Method Article

ויסות כימוגנטי בתאי קודמן שמקורם בתאי גזע מתוכנתים מחדש בטיפול במחלות נוירודגנרטיביות

DOI:

10.3791/68032

⸱

May 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Cell Therapy Center, Beijing Municipal Geriatric Medical Research Center, Xuanwu Hospital Capital Medical University, 2National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, and Key Laboratory of Neurodegenerative Diseases, Ministry of Education, 3The Department of Neurology, Xuanwu Hospital Capital Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להנדסת תאי גזע שתוכנתו מחדש כימית כדי להשיג אפנון עצבי מדויק על ידי התמיינות תאים אלה לתאים קודמים דופמינרגיים, השתלתם במודלים של עכברים של מחלת פרקינסון, והערכת תוצאות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות כדי לאשר את האינטגרציה המוצלחת והיעילות התפקודית של התאים המושתלים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השילוב של קולטנים מעוצבים המופעלים באופן בלעדי על ידי תרופות מעצבים (DREADD) עם טיפולים מבוססי תאי גזע מציג אסטרטגיה מתקדמת לאפנון עצבי מדויק. כאן, השתמשנו בתאי גזע אנושיים מתוכנתים מחדש על ידי CRISPR המבטאים קולטני DREADD מעוררים (hM3Dq) או מעכבים (hM4Di) כדי להעריך את האינטגרציה והאפנון התפקודי של קודמנים דופמינרגיים מושתלים במודל עכברי של מחלת פרקינסון (PD). השלבים העיקריים כללו יצירת קווי תאי גזע המבטאים DREADD שאינם היתוך, התמיינות שלהם לקודמנים דופמינרגיים במוח האמצעי, והשתלת תאים אלה בסטריאטום של עכברים נגועים 6-הידרוקסידופמין (6-OHDA). ביצענו הערכות התנהגותיות והקלטות אלקטרופיזיולוגיות כדי לנתח את ההשפעות של התאים המושתלים. בדיקות התנהגותיות, כגון מבחן הצילינדר, הראו אפנון משמעותי של התפקוד המוטורי לאחר מתן קלוזפין-N-אוקסיד (CNO). באופן ספציפי, הפעלת hM4Di הפחיתה את תנועת הגפיים הקדמיות הנגדיות, בעוד שהפעלת hM3Dq הייתה קשורה להתנהגות מוטורית משופרת. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות חשפו תגובות סינפטיות מובהקות. הפעלת hM4Di הגדילה את המרווחים הבין-אירועים והפחיתה את אמפליטודות השיא של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים ספונטניים (sEPSCs), בעוד שהפעלת hM3Dq הפחיתה את המרווחים הבין-אירועים והגדילה את אמפליטודות השיא, מה שמשקף איתות מעורר משופר. לסיכום, השילוב של הערכות התנהגותיות ואלקטרופיזיולוגיות מאמת את השילוב התפקודי המדויק של תאי גזע מתוכנתים מחדש כימית במעגלים עצביים מארחים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קולטנים מעצבים המופעלים באופן בלעדי על ידי תרופות מעצבים (DREADD) הם קולטנים מצומדים לחלבון G מהונדסים הניתנים להפעלה סלקטיבית על ידי ליגנדים סינתטיים אינרטייםאחרת 1. הגישה הכימוגנטית הפכה לכלי חיוני במדעי המוח בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לחקור קישוריות של מעגלים עצביים בדיוק גבוה ולשפר את ההבנה שלנו לגבי תפקודים תאיים הן in vivo והן in vitro באמצעות הפעלה או עיכוב סלקטיביים של אזורי מוח ספציפיים או סוגי תאים 2,3.

