Method Article

יצירה ואפיון של אסטרוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם וחסרים ריבונוקלאופרוטאין שליח X שביר

DOI:

10.3791/68081

⸱

June 6th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Centre for High Impact Neuroscience and Translational Applications, TCG Centres for Research and Education in Science and Technology, 2Centre for Brain Development and Repair, 3National Centre for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research, 4Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לאסטרוציטים פונקציונליים ספציפיים למוח הקדמי. זה מאפשר לחקור את תפקידם של תאי גליה בפתוגנזה של הפרעות נוירו-התפתחותיות, כגון תסמונת ה-X השביר, ומודלים של הפרעות מוח אחרות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תסמונת ה-X השביר (FXS), גורם תורשתי מוביל להפרעת הספקטרום האוטיסטי ולמוגבלות שכלית, נחקרה בהרחבה באמצעות מודלים של מכרסמים. לאחרונה, נעשה שימוש גם במערכות מודל שמקורן בתאי גזע אנושיים כדי להשיג תובנות מכניסטיות לגבי הפתופיזיולוגיה של FXS. עם זאת, מחקרים אלה התמקדו כמעט אך ורק בנוירונים. יתר על כן, למרות הראיות ההולכות וגדלות לתפקיד מפתח של גליה בתפקוד עצבי בבריאות ובמחלות, מעט ידוע על האופן שבו אסטרוציטים אנושיים מושפעים מ-FXS.

לכן, במחקר זה, פיתחנו בהצלחה פרוטוקול הלוכד אבני דרך מרחביות-זמניות מרכזיות בהתפתחות המוח ומיישר קו גם עם תהליך הגליוגנזה. יחד זה מציע מסגרת שימושית לחקר הפרעות נוירו-התפתחותיות. ראשית, עיצבנו את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לשושלת הנוירו-אקטודרמלית עם מדכא כפול של אמהות כנגד עיכוב דקפנטפלגי (SMAD) ומולקולות קטנות. לאחר מכן, השתמשנו בגורמי גדילה וציטוקינים ספציפיים כדי ליצור תאי אב אסטרוציטים שמקורם בחולה (CTRL) ו-FXS. טיפול ב-APCs עם גורם נוירוטרופי רירי, ציטוקין מבדיל, מווסת והניע את תאי האב לקראת התבגרות אסטרוציטית, והניב אסטרוציטים המבטאים חלבון חומצי סיבי גליה ספציפי למוח הקדמי.

מצאנו כי אסטרוציטים אלה מתפקדים, כפי שמעידים תגובות הסידן שלהם ליישום ATP, והם מציגים מטבוליזם גליקוליטי ומיטוכונדריאלי לא מווסת ב-FXS. יחד, ממצאים אלה מספקים פלטפורמה ניסויית שימושית ממוצא אנושי לחקירת השלכות אוטונומיות תאיות ולא אוטונומיות של תאים של שינויים בתפקוד האסטרוציטי הנגרמים על ידי הפרעות נוירו-התפתחותיות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תסמונת X שביר (FXS), צורה תורשתית נפוצה של מוגבלות שכלית והפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD), נגרמת על ידי היעדר ריבונוקלאופרוטאין שליח X שביר (FMRP) המיוצר על ידי הגן ריבונוקלאופרוטאין שליח X שביר 1 (FMR1) (OMIM: #300624, https://www.omim.org/entry/300624). FMRP ממלא תפקיד בוויסות תרגום mRNA, היווצרות והובלה של גרגירי mRNA וויסות בתיווך microRNA של ביטוי גנים1. לפיכך, אובדן FMRP משפיע לא רק על התפתחות המוח אלא גם על תפקוד המוח של מבוגרים. גם רמות תעתיק mRNA של FMR1 וגם צביעה חיסונית עבור FMRP במוח הראו ביטוי עצבי גבוה, לצד ביטוי משמעותי גם בתאי גליה2. עם זאת, הרוב המכריע של המחקרים הקודמים במודלים של בעלי חיים של FXS התמקדו בעיקר בתאי עצב וסטיות בתפקודם. כתוצאה מכך, מעט ידוע על תפקידה של גליה ב-FXS3. באופן מסורתי נחשב לתאי "תמיכה פסיבית"4, ישנן עדויות מצטברות לכך שאסטרוציטים הם קריטיים בתיווך מגוון רחב של תפקודים עצביים 5,6, כולל קידום סינפטוגנזה7, חידוד של מעגלים עצביים מתפתחים8 ומיחזור נוירוטרנסמיטורים9. במקביל, ישנן עדויות הולכות וגדלות לתפקידם של אסטרוציטים בפתוגנזה של מחלות ומצבים נוירולוגיים רבים נקשרו לתפקוד לקוי של אסטרוציטים10.

