הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השפעות שיקונין על מסלול איתות HIF-1α/VEGF בעכברים עם פגיעה ריאתית חריפה הנגרמת על ידי אלח דם

509 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68085

⸱

6 ביוני 2025

 , 
1The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול נועד להעריך את יעילותו של שיקונין בהקלה על פגיעה ריאתית חריפה הנגרמת על ידי אלח דם בעכברים. על ידי התמקדות במסלול HIF-1α/VEGF, המחקר חוקר כיצד מינונים שונים של שיקונין משפיעים על שיעורי ההישרדות, פתולוגיה של הריאות וביטוי סמנים דלקתיים, תוך הדגשת היתרונות הטיפוליים הפוטנציאליים שלו.

תקציר

אלח דם גורם לעתים קרובות לפגיעה ריאתית חריפה (ALI), סיבוך של תמותה גבוהה. מסלול HIF-1α/VEGF ממלא תפקיד מפתח באלח דם, ושיקונין, תרכובת טבעית בעלת תכונות אנטי דלקתיות, עשויה להקל על פגיעה ריאתית על ידי התמקדות במסלול זה. עכברי Balb/c חולקו באופן אקראי לארבע קבוצות: קבוצת דמה, קבוצת מודל, קבוצת טיפול במינון נמוך וקבוצת טיפול במינון גבוה. קבוצת הדמה עברה לפרוטומיה ללא קשירת צקל וניקוב (CLP), בעוד שקבוצת המודל עברה CLP כדי לגרום לפגיעה ריאתית חריפה הקשורה לאלח דם. לאחר המודל, קבוצות הטיפול במינון נמוך ובמינון גבוה קיבלו שיקונין במינונים של 12.5 מ"ג/ק"ג ו-50 מ"ג/ק"ג, בהתאמה, פעם ביום למשך 14 יום. שיעור ההישרדות של 7 הימים של העכברים נוטר. צביעת המטוקסילין ואאוזין (HE) שימשה להערכת הפתולוגיה של רקמת הריאה, נמדד יחס משקל הריאה הרטוב/יבש (W/D), ובוצע כתם מערבי כדי לזהות את הביטוי של HIF-1α, VEGF, TNF-α ו-IL-6 ברקמת הריאה. שיקונין שיפר משמעותית את שיעור ההישרדות של עכברים ספטיים, כאשר ההשפעה הגדולה ביותר נצפתה בקבוצת המינון הגבוה (p < 0.05). בהשוואה לקבוצת המודל, יחס ה-W/D של הריאות והנזק לרקמות בקבוצות שטופלו בשיקונין הופחתו באופן משמעותי באופן תלוי מינון. בנוסף, שיקונין הפחית באופן משמעותי את הביטוי של HIF-1α, VEGF, TNF-α ו-IL-6, כאשר קבוצת המינון הגבוה הראתה את הירידה הבולטת ביותר (p < 0.05). שיקונין מקל על פגיעה ריאתית חריפה בעכברים ספטיים, פוטנציאלית על ידי עיכוב הביטוי של HIF-1α והפחתת הייצור של גורמים דלקתיים קשורים.

מבוא

אלח דם הוא תגובה דלקתית מערכתית חמורה המופעלת על ידי זיהום. 1 לעתים קרובות זה מוביל לתפקוד לקוי של איברים מרובים ויכול להיות מסכן חיים ככל שהמצב מתקדם. 2 למרות השימוש בטיפולים כמו הנשמה מכנית וטיפול תומך, שיעורי התמותה מ-ALI הקשור לאלח דם נותרו גבוהים ומגיעים ל-30%-40%3. טיפולים אלה מטפלים בעיקר בסימפטומים ולא בגורמים הבסיסיים, ומגבילים את יעילותם הכוללת. לכן, זיהוי גישות טיפוליות חדשות המכוונות לגורמים לפגיעה ריאתית יכול לשפר משמעותית את תוצאות המטופלים באלח דם.

מחקרים אחרונים זיהו גורם המעורר היפוקסיה-1α (HIF-1α) כמווסת קריטי בהתקדמות ALI 4,5 המושרה על ידי אלח דם. HIF-1α מצטבר ברקמת הריאה במהלך אלח דם, ומניע את הביטוי של גנים במורד הזרם המחמירים דלקת ונזק לרקמות6. תהליך זה תורם באופן משמעותי להחמרת הפגיעה בריאות. לכן, מיקוד במסלול האיתות HIF-1α מציע גישה מבטיחה להפחתת התגובות הדלקתיות וההיפוקסיות הנראות ב-ALI המושרה על ידי אלח דם.