טיפול מבוסס תאי גזע מציג אסטרטגיה מבטיחה לטיפול במחלות ניווניות. יעילותם של תאי השתל מסתמכת על אינטגרציה נכונה, הישרדות ותרומה תפקודית לרקמות המארח. פעילות תאית בלתי מבוקרת עלולה להוביל לתוצאות שליליות, כולל גידול4; מה שמחייב בקרה מדויקת על תאים אלה לאחר ההשתלה. מינוף טכנולוגיית DREADD בתאי גזע אנושיים מתוכנתים מחדש ונוירונים נגזרים מספק אמצעי לשליטה מדויקת בפעילות העצבית באמצעות מתן תרופת המעצב CNO 2,5. בהקשר של מחלת פרקינסון (PD), המאופיינת באובדן נוירונים דופמינרגיים, מניפולציה של פעילותם של נוירונים דופמינרגיים שמקורם בתאי גזע היא חיונית לחקירת התשומות הסינפטיות ודפוסי ההקרנה שלהם במודלים של מכרסמים 6,7,8,9,10. שילוב קולטני hM3Dq מעוררים ומעכבי hM4Di במודלים אלה מאפשר אפנון מדויק של הפעילות העצבית11,12.

השילוב של הערכות התנהגותיות של בעלי חיים ורישומים אלקטרופיזיולוגיים מאפשר הערכה מקיפה של ההשפעות של אפנון כימוגנטי על תאים מושתלים in vivo13. הערכות התנהגותיות, כולל סיבוב המושרה על ידי אפומורפין, מבחן הצילינדר ומבחן הרוטרוד, מעריכות את הקואורדינציה המוטורית ומספקות תובנות לגבי שינויים בתפקוד המוטורי הקשורים למודלים ניסיוניים של PD14. טכניקות אלקטרופיזיולוגיות, כגון הקלטות מהדק טלאי, מאפשרות ניטור בזמן אמת של תגובות סינפטיות ופוטנציאל פעולה, ומספקות מבט מקיף על האופן שבו תאים מושתלים משתלבים ברשתות עצביות קיימות15. על ידי שילוב הערכות התנהגותיות עם הערכות אלקטרופיזיולוגיות, אנו יכולים לחקור כיצד אפנון כימוגנטי משפיע על האינטגרציה והפונקציונליות של תאים אלה בתוך מעגלים עצביים מארחים16. ממצאים ראשוניים מצביעים על כך שמתן CNO מווסת ביעילות את הפעילות העצבית בתאים מושתלים, וכתוצאה מכך תוצאות תפקודיות משופרות במודלים של בעלי חיים.

בפרוטוקול זה, תאי גזע אנושיים שתוכנתו מחדש הונדסו לבטא קולטני hM3Dq או hM4Di על ידי שימוש בטכנולוגיית CRISPR. לאחר התמיינות תאי גזע שתוכנתו מחדש לתאי קודמן דופמינרגיים במוח האמצעי, תאים אלה הושתלו במודלים של עכברים של מחלת פרקינסון כדי להעריך את האינטגרציה והוויסות התפקודי שלהם במעגלים העצביים של המארח באמצעות הערכות התנהגותיות ורישומים אלקטרופיזיולוגיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי אגודת בייג'ינג למדעי חיות מעבדה והמכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. תאים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי (PBMCs) התקבלו מתורם בריא עם הסכמה מדעת בכתב כמתואר במחקר קודם17.