בעוד שחלק ניכר מהעבודה המוקדמת יותר שהשתמשה במודלים של בעלי חיים של FXS התמקדה בזיהוי ואימות מטרות מולקולריות שונות בתאי עצב לטיפול ב-FXS, ממצאים פרה-קליניים אלה לא תמיד הובילו לתוצאות קליניות מוצלחות. יתר על כן, כישלונות בניסויים הקליניים האחרונים מדגישים גם את הצורך במערכות מודלים מבוססות אדם. מודלים של הפרעות נוירולוגיות המבוססים על תאי מוח שמקורם בתאי גזע אנושיים מציעים אסטרטגיה רבת עוצמה לגשר על הפער הזה בין תובנות מכניסטיות ממחקרים בבעלי חיים לבין הצלחה מוגבלת בתוצאות קליניות עבור חולים. עם זאת, רק קומץ מהמחקרים הללו התמקדו באסטרוציטים וגם זה בעיקר באסטרוציטים שמקורם בעמוד השדרה. זה, בתורו, רלוונטי לאור מחקרים המראים כי המבנה והתפקוד של אסטרוציטים משתנים בין אזורי מוח11,12. לכן, הבנה טובה יותר של שינויים שנגרמים על ידי מחלות באסטרוציטים אנושיים צריכה גם לקחת בחשבון את ההבדלים הספציפיים לאזור המוח הזה באסטרוציטים. עם זאת, מודלים של הפרעות נוירו-התפתחותיות המשתמשות באסטרוציטים שמקורם בתאי גזע אנושיים הספציפיים למוח הקדמי נותרו לא נחקרים באופן יחסי13. לפיכך, כדי להתחיל לטפל בפערים אלה, אנו מתארים פרוטוקולים ליצירת אסטרוציטים ספציפיים למוח הקדמי מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם בחולה הנושאים מוטציות FXS; יתר על כן, אנו מראים שאסטרוציטים מתפקדים ומציגים חילוף חומרים שונה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs) (טבלה 1) בוצעו לאחר קבלת אישורים רגולטוריים מוסדיים מתאימים. איור 1A מייצג פרוטוקול התמיינות מלא של hiPSCs לאסטרוציטים בוגרים ספציפיים למוח הקדמי.

