מאמר שיטה

אפיון התנהגותי של התקפים הנגרמים על ידי Pentylenetetrazole: מעבר לסולם Racine

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68112

⸱

8 ביולי 2025

 ,  , 
1Brain Institute, Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול מציג שיטה חדשנית לניתוח והדמיה של התנהגויות הקשורות להתקפים המושרים על ידי פנטילנטרזול בעכברים. גישה זו משתרעת מעבר לציונים המסורתיים של רסין, ומספקת הערכה מקיפה יותר של המגוון והדינמיקה הזמנית של התנהגויות איקטליות.

תקציר

אפיון התנהגותי מפורט של התקפים חיוני במודלים של אפילפסיה בבעלי חיים. למרות שקיימים פרוטוקולים שונים לגרימת התקפים, סולם רסין נותר השיטה המאומצת ביותר לכימות שלו. הסולם, שפותח בתחילה כדי לנקד את הגיוס הפרוגרסיבי של התנהגויות במהלך הדלקה חשמלית של מבנים לימביים, הפך מאז לסטנדרט לסיווג התקפים על פני מודלים עם אטיולוגיות שונות.

עם זאת, בחינה מדוקדקת של התנהגות לאחר מתן פנטילנטטרזול (PTZ), מודל התקפים נפוץ, מגלה כי סולם רסין אינו יכול ללכוד את כל הספקטרום של שינויים התנהגותיים הנגרמים על ידי אנטגוניסט GABAergic זה. לאחר הזרקת PTZ תת עורית אחת במינון גבוה, עכברים מפגינים תחילה התנהגויות לא עוויתיות כגון היפוטוניה, ירידה באמבולציה, עצירת התנהגות ורעד. אחריהם מגיעות התנהגויות איקטליות, כולל עוויתות, טלטולים מיוקלוניים והתקפים לימביים, אם כי רק האחרון מכומת על ידי סולם רסין.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, נעשה שימוש בגישה מעודנת המשלבת תיוג וידאו עם מעקב אחר בעלי חיים כדי להבחין בין עוויתות ומיוקלונוס כביטויים התנהגותיים מובהקים מהתקפים לימביים. התנהגויות מוקדמות אלה עשויות להקל על גיוס מבנים לימביים, ובסופו של דבר לעורר התקפים לימביים. השיטה פשוטה ליישום ומאפשרת הערכה מקיפה יותר של התקפים חריפים הנגרמים על ידי PTZ. התועלת שלו ניכרת עוד יותר בפרוטוקול ההדלקה של PTZ, שבו מינונים נמוכים חוזרים ונשנים של PTZ גורמים לשינויים זמניים בעוויתות, מיוקלונוס וחומרת ההתקפים הלימביים. גישה זו טומנת בחובה פוטנציאל לשיפור יכולת השחזור במחקר התקפים ואפילפסיה.

מבוא

אפיון התנהגותי של התקפים הוא הקריאה הנפוצה ביותר במחקרים על הפתופיזיולוגיה של אפילפסיה ופעילות התקפים, והוא נמצא בשימוש נרחב להקרנה של תרופות חדשות נגד פרכוסים 1,2. רוב העבודות שפורסמו ב-50 השנים האחרונות השתמשו במערכת הניקוד הפרוגרסיבי שפותחה על ידי רונלד ג'יי רסין כדי לתאר חומרת התקפים התנהגותיים במהלך האמיגדלה והדלקת ההיפוקמפוס3. סולם רסין הראה מתאם חזק בין התנהגות לפעילות פרוקסימלית אלקטרופיזיולוגית בחולדות3 וחתולים4. הוא מסווג את הביטוי ההתנהגותי של ההתקף לחמישה שלבים מתקדמים: "(i) תנועות פה ופנים, (ii) הנהון ראש, (iii) קלונוס הגפיים הקדמיות, (iv) התרוממות ו-(v) גידול ונפילה"3. בשל פשטותו, קלות השימוש והפרשנות, מהירות הניקוד ויכולת השחזור, השימוש בסולם רסין במחקרי אפילפסיה והתקפים ממשיך לגדול גם בימינו (איור 1).

