הקמת מודל עכבר פסוריאזיס על ידי Imiquimod

סיכום

כאן, אנו מציגים מודל עכברי יעיל ויציב ביותר של פסוריאזיס שהוקם באמצעות שימוש באימיקימוד. בנוסף, אנו מפרטים את המתודולוגיות בהן נעשה שימוש כדי להעריך את חומרת הפסוריאזיס.

תקציר

פסוריאזיס היא מחלת עור נפוצה, כרונית, התקפית ודלקתית המאופיינת בחדירת עור מעובה, קשקשים ואריתמה. הפתוגנזה של המחלה מורכבת ביותר, וכוללת אינטראקציה של גורמים שונים כגון גנטיקה, חסינות וגורמים סביבתיים. כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס פסוריאזיס, חוקרים פיתחו מודלים רבים של המחלה בבעלי חיים. עם זאת, השונות במתודולוגיות הציבה אתגרים לבניית מודלים אלה באופן עקבי. במחקר זה, ביססנו והערכנו באופן מקיף מודל עכבר פסוריאזיס יעיל ויציב ביותר באמצעות imiquimod (IMQ). עכברי C57BL/6J נקבות בנות 8 שבועות בדרגת SPF שימשו לביסוס מודל עכברי הפסוריאזיס. לאחר שבוע של התאקלמות, לא נכללו עכברים עם עור מגורה או פגום באזורים המפוקפקים. החל מהיום השני, קרם 5% IMQ (62.5 מ"ג/יום) נמרח מדי יום על אזורי הצוואר והגב המפורק במשך שבעה ימים רצופים. במהלך הניסוי נערכו מדידות יומיות של משקל גוף, צילום עור, ניקוד עור ותצפיות התנהגותיות. לאחר הניסוי בוצעו קביעת אינדקס הטחול, ניתוח היסטולוגי של העור, זיהוי ציטוקינים בסרום וזיהוי רמת mRNA בעור. התוצאות הראו כי עכברים בקבוצת IMQ פיתחו תסמינים אופייניים דמויי פסוריאזיס, כולל אריתמה, קשקשים ועיבוי עור, המלווים בהתנהגות גירוד מוגברת, ירידה במשקל, אינדקס טחול מוגבר ועובי עור מוגבר. ושינויים משמעותיים ברמות TNF-α, IL-23 ו-IL-17A בסרום, כמו גם ברמות ה-mRNA של IL-23, IL-17A, IL-17F ו-IFN-γ בעור. רמות הציטוקינים בסרום (TNF-α, IL-23, IL-17A) וביטוי mRNA בעור של סמנים פרו-דלקתיים (IL-23, IL-17A, IL-17F, IFN-γ) היו מווסתים במיוחד. לעומת זאת, קבוצת הביקורת לא הראתה שינויים כאלה. על ידי אופטימיזציה של משך האינדוקציה של IMQ וסטנדרטיזציה של פרוטוקול הניהול, תוך ניטור דינמי של שינויים בעור, מחקר זה נועד לספק מסגרת סטנדרטית לחוקרים לבניית מודלים אמינים של פסוריאזיס.

מבוא

פסוריאזיס היא מחלת עור מערכתית נפוצה, כרונית, התקפית ודלקתית, כאשר פסוריאזיס פלאק הוא הביטוי הקליני הדומיננטי ביותר¹. המאפיינים הקליניים שלו כוללים בדרך כלל חדירת עור, עובי, קשקשים ואריתמה², והוא יכול גם לעורר מגוון סיבוכים, כולל דלקת מפרקים פסוריאטית, דיכאון, תסמונת מטבולית ומחלות לב וכלי דם¹. בנוסף, פסוריאזיס מלווה לעתים קרובות בגירוד^{כרוני 3}. ברחבי העולם, פסוריאזיס משפיעה על 2% עד 3% מהאוכלוסייה⁴, והשכיחות שלה נמצאת במגמת עלייה. לכן, ביסוס מודלים אמינים של בעלי חיים המחקים מקרוב את המאפיינים הפתולוגיים של פסוריאזיס אנושי הוא חיוני לחשיפת הפתוגנזה שלו ולפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