1. תחזוקה והרחבה של hiPSCs

  1. יום אחד לפני ציפוי ה-iPSCs, צפו צלחת של 6 בארות במטריג'ל מדולל 1:60 (מטריצה חוץ-תאית [ECM]) ב-Modified Eagle Medium/F-12 של Ham (DMEM/F12) של Advanced Dulbecco ואחסנו בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
    הערה: הימנע מאחסון כלים מצופים מטריג'ל למשך >5 ימים בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס, מכיוון שהדבר עלול לגרום לפירוק החלבון ב-ECM לאורך זמן. כדי למנוע ייבוש של המנה, מצפים מינימום 1 מ"ל של מטריג'ל מדולל 1:60 לבאר אחת של צלחת בת 6 בארות ומורחים באופן שווה על פני המנה. אם משתמשים באותו יום, יש לשמור את הצלחת בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שעה.
  2. ביום גידול ה-hiPSCs, הסר את חומר הציפוי והוסף 1 מ"ל של מדיום Essential 8 שלם (מדיום בסיסי E8 עם תוסף Essential 8) יחד עם מעכב ROCK בריכוז סופי פי 1 ושמור את המנה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לפני הוספת ה-hiPSCs.
  3. השעו מחדש את ה-hiPSCs במדיום E8 שלם יחד עם מעכב ROCK בריכוז סופי פי 1 להיצמדות טובה יותר של המושבות.
    הערה: אין להכין כמויות גדולות של מדיום תרבית. מכינים רק 3-4 ימים לכל היותר ושומרים בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
  4. למחרת, יש לחדש את מדיום E8 המלא ללא מעכב ROCK עד שהתאים מתכנסים ב-80% (כ-4-5 ימים).
  5. כאשר הם מגיעים למפגש של 80%, נתקו את המושבות באופן אנזימטי.
    1. כדי להעביר את ה-iPSCs, הוציאו את החומר המשומש מהצלחת והוסיפו 1 מ"ל לכל באר של תערובת קולגנאז (2 מ"ג/מ"ל) מחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס) ודיספאזה (1 מ"ג/מ"ל) ביחס של 1:1 ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יותר מ-20-30 דקות כדי לאפשר למושבות ה-iPSC להתרומם.
      הערה: אין להשאיר את הכלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יותר מ-20-30 דקות; מעבר לתקופה זו, המושבות יתפרקו והתאים ימותו.
  6. כאשר המושבות מתחילות להתרומם, הוציאו את הכלים מהאינקובטור ונטרלו את פעילות האנזים על ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת מלח פוספט (DPBS) של Dulbecco.
  7. מגרדים את המושבות עם DPBS ואוספים את המתלה בצינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית רחבה של 10 מ"ל.
  8. יש לשלש בעדינות את התרחיף פי 2-3 כדי לפרק את המושבות באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, ולאפשר למושבות להתייצב.
    הערה: אל תהפוך את המושבות לתאים בודדים; זה עלול לגרום לכך שהתאים לא ייצמדו לצלחת ולגרום למוות נוסף של תאים. יתר על כן, אל תשאירו אותם כמושבות גדולות; זה יוביל למושבות מובחנות יותר בהמשך.
  9. לאחר שהמושבות מתייצבות (בערך לאחר 2 דקות), שאבו את תערובת האנזים DPBS והשאירו כ-1 מ"ל בצינור.
  10. הוסף 2 מ"ל DPBS לצינור, ערבב את המושבות על ידי הקשה ואפשר להן להתייצב. חזור על פעולה זו פעמיים כדי להסיר את כל שאריות האנזים מהמושבות. הסר כמה שיותר סופרנטנט לאחר הכביסההשנייה , השהה מחדש את המושבות ב -1 מ"ל של E8 בינוני שלם, וצלחת בכלי טרי שהוזכר בשלבים 1.2-1.3.
  11. לחלופין, שימור בהקפאה של חלק מהמושבות תוך שימוש ב-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) כתמיסה להגנה מפני הקפאה להרחבה ושימוש עתידיים.
    1. הכן מדיום שימור בהקפאה טרי על ידי ערבוב של 90% מדיום E8 שלם ו-10% DMSO כתמיסה להגנה מפני הקפאה והנח אותו בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  12. כדי לשמר בהקפאה, בצע את שלבים 1.5-1.10.
  13. במהלך שלב 1.10, לאחר הכביסההשנייה , אפשר למושבות להתיישב ולהסיר את הסופרנטנט. למושבות מוסיפים 1 מ"ל של מדיום שימור קר טרי שהוכן ומעבירים לקריוביאלים.
    הערה: לאחר הוספת אמצעי השימור בהקפאה למושבות, העבירו במהירות את התכולה לקריוביאלים. עיכוב עלול לגרום לקצב תחייה נמוך יותר מכיוון ש-DMSO הוא חומר מגן בהקפאה שעלול לפגוע בתאים.
  14. העבירו מיד את הקריוביאלים לקריובוקס ושמרו במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  15. למחרת, העבירו את כל הקריוביאלים למיכל חנקן נוזלי (מיכל LN2 ) לשימוש עתידי.
    הערה: יש לבצע קריוטיפ שגרתי של hiPSCs באמצעות פס G (איור משלים S1) עבור כל חריגה, המאופיין באמצעות אימונוציטוכימיה לפלוריפוטנטיות (איור 1B), ולבדוק מיקופלזמה.
    1. כדי לאפיין hiPSCs באמצעות אימונוציטוכימיה, יש לצלחת את המושבות על כיסויי זכוכית 13 מ"מ מצופים מטריג'ל 1:60. לאחר שהם מתכנסים ב-40%, שטפו את התאים עם PBS-T (PBS-0.1% Tween 20), התקנו עם 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות, חלחלו עם 0.3% טריטון X-100 ב-PBS למשך 10 דקות, וחסמו עם 3% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS למשך שעה אחת כדי למנוע קשירה לא ספציפית.
    2. לאחר החסימה, יש לדגור על התרביות עם נוגדנים ראשוניים למשך שעה אחת ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים עם PBS-T למשך 5 דקות כל אחת, ולאחר מכן נוגדנים משניים מתאימים (טבלת חומרים) בחושך למשך שעה.
    3. הרכיבו את הכיסויים על שקופיות זכוכית עם אמצעי הרכבה והשיגו תמונות על ידי סריקת לייזר קונפוקלית ב-405 ננומטר, 488 ננומטר, 561 ננומטר ו-633 ננומטר. צלם תמונות ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים; הגדר את גודל צעד Z ל-0.5 מיקרומטר עם יחידה אוורירית אחת בקוטר חור סיכה.