figure-introduction-1
תרשים 1: מספר הציטוטים השנתיים שהתקבלו במחקר של רסין משנת 1972. שימו לב לעלייה המתמדת במספר הציטוטים ב-50 השנים האחרונות. חיפוש ב-Web of Science שבוצע ב-27 בנובמבר 2024 חשף 6,040 ציטוטים, ו-91 רשומות לא הכילו מידע בתחום 'שנת הפרסום'. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לאחר מכן הסולם יושם על מודלים אחרים של בעלי חיים של אפילפסיה והתקפים, כולל אלה המשתמשים בתרופות כדי לגרום להתקפים. התיאורים המוקדמים של התקפים המושרים על ידי חומצה קאינית5 וסטטוס אפילפטיקוס (SE)6, כמו גם מקומי7 ו-SE 8 המושרה על ידי פילוקרפין, השתמשו בסולם רסין כדי לכמת התקפים מושרים וספונטניים כאחד. מעניין שתרופות אלה לא גרמו רק להתקפים לימביים, כפי שנצפה בבעלי חיים בעלי גירוי חשמלי ותוארו על ידי רסין, אלא הם גם עוררו קבוצה שונה של התנהגויותשתוארו בצורה גרועה או לעתים רחוקות יותר.

המגבלות של סולם רסין לתפיסת מגוון ההתנהגויות האיקטליות זוהו מוקדם על ידי חוקרים המשתמשים במודלים של התקפים שבהם מוקד ההתקף נמצא באזורים אחרים במוח מלבד המערכת הלימבית. לדוגמה, גרסיה-קיירסקו היה אחד הראשונים שהשתמשו בכלים אתולוגיים כדי להעריך את ההתנהגות בהתקפים אודיו-גניים10, וחשף את המורכבות וההתקדמות הזמנית של התנהגויות איקטליות 10,11. לאחרונה, איוון סולטס השתמש בניתוח עומק וידאו מתוחכם ובקידוד זמני מפורט כדי לחשוף 'טביעות אצבע התנהגותיות נסתרות' בחולדות שהודלקו חשמלית12. בהתבסס על גישות אלה, מוצגת כאן מערכת קידוד חדשה להתקפים חריפים המושרים על ידי פנטילנטטרזול בעכברים.

Pentylenetetrazole (PTZ) מוביל להתקפים על ידי עיכוב העברה עצבית GABAergic13, וכתוצאה מכך ריגוש עצבי מוגבר והפעלה סינכרונית של אוכלוסיות עצביות 14,15. לאחר מינון גבוה יחיד (40-80 מ"ג/ק"ג) של PTZ מערכתי, מכרסמים מציגים ניידות מופחתת, תנועות שפם לא ספציפיות, עוויתות בכל הגוף וטלטלות מיוקלוניות, קלונוס פה ופנים וכפות והתקפים לימביים מלאים16. בניגוד למודלים של סטטוס אפילפטיקוס, התנהגות חריגה לאחר PTZ נמשכת עד שעה אחת ומעבירה באופן ספונטני 16,17,18. מחברים קודמים הציעו גרסה מתוקנת של סולם רסין עבור חולדות17 ועכברים18. למרות ניסיונם לספק תובנות חדשות לגבי מגוון ההתנהגויות האיקטליות, הסולם החדש שלהם משלב רמה אחת או שתיים חדשות, הקשורות לריצה פראית ו/או קפיצה (רמה 6, van Erum et al.18) והארכת טוניק המובילה לדום נשימה (רמה 7, van Erum et al.18).

פרוטוקול זה מציג גישה חדשה לכימות וייצוג התנהגויות איקטליות הנגרמות על ידי PTZ, עם דגש ספציפי על עוויתות ומיוקלונוס. התנהגויות אלו הן בין הנפוצות ביותר לאחר מתן PTZ מערכתי, אך לעתים קרובות מתעלמים מהן במחקרי התקפים ואפילפסיה. לפיכך, גישה זו מטפלת בפער מתודולוגי קריטי על ידי מתן קריטריונים ספציפיים לזיהוי עוויתות ומיוקלונוס והבחנה התנהגותית בינם לבין התקפים לימביים. הוא מדגים כי עוויתות ומיוקלונוס מציגים דינמיקה זמנית מובהקת לאחר מתן PTZ יחיד וחוזר ונשנה. מערכת קידוד זו קלה ליישום, משלבת פרמטרים חדשים של פעילות חריגה במתודולוגיות קיימות, ומציעה תובנות חדשות לגבי מנגנוני יצירת התקפים. לבסוף, לאסטרטגיה חדשה זו יש פוטנציאל לתקנן את כימות ההתנהגות האיקטלית במעבדות, לשפר את יכולת השחזור ולהרחיב את נקודות המבט על מנגנוני התפיסה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הליכי הניסוי אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית של האוניברסיטה הפדרלית של ריו גרנדה דו נורטה (פרוטוקול מספר 043/2022, מספר רישיון 307.043/2022). בפרוטוקול זה נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6 בגילאי 3 עד 4 חודשים, עם גודל מדגם מומלץ של 6-10 בעלי חיים על פי פרוטוקולי אינדוקציה PTZשנקבעו 16.