בתחום המחקר הדרמטולוגי, פסוריאזיס זכתה לתשומת לב משמעותית בשל הפתוגנזה המורכבת שלה, הכוללת יחסי גומלין בין גורמים גנטיים, אימונולוגיים וסביבתיים, המציבה אתגרים ניכרים למחקר מעמיק¹. מחקרים עדכניים מצביעים על כך שהופעת הפסוריאזיס מתווכת בעיקר על ידי תאי T, אשר, עם ההפעלה, מעוררים קרטינוציטים להתרבות יתר על המידה ומשנים את הפרשת הציטוקינים במהלך תהליך ההתמיינות שלהם⁵. בתהליך זה, ציר האינטרלוקין (IL)-23/IL-17 ממלא תפקיד מרכזי. IL-23 מקדם התמיינות והפעלה של תאי Th17, המייצרים ציטוקינים כגון IL-17A ו-IL-17F, הממלאים תפקיד משמעותי בהתפתחות פסוריאזיס ^6,7,8. נכון לעכשיו, הפתוגנזה של פסוריאזיס כוללת שינויים מולקולריים רבים. אלה כוללים ציטוקינים כגון גורם נמק גידול-α (TNF-α), ציר IL-23/IL-17, IL-37, מסלולי איתות תוך-תאיים כמו גורם גרעיני-κB (NF-κB), והעברת אותות ג'אנוס קינאז ומפעיל שעתוק (JAK-STAT). יתר על כן, הוא קשור קשר הדוק למולקולות הקשורות לסוכר, מחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA), חומצות אמינו, מסלולי חילוף חומרים של שומנים, כמו גם גורמי ויסות אפיגנטיים, כולל מתילציה של DNA ושינוי היסטון. מטרות אלה שזורות זו בזו בצורה מורכבת ומקיימות אינטראקציה זו עם זו, ומניעות במשותף את הופעתה והתקדמותה של פסוריאזיס⁹.

במחקר הפסוריאזיס הנוכחי, נעשה שימוש במגוון מודלים של בעלי חיים, כולל מודלים ספונטניים, מודלים של השתלה אלוגנית, מודלים טרנסגניים או נוקאאוט של גנים, ומודלים המושרים כימית,^{בין היתר}. מודלים אלה של בעלי חיים ממלאים תפקיד חיוני בחקר הפסוריאזיס, כאשר מדענים השתמשו במינים מרובים כגון עכברים, שרקנים ודגי זברה כדי לבנות מודלים של פסוריאזיס 11,12,13. עם זאת, לכל המודלים הללו יש מגבלות מסוימות, כולל מורכבות גנטית, הבדלים בין מינים, חששות אתיים ושיקולי עלות¹⁴.

אימיקימוד (IMQ), כאגוניסט של קולטנים דמויי טול (TLRs), יכול לעורר דלקת בעור וחדירת תאי חיסון, תוך קידום התפשטות של קרטינוציטים ושיפור כלי הדם העוריים¹³. מחקר דיווח כי יישום מקומי של IMQ בבני אדם יכול לגרום לפסוריאזיס¹⁵. תצפיות קליניות גילו גם כי IMQ מחמיר את תסמיני הפסוריאזיס בחולים⁷. במודלים של פסוריאזיס של עכברים, מתן רציף של ריכוז של 5% של IMQ יכול לשחזר את הביטויים העוריים של פסוריאזיס אנושי, כגון אריתמה וקשקשים. בנוסף, תסמינים אחרים דומים מאוד לאלה של פסוריאזיס רובד אנושי, כולל שינויים באפידרמיס כמו אקנתוזיס ופרקרטוזיס, ניאואנגיוגנזה וכן הלאה. המודלים של עכברי הפסוריאזיס המושרים על ידי IMQ מסוגלים גם לדמות גירוד כרוני⁴. קיימת גם חדירה של תאים דלקתיים המורכבים מתאי T, נויטרופילים ותאים דנדריטיים במודלים של עכברי פסוריאזיס ^2,16. נגעי העור הנגרמים על ידי IMQ מסתמכים בעיקר על ציר TNF-α-IL-23/IL-17, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש במודלים של עכברי פסוריאזיס מבוססי IMQ כדי להמשיך לחקור פסוריאזיס אנושי⁹.