1. בניית קווי תאים מבוססי גזע DREADD ללא היתוך

  1. בנה את הפלסמיד התורם DREADD.
    הערה: יש לתכנן את אתרי העיכול בהתאם לרצף הווקטור. יש לסנתז ולהגביר את השברים עם חפיפות של 20-30 bp התואמות את זרועות השבר כדי לשפר את יעילות ההרכבה.
    1. תכנן וסינתז את שבר T2A-ZsGreen (שבר I).
    2. הגביר את שבר hM3Dq/hM4Di-T2A מהפלסמיד המקורי באמצעות PCR (שבר II). הגדר את תגובת ה-PCR (נפח כולל של 50 מיקרוליטר) כך שתכיל 1x מאגר PCR, 200 מיקרומטר מכל תערובת dNTP, 0.5 מיקרומטר פריימרים קדימה ואחורה, 10-50 ננוגרם של תבנית DNA פלסמיד ו-1.25 U של DNA פולימראז בנאמנות גבוהה. בצע רכיבה תרמית בתנאים הבאים: דנטורציה ראשונית ב-98 מעלות צלזיוס למשך 2.75 דקות כדי לנטרל את התבנית במלואה; 32 מחזורי הגברה המורכבים מ-98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות (דנטורציה), 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (חישול פריימר) ו-72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות (הארכה); הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
    3. עכל את הפלסמיד הווקטורי עם האנזים המתאים כדי להשיג את הווקטור הליניארי. טהר את כל השברים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז וכימת אותם באמצעות ספקטרופוטומטר.
      הערה: כאן, הפלסמיד המקורי עוכל עם MluI ו-SalI.
  2. מערבבים בעדינות 50-100 ננוגרם של הווקטור הליניארי, שבר I ושבר II ביחס מולארי של 1:3:3, יחד עם תערובת שיבוט פי 2. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להקל על רקומבינציה הומולוגית באמצעות מכלול גיבסון.
  3. הכנס את ה-RNA המנחה המכוון לאתר AAVS1 לאתר BbsI של וקטור pX458.
    הערה: בצע אימות רצף על כל הפלסמידים הבנויים באמצעות ריצוף Sanger.
  4. שמור על תאי הגזע המתוכנתים מחדש במדיה, במטרה להגיע לצפיפות תאים של 2-5 ×-106 תאים/מ"ל.
    הערה: תאי הגזע שתוכנתו מחדש ושימשו כאן הושרו מ-PBMCs אנושיים כמתואר במחקר קודם17. ניטור בריאות התא הוא חיוני, מכיוון שמצב התא משפיע באופן משמעותי על יעילות האלקטרופורציה. ראה טבלת חומרים להשוואה בין המדיה.
  5. מערבבים 2-5 × 106 תאים, 2 מיקרוגרם מכל פלסמיד תורם (hM4Di-T2A-ZsGreen או hM3Dq-T2A-ZsGreen), ו-2 מיקרוגרם של פלסמיד gRNA ב-100 מיקרוליטר של מאגר אלקטרופורציה ומעבירים לקובט לאלקטרופורציה.
    הערה: ודא שהתערובת מעורבבת היטב וללא בועות לפני שתמשיך לאלקטרופורציה. אופטימיזציה של פרמטרי אלקטרופורציה על סמך סוג התא כדי למקסם את יעילות הטרנספקציה, מכיוון שהתקנים שונים עשויים לדרוש התאמות ספציפיות.
  6. הגדר את ה-Nucleofector לתוכנית B16 והתחל אלקטרופורציה כדי להקל על העברה יעילה של iNSCs המטרה.