1. הכנת זירת התצפית

  1. השתמש בזירה מרובעת או עגולה עם שטח פנים של לפחות 10X10 ס"מ וגובה קיר של 30 ס"מ. ודא שהזירה מוארת היטב. במידת הצורך, השתמש בתאורת אינפרא-אדום כדי להבטיח רכישת תמונה רוויה (איור 2A).
  2. מקמו לפחות מצלמת וידאו אחת מעל הזירה, עם מבט מלמעלה למטה על כל רצפת הזירה ולפחות 10 ס"מ מהקיר (כדי ללכוד התנהגות גידול מבלי לחתוך את ראש העכבר, איור 2B).
  3. אם תרצה, הצב מצלמת וידאו שנייה עם מבט חזיתי על הזירה. במקרה זה, ודא שאחד מקירות הזירה שקוף.
  4. ודא שהטמפרטורה (21-24 מעלות צלזיוס) והלחות (50-70%) תואמות את תנאי מתקן החיות, ניטור אותם באמצעות מד לחות תרמי והתאמת לפי הצורך.
  5. הניחו את המצעים הדרושים כדי לכסות את תחתית הזירה וודאו שהחיה נראית מהרקע. הפוך מים וכדורי מזון לזמינים באופן חופשי במהלך כל משך הניסוי.
  6. התחל ניסויים רצוי בתחילת שלב האור (למשל, בין 7:00 ל-10:00 בבוקר). שמור על תאורה עקבית בחדר הניסוי (900-1,100 לוקס) עם מחזור אור/חושך של 12/12 שעות, עם אורות דולקים בשעה 6 בבוקר. השתמש במד לוקס כדי לאמת את תנאי התאורה קרוב לזירת ההקלטה, מה שמבטיח איכות הקלטת וידאו אחידה.
  7. חבר את המצלמה למכשיר הקלטת הווידאו כדי לרכוש את הסרטון עם לפחות 24 פריימים לשנייה (fps).

2. הכנת תמיסת ה- PTZ

הערה: ניתן לגרום להתנהגויות איקטליות (כלומר, עוויתות) במינונים המתחילים מ-40 מ"ג/ק"ג. התקפים לימביים נצפים במינונים של 60 מ"ג/ק"ג ומעלה. התקפי טוניק הקשורים לדום נשימה ומוות נצפים בדרך כלל ממינון של 80 מ"ג/ק"ג ומעלה. לפרוטוקול ההדלקה נעשה שימוש במינון של 40 מ"ג/ק"ג.

המינון עשוי להשתנות עבור זני עכברים שונים. מומלץ לערוך ניסוי פיילוט להגדרת מינון ה-PTZ המתאים ביותר לשאלת המחקר.

  1. יש לתת 10 מ"ל/ק"ג באמצעות הזרקות סיסטמיות לעכברים. לכן, ממיסים את אבקת ה-PTZ במים נטולי יונים כדי להגיע לריכוז הסופי של 4 או 6 מ"ג/מ"ל (למינונים של 40 ו-60 מ"ג/ק"ג, בהתאמה).
    הערה: כדי להפחית את השונות, הכן פתרון PTZ יחיד עבור כל אצווה הניסוי.

3. ניהול PTZ

  1. לפני שמניחים את החיה בזירה, יש למדוד את משקל גופה באמצעות משקל.
  2. חשב את נפח תמיסת ה- PTZ הדרושה לכל בעל חיים על סמך משקל גופו.
    הערה: למינון של 60 מ"ג/ק"ג ומשקל גוף של 30 גרם, יש להזריק לבעל החיים 0.3 מ"ל של תמיסת PTZ של 6 מ"ג/מ"ל.
  3. רשום את ההתנהגות לפחות שעה אחת לפני הזרקת ה-PTZ.
    הערה: תקופת ההתרגלות הזו מפחיתה את האמבולציה והחרדה הנגרמות על ידי חידוש, בעוד שניתן להשתמש בה גם כדי לחלץ את הפעילות הבסיסית.
  4. נהל PTZ תוך צפקי (i.p.) או תת עורי (s.c.)15,16. עבור מתן s.c., אבטחו את החיה ביד אחת, וצבטו בעדינות את העור בין השכמות שלה (איור 2C).
  5. בעזרת מזרק של 1 מ"ל המחובר למחט 26 1/2 גרם, הכנס את המחט לתוך החלל התת עורי, במקביל לכיוון הגוף, והזריק לאט את התמיסה לחלל התת עורי. הסר בעדינות את המחט בסיום ההזרקה, החזק את העור ביציאת המחט כדי למנוע את שפיכת התמיסה החוצה עקב לחץ חורים (איור 2C).
    הערה: אסור לתת זריקות מהר מדי, שכן הצטברות מהירה של התמיסה עלולה להוביל לשפיכה ממקום ההזרקה או לדליפה בעת הסרת המחט.
  6. רשום לעצמך כל דליפה, מכיוון שהיא תשפיע על הביטוי של התנהגויות איקטליות. שקול את האפשרות של הזרקה מיידית של 50 מיקרוליטר נוספים של אותה תמיסת PTZ.
  7. מקם את החיה בחזרה בזירה למשך שעה אחת של הקלטת וידאו רציפה.
  8. שעה לאחר הזרקת PTZ (או יותר), עצור את ההקלטות והעתק את הקובץ לעיבוד לאחר (מעקב וידאו וקידוד התנהגותי).