2. יצירה ואפיון של תאי אב אסטרוציטים (APCs)

  1. הרם אנזימטית את ה-hiPSCs כפי שהוזכר בשלבים 1.5-1.10 וצלח אותם על צלחת תרבית תרחיף שאינה נדבקת (100 מ"מ) עם מדיום14 מוגדר כימית המכיל 50% מדיום Dulbecco שונה של Iscove (IMDM), 50% תערובת חומרים מזינים F-12 של חזיר (F12), 5 מ"ג/מ"ל BSA, 1% תרכיז ליפידים מוגדר כימית (CD-Lipid), 450 מיקרומטר מונותיוגליצרול, 7 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 15 מיקרוגרם/מ"ל טרנספרין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין בתוספת מיטוגנים לדפוס המוח הקדמי N-אצטיל ציסטאין (1 מ"מ), LDN 193189 (0.1 מיקרומטר) ו-SB431542 (10 מיקרומטר) למשך 7 ימים.
    הערה: מעכבי מולקולות קטנות SB431542 ו-LDN-193189 (LDN) הם מעכבים של חלבון מורפוגנטי בעצם ומסלולי איתות של גורם גדילה-בטא.
    מנקודה זו ואילך, המדיום התחדש אחת ליומיים או לפי פרוטוקול שני/רביעי/שישי.
  2. הנח את תרחיף התא על שייקר אורביטלי במהירות של 40 סל"ד למשך 7 ימים בתנאים נורמוקסיים כדי לסייע בהתפתחות קורטיקוספירות (איור 1A).
  3. ביום השמיני, העבירו את הקורטיקוספרות למדיום שגשוג תאים המכיל DMEM/F12 מתקדם עם 1% אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית, 1% תוסף N2, 1% תחליף גלוטמין, 0.1% תוסף B27 ו-2.5 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) למשך 7 ימים.
  4. עורר את הכדורים למפרט גליה על ידי חשיפתם למדיום העשרת גליה המכיל DMEM/F12 מתקדם עם 1% אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית, 1% N2, 1% תחליף גלוטמין, 0.1% תוסף B27, 20 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמלי (EGF), bFGF-H (20 ננוגרם/מ"ל bFGF-5 מ"ג/מ"ל הפרין) למשך שבועיים כדי לקבל גליוספרות מוקדמות (איור 1A).
  5. להבשלה של גליוספרות מוקדמות, החלף את bFGF-H בגורם מעכב לוקמיה (LIF) של 20 ננוגרם/מ"ל ושמור על הכדורים למשך 4 שבועות.
  6. לאחר 4 שבועות במדיום ההתבגרות, שמור על הכדורים במדיום העשרת גליה לתקופות ממושכות. כדי למנוע צבירה ואובדן כדאיות, כל שבועיים, קוצצים מכנית את הגליוספירה באמצעות להב תעשייתי סטרילי ומחליפים את כל המדיום ב-DNase I כדי להסיר שברי DNA שנוצרו מהקיצוץ.
  7. לפרק את הגליוספירה לחד-שכבות של APCs באמצעות ערכת דיסוציאציה של פפאין וצלחת על צלחת דבק שטופלה בתרבית תאים עם דילול של 1:80 של ציפוי מטריג'ל.
  8. הפיצו את ה-APCs במדיום העשרת גליה עד ל-80% מתכנסים והעבירו אותם אנזימטית באמצעות מדיום ניתוק תאי האנזים (ראה טבלת החומרים).
  9. כדי לקטע:
    1. הסר את המדיה המושקעת ואסוף בצינור חרוטי. לתאים, הוסף את מדיום ניתוק תאי האנזים והמתן 1-2 דקות. ברגע שהתאים מתחילים להתנתק, הוסף את המדיה המושקעת כדי לנטרל את פעילות האנזים.
    2. אסוף את מתלה התא והצנטריפוגה ב 800 x ɡ למשך 2 דקות.
    3. שאפו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים במדיום העשרת גליה, וצלחו כ-1 x 106 תאים/באר על צלחת 6 בארות מצופה מטריג'ל 1:80.
  10. לשימור בהקפאה:
    1. השעו מחדש את התאים בתערובת קרה של 90% מדיום התפשטות קורטיקוספירה (ללא bFGF) ו-10% קריופרוטקטנט. העבר את התאים המרחפים לקריוביאלים.
    2. העבירו מיד את הקריוביאלים לקריובוקס ושמרו במקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. למחרת, העבירו את כל הקריוביאלים למיכל חנקן נוזלי (מיכל LN2 ) לשימוש עתידי.
      הערה: נגמ"שים נשמרו בהקפאה באמצעות 10% DMSO עד למעבר מספר 6.
  11. אפיינו את ה-APCs המנותקים על ידי צביעה חיסונית (כפי שהוזכר בשלבים 1.15.1-1.15.3) עם סמני וימנטין וגורם גרעיני IA (NFIA) (איור 1C,D) (ראה טבלת החומרים לדילול).
  12. כדי לאשר את הספציפיות האזורית של המוח הקדמי של APCs שמקורם ב-hiPSC, בדוק את התאים עבור סמן מוח קדמי כגון תיבת ראש מזלג אנושי G1 (hFOXG1) (חיובי) וסמן מוח אחורי כגון Homeobox B4 אנושי (hHOXB4) (שלילי) באמצעות qPCR בזמן אמת (איור 1E,F).
    הערה: רצפי הפריימר המשמשים לניסויים אלה מפורטים בטבלה משלימה S1.

