כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לאסטרוציטים פונקציונליים ספציפיים למוח הקדמי. זה מאפשר לחקור את תפקידם של תאי גליה בפתוגנזה של הפרעות נוירו-התפתחותיות, כגון תסמונת ה-X השביר, ומודלים של הפרעות מוח אחרות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
יצירה ואפיון של אסטרוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם וחסרים ריבונוקלאופרוטאין שליח X שביר
במאמר זה
סיכום
תקציר
תסמונת ה-X השביר (FXS), גורם תורשתי מוביל להפרעת הספקטרום האוטיסטי ולמוגבלות שכלית, נחקרה בהרחבה באמצעות מודלים של מכרסמים. לאחרונה, נעשה שימוש גם במערכות מודל שמקורן בתאי גזע אנושיים כדי להשיג תובנות מכניסטיות לגבי הפתופיזיולוגיה של FXS. עם זאת, מחקרים אלה התמקדו כמעט אך ורק בנוירונים. יתר על כן, למרות הראיות ההולכות וגדלות לתפקיד מפתח של גליה בתפקוד עצבי בבריאות ובמחלות, מעט ידוע על האופן שבו אסטרוציטים אנושיים מושפעים מ-FXS.
לכן, במחקר זה, פיתחנו בהצלחה פרוטוקול הלוכד אבני דרך מרחביות-זמניות מרכזיות בהתפתחות המוח ומיישר קו גם עם תהליך הגליוגנזה. יחד זה מציע מסגרת שימושית לחקר הפרעות נוירו-התפתחותיות. ראשית, עיצבנו את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לשושלת הנוירו-אקטודרמלית עם מדכא כפול של אמהות כנגד עיכוב דקפנטפלגי (SMAD) ומולקולות קטנות. לאחר מכן, השתמשנו בגורמי גדילה וציטוקינים ספציפיים כדי ליצור תאי אב אסטרוציטים שמקורם בחולה (CTRL) ו-FXS. טיפול ב-APCs עם גורם נוירוטרופי רירי, ציטוקין מבדיל, מווסת והניע את תאי האב לקראת התבגרות אסטרוציטית, והניב אסטרוציטים המבטאים חלבון חומצי סיבי גליה ספציפי למוח הקדמי.
מצאנו כי אסטרוציטים אלה מתפקדים, כפי שמעידים תגובות הסידן שלהם ליישום ATP, והם מציגים מטבוליזם גליקוליטי ומיטוכונדריאלי לא מווסת ב-FXS. יחד, ממצאים אלה מספקים פלטפורמה ניסויית שימושית ממוצא אנושי לחקירת השלכות אוטונומיות תאיות ולא אוטונומיות של תאים של שינויים בתפקוד האסטרוציטי הנגרמים על ידי הפרעות נוירו-התפתחותיות.
מבוא
תסמונת X שביר (FXS), צורה תורשתית נפוצה של מוגבלות שכלית והפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD), נגרמת על ידי היעדר ריבונוקלאופרוטאין שליח X שביר (FMRP) המיוצר על ידי הגן ריבונוקלאופרוטאין שליח X שביר 1 (FMR1) (OMIM: #300624, https://www.omim.org/entry/300624). FMRP ממלא תפקיד בוויסות תרגום mRNA, היווצרות והובלה של גרגירי mRNA וויסות בתיווך microRNA של ביטוי גנים1. לפיכך, אובדן FMRP משפיע לא רק על התפתחות המוח אלא גם על תפקוד המוח של מבוגרים. גם רמות תעתיק mRNA של FMR1 וגם צביעה חיסונית עבור FMRP במוח הראו ביטוי עצבי גבוה, לצד ביטוי משמעותי גם בתאי גליה2. עם זא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSCs) (טבלה 1) בוצעו לאחר קבלת אישורים רגולטוריים מוסדיים מתאימים. איור 1A מייצג פרוטוקול התמיינות מלא של hiPSCs לאסטרוציטים בוגרים ספציפיים למוח הקדמי.