figure-protocol-1
איור 2: מערך ניסוי והליך הזרקה. (A) ארבע זירות מרובעות שקופות עם מצלמות ראייה מלמעלה למטה הממוקמות מעל המרכז שימשו לתיעוד התנהגויות ומעקב אחר מיקומי בעלי חיים לפני ואחרי מתן PTZ. (ב) תמונת מצב של סרטון מייצג אחד שהושג עם ההגדרה המתוארת ב-A. (C) דוגמה להזרקה תת-עורית של PTZ. המחט ממוקמת בין השכמות של החיה בחלל התת עורי. (ד) ייצוג סכמטי של איסוף הנתונים ההתנהגותיים והניתוחים ששימשו במחקר הנוכחי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. רווחת בעלי חיים

  1. הסר והמתת חסד של בעלי חיים אם ההתקף נמשך יותר מ-5 דקות כדי למנוע מוות של תאים ונזק לרקמת המוח, במיוחד במהלך פרוטוקולי זריקות חוזרות.
  2. עקוב אחר משקל החיות מדי יום לאורך כל תקופת הניסוי.
  3. עקוב אחר מצבם הכללי של בעלי החיים, כולל צריכת מזון, תנועה, יציבה, טיפוח וסימני כאב או מצוקה.
  4. מתן טיפול אנטי דלקתי (איבופרופן, 5 מ"ג/ק"ג) וטיפול בכאב לפי הצורך. ספק מזון או מים משלימים במידת הצורך.
  5. הסר בעלי חיים אם הם מציגים ירידה במשקל של יותר מ-20% שלא ניתן לשחזר תוך יומיים מתוסף אישי, נגעים באפידרמיס או כל סימן של כאב כרוני או אי נוחות שאינם מגיבים לטיפול תרופתי.
  6. המתת חסד של כל בעלי החיים בהתאם להנחיות אתיות בינלאומיות ומוסדיות.