  7. הוסף 1 מ"ל של 50 מיקרוגרם/מ"ל פולי-D-ליזין (PDL) לכל באר של צלחת בת 6 בארות ודגר בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות. הסר את כל ה-PDL מהבארות והוסף 1.5 מ"ל של למינין של 5 מיקרוגרם/מ"ל לכל באר ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-4 שעות. השתמש מיד בצלחת המצופה או אחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס למשך שבוע.
  8. העבירו את התאים האלקטרופורטיים לצלחות בנות שש בארות שצופו ב-PDL ולמינין. מחלקים כ -500,000 תאים לבאר בנפח של 2 מ"ל מדיום תרבית לבאר.
  9. לאחר 72 שעות של אלקטרופורציה, השתמש בציטומטר זרימה כדי למיין תאים חיוביים פלואורסצנטיים.
    1. השעו מחדש תאים מנותקים ב-DPBS, וסננו דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר.
    2. הגדר את הממיין עם ערוץ FITC לזיהוי ZsGreen. כלול iNSCs לא מטופלים כבקרות שליליות כדי להגדיר את הקרינה הבסיסית.
    3. כייל את המכשיר באמצעות חרירי 100 מיקרומטר בלחץ נדן של 20 psi. יישם מצב מיון טוהר לארבעה כיוונים עם אישור תא יחיד.
  10. צלחו תאי ZsGreen+ בודדים בצלחות של 96 בארות מצופות מראש ב-PDL ולמינין, והוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל באר כדי לתמוך בצמיחה הראשונית. יש לשמור בתרבית בינונית למשך 7-14 ימים
    הערה: עקוב אחר בארות מדי יום לאיתור סימני צמיחה ופלואורסצנטיות המעידים על אינטגרציה מוצלחת וסמן את הבאר החיובית.
  11. בודד שיבוטים בודדים המציגים פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד בסט מסנני GFP. שיבוטי מסך בהגדלה של פי 10. סמן בארות המכילות מושבות חד-שבטיות עם אות ZsGreen מתמשך ואחיד. צלם תמונות של שדה בהיר ופלואורסצנטי כדי לתעד מורפולוגיה ועוצמת הקרינה.
    הערה: לפני ההדמיה, החלף מדיום טרי כדי להפחית את הקרינה ברקע. אל תכלול מושבות עם מורפולוגיה לא סדירה או אוטופלואורסצנטיות.
  12. הרחב את התאים החיוביים על צלחות מצופות של 48 בארות. לאחר מכן התפצל לשני חלקים, האחד לתרבית והשני לגנוטיפ.
  13. חלץ DNA גנומי משיבוטים מועמדים. הכן תגובות PCR עם שני זוגות פריימרים: זוג אחד לאישור החדרת הגן המעניין, הפריימר השני להבחנה בין שיבוטים הומוזיגוטיים והטרוזיגוטים. בצע רכיבה תרמית בתנאים הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 38 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות; הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. יש לפתור את מוצרי ה-PCR על ג'ל אגרוז 2%.
    הערה: ראה טבלת חומרים עבור הפריימרים. אשר את החדרת הגן המעניין על ידי פס יחיד של 650 bp (פריימר 1). זהה שיבוטים הטרוזיגוטיים על ידי נוכחות של פס יחיד של 630 bp ושיבוטים הומוזיגוטיים על ידי היעדר פס זה (פריימר 2).
  14. הרחב את התאים החיוביים על צלחות מצופות של שש בארות.
  15. עכל את התאים ושטוף אותם במי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) על ידי צנטריפוגה בחום של 250 × גרם למשך 3 דקות. הקפיאו את התאים במדיום שימור בהקפאה עם 10% DMSO בצפיפות של 2.5 × 106 תאים לבקבוקון.