3. יצירה ואפיון של אוכלוסייה הומוגנית של אסטרוציטים ספציפיים למוח הקדמי

  1. הבחנה בין אסטרוציטים לנגמ"שים
    1. השתמש במדיום התמיינות אסטרוציטי (ADM) במשך 14 יום כדי להבדיל APCs לאסטרוציטים. מדיום התמיינות אסטרוציטי מכיל נוירו-בזאלי, 1% אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית, 1% תחליף גלוטמין, 1% תוסף N2, 0.2% תוסף B27, 1% מדיום חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) ו-10 ננוגרם/מ"ל גורם נוירוטרופי ריסני (CNTF).
    2. אשר את הזהות האסטרוציטית על ידי שימוש בצביעה חיסונית (כפי שהוזכר בשלבים 1.15.1-1.15.3.) עם חלבון חומצי סיבי גליה (GFAP) וסמני ביטוי S100β (איור 2A,B).
  2. סינתזת חלבון דה נובו ב-APCs ובאסטרוציטים
    1. שמור על נגמ"שים ואסטרוציטים במוח הקדמי שמקורם ב-hiPSC על כיסויי זכוכית סטריליים 13 מ"מ שעברו חיטוי והכתים אותם כאמור בשלבים 1.15.1-1.15.3.
    2. לסינתזה של חלבון דה נובו , השתמש בשיטת תיוג חומצות אמינו פלואורסצנטיות לא קנוניות (FUNCAT), שהוסברה בקצרה בשלבים 3.2.3-3.2.6 (איור 3A).
    3. כדי להבטיח מחסור במתיונין, הסר את מצע הגידול מהתרביות והחלף במדיום נטול מתיונין וציסטאין מעורבב עם 1 מ"מ L-azidohomoalanine (AHA) למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
    4. שטפו את התרביות עם PBS-T, קבעו עם 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות, חלחלו עם 0.3% טריטון X-100 ב-PBS למשך 10 דקות, וחסמו עם 3% BSA ב-PBS למשך שעה אחת כדי למנוע קשירה לא ספציפית.
    5. דגרו את התרביות בחושך למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם תערובת תגובה כימית של תאי קליק ואלקין אלקסה פלואור 647, ואחריהם נוגדנים ראשוניים למשך שעה ונוגדנים משניים מתאימים (טבלת חומרים) למשך שעה אחת (איור 3B).
    6. הרכיבו את הכיסויים על שקופיות זכוכית עם אמצעי הרכבה והשתמשו בהם לניתוח תמונה נוסף.
      1. השג תמונות על ידי סריקת לייזר קונפוקלית ב-405 ננומטר, 488 ננומטר, 561 ננומטר ו-633 ננומטר.
      2. צלם תמונות ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים; הגדר את גודל צעד Z ל-0.5 מיקרומטר עם יחידה אוורירית אחת בקוטר חור סיכה.
      3. שמור על פרמטרי המיקרוסקופיה וההדמיה בהגדרה קבועה בין סוגי תאים. צלם תמונות עבור כל שכפול ביולוגי באותו מפגש.
      4. בצע מדידות עוצמה באמצעות כל תוכנת ניתוח תמונה סטנדרטית (למשל, פיג'י או אימריס). ב-Imaris, השתמש במודול SURFACES כדי להניב מדידות נפחיות של גופי תאים חיוביים לאות תיוג חומצות אמינו לא קנוניות פלואורסצנטיות (FUNCAT) עם וימנטין (APCs) ו-GFAP (אסטרוציטים) המגבילים את טווח הווקסל (250-350) להסרת פסולת.
        הערה: שמור על הפרמטרים על פני כל השכפולים הביולוגיים עבור שני סוגי התאים.
  3. גלי סידן תנודתיים המושרים על ידי אדנוזין 5′-טריפוספט (ATP)
    1. צלחת אסטרוציטים על צלחת תחתית זכוכית (35 מ"מ) ב-5 ×-103 תאים/צלחת כדי למדוד את התגובה התאית ל-ATP.
    2. אפשר לתאים להיצמד לתחתית הזכוכית למשך 24 שעות, שטוף אותם פי 3 עם HBSS (20 מ"מ HEPES, 137 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 10 מ"מ גלוקוז, 1 מ"מ MgCl2, pH = 7.3) ללא סידן, ודגר במדיום תרבית עם צבע מטרי ביחס של 5 מיקרומטר Fura-2AM ו-0.02% פלורוניקה F127 למשך שעה בטמפרטורת החדר.
      הערה: Fura-2AM הוא כימיקל רגיש לאור ולטמפרטורה; יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    3. לאחר הדגירה, שטפו פי 2 עם מדיום תרבית והחליפו ב-2 מ"מ Ca2+ המכיל HBSS ודמו את התאים במהירות של 2 FPS באמצעות מטרת שמן פי 60 (1.35 NA) במיקרוסקופ הפוך מפצה על סחיפה ממוקדת.
    4. רשום תגובות סידן הנגרמות על ידי ATP על ידי יישום אמבטיה של ATP בריכוז הסופי של 5 מ"מבשנייה ה-25 (איור 4A).
    5. ציירו אזורי עניין סביב כל תא באמצעות Fiji/ImageJ וחשבו את היחס F340/F380 על פני כל נקודות הזמן (איור 4B).
  4. בדיקות מטבוליות של תאים
    הערה: קצב צריכת החמצן (OCR) וקצב החמצה חוץ-תאית (ECAR) של תאים חיים נמדדו בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת החומרים).