מודל עכברי הפסוריאזיס המושרה על ידי IMQ ששימש במחקר זה מתאים לזני עכברים כגון C57BL/6 ו-BALB/c, בעלי נטיות Th1 ו-Th2, בהתאמה⁷. מודל זה יציב ויעיל ביותר, עם יתרונות של עלות נמוכה, משך ניסוי קצר, פעולה פשוטה, תסמינים מובהקים ואחוזי הצלחה גבוהים. בניסוי סיפקנו תיאור מפורט של מספר שיטות ששימשו לניטור התקדמות הפסוריאזיס. שיטות אלה כללו ניקוד עור ובדיקות התנהגותיות. בנוסף, אימתנו עוד יותר את ממצאי הניסוי באמצעות שימוש בניתוח היסטופתולוגי, בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים (ELISA) ותגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך (RT-qPCR). מודל זה מתאים לא רק לחקר הפתוגנזה של פסוריאזיס אלא גם להערכה פרה-קלינית של גישות טיפוליות חדשות, מה שהופך אותו לכלי רב ערך במחקר.

פרוטוקול

פרוטוקול השימוש בבעלי חיים המפורט להלן נבדק ואושר על ידי ועדת הרווחה והאתיקה המוסדית של אוניברסיטת גואנגשי לרפואה סינית (DW20191220-153). תעודת החיה של העכברים שנרכשו הייתה SCXK (Xiang) 2024-0009. במחקר זה, עכברים נקבות C57BL/6J בנות 8 שבועות, בדרגת SPF, חולקו באופן אקראי לקבוצות, כל קבוצה הכילה 6 עכברים. הכלוב ממוקם בחדר מבוקר טמפרטורה (23 ± 2 מעלות צלזיוס, מחזור אור/חושך של 12 שעות) עם גישה חופשית למזון ומים. תרשים הזרימה של הניסוי מוצג באיור 1. מלבד אי השראת קרם IMQ, העכברים בקבוצת הביקורת קיבלו את אותם טיפולים כמו אלה בקבוצת IMQ מכל הבחינות האחרות.

1. הכנת בעלי חיים

1. התחל לדגמן לאחר התאמת החיה לסביבה במשך שבוע. לפני תחילת הניסוי, יש לחטא בקפידה את שולחן הניסוי באמצעות תמיסת אתנול של 75%.
2. בעזרת עט טוש, סמנו בבירור את זנבות העכברים, והבטיחו את זיהויים האישי.
3. השתמש במכונת הגילוח כדי לגלח את שיער הצוואר והגב של כל העכברים לשטח של כ-4 ס"מ על 3 ס"מ (יום 0; איור 2A). השתמשו במקלון צמר גפן כדי למרוח כמות מתאימה של קרם אפילציה על העור המגולח ולמרוח אותו באופן שווה (איור 2B).
4. לאחר מריחת קרם האפילציה יש להמתין כ -15 שניות. השאירו את קרם האפילציה על פני העור של העכבר למשך 15-20 שניות אופטימליות. נגב בעדינות ובמהירות.
5. השתמש במקלון צמר גפן חדש כדי להשרות אותו במים ונגב שוב ושוב בכיוון מזנב העכבר לראש כדי לנקות את השיער. יש לייבש בעדינות את העור המקומי עם נייר סופג רפואי.
6. בדוק את מצב העור של עכברים 24 שעות לאחר האפילציה ולא לכלול את אלה עם אזורי אפילציה פגומים.