5. התקנה, קביעת תצורה ושימוש בתוכנה

  1. לצורך הניתוח המתואר במחקר זה, השתמש ב-MouseLabTrack19 וב-Solomon Coder. הורד אותם ובצע את הליך ההתקנה (ראה קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2).
    הערה: בעוד ש-MouseLabTrack פועל תחת מסגרת MATLAB, Solomon Coder הוא קובץ הפעלה עבור מערכת ההפעלה Windows. שתי התוכנות הן קוד פתוח.
  2. לחץ על Solomon בתפריט התחל של Windows או חפש את Solomon Coder ופתח את התוכנה.
    1. אם קובץ תצורה זמין (ראה קובץ משלים 3), עבור אל קובץ | תצורת עומס. המסך יטען את ההגדרות המוגדרות מראש.
    2. אם אין קובץ תצורה זמין,
      1. לחץ לחיצה ימנית על האזור הפנוי כדי ליצור כפתור חדש. לחץ לחיצה ימנית על הכפתור החדש שנוצר כדי לפתוח את מסך התצורה .
      2. בשדה שם לחצן , שנה את שם הלחצן כדי לייצג את אופן הפעולה הרצוי.
      3. בשדה צבע פני לחצן , בחר צבע.
      4. בשדה קטגוריות, שנה את השם ברירת מחדל לאופני פעולה (זה יהיה שם העמודה).
      5. בשדה מקש קיצור , הקצה מקש מקלדת כדי לסמן את ההתנהגות במהלך ניתוח וידאו (למשל, מקש "1").
      6. (אופציונלי) סמן את התיבה מעל מקש קיצור אם האירוע הוא מיידי, כלומר הוא ירשום אירוע בודד כאשר המקש נלחץ ומשוחרר. אם אפשרות זו אינה מסומנת, אופן הפעולה יישאר מתועד עד לשחרור המפתח.
    3. כדי לפתוח סרטון, עבור אל קובץ | פתח את וידאו.
    4. לחץ על הפעל כדי להפעיל את הסרטון.
    5. כאשר ההתנהגויות נצפות, לחץ על לחצן העכבר השמאלי או הקש על מקש המקלדת שהוקצה כדי לסמן אותן.
    6. כדי לשמור את הנתונים כקובץ ערכים מופרדים באמצעות פסיקים (.csv), עבור אל ניתוח | שמור פלט בשם. כדי לשמור את גיליון הקידוד של סולומון ( .arch), עבור אל קובץ | שמור גיליון קידוד.
  3. כדי לפתוח ולטעון את MouseLabTracker.
    1. פתח את MATLAB, במסוף, הקלד 'main()' ולחץ על Enter.
    2. כדי לטעון את הסרטון, לחץ על כפתור הפתיחה. לאחר הטעינה, המסך הסמוך יציג את הסרטון עם רקע ירוק ואת החיה בלבן.
    3. ציין את מרווח הזמן שיש לנתח בסרטון. לחץ על התחל כדי להגדיר את תחילת הניתוח. לחץ על סיום כדי להגדיר את סיום הניתוח.
      הערה: אם לא הוגדר מרווח זמן, התוכנה מנתחת את הסרטון כולו.
    4. כדי לקבוע את תצורת הגדרות המעקב, עבור אל הכרטיסיה הגדרות מעקב .
      1. בחר Dark Objects / Light Background כדי לציין שהחיה כהה יותר מהרקע.
      2. כדי להתאים את מספר בעלי החיים, עבור אל נושאים ושנה את המספר ל-1.
      3. כדי להתאים את פרמטרי הזיהוי, שנה את הגדרת הפרמטר סף כך שערכי הרדיוס יהיו בין 30 ל- 40.
