Method Article

שיטה פשוטה ויעילה לבדיקת חומרים אימונומודולטוריים ליצירת תאים דנדריטיים טולרוגניים ממונוציטים CD14+ אנושיים

DOI:

10.3791/68159

⸱

April 11th, 2025

 , 
1Chemical and Biological Engineering Department, Drexel University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים הליך להערכת היכולת של חומרים פרמקולוגיים לייצר תאים דנדריטיים טולרוגניים מתאים דנדריטיים נאיביים שמקורם במונוציטים במבחנה ולאמת את עוצמתם על ידי יצירת תאי T רגולטוריים אוטולוגיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים דנדריטיים טולרוגניים (tolDCs) הם תת-קבוצה של תאים דנדריטיים (DCs) הידועים כמשפיעים על תאי T נאיביים לעבר פנוטיפ תאי T רגולטוריים (Treg). TolDCs נחקרים כיום כטיפולים לאוטואימוניות והשתלה, הן כטיפול תאי והן כשיטה לגרימת tolDCs מ-DCs אנדוגניים. עם זאת, עד כה, מספר התרופות הידועות לגרימת tolDCs מ-DCs נאיביים הוא קטן יחסית ועוצמתם ליצור Tregs in vivo לא הייתה עקבית, במיוחד טיפולים הגורמים ל-tolDCs מ-DCs אנדוגניים. זה מספק הזדמנות לחקור תרכובות חדשות ליצירת סובלנות.

כאן אנו מתארים שיטה לבדיקת תרכובות אימונומודולטוריות חדשות על DCs שמקורם במונוציטים (moDCs) במבחנה ומאמתים את הפונקציונליות שלהם ליצירת Tregs אוטולוגיים. ראשית, אנו משיגים PBMCs ומבודדים מונוציטים CD14+ ותאי CD3+ T באמצעות ערכות הפרדה מגנטיות זמינות מסחרית. לאחר מכן, אנו מבדילים מונוציטים ל-moDCs, מטפלים בהם עם אימונומודולטור מבוסס, כגון רפמיצין, דקסמתזון, IL-10 או ויטמין D3, למשך 24 שעות ובודקים את השינוי שלהם בסמנים טולרוגניים כאימות של הפרוטוקול. לבסוף, אנו מתרבתים במשותף את ה-tolDCs המושרים עם תאי T אוטולוגיים בנוכחות גירוי אנטי-CD3/CD28 וצופים בשינויים באוכלוסיות Treg ובהתפשטות תאי T. אנו צופים שימוש בפרוטוקול זה כדי להעריך את יעילותם של סוכנים אימונומודולטוריים חדשים לתכנת מחדש DCs שכבר מובחנים לקראת tolDC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים דנדריטיים (DCs) הם מתווכים קריטיים בין חסינות מולדת לנרכשת. DCs, השוכנים בעיקר בריריות, בעור וברקמת הלימפה, הם התאים המציגים אנטיגן (APCs) העיקריים1. DCs קולטים חלבונים זרים ומעבדים ומציגים אותם על חלבוני תאימות היסטולוגית עיקרית (MHC) לתאי T נאיביים. DCs מבטאים באופן ספציפי חלבוני MHC Class II, כגון אנטיגן לויקוציטים אנושיים-DR-DR (HLA-DR) בבני אדם. מצב ההפעלה של ה-DCs עם חשיפה לאנטיגן הוא קריטי לתגובת תאי T במורד הזרם2. DCs לא בשלים מבטאים קולטנים שונים לזיהוי דפוסים (PRRs) המזהים סוגים של מולקולות הנקראות דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן (PAMPs), כגון מרכיב דופן החיידקים, ליפופול....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל דגימות התאים החד-גרעיניים של הדם ההיקפי האנושי (PBMC) התקבלו מליבת האימונולוגיה האנושית של אוניברסיטת פנסילבניה מתורמים לא מזוהים באישור מראש של מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פנסילבניה (IRB) בהסכמת המטופל.

אופציונלי: בעוד שבשיטה זו, השתמשנו ב-PBMCs מבודדים טריים שהתקבלו ממעבדה אקדמית, ניתן לבודד PBMCs מדם מלא או ממוצרי דם מועשרים בלויקפרזיס. אנו ממליצים להשתמש בשיטת צנטריפוגת שיפוע צפיפות, מכיוון שמדובר בשיטה מבוססת ואמינה המתוארת במקום אחר23.