2. השתלת תאי מבשר שמקורם בתאי גזע DREADD בעכברים מדגם PD

  1. יש לתת זריקה תוך-צפקית של דזיפרמין בריכוז של 5 מ"ג/מ"ל (10 מ"ג/ק"ג) לעכברים מדוכאי חיסון 30 דקות לפני הניתוח. להרדים את העכברים עם 2% איזופלורן.
  2. בצע זריקות סטריאוטקסיות חד צדדיות של 3 מיקרוליטר של 6-הידרוקסידופמין (6-OHDA, 5 מיקרוגרם/מיקרוליטר). כוון את הקורפוס סטריאטום הימני באמצעות הקואורדינטות הבאות: אנטרופוסטריור = 0.5 מ"מ, לרוחב = 2.1 מ"מ ואנכי = -3.2 מ"מ.
    הערה: יש להמיס 6-OHDA במי מלח המכילים 0.2% חומצה אסקורבית. הקפידו על מיקוד מדויק כדי למזער את השונות בחומרת הנגע.
    אזהרה: 6-OHDA הוא ציטוטוקסי ומייצר מיני חמצן תגובתיים הגורמים ללחץ תאי. טפל בזהירות.
  3. יש לתת זריקה תוך-צפקית של אפומורפין (1 מ"ג/ק"ג, 0.5 מ"ג/מ"ל מומס במי מלח) כדי לאמת את הנגעים 4 שבועות לאחר הניתוח. בחר עכברים נגועים המציגים יותר מ-100 סיבובים נגדיים בתוך תקופת תצפית של 30 דקות לניסויים הבאים.
    הערה: אפומורפין הוא אגוניסט לקולטן דופמין, המפעיל ישירות קולטנים פוסט-סינפטיים סופר-רגישים בסטריאטום המנותק, ומפר את פעילות המעגל הניגרוסטריאטלי הדו-צדדי. סיבוב המושרה על ידי אפומורפין משמש להערכת חומרת הנגעים הדופמינרגיים החד-צדדיים על ידי 6-OHDA.
  4. תאי זרע ותרבית בצלחות מצופות של שש בארות (150,000 תאים לבאר). דגירה במדיום התמיינות שלב 1 למשך 10 ימים, רענון המדיום כל יומיים. ביום ה-11, עברו למדיום ההתמיינות של שלב 2 והמשיכו בדגירה עד היום ה-13, והחליפו את המדיום בכל יום.
    הערה: ראה טבלת חומרים להשוואה בין מדיום התמיינות.
  5. קצרו את התאים בימים 10 ו-13 של התמיינות, ואז ערבבו אותם ביחס של 1:7. השעו את התערובת במאגר ההשתלה בריכוז של 100,000 תאים/מיקרוליטר.
    הערה: ראה טבלת חומרים להשוואה של מאגר השתלה.
  6. לתת הזרקה סטריאוטקסית בנפח כולל של 4 מיקרוליטר של תרחיף התאים המוכן לעכבר PD.
  7. בצע את בדיקת הצילינדר בנקודות זמן שונות לאחר השתלת התאים. הניחו זכוכית (קוטר: 20 ס"מ, גובה: 30 ס"מ) על משטח שטוח ולא מחזיר אור. מקם מצלמה בתצוגה עליונה מעל הגליל כדי ללכוד את הקוטר המלא.
    הערה: סגור את הצילינדר בווילונות שחורים כדי למנוע גירויים חזותיים חיצוניים.
  8. הנח כל עכבר במרכז הגליל והתחל הקלטת וידאו בו זמנית (3 דקות למפגש). לאחר ההפעלה, החזר את העכבר לכלוב הביתי שלו.
    הערה: אקלום עכברים לחדר הבדיקה למשך 30 דקות בתנאי תאורה. נקה את הצילינדר עם 70% אתנול בין הניסויים כדי למנוע סימני ריח.
  9. העריכו את יכולת התנועה של הגפיים העליונות של העכברים למשך 3 דקות. חשב את מספר מגעי הקיר שנוצרו על ידי הגפה הקדמית הפגומה ביחס למספר הכולל של המגעים שנוצרו על ידי שתי הגפיים הקדמיות.
  10. יש לתת מי מלח או CNO במינון של 1.2 מ"ג/ק"ג באמצעות הזרקה תוך צפקית. בצע את בדיקת הצילינדר כדי להעריך אפנון התנהגותי במודל עכבר PD לאחר מתן CNO
    הערה: אפשר תקופת התאוששות של כ-40 דקות לפני שתמשיך בהערכה.