2. מודל עכבר פסוריאזיס המושרה על ידי IMQ

1. ודא שהנזק הקל לעור שנגרם כתוצאה מגילוח או אפילציה מתאושש במלואו.
2. החל מהיום^השני , יש למרוח קרם IMQ 5% במינון של 62.5 מ"ג⁷. לשם כך, מלאו מראש את כל המזרק של 1 מ"ל בקרם IMQ מראש ותנו את התרופה לעכבר בהתאם לנפח המתאים ל-62.5 מ"ג IMQ ליום לעור המנופח של העכבר באמצעות כף בעלת ידית שטוחה (איור 2C). במהלך היישום, ודא שקרם ה-IMQ נמרח בצורה אחידה ככל האפשר על האזור המפוזר, ואזור המריחה קטן יותר מהאזור המפוזר.
3. לאחר מריחת התרופה, הניחו את העכבר בכלוב ריק והמתינו 15 דקות. החזירו את העכבר לכלוב ההאכלה לאחר שהתרופה נספגה לחלוטין. בצע את יישום התרופה ברציפות במשך 7 ימים.

3. ניתוח משקל גוף של עכברי פסוריאזיס

1. הניחו נקייה על איזון אלקטרוני וטרפו אותה. לאחר מכן, הנח בעדינות את העכבר בפנים ושים לב לקריאות היציבות המוצגות על האיזון.
2. מהיום הראשון (היום שלפני היישום הראשוני של IMQ), שקלו את העכברים מדי יום עד היום ה-8. השווה את המשקל של כל עכבר למשקל המקביל לו ביום הראשון.

4. אפיון עור של עכברי פסוריאזיס

1. הניחו את העכברים על רקע לבן עם סרגל. שמרו על גופם של העכברים ישרים בלי לכווץ את ראשיהם או לבצע תנודות גדולות (איור 3).
2. מהיום הראשון, צלם ברזולוציה גבוהה של אתר הניהול של העכברים באותה עוצמת תאורה בכל יום ותעד את אפיון העור של העכברים.
3. במהלך כל סשן צילום, שמור על עקביות המרחק בין המצלמה לעכברים, כמו גם על הגדלת המצלמה, ומקם את הסרגל בניצב למצלמה.

5. ניקוד עור

1. ציינו את חומרת פסוריאזיס דרמטיטיס בעכברים באמצעות מדד השטח והחומרה של פסוריאזיס (PASI)¹⁷ בכל יום מהיום הראשון עד היום השמיני. העסיקו שלושה חוקרים המשתמשים בשיטה כפולת סמיות כדי לדרג באופן עצמאי אריתמה, קשקשים ועובי עור בסולם של 0 עד 4, תוך התחשבות בממוצע האריתמטי של השלושה. לכללי ניקוד PASI, עיין בטבלה 1.
   ציון PASI = אריתמה + סולם + עובי

6. תצפית התנהגותית על עכברים

1. באותה סביבה שקטה ומוארת בדרך כלל בטמפרטורת החדר (כמו בשלב 4), הניחו כל עכבר בקופסה אקרילית נפרדת (10 ס"מ על 10 ס"מ) עם כמות קטנה של ריפוד קלחי תירס בתחתית.
2. השתמש במחיצות שחורות כדי להפריד כל קופסה ולחסום את קו הראייה. לאחר תקופת הסתגלות של 15 דקות, הקליטו בווידאו את התנהגות בעלי החיים למשך שעה.
3. הקלט סרטוני התנהגות בשעה קבועה בכל יום מהיום הראשון עד היום השמיני. מקם את עדשת המצלמה בניצב לקופסת האקריליק וודא שהיא לוכדת במלואה את פעילויות העכבר בפנים.
4. תעד מקרים שבהם העכבר מרים את כפו האחורית כדי לשרוט את הצוואר והגב ולאחר מכן מוריד אותה כהתנהגות גירוד אחת.