בחיפוש אחר טיפולים יעילים יותר, הרפואה הסינית המסורתית (TCM) סיפקה תובנות חשובות 7,8. שיקונין היא תרכובת אנתרקינון המופקת מ-Lithospermum erythrorhizon7. הוא מראה השפעות אנטי דלקתיות בולטות9, אנטיבקטריאליות10 ואנטי גידול11. שיקונין יכול להקל על פגיעה ריאתית הנגרמת על ידי ליפופוליסכריד (LPS), מה שמרמז על תפקידו הטיפולי הפוטנציאלי במצבי ריאה12. במקביל, כמה מחקרים הציעו גם כי שיקונין עשוי להקל על נזקי חמצון הנגרמים על ידי אלח דם על ידי ויסות מערכת המקרופאגים החד-גרעינית, איזון תגובות פרו-דלקתיות ואנטי דלקתיות. עם זאת, המנגנונים מאחורי ההשפעות המגנות של שיקונין ב-ALI המושרה על ידי אלח דם אינם מובנים במלואם. זה מייצג פער קריטי במחקר הנוכחי.

במחקר זה, אנו שואפים לחקור את ההשפעות המגנות של שיקונין במודל עכברי של ALI המושרה על ידי אלח דם באמצעות קשירת צקל וניקוב (CLP). טכנולוגיית CLP ממלאת תפקיד חשוב בחקר אלח דם מכיוון שהיא יכולה לדמות תגובות דלקתיות מערכתיות מורכבות ותפקוד לקוי של איברים, מה שהופך אותה למתאימה להערכת היעילות של אסטרטגיות טיפול חדשות. טכנולוגיית CLP רלוונטית יותר מבחינה קלינית בהשוואה לשיטות הזרקת LPS מסורתיות: היא מדמה את התגובה הדלקתית המערכתית הנגרמת על ידי טרנסלוקציה של מיקרוביוטה במעי, הקרובה יותר לתהליך הפתולוגי של אלח דם קליני. ניתן לדרג ולשלוט בו: על ידי התאמת אורך הקשירה וגודל הניקוב, ניתן לשלוט בחומרת המחלה, והיא מתאימה לכל חקר אלח דם. בנוסף, זה יכול לדמות שינויים דינמיים דומים בתפקוד לקוי של איברים מרובים ותגובת ציטוקינים. על ידי חקירת תפקידו של שיקונין בוויסות מסלול האיתות HIF-1α/VEGF, אנו מקווים לספק תובנות לגבי אסטרטגיות טיפוליות חדשות המתייחסות למנגנונים הבסיסיים של פגיעה ריאתית הקשורה לאלח דם, מה שעשוי לשפר את התוצאות הקליניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול קיבל אישור מהמרכז לבעלי חיים ניסיוניים של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברים זכרים C57Bl/6 (בני 5-6 חודשים; 20-25 גרם). פרטי הריאגנטים העיקריים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מודל עכבר אלח דם