3. פרופיל אלקטרופיזיולוגי in vivo של תאים מווסתים כימוגנטית

  1. להרדים עכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 250 מ"ג/ק"ג פנטוברביטל. חלצו את המוח והניחו אותו מיד בנוזל מוחי שדרתי מלאכותי על בסיס סוכרוז קר כקרח (s-ACSF) כדי לשמור על שלמות התאים. בעזרת ויברטום, חתכו את המוח למקטעים בעובי של 300-400 מיקרומטר.
    הערה: עבדו במהירות כדי לשמור על המוח בטמפרטורות נמוכות כדי לשמר את תפקוד התאים. ראה טבלת חומרים עבור s-ACSF המשמש להכנת חתך מוח טרי.
  2. העבירו את הדגימות לתא מלא ב-ACSF מאוזן עם 95% O2 ו-5% CO2 ב-34 מעלות צלזיוס, והבטיחו שטמפרטורה זו נשמרת לאורך כל הניסוי.
    הערה: ראה טבלת חומרים עבור ACSF.
  3. טען פיפטות זכוכית עם תמיסה תוך-תאית קרה, עם התנגדות אלקטרודה הנעה בין 7 ל-10 MΩ.
    הערה: ראה טבלת חומרים לתמיסה תוך-תאית. פיפטות זכוכית מיוצרות מנימי זכוכית על ידי מושך מיקרופיפטה18. בדוק אם יש נזילות בפיפטות הזכוכית לפני תחילת הניסויים, וודא שהקצוות חדים מספיק כדי לחדור לקרום התא. הכן פיפטות במהירות כדי למזער את תנודות הטמפרטורה בתמיסה התוך תאית.
  4. הרכיבו פרוסות בתא הקלטה שקוע (2 מ"ל/דקה) עם ACSF מחומצן ב-34 מעלות צלזיוס. מקם פיפטות באמצעות מיקרומניפולטורים ממונעים תחת מיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות אינפרא אדום. ביסוס תצורת תא שלם על ידי הפעלת יניקה עדינה (התנגדות > 1 GΩ) על נוירונים טלאים בתוך אזורי השתל. תאי מהדק ב -70 mV באמצעות מגבר מהדק תיקון; רכשו רכיבי sEPSC בסיסיים למשך 8 דקות בקצב דגימה של 10 kHz (מסוננים ב-2 kHz), וניטור רציף של התנגדות הגישה (יעד: <20 MΩ; השליכו אם >25 MΩ או תנודות >10%).
    הערה: השתמש בלחץ מתאים בעת הפעלת יניקה כדי למנוע תזוזה או קרע לא רצויים של תאים, והתאם בזהירות את מיקום הפיפטה כדי להשיג אטימה טובה. אם איכות האיטום ירודה, השליכו את הפיפטה ונסו שוב.
  5. הוסף 50 מיקרומטר CNO לתא ההקלטה מיד לאחר השלמת המדידה הבסיסית והמשך להקליט נתונים למשך 16 דקות נוספות תוך התבוננות בשינויים בתדר או במשרעת sEPSC.
  6. בצע הליך שטיפה על ידי החלפת תמיסת CNO ב-ACSF טרי כדי להסיר ביעילות CNO מתא ההקלטה. המשך לרשום נתונים להמשך הניסוי כדי להעריך כל התאוששות בפעילות הסינפטית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מציג את השלבים העיקריים של גישה מתודולוגית זו עבור תאי גזע אנושיים מתוכנתים מחדש המבטאים קולטני DREADD מעוררים (hM3Dq) או מעכבים (hM4Di) כדי להעריך את האינטגרציה התפקודית והאפנון של קודמנים דופמינרגיים נגזרים במודל עכבר של מחלת פרקינסון (PD). איור 2 מתאר את אסטרטגיית הדפיקה הגנטית בתיווך CRISPR/Cas9 להכנסת מבנים שאינם היתוך של hM4Di-T2A-ZsGreen ו-hM3Dq-T2A-ZsGreen לתאי גזע מתוכנתים מחדש ומאומתים על ידי גנוטיפ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה השתמש בטכנולוגיית CRISPR כדי להנדס תאי גזע אנושיים שתוכנתו מחדש כדי לבטא קולטני hM3Dq מעוררים ומעכבי hM4Di. אפנון הפעילות העצבית על ידי CNO הוערך באמצעות השתלת תאים במודלים עכבריים של מחלת פרקינסון, בליווי הערכות התנהגותיות ורישומים אלקטרופיזיולוגיים.