7. איסוף הדם ומדידת רמות הציטוקינים בסרום על ידי ELISA

1. הסר את גלגלי העיניים של העכברים במהירות בעזרת מלקחיים ואסוף את הדם ביום 9.
2. השאירו את הדם לעמוד על 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. הפרד את הדם באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה נמוכה ב-3000 x גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. יש לאסוף את הסרום ולאחסן אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
3. כמת את רמות TNF-α, IL-17A ו-IL-23 בסרום באמצעות ערכת ELISA הרלוונטית לפי פרוטוקול¹⁸ של היצרן.

8. דגימת העור והטחול

1. על פי תקנות ועדת האתיקה הרלוונטית לניסויים בבעלי חיים, יש לעקור את חוליות צוואר הרחם של עכברים לצורך המתת חסד לאחר איסוף הדם ביום התשיעי.
2. לאחר המתת חסד, חותכים את נגעי העור בגב העכברים לשתי מנות. טבלו חלק אחד בצינור צנטריפוגה של 5 מ"ל עם תמיסת פרפורמלדהיד 4% לקיבוע ושימור. יש להפריד ולארוז את החלק השני של רקמות העור ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.
3. השתמש במספריים מעוקרים כדי לחתוך את העור לאורך קו האמצע של בטן העכבר, לחשוף את חלל הבטן ולמצוא ולהסיר לחלוטין את הטחול. שטפו את הדגימות במי מלח רגילים סטריליים, ואז הכניסו אותן למי מלח רגילים, שקלו אותן ורשמו את הנתונים.

9. ניתוחים היסטולוגיים של קטעי עור

1. הסר את רקמת העור מהפרפורמלדהיד והנח אותה בקופסת ההטבעה.
2. בצע את השלבים הבאים על העור: השתמש באלכוהול שיפוע מ-75% ל-100% (מריכוז נמוך לגבוה), עם שלושה מיכלים של 100% אלכוהול. השאירו אותו בכל מיכל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש בשני מכלים של קסילן. השאירו אותו בכל מיכל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. השתמש בשלושה מיכלים של שעוות פרפין עם נקודת התכה של 56-58 מעלות צלזיוס. השאירו אותו בכל מיכל למשך שעה בטמפרטורת החדר.
3. הטמיעו את רקמת העור המטופלת: הניחו את רקמת העור הספוגה בשעווה זקופה בתבנית פרפין. יוצקים את הפרפין המומס לתבנית כאשר טמפרטורת הפרפין המוטמעת גבוהה ב-5-7 מעלות צלזיוס מנקודת ההיתוך של הפרפין. העבירו אותו במהירות לשולחן ההקפאה כדי לקרר ולמצק את גוש השעווה במהירות.
4. הקפיאו את גוש השעווה ל-0 מעלות צלזיוס, הוציאו אותו מקופסת ההטבעה, קבעו אותו על שולחן ההידוק של הפורס ופרסו אותו לעובי של 3 מיקרומטר.
5. השתמש בפינצטה כדי לאסוף את הפרוסות ולהלבין אותן במים חמים בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס. חבר את הקטע למרכז החלק החלק של השקופית וסמן את המספר הפתולוגי באזור החלבי בעזרת עיפרון. הטה את השקופית ל-45 מעלות לרגע כדי לאפשר ללחות לזרום החוצה, ואז הכניס אותה לתנור בחום של 62 מעלות צלזיוס ואופה במשך 30 דקות.
6. מכתים: מניחים את הפרוסות בקסילן למשך 5 דקות, ואז במיכל אחר של קסילן למשך 5 דקות, באתנול נטול מים למשך דקה, ב-95% אתנול למשך דקה, ב-85% אתנול למשך דקה אחת וב-75% אתנול למשך דקה. יש לשטוף במי ברז למשך דקה, להכתים בתמיסת המטוקסילין למשך 5 דקות ולשטוף את תמיסת ההמטוקסילין מתחת למים זורמים למשך דקה.
7. משרים באתנול חומצה הידרוכלורית 1% למשך 3 שניות, שוטפים במים למשך 20 שניות, משתמשים במים חמים להחזרה כחולה למשך 5 דקות, שוטפים במים זורמים למשך 2 דקות, מכתימים עם 0.5% אאוזין למשך דקה, משרים באתנול 95% למשך 2 שניות, ואז באתנול 95% למשך 2 דקות, באתנול נטול מים למשך 4 דקות, במיכל אחר של אתנול נטול מים למשך 4 דקות, בקסילן למשך 4 דקות, במיכל אחר של קסילן למשך 4 דקות, ובמיכל האחרון של קסילן למשך 4 דקות. לאחר הייבוש באוויר, אטמו אותו עם מסטיק ניטרלי.
8. התבונן בקטעים תחת מיקרוסקופ וצלם באופן אקראי בשלושה מיקומים בהגדלה של 400. עבור כל תמונה, מדוד באופן אקראי את עובי האפידרמיס בחמישה מיקומים באמצעות תוכנת Image J. רשום ונתח את הנתונים.