  1. עכברי בית בטמפרטורה קבועה של 25 מעלות צלזיוס, 50% לחות ומחזור אור/חושך של 12 שעות.
  2. לאחר תקופת התאקלמות של 7 ימים, חלקו את העכברים באופן אקראי לארבע קבוצות: קבוצת דמה, קבוצת מודל, קבוצת טיפול במינון נמוך וקבוצת טיפול במינון גבוה, עם 20 עכברים בכל קבוצה.
  3. בהתבסס על הפניות ממחקר קודם13, טפל בקבוצה במינון נמוך בריכוז של 12.5 מ"ג/ק"ג פורפורין במשך 14 יום, ובקבוצה במינון גבוה בריכוז של 50 מ"ג/ק"ג למשך 14 יום. עבור קבוצת ניתוחי הדמה, בצע לפרוטומיה, מתיחת ציקל, הפחתה וסגירה ללא קשירה או ניקוב, וטפל באותו מינון של מי מלח פיזיולוגיים למשך 14 יום. שלבי הניסוי לקבוצת אלח דם הם כדלקמן.
  4. לאחר צום לילה (מים היו מותרים), הרדימו את העכברים עם נתרן פנטוברביטל (40-80 מ"ג/ק"ג) בתנאים סטריליים לאורך כל התהליך. מרחו משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן ההרדמה.
  5. בדוק הרדמה נכונה כהאטה בקצב הנשימה, ירידה במתח השרירים וללא תגובת מתח ברורה בעת הידוק קל של הגפיים התחתונות עם מלקחיים המוסטטיים.
  6. בצע חיטוי עם 75% אתנול, פי 3. בצע חתך אורכי של כ-1 ס"מ במיקום השמאלי האמצעי-שמאלי של בטן העכבר, וחתוך את העור, הפאשיה והשרירים בשכבות כדי לחשוף את חלל הבטן.
  7. בעזרת מלקחיים עיניים קהים בשתי הידיים, חקרו בעדינות את חלל הבטן, אתרו ושחררו את הצקום של העכבר, וקשרו אותו במרחק של כ-1 ס"מ מקצה הצקום.
  8. השתמש במחט 21G כדי לנקב ולקשור את קצה הצקום, סחט בעדינות כמות קטנה של תוכן מעיים ממקום הניקוב באמצעות מלקחיים עיניים קהים ולאחר מכן החזר אותו לתוך הצקום.
  9. בצע החייאת נוזלים תת עורית עם 1 מ"ל של תמיסת נתרן כלורי 0.9%. אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה על החזה. נציין כי בעל החיים שעבר ניתוח אינו מוחזר לחברת בעלי חיים אחרים עד להחלמתו המלאה.
  10. לאחר 7 ימים של דוגמנות CLP, יש לתת הרדמה מוגזמת להמתת חסד.
    הערה: בשל ההשפעות המגרות האפשריות של פורפורין על העור, דרכי הנשימה ודרכי העיכול, כמו גם רעילותו הגבוהה לאורגניזמים מימיים, זיהום סביבתי, השתמש בהגנה אישית במהלך הניסוי.

