapy: From the drawing board into medical practice. Biomed Eng Online. 13 (1), 29(2014).
  6. Ando, R., Sakaue-Sawano, A., Shoda, K., Miyawaki, A. Two coral fluorescent proteins of distinct colors for sharp visualization of cell-cycle progression. Cell Struct Funct. 48 (2), 132-144 (2023).
  7. Nesmith, T., Vieira, C., Rackus, D., Gupta, G. An electroporation cytometry system for long-term, live cell cycle analysis. Biomicrofluidics. 18 (4), 044105(2024).
  8. Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence. Science. 166 (3906), 747-749 (1969).
  9. Chao, H. X., et al. Evidence that the human cell cycle is a series of uncoupled, memoryless phases. Mol Sys Bio. 15 (3), e8604(2019).
  10. Diehl, F. F., Sapp, K. M., Vander Heiden, M. G. The bidirectional relationship between metabolism and cell cycle control. Trends Cell Bio. 34 (2), 136-149 (2024).
  11. Rems, L., et al. Cell electrofusion using nanosecond electric pulses. Sci Rep. 3, 3382(2013).
  12. Klein, S. G., et al. Toward best practices for controlling mammalian cell culture environments. Front Cell Dev Bio. 10, 788808(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

U2 OSlapsed timeFUCCIS

מאמרים קשורים