הצעד הקריטי הראשון ביצירת מבני DREADD המתבטאים ביציבות ולא היתוך בתאי גזע מתוכנתים מחדש כימוגנטית כרוך בקלטת הביסיסטרונית T2A-ZsGreen. עם זאת, פלסמידים המבטאים חלבון היתוך, כגון hM3Dq-mCherry ו-hM4Di-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של בייג'ינג (7242068), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82171250), קרן ועדת הבריאות העירונית של בייג'ינג (PXM2020_026283_000005) והפרויקט לפיתוח טכנולוגיה של מכוני מחקר רפואיים המסונפים לבייג'ינג (11000023T000002036310).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2 x Rapid Taq Master MixVazymeP222-01המשמש לניתוח גנוטיפ
פעמיים; תערובת שיבוט חלקהBiomed Gene Tech.CL117-01המשמש לבניית פלסמיד
6-OHDASigma-AldrichH4381המשמש להקמת עכברי PD דגם
AAVS1-Pur-CAG-EGFPAddgene80945המשמש כבקרה 
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherryAddgene80947פלסמיד מקורי לבניית hM4Di-T2A-ZsGreen
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherryAddgene80948פלסמיד מקורי לבניית hM3Dq-T2A-ZsGreen
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreenN/AN/Aפלסמיד תורם בנוי המבוסס על #80947
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreenN/AN/Aפלסמיד תורם בנוי המבוסס על #80948
AccutaseInvitrogenA11105-01המשמש לעיכול תאים
AMAXA NucleofectorLonzaAAD-1001S
ApomorphineSigma-AldrichA4393
נוזל מוחי שדרה מלאכותי (ACSF)N/AN/A125 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl<תת>2, 1.25 מ"מ NaH2PO4, 1 mM MgSO4, 25 mM גלוקוז, ו  26 מ"מ NaHCO3
Ascorbic חומצהסיגמא-אולדריץ1043003 B-27
תוסףתזונה Gibco17504044
BDNFPeprotech450-02
cAMPSigma-AldrichD0627
CHIR99021Yeasen53003ES10
Clozapine-N-oxideEnzoBML-NS105
DAPTסיגמא-אולדריץ'D5942
דזיפרמין סיגמא-אולדריץ'D3900
D-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G5767
DMEM/F12Gibco11330-032
DMEM/F12Gibco11320-033
DMSOסיגמא-אולדריץ'D2650
FGF8פפרוטק100-25
GDNFפפרוטק450-10
גלוטה-מקסגיבקו35050-061
האנק s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS)Gibco14175095
גורם מעכב לוקמיה אנושית (hrLIF)MilliporeLIF1010
נוזל תוך תאי קרN/AN/A130 מ"מ K-גלוקונט, 16 מ"מ KCl, 0.2 מ"מ EGTA, 2 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ HEPES, 4 מ"מ Na2-ATP, 0.4 מ"מ Na3-GTP, 0.3% של נוירוביוטין
החלפת סרום נוקאאוטGibco10828028
LamininRoche11243217001
Micropipette PullerSutter Instrument CompanyP-1000
N-2 תוסףThermo Fisher17502048
Neurobasal-A בינוניGibco10888-022
אמינו לא חיוני חומצות (NEAA)Gibco11140-050
PBSGibco10010023
pCLAMP 11 חבילת תוכנההתקנים מולקולרייםN/APatch-clamp אלקטרופיזיולוגיה תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים
1 מדיום התמיינותN/AN/A96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% תוסף B-27, 1% תוסף N-2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 ומיקרו; M SAG1 ו-100 ננוגרם/מ"ל FGF8 
מדיום התמיינות שלב 2 N/A96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% תוסף B-27, 1% תוסף N-2, 1% NEAA ו-1% GlutaMax, 10 ננוגרם/מ"ל BDNF, 10 ננוגרם/מ"ל GDNF, 1 ננוגרם/מ"ל TGF-ובטא; III, 10 ומיקרו; M DAPT, 0.2 מ"מ חומצה אסקורבית ו-0.5 מ"מ cAMP.
פולי-D-ליזין הידרוברומיד (PDL)Sigma-AldrichP7886
פריימרים לגנוטיפN/AN/Aהחדרה קדימה: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT;
היפוך הכנסה: CCTGTGGGAGAAGAGAAGAGGT;
הומוזיגוטיות Foward:CGTCTCTCTGGCTTTAGCCA; הומוזיגוטיות הפוכה: GATCCTCTCTCTCTCTCTCCATCCATCG
pX458Addgene152199
SAG1EnzoALX-270-426-M01
SB431542Yeasen53004ES50
נוזל מוחי שדרה מלאכותי מבוסס סוכרוז (s-ACSF)234 מ"מ סוכרוז, 2.5 מ"מ KCl, 26 מ"מ NaHCO3, 1.25 מ"מ NaH2PO4, 11 מ"מ דגלוקוז, 0.5 מ"מ CaCl2 ו-10 מ"מ
תרבית תאי גזע MgSO4 מדיהN/AN/A  48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) ו-48% נוירו-בזאלי, בתוספת של 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ננוגרם/מ"ל hrLIF, 2 ומיקרו; M SB431542, ו-3 ומיקרו; M CHIR99021
TGF-ובטא; IIIPeprotech100-36E
מאגר השתלהN/A N/AHBSS עם 5 גרם/ליטר D-גלוקוז, 100 ננוגרם/מ"ל BDNF, 100 ננוגרם/מ"ל GDNF ו-0.2 מ"מ חומצה אסקורבית
VibratomeLeica VT1000 S
התקנים מולקולרייםמהדק תיקון תא שלם  MultiClamp700B
' שלב

