מאמר שיטה

פנים פנים הקפאה של רשתית עכבר לניתוח מרחבי מרחבי בממדים גבוהים

DOI:

10.3791/68171

⸱

8 ביולי 2025

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרשתית מציגה ארגון מרחבי מורכב על פני המבנה הלמינרי שלה. טכניקות מודרניות של טרנסקריפטומיקה מרחבית וריצוף דורשות קטעי רקמה בעובי < 20 מיקרומטר, מה שמגביל את תחולת מחקר הרשתית. שיטת הקפאה טרייה זו מייצרת קטעי פנים דקים של רשתית העכבר תוך שמירה על יחסים מרחביים מישוריים, ומאפשרת מיפוי מולקולרי מקיף על פני הלמינות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המבנה הלמינרי המורכב של הרשתית מציב אתגרים משמעותיים למיפוי מולקולרי מרחבי מקיף. הטכניקות הנוכחיות לחקירת ארכיטקטורת רקמות ואינטראקציות מולקולריות מוגבלות על ידי אילוצים טכניים הפוגעים ביחסים מרחביים או מגבילים פרופיל מולקולרי. שיטות קיימות כמו חתך, תכשירי הרכבה שלמה, דיסוציאציות כימיות או מכניות וחתכים עבים משבשים את שלמות הרקמות, מאבדים הקשר מרחבי קריטי, או לרוב, פשוט אינם תואמים לפלטפורמות ריצוף מרחבי בממדים גבוהים.

מחקר זה מציג טכניקת הקפאה המייצרת חתכים דקים (<20 מיקרומטר) תוך שמירה על היחסים המרחביים החיוניים למיפוי התפלגות תאי הרשתית. השיטה שומרת על שלמות ה-RNA וארכיטקטורת הרקמות תוך יצירת מקטעים התואמים לפלטפורמות ניתוח מולקולרי בתפוקה גבוהה. שלמות ה-RNA נשמרת מכיוון שטכניקה זו חותכת רקמה קפואה טרייה, שיצרני פלטפורמות טרנסקריפטומיות מרחביות תומכים בה באופן רשמי ביחס לרקמה פוסט-קבועה. אנו מאמתים גישה זו באמצעות שיטות פרופיל מולקולאריות מרובות, המדגימות אינטגרציה מוצלחת הן עם היברידיזציה ידנית של RNAscope באתרו (12 מטרות) והן עם ריצוף מרחבי של קסניום (300 מטרות). הטכניקה משמרת באופן עקבי את ארכיטקטורת הרקמות על פני דגימות תוך שמירה על איכות RNA המתאימה ליישומים מולקולריים רגישים אלה.

התקדמות מתודולוגית זו מאפשרת חקירות חדשות של התפלגות סוגי תאי רשתית, שיפועים מולקולריים על פני למינות והיבטים מרחביים של פתולוגיה של הרשתית. הרבגוניות והתאימות של הטכניקה לפלטפורמות מודרניות של ביולוגיה מרחבית מספקות בסיס למיפוי מולקולרי מקיף של הארגון התאי המורכב של הרשתית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירונים ברשתית פיתחו טופוגרפיות מרחביות המאפשרות עיבוד מידע, אשר במינים רבים מביא להתמחויות גסות כמו foveas, אזור מרכזי ופסים 1,2,3. בניגוד למגוון המובן היטב של התפלגות קולטני האור, ההתמחות המרחבית של תפוקת הרשתית, שנוצרה על ידי תאי גנגליון רשתית (RGCs), פחות ברורה. עבור רוב המינים, ההתפלגות המרחבית של ה-RGCs אינה ידועה לחלוטין. אפילו עבור העכבר, שאפשר לטעון שהוא אחד אם לא מודל החולייתנים הנחקר ביותר של תפקוד הראייה, פחות משליש מתת-הסוגים של RGC מופו בטכניקות מסורתיות כמו אימונוהיסטוכימיה שלמה2. טכניקות אלו נכשלות מכיוון שלרוב תת-הסוגים של RGC אין סמן גנטי ספציפי. במקום זאת, יש צורך במידע מולקולרי בעל מימדים גבוהים יותר לסיווג RGC מדויק4 באמצעות ריצוף RNA של תאיחיד 5,6,7.