    1. יום אחד לפני הבדיקה, אפשר לאסטרוציטים להיצמד למיקרו-צלחת (צפיפות זריעה של 1.5 × 104 ) במדיום CNTF ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    2. לבדיקת מתח גליקוליזה:
      1. החלף את מדיום תרבית התאים במדיום בסיס בתוספת 2 מ"מ גלוטמין (pH מותאם ל-7.4) ודגר בתא שאינו CO2 ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
        הערה: יש לכוונן את ה-pH באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
      2. הכנס את לוחית המחסנית למכשיר כדי לכייל את החיישן. לאחר הכיול, החלף את לוחית המחסנית בלוחית תרבית התאים בריכוז סופי של רכיבי הערכה הבאים: 10 מ"מ גלוקוז, 1 מיקרומטר אוליגומיצין ו-50 מ"מ 2-דאוקסי-גלוקוז (2-DG) (איור 5A).
      3. בסיום הבדיקה, יש ליז את התאים ולהעריך את תכולת החלבון הכוללת.
    3. לבדיקת המתח של המיטוכונדריון:
      1. החלף את מדיום ה-CNTF במדיום בסיס בתוספת 2 מ"מ גלוטמין, 1 מ"מ פירובאט, 10 מ"מ גלוקוז (pH מותאם ל-7.4) באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס.
      2. דגרו את הצלחת בתא שאינו CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. בינתיים, הכנס את לוחית המחסנית למכשיר כדי לכייל את החיישן.
      3. לאחר הכיול, החלף את לוחית המחסנית בלוחית תרבית התאים בריכוז סופי של רכיבי הערכה הבאים: 1.5 μM אוליגומיצין, 1 μM קרבוניל ציאניד-4 (trifluoromethoxy) פנילהידרזון (FCCP), ו-0.5 μM רוטנון/אנטימיצין A (איור 5C).
      4. בסיום הבדיקה, יש ליז את התאים ולהעריך את תכולת החלבון הכוללת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSC) נשמרו באמצעות מדיום מוגדר זמין מסחרית וצבוע חיסון עבור סמני פלוריפוטנטיות, Oct4 ו-Nanog (איור 1B). נגמ"שי FXS ו-CTRL הראו פרופורציות דומות של תאים מועשרים מאוד עבור וימנטין ו-NFIA (איור 1C,D). מצאנו כי APCs שמקורם ב-hiPSCs בריאים ו-FXS הראו ויסות משמעותי של FOXG1 בהשוואה ל-HOXB4 (איור 1F) התואם לזהות מוחית קדמית דו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת אסטרוציטים אנושיים שמקורם ב-iPSC המשמשים כפלטפורמת בדיקה לאפיון שינויים תפקודיים הנגרמים על ידי FXS. אסטרוציטים אלה ברי קיימא מבחינה תפקודית בתרבית ומציגים תכונות שונות, כפי שמעידים מגוון מדידות שבוצעו במחקר הנוכחי. שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא ההמרה הראשונית של iPSCs לקורטיקוספירות באמצעות שיטת ההרמה האנזימטית. בשלב זה, אופטימיזציה של זמן הדגירה עבור קולגנאז מסוג IV ודיספאזה היא קריטית. אם זה לא ממוטב, זה עלול לגרום ל-iPSCs להתפרק או ליצור תאים בודדים, מה שימנע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לפרופ' סומנטרה צ'אטרג'י על הכספים הפנימיים. אנו מודים לפרופ' גיטי חסן על הגישה למערך הדמיית הסידן, למתקן ההדמיה והזרימה המרכזי - המרכז הלאומי למדעי הביולוגיה, לפדמנב סינג ופרנגיה הוטה על ההגהה וההצעות, ולצוות Labmate Asia על הסיוע בביצוע בדיקות סוסון ים XF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-תיוגליצרולסיגמא-אולדריץ'M6145
אקוטאז  פתרוןSigma-AldrichA6964מדיום ניתוק תאי אנזים 
אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט מלח מגנזיוםסיגמא-אולדריץ'A9187
מתקדם DMEM/F-12ThermoFisher Scientific12634010
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקה (100x)ThermoFisher Scientific15240062
תוסף B-27 (פי 50), ללא סרוםThermoFisher Scientific17504044
בקר סרום אלבומיןSigma-AldrichA9418
תרכיז ליפידים מוגדר כימיתThermoFisher Scientific11905031
קולגנאז, סוג IV, אבקהThermoFisher Scientific17104019
Deoxyribonuclease IWorthington Biochemical CorporationLK003170
דימתיל סולפוקסידSigma-AldrichD2650
Dispase II, אבקתThermoFisher Scientific17105041
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםThermoFisher Scientific14190144
Essential 8Medium ThermoFisher ScientificA1517001
FXS1, FXS2 מכון קוריל למחקר רפואי GM07072, GM05848תאי חולי FXS