1. תחזוקה והרחבה של hiPSCs
- יום אחד לפני ציפוי ה-iPSCs, צפו צלחת של 6 בארות במטריג'ל מדולל 1:60 (מטריצה חוץ-תאית [ECM]) ב-Modified Eagle Medium/F-12 של Ham (DMEM/F12) של Advanced Dulbecco ואחסנו בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
הערה: הימנע מאחסון כלים מצופים מטריג'ל למשך >5 ימים בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס, מכיוון שהדבר עלול לגר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מושבות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSC) נשמרו באמצעות מדיום מוגדר זמין מסחרית וצבוע חיסון עבור סמני פלוריפוטנטיות, Oct4 ו-Nanog (איור 1B). נגמ"שי FXS ו-CTRL הראו פרופורציות דומות של תאים מועשרים מאוד עבור וימנטין ו-NFIA (איור 1C,D). מצאנו כי APCs שמקורם ב-hiPSCs בריאים ו-FXS הראו ויסות משמעותי של FOXG1 בהשוואה ל-HOXB4 (איור 1F) התואם לזהות מוחית קדמית דו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת אסטרוציטים אנושיים שמקורם ב-iPSC המשמשים כפלטפורמת בדיקה לאפיון שינויים תפקודיים הנגרמים על ידי FXS. אסטרוציטים אלה ברי קיימא מבחינה תפקודית בתרבית ומציגים תכונות שונות, כפי שמעידים מגוון מדידות שבוצעו במחקר הנוכחי. שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא ההמרה הראשונית של iPSCs לקורטיקוספירות באמצעות שיטת ההרמה האנזימטית. בשלב זה, אופטימיזציה של זמן הדגירה עבור קולגנאז מסוג IV ודיספאזה היא קריטית. אם זה לא ממוטב, זה עלול לגרום ל-iPSCs להתפרק או ליצור תאים בודדים, מה שימנע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
אנו מודים לפרופ' סומנטרה צ'אטרג'י על הכספים הפנימיים. אנו מודים לפרופ' גיטי חסן על הגישה למערך הדמיית הסידן, למתקן ההדמיה והזרימה המרכזי - המרכז הלאומי למדעי הביולוגיה, לפדמנב סינג ופרנגיה הוטה על ההגהה וההצעות, ולצוות Labmate Asia על הסיוע בביצוע בדיקות סוסון ים XF.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1-תיוגליצרול | סיגמא-אולדריץ' | M6145 | |
| אקוטאז פתרון | Sigma-Aldrich | A6964 | מדיום ניתוק תאי אנזים |
| אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט מלח מגנזיום | סיגמא-אולדריץ' | A9187 | |
| מתקדם DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12634010 | |
| אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקה (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
| תוסף B-27 (פי 50), ללא סרום | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| בקר סרום אלבומין | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| תרכיז ליפידים מוגדר כימית | ThermoFisher Scientific | 11905031 | |
| קולגנאז, סוג IV, אבקה | ThermoFisher Scientific | 17104019 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corporation | LK003170 | |
| דימתיל סולפוקסיד | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dispase II, אבקת | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Essential 8 | Medium ThermoFisher Scientific | A1517001 | |
| FXS1, FXS2 | מכון קוריל למחקר רפואי | GM07072, GM05848 | תאי חולי FXS |
| תוסף GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 35050061 | תחליף גלוטמין |
| התזונה F-12 של Ham's | ThermoFisher Scientific | 11765054 | |
| תאי בקרה בריאים | המרכז הרפואי סידרס-סיני | ND30625 | תאי בקרה בריאים |
| מלח נתרן הפרין משררית מעי חזיר | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| IMDM | ThermoFisher Scientific | 12440053 | |
| אינסולין, | Roche | 11376497001 | |
| 193189 | Stratech Scientific | S2618-SEL | |
| לוקמיה גורם מעכב | סיגמא-אולדריץ' | L5283 | |
| אנושי מטריגל גורם צמיחה מופחת (GFR) מטריצת ממברנה בסיסית | קורנינג | 354230 | |
| MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| עכבר FGF-בסיסי (FGF-2/bFGF) חלבון רקומביננטי | פפרוטק | 450-33 | |
| מיכל הקפאה מר פרוסטי | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | cryobox |
| N-2 תוסף (100x) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NeuroBasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | ThermoFisher Scientific | 377267 | |
| Nunc Cell-Culture Treat 6 Well Dish | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| מערכת דיסוציאציה פפאין | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| חלבון CNTF אנושי רקומביננטי, CF | מו"פ D Systems | 257-NT-010 | |
| חלבון EGF אנושי רקומביננטי, CF | R& D Systems | 236-EG-01M | |
| RevitaCell Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | A2644501 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| Seahorse XFe24 Analyzer | Agilent Technologies | ||
| Seahorse XF Cell Mito ערכת בדיקת מאמץ | Agilent Technologies | 103015-100 | |
| ערכת בדיקת מאמץ גליקוליזה של סוסון ים | Agilent Technologies | 103020-100 | |
| כלי תרבית רקמות-100 ס"מ | Biostar Lifetech | TCD000100 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 | |
| VWR Razor להבים | VWR International | 55411-050 | |
| <נוגדנים חזקים>נוגדנים | |||
| <חזק>נוגדן ראשוני | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי< | חזק>דילול |
| אוק4 (C-10) | סנטה קרוז ביוטכנולוגיה | sc-5279 | דילול: 1:250 נוגדן משני: IgG נגד עכבר עיזים, Alexa Fluor 568 |
| Nanog | R & דילול D Systems | AF1997 | : 1:100 נוגדן משני: חמור נגד עזים IgG, Alexa Fluor 488 |
| Vimentin | Abcam | Ab5733 | דילול: 1:500 נוגדן משני: עיזים נגד עוף IgY, Alexa Fluor 488 |
| NFIA | Abcam | Ab41851 | דילול: 1:500 נוגדן משני: עיזים נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 568 |
| GFAP-cy3 | Sigma | C9205 | דילול: 1:500 נוגדן משני: NA |
| GFAP | DAKO | Z0334 | דילול: 1:500 נוגדן משני: עז נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 568 |
| S100β | דילול DAKO | IR504 | : 1:500 נוגדן משני: עז נגד ארנב IgG, נוגדן נגד גרעינים Alexa Fluor 488 |
| , שיבוט 235-1 | Merck Millipore | MAB1281 | דילול: 1:1000 נוגדן משני: עז נגד עכבר IgG1, Alexa Fluor 555 |
| <נוגדנים חזקים>משניים | <חזק>דילול | ||
| עז נגד עכבר IgG, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11004 | 1:1000 |
| חמור נגד עיזים IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | 1:1000 |
| עיזים נגד עוף IgY, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11039 | 1:1000 |
| עיזים נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11011 | 1:1000 |
| עיזים נגד ארנב IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | 1:1000 |
| עז נגד עכבר IgG1, Alexa Fluor 555 | תרמו פישר מדעי | A21127 | 1:1000 |
מקורות
- Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Molecular of fragile X syndrome: A twenty-year perspective. Annu Rev Pathol. 7, 219-245 (2012).
- Wang, H., et al. Developmentally-programmed FMRP expressio....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