1. בידוד מונוציטים/תאי T והתמיינות moDC

  1. בידוד מונוציטים ותא....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיארנו פרוטוקול ל-PBMCs אנושיים, לבודד גם תאי CD3+ T וגם מונוציטים CD14+ באמצעות ערכות הפרדה מגנטיות זמינות מסחרית, להבדיל מונוציטים ל-CD14-, HLA-DR+, CD141+, CD1c+ moDCs באמצעות GM-CSF ו-IL-4, לטפל בהם במשך 24 שעות, ולבצע תרבית משותפת עם תאי T אוטולוגיים עם גירוי אנטי-CD3/CD28 למשך 72 שעות. סכמת ניסוי מוצגת באיור 1.

בידוד מונוציטים/תאי T והתמיינות moDC
עבור התוצאות המייצגות הראש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים שיטה אמינה ורב-תכליתית להערכת הפונקציונליות של חומרים אימונומודולטוריים כדי לגרום ל-tolDCs מ-moDCs ולאמת את הפונקציונליות שלהם ליצירת Tregs מתאי T אוטוגניים ex vivo. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, מונוציטים הם תאים רגישים לשמצה ויש להשיגם מ-PBMCs טריים שלא הוקפאו בעבר לקבלת התוצאות הטובות ביותר. יש לבודד מונוציטים בהקדם האפשרי ולהניח אותם בקוקטייל ההבחנה. בדרך כלל, תפוקת מונוציטים ירודה או שיעורים גבוהים של מוות מונוציטים ב-24 השעות הראשונות נובעים מ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לליבת האימונולוגיה האנושית של אוניברסיטת פנסילבניה (HIC) על אספקת PBMCs אנושיים טריים מתורמים. ה-HIC נתמך בחלקו על ידי NIH P30 AI045008 ו-P30 CA016520.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10 ומיקרו; L קצות פיפטות מסוננותVWR76322-158תרבית תאים כללית
1.5 מ"ל צינור צנטריפוגהVWR77508-358תרבית תאים כללית
10 מ"ל צנרת סרולוגיתVWR414004-267תרבית תאים כללית
100-1000 ומיקרו; L טיפים לפיפט מסונניםVWR76322-164תרבית תאים כללית
15 מ"ל צינור חרוטיVWR77508-212תרבית תאים כללית
20-200 ומיקרו; L קצות פיפט מסוננותVWR76322-160תרבית תאים כללית
2-מרקפטואתנולתרבית תאי Tביו-רפואית
194834 50 מ"ל צינור חרוטיVWR21008-736תרבית תאים כללית
60 x 15 מ"מ צלחת, Nunclon DeltaThermo Fischer150326תרבית תאים כללית
96 צלחת תחתונה חרוטית (V) היטבלא מטופל תרמו פישר277143תרבית תאים כללית
96 באר צלחת תחתונה שטוחהתרמו פישר161093תרבית תאים כללית
APC/Cyanine7 אנטי אנושי CD272 (BTLA) נוגדןBiolegend344518זרימה ציטומטריה
Attune NxT (לייזר אדום/כחול, 7 ערוצים)תרמו פישרA24863ציטומטריית זרימה
BSAתרמו פישר15260-037תא כללי תרבית
CD14 נוגדן חד שבטי (61D3), PEThermo Fischer12-0149-42זרימה ציטומטריה
CD1c נוגדן חד שבטי (L161), PE-ציאנין7תרמו פישר25-0015-42זרימה ציטומטריה
CD209 (DC-SIGN) נוגדן חד שבטי (eB-h209), PerCP-ציאנין5.5תרמו פישר45-2099-42זרימה ציטומטריית
CD25 נוגדן חד שבטי (CD25-4E3), APCתרמו פישר17-0257-42זרימה ציטומטריה
CD274 (PD-L1, B7-H1) נוגדן חד שבטי (MIH1), PEתרמו פישר12-5983-42זרימה ציטומטריה
CD4 נוגדן חד שבטי (RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42זרימה ציטומטריה
CD40 נוגדן חד שבטי (5C3), APCThermo Fischer17-0409-42זרימה ציטומטריה
CD40 נוגדן חד שבטי (5C3), APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42Flow Cytometry
CD69 נוגדן חד שבטי (FN50), PEThermo FischerMA1-10276Flow Cytometry