מידע על התפלגות RGC חשוב, שכן הטופוגרפיות שנצפו בעכבר מדגימות מתאמים אקולוגיים ברורים בין מיקום RGC לתפקוד הראייה. הדוגמה הבולטת ביותר היא הארגון המרחבי של ɑON-S RGCs, המתקבצים ברשתית הטמפורלית. אזור זה מקבל את תמונת הטרף8 במהלך התנהגויות ציד9. כמו כן, מוערך היטב כי תת-סוגים של RGC רגישים באופן דיפרנציאלי למחלה10, ולכמה מחלות נפוצות כמו גלאוקומה יש מרכיב מרחבי להתקדמותן 11,12. לפיכך, שאלה חשובה העומדת בפני התחום היא: מהו הארגון המרחבי של תת-סוגים של RGC כשהם מרצפים את הרשתית1? פער הידע הזה מגביל כיום תובנות לגבי התנהגויות ומחלות מונחות חזותיות אחרות.

המוקד של השיטה הנוכחית הוא לטפל בפערי הידע המולקולרי הללו באמצעות גישת הקפאה פנים אל פנים המשמרת יחסים מרחביים תוך מתן אפשרות לניתוח מולקולרי ברזולוציה גבוהה. פלטפורמות ריצוף מרחבי מודרניות כמו Xenium של 10X מייצגות התקדמות טרנספורמטיבית בפרופיל מולקולרי, ומציעות תובנות חסרות תקדים לגבי ארגון רקמות ואינטראקציות תאיות. עם זאת, פלטפורמות אלה, יחד עם טכניקות בעלות פלקס נמוך יותר כמו RNAscope ושיטות ריצוף מקודדות מרחבית כמו Visium, חולקות אילוץ טכני קריטי: הן דורשות קטעי רקמה דקים יותר מ-20 מיקרומטר. דרישה זו מציבה אתגר מיוחד עבור רקמת הרשתית, שעוביה בדרך כלל 200 מיקרומטר.

עד כה, חוקרים הסתמכו בעיקר על חתכים בעת יישום טכנולוגיות אלה על רקמת הרשתית13. בעוד שחתכים חושפים ביעילות יחסים מולקולריים בתוך שכבות גרעיניות ופרספקס בהקשר של מעגלים אנכיים, הם פחות מתאימים ללכידת ההתפלגות המרחבית הרחבה יותר של תאי רשתית שתכשירי הרכבה שלמים חשפו באופן מסורתי8. הניסיונות האחרונים לחתך פנים הוגבלו על ידי אילוצי עובי חתך, כאשר מחקרים השיגו רק 50 מיקרומטר קטעים בעובי14 מדי עבור פלטפורמות ניתוח מולקולרי מודרניות בעלות פלקס גבוה. גישות היסטוריות אחרות שנפרסו לחקר למינה רשתית בודדת אך אינן תואמות לטכניקות ריצוף מרחבי מודרניות כוללות עיכול אנזימטי, בשילוב עם דיסוציאציה מכנית15,16, או דיסוציאציות מכניות בלבד 17,18,19,20. כאן, אנו מציגים טכניקת הקפאה חדשה שתוכננה במיוחד עבור רקמת רשתית דקה ומעוקלת המתגברת על מגבלות אלו. בקצרה, השיטה שלנו כוללת חילוץ החדר האחורי של העין, יצירת חתכי הקלה הן דרך הרשתית והן דרך הסקלרה, השטחת הרקמה עם הרשתית הפנימית כנגד זכוכית כיסוי, הטמעת הרקמה ב-OCT, ולבסוף, הקפאה מהרשתית החיצונית לפנימית (איור 1). השיטה שלנו שומרת על יחסים מרחביים תוך הפקת קטעים דקים מספיק (<20 מיקרומטר) עבור כלי ביולוגיה מרחבית בממדים גבוהים, כפי שאומת באמצעות יישום מוצלח הן עם RNAscope ידני (12 מטרות) והן עם פלטפורמת הקסניום האוטומטית (300 מטרות), מה שמדגים תאימות על פני סולמות מורכבות שונים של ניתוח מולקולרי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים נערכו בהתאם ובאישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) והנחיות מוסדיות רלוונטיות המאשרות שיטות אלה בפיקוח אוניברסיטת קולורדו. כל השלבים הקשורים לשימוש בבעלי חיים והמתת חסד חייבים לעמוד בתקנות המקומיות ובהיתרי ניסוי. כל העכברים שוכנו בטיפול סטנדרטי במתקן וטרינרי מוסמך עם גישה חופשית למזון ומים. טכניקת הקפאה זו מתבססת על טכניקות חיתוך רשתית סטנדרטיות המותאמות לעכברי C57BL/6. כדי לפתח טכניקה זו נעשה שימוש בכ-150 עכברים משני המינים בגילאי 6 שבועות עד שנתיים. לטכניקה הסופית המועברת כאן יש שיעור הצלחה של כ-95% ללא קשר למאפיינים הדמוגרפיים של העכברים. שימו לב שאם טמפרטורה לא מופיעה עבור מדרגה, צפויה טמפרטורת החדר של כ-20-25 מעלות צלזיוס. פתרונות ללא טמפרטורה רשומה יפעלו אם הם מקוררים ולכן טווח טמפרטורות העבודה לתמיסות הוא 4-25 מעלות צלזיוס.