      4. הגדירו את צבע החיה על ידי לחיצה על צבע ובחירת הצבע המתאים.
      5. כדי להגדיר את הזירה, לחץ על הגדר זירה, ולאחר מכן בחר את הפינה השמאלית העליונה של הזירה, ולאחר מכן בחר את הפינה הימנית התחתונה של הזירה.
    5. כדי להתחיל בתהליך המעקב, לחץ על מעקב. המתינו עד שמד ההתקדמות יגיע ל-100%.
    6. לאחר השלמת המעקב, שמור את קובץ הפלט של הניתוח על ידי לחיצה על שמור תוצאות.

6. התנהגויות קידוד

  1. ראשית, תייג את זמן ניהול ה-PTZ כאשר העכבר מופיע שוב בפריים הווידאו לאחר שהוצב בזירת התצפית. רגע זה משמש כזמן אפס, ומשמש כהתייחסות זמנית לכל ההתנהגויות האחרות, כולל חישובי חביון.
  2. צפו בעוויתות ומיוקלונוס כמה דקות לאחר הזרקת PTZ (איור 3), ואחריהם התקפים לימביים אפשריים. עוויתות הן התכווצויות קצרות, חולפות ומהירות של שרירי הציר, כולל כיפוף אוזניים דו-צדדי, התכווצות שרירי הגב, הרמת זנב (הזנב של שטראוב), ולעיתים נדירות, תגובת קפיצה בהלה (איור 3A). קוד מתכווץ כאירועים נפרדים, ומשייך אותם למסגרת וידאו אחת ללא משך זמן.
    הערה: כמת את המגוון והשילוב של חלקי גוף שונים בביטוי של עוויתות (ראה סעיף תוצאות מייצגות).
  3. כדי לקודד מיוקלונוס, התבונן באירועים ארוכים מ-200 אלפיות השנייה; הם מאופיינים בטלטול מיוקלוני פתאומי וחזק המערב את הראש, הצוואר והכפות. זה עשוי להיות קשור לרעידות ולאובדן תנוחת הגוף (איור 3B). תת-סיווג כולל מיוקלונוס עם רעידות או עם אובדן יציבה קדימה, שמאלה או ימינה. משך הזמן נע בדרך כלל בין 1 ל-2 שניות. בשל אורכם, מיוקלונוס דורש קידוד על פני מספר יחידות זמן עבור אירוע יחיד.
  4. כדי לקודד התקפים לימביים, התבונן באירועים הדומים לזה שתואר על ידי רסין וניתן לקודד אותם באמצעות סולם רסין. זה מתחיל בדרך כלל בדום התנהגותי או כישוף בהייה, ואחריו אוטומטיזמים של חוש הריח והטעם, תנועות פה ופנים, מיוקלונוס של הגפיים הקדמיות ו/או הראש, גידול עם או בלי נפילה, ריצה פראית או קפיצה והתקף טוניק עם דום נשימה. השתמש בסולם רסין18 המותאם כדי לסווג התקפים לימביים, הנמשכים יותר מ-10-15 שניות וניתן להבחין בינם לבין עוויתות ומיוקלונוס.
  5. כלול שיעורי התנהגות נוספים המבוססים על פרוטוקול הניסוי, המאפשרים סינון מקיף יותר של התנהגויות.
  6. סמן את סיום סשן ההקלטה במסגרת זמן אחת (שעה לאחר הזרקת PTZ). אם החיה מתה לאחר התקף טוניק, זהה את זמן המוות עם סימן הסיום.
    הערה: ניתן לשמור את גיליון הקידוד בכל שלב במהלך תהליך הקידוד ולפתוח אותו מחדש בתוך התוכנה לפי הצורך להמשך קידוד או שינויים.