2. הערכת מודלים של בעלי חיים

  1. תצפית הישרדות עכברים
    1. בצע טיפול בבעלי חיים כמתואר לעיל. רשום את שיעור התמותה תוך שבוע לאחר מידול לניתוח סטטיסטי. חלק מהעכברים מתים ללא אלח דם לפני המתת חסד, בעוד שלעכברי מודל CLP יש שיעור תמותה מסוים (טבלה 1).
    2. מדידת יחס משקל ריאות רטוב ליובש
      1. לאחר 24 שעות של דוגמנות, יש להרדים את העכברים שוב לפי שלבים 1.4-1.5.
      2. בצע חתך אורכי של כ-1 ס"מ בצד שמאל של קו האמצע של עצם הבריח של העכבר, והסר את שכבות העור, הפאשיה והשרירים כדי לחשוף את חלל החזה בעזרת מספריים ומלקחיים כירורגיים.
      3. הסר את הריאה השמאלית ונקז את נוזל פני השטח. מודדים את המשקל הרטוב ולאחר מכן מייבשים אותו בתנור 80 מעלות למשך 72 שעות למשקל קבוע לקבלת המשקל היבש.
      4. חשב את תכולת מי הריאות כ:
        תכולת מי ריאות = (משקל רטוב - משקל יבש) / משקל רטוב x 100%.
    3. השוואה היסטופתולוגית של רקמות ריאה
      1. בנקודות זמן מוגדרות, אסוף את הריאה השמאלית כמתואר לעיל בשלב 2.2. מקבעים את הריאה בפורמלדהיד ניטרלי של 10%, מטמיעים אותה בפרפין וחותכים אותה בעובי של 5 מיקרומטר.
      2. מסירים שעווה מהריאה בקסילן, פי 2, למשך 5-10 דקות בכל פעם. בצע החזרת אתנול סדרתית עם 100%, 95%, 85% ו-75%, למשך 3 דקות לכל שיפוע. משרים במים מזוקקים למשך 2 דקות.
      3. יש להכתים בכ-100 מ"ל תמיסת המטוקסילין למשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים כדי להסיר כל צבע צף.
      4. מוסיפים כ -70 מ"ל מתמיסת הבידול ומשרים למשך 30 שניות. לאחר מכן, יש להשרות במי ברז פעמיים, בכל פעם למשך 3-5 דקות.
      5. הוסף כ-100 מ"ל של תמיסת צבע אאוזין בטיפה למשך 2 דקות. שפכו עודפי תמיסת צבע וייבשו במהירות כמתואר להלן.
      6. יש לבצע התייבשות, שקיפות ואיטום כמתואר להלן.
        1. השרו דגימות באתנול שיפוע: 75%, 85%, 95% ו-100% אתנול (I) למשך 2-3 שניות כל אחת. משרים ב-100% אתנול (II) למשך דקה אחת, ומשרים בקסילן פעמיים למשך דקה אחת בכל פעם. בעזרת קש או טפטפת, טפטפו מסטיק ניטרלי על פני פרוסות הרקמה ופזרו אותו באופן שווה ככל האפשר כדי למנוע היווצרות בועות. אטמו והתבוננו תחת מיקרוסקופ ב-400x.
      7. בחר 10 שדות אקראיים לכל מקטע ריאות. בקש מפתולוג לדרג שינויים פתולוגיים כגון בצקת המכתשית, דימום וחדירת נויטרופילים מ-0 (נורמלי) ל-4 (נזק חמור). השתמש בציון הכולל להערכה.
    4. כתמים מערביים
      1. חלץ חלבונים גרעיניים מרקמת הריאה לפי הוראות ערכת מיצוי החלבון הגרעיני, ומדוד את ריכוז החלבון בשיטת BCA לפי הוראות היצרן.
      2. הכן דגימות טעינת חלבון עם 50 מיקרוגרם חלבון טעון לכל דגימה. הכן ג'ל הפרדה SDS-PAGE (10%) וג'ל ערימה (3%). בצע אלקטרופורזה ב-80 וולט למשך 45 דקות, ולאחר מכן העביר חלבון לקרום PVDF ב-110 וולט למשך 60 דקות לאחר שהדגימות נכנסו לג'ל המפריד.
      3. מעבירים חלבונים לקרום וחוסמים למשך 60 דקות. דגירה עם נוגדנים ראשוניים (ראה טבלת חומרים, 1:1000) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן דגירה של נוגדנים משניים (ראה טבלת חומרים, 1:1000) ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
      4. שטפו את הממברנה עם TBST והשתמשו ב- ECL להדמיה. בחדר חשוך, הוסף את הריאגנטים המוכנים על קרום PVDF ובצע הדמיית טלטול ופלואורסצנטיות. ריאגנטים של ECL מקיימים אינטראקציה עם ביומולקולות על הממברנה, ומייצרים תגובות כימילומינסנציה חזקות, הנרשמות על ידי מכשירי הדמיה פלואורסצנטיים.
      5. נתח את ערך גווני האפור של רצועות חלבון באמצעות מערכת ניתוח תמונה, שיטת כימות פס (למידע מפורט על המערכת המשמשת לניתוח צפיפות פס, ראה תמונת NIH).
    5. ניתוח סטטיסטי
      1. השתמש ב-SPSS 26.0 לניתוח סטטיסטי. השתמש ב-ANOVA חד-כיווני כדי להשוות את הממוצעים של מספר קבוצות, ובמבחני LSD-t להשוואות זוגיות. שקול ערך p < 0.05 כמובהק סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של שיקונין, הערכנו תחילה את השפעתו על ההישרדות בעכברים ספטיים לאורך תקופה של 7 ימים. טיפול בשיקונין שיפר את שיעורי ההישרדות באופן תלוי מינון (איור 1).

בהתחשב בשכיחות הנרחבת של פגיעה ריאתית באלח דם, הערכנו גם בצקת ריאות בעכברים. בצקת ריאות הוערכה על ידי מדידת יחס משקל רטוב ליובש (W/D) של הריאות. יחס W/D היה גבוה משמעותית בקבוצת המודל בהשוואה לקבוצת הדמה (p < 0.05). הטיפול בשיקונין מיתן את ההשפעה הזו באופן תלוי מינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כמודל תקן הזהב לחקר אלח דם, מודל CLP הוא צעד מפתח בניסוי זה מכיוון ש-CLP מחקה את המורכבות של אלח דם אנושי טוב יותר ממודלים רבים אחרים. ALI הקשור לאלח דם נותר אתגר קליני קריטי בשל שיעורי התמותה הגבוהים שלו והיעילות המוגבלת של הטיפולים הנוכחיים14,15. המחקר שלנו מדגים, בפעם הראשונה, כי שיקונין משפר משמעותית את ההישרדות בעכברים ספטיים על ידי ויסות הן HIF-1α והן תגובות דלקתיות על ידי יצירת מודל CLP.