1. דיסקציה

  1. להרדים את העכבר עם איזופלורן ולאמת את ההרדמה עם צביטת הבוהן, או לעקוב אחר הכללים והתקנות המקומיים כדי לגרום ולאשר הרדמה מכיוון ששיטות אחרות מתאימות באותה מידה.
  2. המתת חסד של העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם: אבטח את ראש העכבר ביד אחת ואת בסיס הזנב ביד השנייה, ואז משוך לכיוונים מנוגדים. בצע המתת חסד משנית על ידי עריפת ראש.
  3. מיתגו את הקוטב הטמפורלי של הגלובוס על הקרנית כדי לשמור על כיוון וליצור נקודת תורפה לדיסקציה (איור 2B ואיור 3A).
  4. טבלו את הגלובוס בתמיסת איימס בכלי המכיל פיסת נייר פילטר (גדולה מהגלובוס אך קטנה מהצלחת).
    הערה: שימוש בתמיסות אחרות מלבד איימס יגרום להידרדרות הרשתית (איור 4A).
  5. באמצעות מלקחיים חדים #5 ומספריים לקשתית, הסירו בזהירות את כל השרירים, הפאשיה, כלי הדם והעצבים מהגלובוס (איור 2E,F ואיור 3B) מבלי לנקב את הסקלרה (איור 2D).
    הערה: ניקוב הסקלרה במהלך שלב זה (איור 4B) יגרום לבקע רקמות (איור 4C).
  6. מקם את קצה להב מספריים קשתית אחד בניצב למותג הקרנית, עם מספריים מקבילים לראש עצב הראייה. לנקב את הגלובוס במיקום הזה (איור 3C,D).
  7. בצעו חתך נקי יחיד דרך הקרנית והלימבוס, והמשיכו לתוך הסקלרה והרשתית לכיוון ראש עצב הראייה (איור 3E).
    הערה: אין לחתוך את ראש עצב הראייה אחרת הסקלרה והרשתית ייפרדו. אורכו המדויק של חתך זה ישתנה בהתאם לגודל הגלובוס, שיכול להשתנות באופן דרמטי בין בעלי חיים זקנים לעומת צעירים, כמו גם בקווי Cre מסוימים ביחס לחיות בר. אנו ממליצים להשאיר כ-1 מ"מ של רקמה בין ההיקף העמוק ביותר של חתך זה לראש עצב הראייה.
  8. מקם את הלהב בניצב לחיתוך הראשוני (איור 3F,G), כ-1 מ"מ אחורי הלימבוס (איור 2C). התחל לחתוך באופן רדיאלי דרך הסקלרה והרשתית.
    1. שמור על קו חיתוך עקבי אחורי ומקביל ללימבוס על ידי שימוש במלקחיים חדים כדי להנחות ולסובב את הגלובוס. בעוד שמזעור חיתוכים הוא אידיאלי, תן עדיפות לשמירה על נתיב רדיאלי נקי. אם הרשתית והסקלרה נפרדות, מקם מחדש את להב המספריים של הקשתית כדי לחתוך אותן יחד.
      הערה: חיתוך לתוך הלימבוס עלול לגרום להפרדת רשתית מהסקלרה במהלך חילוץ העדשה. חיתוכים וסיבובים קטנים מקובלים. הימנע מהפעלת כוח כדי לאבטח אותו, מכיוון שהדבר מסתכן בבקע ברשתית.
    2. הערך את המרחק האחורי של 1 מ"מ באמצעות הרוחב האמצעי של להב המספריים של הקשתית. כאשר אינך בטוח, טעה לכיוון מיקום אחורי יותר, מכיוון שחיבור הרשתית ללימבוס מתעקל פנימית. חתך אחורי יותר מקל על חילוץ רשתית שטוח.
  9. לאחר השלמת החיתוך הרדיאלי במקביל ללימבוס, בדוק אם נותרו חיבורי הרשתית. חתוך אותם בזהירות עם מספריים לקשתית עד שחלקי הגלובוס הקדמיים והאחוריים נפרדים.
  10. באמצעות שני זוגות של מלקחיים חדים #5, הפרידו בעדינות את החלקים הקדמיים והאחוריים של הגלובוס (איור 3H). בעכברים מבוגרים, סיבים שקופים עשויים לחבר את העדשה לכוס הרשתית; חתכו אותם בזהירות עם מספריים לקשתית תוך מזעור הפרדת הרשתית-סקלרלית.
    הערה: העדשה צריכה להישאר מחוברת ללימבוס ולקרנית.
  11. השתמשו בנייר הסינון כפלטפורמת תמיכה, חתכו את הרשתית לתבנית עלה תלתן (שידועה גם כצלב ברזל) בעזרת מספריים לקשתית (איור 3I-K).
    הערה: חתכי עלי תלתן צריכים להיות קצרים יותר מחתך הכיוון הראשוני שנעשה בתחילה דרך הלימבוס אם רצוי להקליט כיוון עם פרוסה זו. אנו ממליצים להקטין את גודל שלושת החתכים הרדיאליים החדשים הללו כך שיהיה קצר בערך ב-1-2 מ"מ מהחתך הראשוני. אם תשמש תכונה אחרת, כמו שיפוע האופסין, להתמצאות, ראוי שכל החתכים יהיו באותו אורך תוך שמירה תמיד על כ-1 מ"מ של רקמה בין החלק העמוק ביותר של החתך לראש עצב הראייה כדי למנוע הפרדה של הרשתית והסקלרה.
  12. חזור על הדיסקציה בעין השנייה. כדי למזער נמק, הסרה מלאה של החדר הקדמי של העין השנייה תוך 10 דקות מהמתת חסד.