figure-protocol-2
איור 3: תמונות של התנהגויות ictal שנצפו לאחר מתן PTZ. (A) זוהי דוגמה מייצגת לאחת העוויתות הראשונות שנצפו לאחר הזרקת PTZ. כל המסגרות מוצגות (דגימה של 30 פריימים לשנייה). שימו לב שהעווית נמשכת פחות מ-200 אלפיות השנייה ונעה בכיוון הרוסטרוקאודלי. בדוגמה זו, לא התרחשה הרמת זנב גלויה. (B) דוגמה מייצגת של מיוקלונוס שמקושר לנטייה קדימה. בדוגמה זו, המיוקלונוס נמשך יותר משנייה אחת, שם התרחשו שיבוטים מרובים של זנב וגפיים קדמיות. (ג) דוגמה מייצגת להתקף לימבי. לפני שלב 1 של רסין, העכבר הראה מיוקלונוס גפיים מתמשך, כולל אובדן תנוחת הגוף. הרצף מציג את כל חמשת השלבים המסורתיים של סולם ראסין הקונבנציונלי. במקרה זה, העכבר יקבל ציון של 5. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

7. ניתוח נתונים וויזואליזציה

  1. חשב את זמן ההשהיה של המופע הראשון של כל אחת מקטגוריות ההתנהגות (למשל, עווית, מיוקלונוס, התקף וכו') על ידי הפחתת זמן הזרקת ה-PTZ מהזמן המתועד שלו בגיליון הקידוד.
  2. חשב את משך הזמן של כל מיוקלונוס ואירוע התקף, ולאחר מכן סכם אותם כדי לקבל את משך הזמן הכולל עבור כל קטגוריה.
  3. חשב את קצב ההתרחשות עבור כל התנהגות על-ידי חלוקת המספר הכולל של האירועים במשך ההקלטה.
  4. חשב את מרווח הזמן בין האירועים עבור כל התנהגות על-ידי מציאת הפרש הזמן בין אירועים עוקבים.
  5. הגדר אפיזודות בהתאם להתפלגות הזמנית של התנהגויות איקטליות בכל סשן הקלטה במידת הצורך. חשב את הפרמטרים לעיל עבור כל פרק.
    הערה: סיום ההתקפים מוביל לתקופת דיכוי פוסטיקטלית, המסמנת את סיומו של אפיזודה לפרוטוקול זה. הופעתן המחודשת של התנהגויות איקטליות מסמנת את תחילתו של פרק חדש.
    הערה: בהיעדר התקפים, סווג את סשן ההקלטה על סמך ההתפלגות הזמנית של עוויתות ומיוקלונוס.
  6. בדיקת נורמליות באמצעות מבחן שפירו-וילק עבור כל קבוצה.
  7. להשוואות פרמטריות בין מספר קבוצות, השתמש במבחן ניתוח שונות חד כיווני (ANOVA). עבור נתונים מזווגים, השתמש במבחן t מזווג או ב-ANOVA במדידות חוזרות, בהתאם למבנה הנתונים.
  8. הגדר מובהקות סטטיסטית לערך p של < 0.05. בנוסף, עיגול ערכי p מתחת ל-0.0001 ודיווח עליהם כ-<0.0001.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להעריך את אסטרטגיית הקידוד ואת יכולתה לפרט התנהגויות איקטליות במהלך התקפים הנגרמים על ידי PTZ, נבדקו תחילה שלוש מנות של PTZ והשפעותיהן על עכברי C57BL/6 שנצפו (40, 60 ו-80 מ"ג/ק"ג, N = 7, 5 ו-5, בהתאמה). תוצאות התנהגותיות שנצפו על פני שלוש מנות של PTZ חשפו הבדלים ברורים תלויי מינון לאחר זריקה אחת. בעלי חיים שטופלו ב-PTZ של 40 מ"ג/ק"ג הראו עוויתות אך לא התקפים לימביים או מיוקלונוס. לעומת זאת, בעלי חיים שטופלו ב-60 ו-80 מ"ג/ק"ג ביטאו באופן עקבי עוויתות, מיוקלונוס והתקפים לימביים. שיעור התמותה היה 0% עבור בעלי חיים שקיבל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה השתמש בסיווג התנהגויות המבוססות על ביטויים מוטוריים כדי לספק מסגרת מקיפה יותר לניתוח דינמיקת התקפים. גישה זו מאפשרת לכמת פרמטרים מרכזיים, כולל חביון, משך ותדירות של עוויתות, מיוקלונוס והתקפים לימביים. תוצאות מזריקות PTZ שבועיות הראו כי חשיפה חוזרת משנה באופן משמעותי את התזמון והתדירות של ההתקפים הלימביים, עם ירידה ניכרת בהשהיה לעוויתות הראשונות וההתקפים הלימביים, לצד עלייה במשך ההתקפים הלימביים. בנוסף, זריקות יומיות במינון PTZ נמוך יותר חשפו שינוי זמני בעוויתות, המאופיין בתדירות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, מענקים מספרים 308110/2020-0 ו-316441/2023-6), Fundação de Amparo e Promoção da Ciência, Tecnologia e Inovação do Rio Grande de Norte (FAPERN, מספר מענק 042/2022) ו-Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, מספר מענק #385/2019), ו-Propesq-UFRN (מספר מענק PVP18039-2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.9% תמיסת נתרן כלוריFresenius Kabi Brasil Ltda74MK3168מערכת סגורה לשימוש תוך ורידי; תמיסה להזרקה, 250 מ"ל.
סולם אנליטישימדזוATY224קיבולת מקסימלית: 220 גרם, קיבולת מינימלית: 10 מ"ג, קריאות: 0.1 מ"ג. מספר סידורי: 1311070096
מצלמהאנונימיJortan-8816AHDמצלמת IR CCD, מערכת NTSC, רזולוציית 2.0 מגה פיקסל, עדשת 3.6 מ"מ, ספק כוח DC 12 וולט.
מד לוקס דיגיטלימיניפהMLM-1011מודד את עוצמת האור ביחידות לוקס.
מחט היפודרמיתדסקארפאק353101גודל 26.5 גרם.
עכברים--זכר C57BL/6 עכברים מסוג בר. בן חודשיים-שלושה.
Pentylenetetrazoleסיגמא-אולדריץ' (מרק)P6500-25Gאבקה, ממריץ מערכת העצבים המרכזית. רכישה: 25 גרם. אחסון: -25 & מעלות צלזיוס.
תוכנה: MouseLabTracker  ג'וליאנו ויללה-תוכנת קוד פתוח, נייר עזר: DOI: 10.1016/j.jneumeth.2006.04.005.
אתר: https://neuro.ufrn.br/softwares/mouselabtracker
תוכנה: Solomon CoderAndrá s Pé טר-תוכנת קוד פתוח, v.19.08.02.
אתר:  https://solomon.andraspeter.com/
תרמו-היגרומטרהיקאריהונג קונג-T240מודד טמפרטורה ולחות.