תמותה ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

תודות

המחקר נתמך על ידי פרויקט המדע והטכנולוגיה של וונג'ואו (Y2020976).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
H& ערכת כתמים E ערכת צביעהSolaibao TechnologyG1120HE
צנטריפוגה בטמפרטורה נמוכהSigma3K15
Microplate ReaderBio-Radדגם 680
ארנב חד שבטי VEGF-קולטן 1 נוגדןAbcamab238632
ארנב פוליקלונלי HIF-1α נוגדןAbcamab51608
SDS-PAGE מערכת אלקטרופורזהBio-RadMINI Protean2
ShikoninMedChemExpressHY-N0822

מקורות

  1. Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathophysiology and treatment of sepsis. N Engl J Med. 348 (2), 138-150 (2003).
  2. Vincent, J. L. Current sepsis therapeutics. EBioMed. 86, 104318(2022).
  3. Li, W., et al. Classic signaling pathways in alveolar injury and repair involved in sepsis-induced ali/ards: New research progress and prospect. Dis Markers. 2022, 6362344(2022).
  4. Mokrá, D. Acute lung injury - from pathophysiology to treatment. Physiol Res. 69 (Suppl 3), S353-S366 (2020).
  5. Prangsaengtong, O., Jantaree, P., Lirdprapamongkol, K., Svasti, J., Koizumi, K. Shikonin suppresses lymphangiogenesis via nf-kappab/hif-1alpha axis inhibition. Biol Pharm Bull. 41 (11), 1659-1666 (2018).
  6. Liu, Y., Xiang, D., Zhang, H., Yao, H., Wang, Y. Hypoxia-inducible factor-1: A potential target to treat acute lung injury. Oxid Med Cell Longev. 2020, 8871476(2020).
  7. Fan, T. T., Cheng, B. L., Fang, X. M., Chen, Y. C., Su, F. Application of chinese medicine in the management of critical conditions: A review on sepsis. Am J Chin Med. 48 (6), 1315-1330 (2020).
  8. Liang, X., et al. Efficacy of traditional chinese medicine on sepsis: A systematic review and meta-analysis. Int J Clin Exp Med. 8 (11), 20024-20034 (2015).
  9. Boulos, J. C., Rahama, M., Hegazy, M. F., Efferth, T. Shikonin derivatives for cancer prevention and therapy. Cancer Lett. 459, 248-267 (2019).
  10. Guo, Y., et al. Recent advances in shikonin for the treatment of immune-related diseases: Anti-inflammatory and immunomodulatory mechanisms. Biomed Pharmacother. 165, 115138(2023).
  11. Guo, C., et al. Pharmacological properties and derivatives of shikonin-a review in recent years. Pharmacol Res. 149, 104463(2019).
  12. Zhang, Y., et al. Shikonin ameliorates lipoteichoic acid‑induced acute lung injury via promotion of neutrophil apoptosis. Mol Med Rep. 23 (2), 133(2021).
  13. Bai, G. Z., et al. Shikonin attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice. J Surg Res. 182 (2), 303-311 (2013).
  14. Fein, A. M., Calalang-Colucci, M. G. Acute lung injury and acute respiratory distress syndrome in sepsis and septic shock. Crit Care Clin. 16 (2), 289-317 (2000).
  15. Sun, B., et al. Acute lung injury caused by sepsis: How does it happen. Front Med. 10, 1289194(2023).
  16. Song, Y., Lin, W., Zhu, W. Traditional chinese medicine for treatment of sepsis and related multi-organ injury. Front Pharmacol. 14, 1003658(2023).
  17. Li, M. Y., et al. Shikonin suppresses proliferation and induces cell cycle arrest through the inhibition of hypoxia-inducible factor-1alpha signaling. Chem Biol Interact. 274, 58-67 (2017).
  18. Shi, J., et al. Dexmedetomidine ameliorates endotoxin-induced acute lung injury in vivo and in vitro by preserving mitochondrial dynamic equilibrium through the hif-1a/ho-1 signaling pathway. Redox Biol. 41, 101954(2021).
  19. Das, U. N. Infection, inflammation, and immunity in sepsis. Biomolecules. 13 (9), 1332(2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

טיפול בשיקוניןמודל עכברים לספסיסHIF-1 אלפאנתיב VEGFציטוקינים דלקתייםWestern Blotפתולוגיה של הריאהצביעת המטוקסילין-אאוזיןשיעור הישרדות

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.