2. שימור בהקפאה

  1. הכן פיפטת פלסטיק חד פעמית על ידי חיתוך הקצה ליצירת פתח גדול יותר מהרשתית והסקלרה המנותחת (להלן הרשתית).
  2. שאבו בעדינות את הרשתית לתוך הפיפטה והניחו אותה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית. בעזרת מגבון מעבדה, הסר בזהירות את תמיסת איימס העודפת סביב הרשתית עד שהיא כבר לא יכולה לצוף בחופשיות וניתן לשטח אותה.
  3. בעזרת שני מלקחיים חדים #5, פתחו את הרשתית והניחו אותה שטוחה כשגביעונית העין הפנימית פונה כלפי מעלה. בהתאם לגודל הרקמה, בצע חתכי תבליט של 0.5-2 מ"מ בכל קטע עלה תלתן כדי לשטח עוד יותר את הרשתית, והתאם בזהירות את הרקמה כדי למנוע קיפול (איור 5A). הסר תמיסת איימס נוספת עד שהנוזל נשאר רק בסמוך לרשתית.
  4. באמצעות כיסוי, לחצו במהירות והעבירו את הרשתית (איור 5B) עם הנוזל שסביבה כך שהסקלרה החיצונית פונה כלפי מעלה וכוס העין הפנימית תיצור קשר עם הכיסוי, כלומר תאי הגנגליון ברשתית יפנו כלפי מעלה (איור 5C).
  5. ודא שהרשתית אינה מקופלת ובצע התאמות לפי הצורך; הוסף פתרון איימס למניפולציה קלה יותר. מכיוון שעודף נוזלים יגרום לרקמה להתכרבל, השתמש במגבון מעבדה כדי להסיר את כל תמיסת איימס העודפת ולאפשר לרשתית להתייבש באוויר למשך 5-10 שניות.
    הערה: אי מתן אפשרות לייבוש קצר באוויר עלול לגרום באופן אקראי להפרדת רקמה-OCT במהלך הקפאה. ייבוש יתר באוויר עלול להוביל לנזק לרקמות הקשורות לגבישי מלח.
  6. יש למרוח מדיום OCT כדי לכסות את הרשתית ולהשתמש במלקחיים כדי לפזר שכבה זו באופן שווה על פני החלקת הכיסוי, ולמנוע ציפה של הרשתית. אפשר 30 שניות למדיום OCT לחדור לרשתית.
  7. הקפאת הבזק של הרשתית ב-OCT (איור 5D) באמצעות לוחית מתכת מקוררת בעקיפין עם אדי חנקן נוזלי או על ידי הבאתה למגע ישיר עם קרח יבש.
  8. אחסן את הרשתית על קרח יבש אם משתמשים מיד או במקפיא של -80 מעלות צלזיוס בשקית ניילון או במיכל המכיל חומרי ייבוש אם מאחסנים אותו לטווח ארוך.

3. הקפאה

  1. הגדר את תא הקריוסטט ל-18 מעלות צלזיוס ואת ה-stage ל-12 מעלות צלזיוס. הנח את הרשתית בתא כדי לאזן את הטמפרטורה.
  2. צור כיפת OCT על צ'אק הדגימה. אם אתה משתמש באותו דגם קריוסטט, ודא שכיפה זו תופסת את 2-3 הטבעות הפנימיות. לאחר ההקפאה, חתוך את כיפת ה-OCT כדי ליצור משטח במה שטוח במקביל ללהב שעל הצ'אק כדי לשמור על שטוחות למינרית (איור 6A).
  3. צור או שים לב למדריך ההתמצאות המקשר בין הצ'אק לשלב הקריוסטט.