תוסף GlutaMAXThermoFisher Scientific35050061תחליף גלוטמין
התזונה F-12 של Ham'sThermoFisher Scientific11765054
תאי בקרה בריאים המרכז הרפואי סידרס-סיני ND30625תאי בקרה בריאים 
מלח נתרן הפרין משררית מעי חזירSigma-AldrichH3149
IMDMThermoFisher Scientific12440053
אינסולין,Roche11376497001
193189 Stratech ScientificS2618-SEL
לוקמיה גורם מעכבסיגמא-אולדריץ'L5283
אנושי מטריגל  גורם צמיחה מופחת (GFR) מטריצת ממברנה בסיסיתקורנינג354230
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)ThermoFisher Scientific11140050
עכבר FGF-בסיסי (FGF-2/bFGF) חלבון רקומביננטיפפרוטק450-33
מיכל הקפאה מר פרוסטיThermoFisher Scientific5100-0001cryobox
N-2 תוסף (100x)ThermoFisher Scientific17502048
N-Acetyl-L-cysteineSigma-AldrichA9165
NeuroBasal MediumThermoFisher Scientific21103049
Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic TubesThermoFisher Scientific377267
Nunc Cell-Culture Treat 6 Well DishThermoFisher Scientific140675
מערכת דיסוציאציה פפאיןWorthington Biochemical CorporationLK003150
פניצילין-סטרפטומיציןThermoFisher Scientific15140122
חלבון CNTF אנושי רקומביננטי, CF מו"פ D Systems257-NT-010
חלבון EGF אנושי רקומביננטי, CFR& D Systems236-EG-01M
RevitaCell Supplement (100x)ThermoFisher ScientificA2644501
SB431542Tocris1614
Seahorse XFe24 Analyzer Agilent Technologies
Seahorse XF Cell Mito ערכת בדיקת מאמץAgilent Technologies103015-100
ערכת בדיקת מאמץ גליקוליזה של סוסון יםAgilent Technologies103020-100
כלי תרבית רקמות-100 ס"מBiostar LifetechTCD000100
TransferrinRoche10652202001
VWR Razor להביםVWR International55411-050
<נוגדנים חזקים>נוגדנים 
<חזק>נוגדן ראשוני<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>דילול
אוק4 (C-10)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-5279דילול: 1:250
נוגדן משני: IgG נגד עכבר עיזים, Alexa Fluor 568
NanogR & דילול D SystemsAF1997: 1:100
נוגדן משני: חמור נגד עזים IgG, Alexa Fluor 488
VimentinAbcamAb5733דילול: 1:500
נוגדן משני: עיזים נגד עוף IgY, Alexa Fluor 488
NFIAAbcamAb41851דילול: 1:500
נוגדן משני: עיזים נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 568
GFAP-cy3SigmaC9205דילול: 1:500
נוגדן משני: NA
GFAPDAKOZ0334דילול: 1:500
נוגדן משני: עז נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 568
S100βדילול DAKOIR504: 1:500
נוגדן משני: עז נגד ארנב IgG, נוגדן נגד גרעינים Alexa Fluor 488
, שיבוט 235-1Merck MilliporeMAB1281דילול: 1:1000
נוגדן משני: עז נגד עכבר IgG1, Alexa Fluor 555
<נוגדנים חזקים>משניים  <חזק>דילול
עז נגד עכבר IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110041:1000
חמור נגד עיזים IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110551:1000
עיזים נגד עוף IgY, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110391:1000
עיזים נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110111:1000
עיזים נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110341:1000
עז נגד עכבר IgG1, Alexa Fluor 555תרמו פישר מדעי A211271:1000
תחליף גלוטמין תערובת LDN אנושי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Molecular of fragile X syndrome: A twenty-year perspective. Annu Rev Pathol. 7, 219-245 (2012).
  2. Wang, H., et al. Developmentally-programmed FMRP expression in oligodendrocytes: A potential role of FMRP in regulating translation in oligodendroglia progenitors. Hum Mol Genet. 13 (1), 79-89 (2004).
  3. Pacey, L. K. K., Doering, L. C. Developmental expression of FMRP in the astrocyte lineage: Implications for fragile X syndrome. Glia. 55 (15), 1601-1609 (2007).
  4. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  5. Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  6. Khakh, B. S., McCarthy, K. D. Astrocyte calcium signaling: From observations to functions and the challenges therein. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (4), a020404(2015).