מקורות

  1. Rogawski, M. A., Löscher, W. The neurobiology of antiepileptic drugs. Nat Rev Neurosci. 5 (7), 553-564 (2004).
  2. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  3. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 32 (3), 281-294 (1972).
  4. Delgado, J. M. R., Sevillano, M. Evolution of repeated hippocampal seizures in the cat. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 13 (5), 722-733 (1961).
  5. Lothman, E. W., Collins, R. C. Kainic acid induced limbic seizures: metabolic, behavioral, electroencephalographic and neuropathological correlates. Brain Res. 218 (1-2), 299-318 (1981).
  6. Lévesque, M., Avoli, M. The kainic acid model of temporal lobe epilepsy. Neurosci Biobehav Rev. 37 (10 Pt 2), 2887-2899 (2013).
  7. Castro, O. W., et al. Comparative neuroanatomical and temporal characterization of FluoroJade-positive neurodegeneration after status epilepticus induced by systemic and intrahippocampal pilocarpine in Wistar rats. Brain Res. 1374, 43-55 (2011).
  8. Turski, W. A., et al. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res. 9 (3), 315-335 (1983).
  9. Leite, J. P., Garcia-Cairasco, N., Cavalheiro, E. A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Res. 50 (1-2), 93-103 (2002).
  10. Garcia-Cairasco, N., et al. New insights into behavioral evaluation of audiogenic seizures. A comparison of two ethological methods. Behav Brain Res. 48 (1), 49-56 (1992).
  11. Garcia-Cairasco, N., Rossetti, F., Oliveira, J. A. C., Furtado, M. deA. Neuroethological study of status epilepticus induced by systemic pilocarpine in Wistar audiogenic rats (WAR strain). Epilepsy Behav. 5 (4), 455-463 (2004).
  12. Gschwind, T., et al. Hidden behavioral fingerprints in epilepsy. Neuron. 111 (9), 1440-1452.e5 (2023).
  13. Macdonald, R. L., Barker, J. L. Specific antagonism of GABA-mediated postsynaptic inhibition in cultured mammalian spinal cord neurons: a common mode of convulsant action. Neurology. 28 (4), 325-330 (1978).
  14. Dhir, A. Pentylenetetrazol (PTZ) kindling model of epilepsy. Curr Protoc Neurosci. 58 (1), 9.37.1-9.37.12 (2012).
  15. Samokhina, E., Samokhin, A. Neuropathological profile of the pentylenetetrazol (PTZ) kindling model. Int J Neurosci. 128 (11), 1086-1096 (2018).
  16. Shimada, T., Yamagata, K. Pentylenetetrazole-induced kindling mouse model. J Vis Exp. (136), e56573(2018).
  17. Lüttjohann, A., Fabene, P. F., Van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
  18. Van Erum, J., Van Dam, D., De Deyn, P. P. PTZ-induced seizures in mice require a revised Racine scale. Epilepsy Behav. 95, 51-55 (2019).
  19. Tort, A. B. L., et al. A simple webcam-based approach for the measurement of rodent locomotion and other behavioural parameters. J Neurosci Methods. 157 (1), 91-97 (2006).
  20. Gelinas, J. N., Khodagholy, D., Thesen, T., Devinsky, O., Buzsáki, G. Interictal epileptiform discharges induce hippocampal-cortical coupling in temporal lobe epilepsy. Nat Med. 22 (6), 641-648 (2016).
  21. Nizinska, K., et al. Behavioral characteristics as potential biomarkers of the development and phenotype of epilepsy in a rat model of temporal lobe epilepsy. Sci Rep. 11 (1), 8665(2021).
  22. Monteiro, ÁB., et al. Pentylenetetrazole: A review. Neurochem Int. 180, 105841(2024).
  23. Barker-Haliski, M., Steve White, H. Validated animal models for antiseizure drug (ASD) discovery: Advantages and potential pitfalls in ASD screening. Neuropharmacology. 167, 107750(2020).
  24. Santucci, V., et al. EEG effects of IV infusion of pentylenetetrazol in rats: A model for screening and classifying antiepileptic compounds. Psychopharmacology. 87 (3), 337-343 (1985).
  25. Swinyard, E. A., Brown, W. C., Goodman, L. S. Comparative assays of antiepileptic drugs in mice and rats. J Pharmacol Exp Ther. 106 (3), 319-330 (1952).
  26. Krall, R. L., Penry, J. K., White, B. G., Kupferberg, H. J., Swinyard, E. A. Antiepileptic drug development: II. Anticonvulsant drug screening. Epilepsia. 19 (4), 409-428 (1978).
  27. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  28. McIntyre, D. C., Poulter, M. O., Gilby, K. Kindling: some old and some new. Epilepsy Res. 50 (1-2), 79-92 (2002).
  29. Yuskaitis, C. J., et al. Factors influencing the acute pentylenetetrazole-induced seizure paradigm and a literature review. Ann Clin Transl Neurol. 8 (7), 1388-1397 (2021).
  30. da Silva, L. F., Pereira, P., Elisabetsky, E. A Neuropharmacological analysis of PTZ-induced kindling in mice. Gen Pharmacol. 31 (1), 47-50 (1998).
  31. Copping, N. A., Adhikari, A., Petkova, S. P., Silverman, J. L. Genetic backgrounds have unique seizure response profiles and behavioral outcomes following convulsant administration. Epilepsy Behav. 101, 106547(2019).
  32. Medina, A. E., Manhães, A. C., Schmidt, S. L. Sex differences in sensitivity to seizures elicited by pentylenetetrazol in mice. Pharmacol Biochem Behav. 68 (3), 591-596 (2001).
  33. Pollo, M. L. M., Gimenes, C., Covolan, L. Male rats are more vulnerable to pentylenetetrazole-kindling model but females have more spatial memory-related deficits. Epilepsy Behav. 129, 108632(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GABAergic

מאמרים קשורים