    הערה: בדגם הקריוסטט שאנו ממליצים, מוביל הכיוון הוא קו מרכזי חרוט במיקום השעה 12 מעל מחזיק הצ'אק, בעוד שלצ'אק עצמו יש חתך משולש על הטבעת החיצונית ביותר. יחד, אנו מתייחסים לתכונות אלה כמדריך ההתמצאות. אם לקריוסטט שלך אין תכונות כאלה, אנו ממליצים להשתמש בטוש קבוע כדי להכין בעצמך.
  4. הכן את הרשתית להעברה באמצעות סכין גילוח על ידי הסרת OCT עודף המקיף את הרשתית לרוחב ולאחר מכן, הפריד בזהירות את הרשתית מהחלקה כדי להפוך אותה לניידת.
  5. הסר את הצ'אק מהבמה ומרח טיפה קטנה של OCT נוזלי על משטח ה-OCT השטוח והשטוח המוכן.
  6. הנח את הרשתית ישירות על ה-OCT הנוזלי. בעזרת שקופית זכוכית מקוררת מראש (-18 מעלות צלזיוס), לחץ והחזק את הרשתית כנגד ה-OCT tagה למשך 10-30 שניות עד להקפאה.
  7. מרחו OCT נוסף על הרשתית והשלב כדי להבטיח הדבקה מלאה. הקפיא את אזור ההקפאה המהירה של הקריוסטט. דגרו את שלב הרשתית/OCT בקריוסטט למשך 30 דקות לפחות כדי להבטיח הדבקה מלאה.
  8. התחל חתך:
    1. יש לחתוך בזהירות את עודפי ה-OCT עד שהרשתית נראית לעין (איור 6B). השתמש בסכין הגילוח כדי להסיר עודפי OCT מקצוות הבלוק.
      הערה: חזור תמיד את ה-stagלפני חידוש החיתוך לאחר כל חיתוך ידני ורדיאלי. לחיתוך פרוסות בפנים, אנו ממליצים להשתמש באותו עובי חיתוך שישמש לקטעים הרצויים; עם זאת, עובי החיתוך עשוי להיות בין 10 מיקרומטר ל-100 מיקרומטר בהתבסס על העדפת המשתמש.
    2. המשך לקצץ תוך כדי בדיקת חלקים לנוכחות סקלרה. כאשר הסקלרה נראית לעין, התאם את זווית הבמה לפי הצורך. המשך לקצץ עד שהקטעים יראו פיזור סקלרה שווה, מה שמבטיח שטוחות אופטימלית ושטח עלי תלתן מקסימלי בכל קטע.
    3. אסוף קטעי רקמה (איור 6C).
      הערה: העובי האופטימלי יהיה תלוי בבדיקה הסופית המתבצעת וחייב לדבוק בפרוטוקול זה במורד הזרם. לדוגמה, אם משתמשים ב-10X Xenium אנו ממליצים על קטעים בעובי 20 מיקרומטר. ואילו עבור 10X Visium, קטעים בעובי 15 מיקרומטר מתאימים יותר.
    4. השתמש בשקופיות מקוררות מראש ותפעל את החלקים למקומם באמצעות שתי מברשות.
    5. הניחו אצבע מתחת לחלק עד שה-OCT נמס והרקמה נדבקת (כ-5 שניות).
    6. החזר את השקופית למשטח קר להקפאה מחדש של רקמות.
      הערה: בעת איסוף קטעים באזורים קטנים (למשל, עבור קסניום), ייתכן שיהיה צורך במחזורי הקפאה-הפשרה מרובים. למרות שזה לא משפיע על טכניקות מבוססות בדיקה, זה עשוי להשפיע על איכות ה-RNA עבור גישות ריצוף בלתי מוטות.
  9. אחסן את המגלשות על קרח יבש לשימוש מיידי, ב-20 מעלות צלזיוס ל-RNAscope למחרת וב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.