  7. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  9. Rothstein, J. D., et al. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate. Neuron. 16 (3), 675-686 (1996).
  10. Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nat Rev Neurol. 14 (6), 351-362 (2018).
  11. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: An underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20 (5), 588-594 (2010).
  12. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14 (5), 311-321 (2013).
  13. Bradley, R. A., et al. Regionally specified human pluripotent stem cell-derived astrocytes exhibit different molecular signatures and functional properties. Development. 146 (13), dev170910(2019).
  14. Das Sharma, S., et al. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42 (4), 112344(2023).
  15. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  16. Hu, X., et al. The JAK/STAT signaling pathway: from bench to clinic. Sig Transduct Target Ther. 6, 402(2021).
  17. Baser, A., et al. Onset of differentiation is post-transcriptionally controlled in adult neural stem cells. Nature. 566 (7742), 100-104 (2019).
  18. Pal, R., Bhattacharya, A. Modelling protein synthesis as a biomarker in fragile x syndrome patient-derived cells. Brain Sci. 9 (3), 1-12 (2019).
  19. Gross, C., Bassell, G. J. Excess protein synthesis in FXS patient lymphoblastoid cells can be rescued with a p110β-selective inhibitor. J Mol Med. 18 (3), 336-345 (2012).
  20. Kumari, D., et al. Identification of fragile X syndrome specific molecular markers in human fibroblasts: A useful model to test the efficacy of therapeutic drugs. Hum Mutat. 35 (12), 1485-1494 (2014).
  21. Jacquemont, S., et al. Protein synthesis levels are increased in a subset of individuals with fragile X syndrome. Hum Mol Genet. 27 (12), 2039-2051 (2018).
  22. Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24 (39), 8606-8620 (2004).
  23. Schmunk, G., Boubion, B. J., Smith, I. F., Parker, I., Gargus, J. J. Shared functional defect in IP3R-mediated calcium signaling in diverse monogenic autism syndromes. Transl Psychiatry. 5 (9), e643-e710 (2015).
  24. Peteri, U. K., et al. Generation of the human pluripotent stem-cell-derived astrocyte model with forebrain identity. Brain Sci. 11 (2), 209(2021).
  25. Alvarez-Mora, M. I., et al. Impaired mitochondrial function and dynamics in the pathogenesis of FXTAS. Mol Neurobiol. 54 (9), 6896-6902 (2017).
  26. Giulivi, C., et al. Mitochondrial dysfunction in autism. JAMA. 304 (21), 2389-2396 (2010).
  27. Anitha, A., et al. Brain region-specific altered expression and association of mitochondria-related genes in autism. Mol Autism. 3 (1), 12(2012).
  28. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Front Neurosci. 11, 737(2018).
  29. Yao, J., et al. Mitochondrial bioenergetic deficit precedes Alzheimer's pathology in female mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (34), 14670-14675 (2009).
  30. Sonntag, K. C., et al. Late-onset Alzheimer's disease is associated with inherent changes in bioenergetics profiles. Sci Rep. 7 (1), 14038(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fragile X SyndromeInduced Pluripotent Stem CellsAstrocyte Progenitor CellsAstrocyte DifferentiationGlial Enrichment MediumCalcium ImagingGlycolytic MetabolismMitochondrial RespirationImmunostaining MarkersNeurodevelopmental Disorders

Related Articles