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thiel, G. Designer receptors exclusively activated by designer drugs. , Humana Press. (2015).
  2. Roth, B. L. Dreadds for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  3. Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
  4. Chehelgerdi, M., et al. Exploring the promising potential of induced pluripotent stem cells in cancer research and therapy. Mol Cancer. 22 (1), 189(2023).
  5. Song, J., Patel, R. V., Sharif, M., Ashokan, A., Michaelides, M. Chemogenetics as a neuromodulatory approach to treating neuropsychiatric diseases and disorders. Mol Ther. 30 (3), 990-1005 (2022).
  6. Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nat Rev Neurosci. 21 (2), 103-115 (2020).
  7. Dell'anno, M. T., et al. Remote control of induced dopaminergic neurons in Parkinsonian rats. J Clin Invest. 124 (7), 3215-3229 (2014).
  8. Chen, Y., et al. Chemical control of grafted human PSC-derived neurons in a mouse model of Parkinson's disease. Cell Stem Cell. 18 (6), 817-826 (2016).
  9. Bjorklund, A., Parmar, M. Dopamine cell therapy: From cell replacement to circuitry repair. J Parkinsons Dis. 11 (S2), S159-S165 (2021).
  10. Alcacer, C., et al. Chemogenetic stimulation of striatal projection neurons modulates responses to Parkinson's disease therapy. J Clin Invest. 127 (2), 720-734 (2017).
  11. Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).
  12. Stachniak, T. J., Ghosh, A., Sternson, S. M. Chemogenetic synaptic silencing of neural circuits localizes a hypothalamus midbrain pathway for feeding behavior. Neuron. 82 (4), 797-808 (2014).
  13. Kang, H. J., Minamimoto, T., Wess, J., Roth, B. L. Chemogenetics for cell-type-specific modulation of signalling and neuronal activity. Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 93(2023).
  14. Miyanishi, K., et al. Behavioral tests predicting striatal dopamine level in a rat hemi-Parkinson's disease model. Neurochem Int. 122, 38-46 (2019).
  15. Zheng, X., et al. Human IPSC-derived midbrain organoids functionally integrate into striatum circuits and restore motor function in a mouse model of Parkinson's disease. Theranostics. 13 (8), 2673-2692 (2023).
  16. Xiong, M., et al. Human stem cell-derived neurons repair circuits and restore neural function. Cell Stem Cell. 28 (1), 112-126.e6 (2021).
  17. Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model. Theranostics. 8 (17), 4679(2018).
  18. Zhu, M., et al. Preparation of acute spinal cord slices for whole-cell patch-clamp recording in substantia gelatinosa neurons. J Vis Exp. (143), (2019).
  19. Wang, X., Han, D., Zheng, T., Ma, J., Chen, Z. Modulation of human induced neural stem cell-derived dopaminergic neurons by DREADD reveals therapeutic effects on a mouse model of Parkinson's disease. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 297(2024).
  20. Iancu, R., Mohapel, P., Brundin, P., Paul, G. Behavioral characterization of a unilateral 6-OHDA-lesion model of Parkinson's disease in mice. Behav Brain Res. 162 (1), 1-10 (2005).
  21. Surmeier, D. J., et al. The role of dopamine in modulating the structure and function of striatal circuits. Prog Brain Res. 183, 148-167 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chemogenetic RegulationReprogrammed Stem CellsDREADD ReceptorsParkinson Disease ModelDopaminergic PrecursorsCRISPR EngineeringElectrophysiological RecordingBehavioral AssessmentClozapine N OxidePatch Clamp

Related Articles