4. זיהוי מטרות ומיקרוסקופיה

הערה: בעוד שהטכניקה תואמת לשיטות פרופיל מולקולרי אחרות, אנו מפרטים את RNAscope כדוגמה מאומתת אחת.

  1. הכנה לדוגמא:
    1. הסר את השקופיות מאחסון של -80 מעלות צלזיוס ומחמם בחום של -20 מעלות צלזיוס למשך שעה.
      הערה: ניתן לאחסן שקופיות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד 12 שעות לפני תחילת שאר הליך זה, אך אין להשאיר אותן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך זמן רב מדי כדי למזער את פירוק ה-RNA.
  2. מחממים במהירות את השקופיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות.
  3. תקן את הטישו על ידי טבילת השקופיות ב-4% PFA טרי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. שטפו את השקופיות היטב עם 1x PBS.
  5. התייבשות רקמות באמצעות סדרת אתנול: 50% אתנול למשך 5 דקות, 70% אתנול למשך 5 דקות, 100% אתנול למשך 5 דקות, 100% אתנול טרי למשך 5 דקות.
    הערה: זהו שלב בקרת איכות קריטי עבור הרכבת רקמות. אם מתרחשת היפרדות רקמות במהלך התייבשות, זה מצביע על חפיפה של OCT מחלקים סמוכים במהלך ההרכבה. קיצוץ זהיר של עודפי OCT במהלך החיתוך וההרכבה מונע בעיה זו.
  6. הכנת מחסום:
    1. יבש את המגלשות על הספסל למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. בעזרת עט מחסום הידרופובי, צייר מחסום סביב כל קטע רקמה. הניחו למחסום להתייבש לחלוטין במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. זיהוי מולקולרי:
    1. החל טיפול פרוטאז IV לחדירת רקמות.
    2. המשך עם פרוטוקול היצרן להכלאת בדיקות מטרה (שעתיים ב-40 מעלות צלזיוס), שלבי הגברת אותות (שלושה מגברים עוקבים), זיהוי פלואורופור (ארבעה סיבובים עוקבים לצביעה של שלושה פלקסים).
  8. דימות:
    1. בצע צביעה גרעינית DAPI לפני כל הרכבת זכוכית כיסוי.
    2. התקן את זכוכית הכיסוי באמצעות אמצעי הרכבה נגד דהייה.
    3. תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ערכות פילטרים מתאימות.
    4. לזיהוי ריבוי, לכוד את אותו שדה בכל ארבעת סבבי הזיהוי לצורך רישום חישובי.
    5. שמור על הגדרות חשיפה עקביות בין סיבובים להשוואת אותות מדויקת.
      הערה: לפרטים מלאים על יישום RNAscope, עיין בפרוטוקולי היצרן (ראה טבלת החומרים). עבור פלטפורמות אוטומטיות לחלוטין כמו Xenium, בצע את כל שלבי פרוטוקול היצרן בדיוק כפי שסופק. עבור כל הפרוטוקולים, צפו כי כשל עקב היפרדות רקמות יתרחש ככל הנראה במהלך שלב התייבשות או שטיפה מוקדם, בגלל חפיפה של OCT, כפי שצוין בפרוטוקול לדוגמה זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יישום מוצלח של פרוטוקול זה מייצר קטעי רשתית שלמים המתאימים לגישות פרופיל מולקולרי מרובות תוך שמירה על יחסים מרחביים על פני השטח של הרשתית. אנו מדגימים את התועלת של הפרוטוקול באמצעות גישת אימות שיטתית, המתקדמת מאימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית דרך זיהוי RNA מולטיפלקס ידני לפרופיל מולקולרי אוטומטי בתפוקה גבוהה.