CD86 נוגדן חד שבטי (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601Flow Cytometry
CD8a נוגדן חד שבטי (RPA-T8), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0088-42ציטומטריית
זרימהתחתית חרוטית (V-well) 96 באר צלחתתרמו פישר2605זרימה ציטומטריה
בקבוקונים קריוגניים, 2 מ"לתרמו פישר430488תרבית תאי T
דימתילסולפוקסיד (DMSO), רצף כיתהתרמו פישר20688תרבית תאים
כללית DPBSתרמו פישר14200166תרבית תאים כללית
EasySep ערכתבידוד מונוציטים אנושייםטכנולוגיות תאי גזע19359הפרדת תאים
ערכת בידוד תאי T אנושיים EasySepטכנולוגיות תאי גזע17951הפרדת תאים
תאי גזעמגנט EasySep18000הפרדת תאים
EDTAתרמו פישרAIM9260Gתרבית תאים כללית
פלקון צינורות פוליסטירן עגולים תחתונים, 5 מ"לטכנולוגיותתאי גזע38025הפרדת תאים
מעכב קשירת קולטן Fc נוגדן פוליקלונליתרמו פישר14-9161-73זרימה ציטומטריה
סרום בקר עוברי תרמופישרA5670701תרבית תאים כללית
כדאיות ניתנת לתיקון צבע eFluor 780תרמו פישר65-0865-18זרימה ציטומטריה
Foxp3 / סט מאגר צביעת גורם שעתוקתרמו פישר00-5523-00זרימה ציטומטריית
FOXP3 נוגדן חד שבטי (PCH101), PE-ציאנין5.5תרמו פישר35-4776-42ציטומטריית זרימה
HBSSתרמו פישר14170-112תרבית תאים כללית
סרום בקר עוברי מומת בחוםתרמו פישרA5670801תרבית תאים כללית
HEPES (1 מ')תרמו פישר15630106תא moDC תרבית
HLA-DR נוגדן חד שבטי (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009Flow Cytometry
Human CD3/CD28/CD2 T Cell ActivatorStemCell Technologies10970T Cell Culture
Human GM-CSF חלבון רקומביננטיThermo Fischer300-03moDC תרבית תאים
אנושית IL-10 ELISA Kit, רגישות גבוההThermo FischerBMS215-2HSאליסה
IL-4 אנושי, חלבון רקומביננטי ללא בעלי חייםתרמו פישרAF-200-04תרבית תאים של moDC
PBMC אנושי (מבודד טרי)תאי HICN/A תאי
TNF אלפא ELISA אנושיים ערכת תרמופישרBMS223-4מיקרוסקופ אור ELISA
(DMi1)Lucia391240תרבית תאים כללית
ליפופוליסכריד (LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC תרבית תאים
LIVE / DEAD ניתן לתיקון קרוב IR ערכת כתמי תאים מתיםתרמו פישרL34975זרימה ציטומטריה
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x)תרמו פישר11140050תרבית תאי
T פניצילין-סטרפטומיצין (100x)תרמו פישר15140122תרבית תאים כללית
VWR77575-370תרבית תאים כללית
רפמיצין, 98+%תרמו פישרJ62473. MFmoDC תרבית תאים
RPMI 1640 עם גלוטמקסתרמו פישר61870-036תרבית תאים כללית
טכנולוגיות תאי גזע20144קוקטייל גירוי תאי T הפרדת תאים
(500x)תרמו פישר00-4970-93תרבית תאים
UltraComp eBead Plus חרוזי פיצויתרמו פישר01-3333-41זרימה
סט פיפטות משתנהפישר סיינטיפיק05-403-152תרבית תאים כללית
MP , משטח טכנולוגיות בקר פיפטה מאגר הפרדת ציטומטריה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18 (1), 767-811 (2000).
  2. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440 (7085), 808-812 (2006).
  3. Anderson....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tolerogenic Dendritic CellsMonocyte Derived Dendritic CellsImmunomodulatory AgentsRegulatory T CellsCD14 Positive MonocytesFlow CytometryMagnetic Cell SeparationT Cell ProliferationImmunomodulator TreatmentFoxp3 Treg Induction

Related Articles