10. מדידת רמות ה-mRNA של IL-17A, IL-17F, IL-23 ו-IFN-γ בעור על ידי RT-qPCR

1. לוקחים את רקמת העור המאוחסנת במקרר בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, במשקל של כ-100 מ"ג, ומחלצים RNA בשיטת טריזול.
2. תמלול הפוך ל-cDNA לפי ערכת השעתוק ההפוך (VAZYME, סין).
3. הגדר את מערכת תגובת ה-PCR בהתאם למדריך ובצע PCR בזמן אמת באמצעות מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי תחת נוהל התגובה שצוין (טבלה 2) ורצף פריימר (טבלה 3).
4. לאסוף נתוני PCR כמותיים פלואורסצנטיים בזמן אמת, לחשב ולנתח את התוצאות באמצעות אלגוריתם qPCR (שיטת 2-ΔΔCt).

תוצאות

לאחר מתן רציף של IMQ, עכברים בקבוצת IMQ הראו תסמינים קליניים של העור האחורי המזכירים פסוריאזיס (איור 4), כאשר האזור המושרה על ידי IMQ מציג את הסימפטומים האופייניים של אריתמה, קשקשים ועובי (איור 5). לעומת זאת, קבוצת הביקורת לא הראתה תסמינים דומים לאלה של קבוצת IMQ. בהשוואה לקבוצת הביקורת, אריתמה וקשקשים מינוריים החלו להופיע בקבוצת IMQ מהיום השלישי (איור 5A,C). ביום החמישי, העכברים האלה פיתחו פלאק חודרני עם קשקשים מוג...

דיון

המחקר שלנו משתמש ב-IMQ כדי לגרום לנגעי עור דמויי פסוריאזיס, ובכך לבנות מודל פסוריאזיס. ניתן להשתמש במודל זה כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות פסוריאזיס ולספק תובנות לפיתוח טיפולים למצב. במחקר של ואן דר פיטס⁷, כאשר ניתנה בתחילה אינדוקציה IMQ, זמן הזירוז נקבע ל-5 או 6 ימים. עם זאת, ג'אבין ועמיתיו הציעו כי החומרה של מודלים של פסוריאזיס הנגרמת על ידי IMQ תגיע לערך מקסימלי מהיום^ה-6 ליום ה-8 לאחר היישום של IMQ¹⁶. ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5% Imiquimod קרם	סצ'ואן מדשיין פרמצבטיקה ושות'
75% אתנול	XUE HUAN	20240401
איזון אנליטי	sartorius	SQP
קרם אפילציה	רקיט בנקיזר	20240612 08X
משקל אלקטרוני	Yingheng Technology	7915
נייר טישו רפואי	JD	20221208
מכונת גילוח	HORD shenjian	AUX-C6S
ספוגית כותנה מעוקרת	Beilun נהר	20230728

40220602