האימות הראשוני של הפרוטוקול שלנו משתמש בשני סמנים מאופיינים היטב כדי להעריך את שלמות הרקמה ושימור המבנה בכל הלמינה ברשתית (איור 7). תאי גנגליון ברשתית ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המוצגת כאן מטפלת במחסום טכני קריטי בביולוגיה מרחבית של הרשתית בכך שהיא מאפשרת ייצור של חתכי פנים דקים המתאימים לטכנולוגיות פרופיל מולקולרי מודרניות. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול מתרכזים סביב טיפול ברקמות במהלך החיתוך הראשוני ובקרה מדויקת של טמפרטורה ולחות במהלך שימור בהקפאה וחתך. יישום מוצלח מסתמך במיוחד על השגת השטחת רקמות נכונה לפני הטמעת OCT ושמירה על בקרת טמפרטורה עקבית לאורך תהליך החיתוך.

תוצרים טכניים נפוצים ופתרון בעיות:

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למשאב המשותף לניטור חיסוני אנושי (RRID:SCR_021985) במרכז הסרטן של אוניברסיטת קולורדו (P30CA046934) על הסיוע המומחה שלהם בהפעלת פלטפורמת 10X Xenium. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01EY035293).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
איימס ופריים; סיגמא-אולדריץ'A1420-10X1Lמותג ספציפי לא חשוב
חרוזים זאפ, מבער חוטיםחנות החרוזים7.90524E+11ניתן להשתמש בצריבה חלופית
CryostatLeicacm1950שיקולים חשובים הם נפח הניתן לשליטה בנפרד לעומת טמפרטורת הבמה.
קרח יבשNANA
NA NA כלי מדע עדין Dumont #5 מלקחייםכלי מדע עדינים 1129500NC9889584מותג ספציפי לא חשוב
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. CompoundFisher Scientific23-730-571מותג ספציפי לא חשוב
Fisherbrand דיוק גבוה ישר דק דק פינצטה / מלקחייםפישר סיינטיפיק12-000-127מותג ספציפי לא חשוב
פישרברנד מספריים חיתוך סטנדרטיפישר סיינטיפיק08-951-20מותג ספציפי לא חשוב
פישרברנד סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ שקופיותפישר סיינטיפיק22-037-246מותג ספציפי לא חשוב
אינטגרה Miltex Noyes איריס מספרייםאינטגרה Miltex 18151012-460-278מותג ספציפי לא חשוב
אולימפוס IX81 מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי דיסק מסתובבעבור איור 7
מדעי12-567-400מותג ספציפי לא חשוב
מכשיר דיוק עולמי דיוק סטריאו זום מיקרוסקופ משולש (IV) על מעמד בוםמכשיר דיוק עולמי PZMTIVBS50-253-8607מותג ספציפי לא חשוב
Zeiss Axio Imager.M2 מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי חיתוך אופטי מופעל (עבור איור 8)
בינוני חוט RNAscope HiPlex ACDBio משקפי כיסוי מלבני פישר סיינטיפיק 12-541-033 מותג ספציפי לא חשוב נתרן ביקרבונט Sigma-Aldrich S6014-25G מותג ספציפי לא חשוב תרמו מדעי Nunc זכוכית תחתון כלים פישר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).
  2. Heukamp, A. S., Warwick, R. A., Rivlin-Etzion, M. Topographic variations in retinal encoding of visual space. Annu Rev Vis Sci. 6, 237-259 (2020).
  3. Collin, S. P. A web-based archive for topographic maps of retinal cell distribution in vertebrates. Clin Exp Optom. 91 (1), 85-95 (2008).
  4. Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. GraSP gene targets to hierarchically infer sub-classes with CuttleNet. bioRxiv. , (2024).
  5. Rheaume, B. A., et al. Single cell transcriptome profiling of retinal ganglion cells identifies cellular subtypes. Nat Commun. 9 (1), 2759(2018).
  6. Tran, N. M., et al. Single-cell profiles of retinal ganglion cells differing in resilience to injury reveal neuroprotective genes. Neuron. 104 (6), 1039-1055.e12 (2019).
  7. Yan, W., et al. Mouse retinal cell atlas: Molecular identification of over sixty amacrine cell types. J Neurosci. 40 (27), 5177-5195 (2020).
  8. Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Curr Biol. 24 (3), 310-315 (2014).
  9. Holmgren, C. D., et al. Visual pursuit behavior in mice maintains the pursued prey on the retinal region with least optic flow. eLife. 10, e70838(2021).
  10. Tapia, M. L., Nascimento-dos-Santos, G., Park, K. K. Subtype-specific survival and regeneration of retinal ganglion cells in response to injury. Front Cell Dev Biol. 10, 956279(2022).
  11. Berchuck, S. I., Mukherjee, S., Medeiros, F. A. Estimating rates of progression and predicting future visual fields in glaucoma using a deep variational autoencoder. Sci Rep. 9 (1), 18113(2019).
  12. de Gainza, A., et al. The trajectory of glaucoma progression in 2-dimensional structural-functional space. Ophthalmol Glaucoma. 3 (6), 466-474 (2020).
  13. Choi, J., et al. Spatial organization of the mouse retina at single cell resolution by MERFISH. Nat Commun. 14 (1), 4929(2023).
  14. Kremers, L., et al. Super-resolution STED imaging in the inner and outer whole-mount mouse retina. Front Ophthalmol. 3, 1126338(2023).
  15. Simon, P., Thanos, S. Combined methods of retrograde staining, layer-separation and viscoelastic cell stabilization to isolate retinal ganglion cells in adult rats. J Neurosci Methods. 83 (2), 113-124 (1998).
  16. Lindqvist, N., Vidal-Sanz, M., Hallböök, F. Single cell RT-PCR analysis of tyrosine kinase receptor expression in adult rat retinal ganglion cells isolated by retinal sandwiching. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 75-83 (2002).
  17. Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2. J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).
  18. Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. -P. Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions: Molecular clock in rat photoreceptors. Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).
  19. Jaeger, C., et al. Circadian organization of the rodent retina involves strongly coupled, layer-specific oscillators. FASEB J. 29 (4), 1493-1504 (2015).
  20. Hecht, R. M., Shi, Q., Garrett, T. R., Sivyer, B., Morgans, C. Split retina as an improved flatmount preparation for studying inner nuclear layer neurons in vertebrate retina. J Vis Exp. (203), e65757(2024).
  21. Budoff, S. A., Poleg-Polsky, A. A Complete spatial map of mouse retinal ganglion cells reveals density and gene expression specializations. bioRxiv. , (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNAscopeXeniumRNA

מאמרים קשורים