כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מרית מונטווידאו לזיגוג עוברים לפני השרשה של עכברים וכבשים, המורכב ממרית תוצרת בית ושימוש בתמיסות תוצרת בית. העוברים מתאזנים במהירות בשתי תמיסות קריופרוטקטנטיות בריכוז הולך וגובר, נטענות על המרית, טובלות בחנקן נוזלי, ולבסוף נאטמות בקשית של 0.5 מ"ל.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מרית מכשיר מונטווידאו לזיגוג של עוברי יונקים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקר זה מתאר שיטת ויטריפיקציה יעילה וחסכונית לשימור הקפאה של עוברי עכברים וכבשים המכונה מרית מונטווידאו (MVD). פרוטוקול זה משתמש במרית תוצרת בית כמכשיר הנשא, המוכן עם קצה מעמיס ג'ל. העוברים מתאזנים במהירות בשתי תמיסות קריופרוטקטנטיות תוצרת בית בריכוז הולך וגובר, נטענות לתוך המרית ולאחר מכן טובלות ישירות בחנקן נוזלי. ניתן להעמיס כ-30-40 עוברי עכברים בשלב טרום ההשתלה על המרית, אשר נאטמת לאחר מכן בקש של 0.5 מ"ל. השימוש במרית במקום קריו-צינורות, המשמשות לעתים קרובות לאחסון עוברים מזוגגים, מייעל את החלל בחצרות החנקן הנוזלי. בנוסף, תהליך ההתחממות דורש רק תמיסת סוכרוז ביתית בריכוז יורד כדי להחזיר לחות לעוברים ולהחזיר את המורפולוגיה שלהם. המעבדה שלנו משתמשת בהצלחה במרית מונטווידאו לעוברים טרום השרשה של עכברים וכבשים במשך למעלה מ-10 שנים. המרית מונטווידאו הדגימה שיעור החלמה ממוצע (עוברים משוחזרים/מזוגגים) של 84% ושיעור הישרדות (עוברים ברי קיימא/משוחזרים) של 97% בעוברי עכברים. ויטריפיקציה של עוברי עכברים הניבה תוצאות טובות יותר מהקפאה איטית, אם כי לא נצפו הבדלים בתוצאות הרבייה (הריון, לידה ושיעורי לידה). בעוברי כבשים, שיעורי הישרדות והתפתחות עוברים דומים הושגו עם מרית מונטווידאו בהשוואה למכשיר מסחרי. למרות ששיעור ההריונות היה גבוה יותר עבור המכשיר המסחרי, שיעור ההישרדות של הכבש לא היה שונה באופן משמעותי בין המכשירים. שיטת הזיגוג של מרית מונטווידאו היא טכניקת שימור הקפאה פשוטה שניתן להשתמש בה כדי לאחסן עודפי עוברים, לגבות קווי עכברים מהונדסים גנטית ומודלים של כבשים, ולהקל על החלפתם בין חוקרים ברחבי העולם.
מבוא
היעילות של יצירת בעלי חיים מהונדסים גנטית (GM) עלתה משמעותית עקב פיתוח שיטות מבוססות אנדונוקלאז, במיוחד CRISPR/Cas9. מעבדות רבות ברחבי העולם מייצרות קווים שונים של עכברים וחולדות מהונדסים גנטית שיש לשמר בהקפאה כדי למנוע סחיפה גנטית ולשמור על שלמות הפנוטיפהמקורי 1. בנוסף, ארכיון מבטל את הצורך בגידול מתמיד, מה שלעתים קרובות מביא למספר מוגזם של בעלי חיים. חלק מהמעבדות שולחות קווי עכברים מהונדסים גנטית כעוברים או זרע שמורים בהקפאה למאגרים בינלאומיים, מה שמקל על החלפת המודלים הללו תוך הימנעות מהובלת בעלי חיים חיים. זה מבטיח נגישות לקווים ללא הדור החוזר של דגמי בעלי חיים מהונדסים גנטית זהים2. מסיבות אלה, שימור עוברים וזרע בהקפ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בעלי חיים ששימשו להשגת עוברי עכברים שוכנו וטופלו על פי החוק הלאומי 18.611 וההנחיות הבינלאומיות לטיפול בבעלי חיים11. פרוטוקול הניסוי (מספר היתר #007-18) אושר בהזדמנות על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכון פסטר דה מונטווידאו (ניתנה הסכמה בכתב). פרוטוקולים ניסיוניים לביציות/עוברים של כבשים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים Fundación IRAUy (פרוטוקול #001-2017), בהתאם להנחיות ARRIVE12 ובוצעו בהתאם להנחיות הבינלאומיות לטיפול בבעלי חיים11.
1. ויטריפיקציה (איור 2)
- הכנת מרית MVD
-
....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בתחילה השתמשנו בשיטת ההקפאה האיטית המסורתית המבוססת על תמיסות פרופילן גליקול, קשיות וציוד הקפאה בקצב מבוקר7. עם זאת, לאחר ששקלנו את שיטת הזיגוג כאפשרות קלה וחסכונית יותר, ערכנו מחקר להשוואת התוצאות של הקפאה איטית מסורתית (SLF) לעומת MVD מרית בעוברי עכברים שנוצרו על ידי 8 תאים in vivo ו-2 תאים במבחנה 13 (טבלה 1 וטבלה 2). התוצאות מוצגות במונח.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ה-Spatula MVD הוא מכשיר ויטריפיקציה קל להרכבה, בעלות נמוכה, בנפח מינימלי עם יכולת החזקת עוברים גבוהה ותפוסה אופטימלית של חנקן נוזלי. שיטה זו הוכיחה את עצמה כפשוטה, מהירה וחזקה. בממוצע, השגנו לא רק שיעורי התאוששות והישרדות גבוהים של עוברים מזוגגים (~90%) אלא גם תוצאות רבייה טובות בעת ביצוע העברת עוברים בעכברים (~80% שיעור הריון ו~30% שיעור לידה), הניתנים להשוואה לשיטות אחרות של זיגוג בנפח מינימלי 18,19,20.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
תודות
אנו מודים לאלג'ו מנצ'אקה על תרומתו לפיתוח ה-MVD של מרית. GS קיבלה מימון מהתוכנית לתואר שני בביוטכנולוגיה - Facultad de Ciencias - Universidad de la República (https://webmasterbiotecnol.wixsite.com/biotec1) (מספר מענק: GS 2437 347). GS, MNM ו-MC קיבלו מימון מ-FOCEM - Fondo para la Convergencia Estructural del Mercosur (https://focem.mercosur.int/es/) (מספר מענק: COF 03/11). GS ו-MC הם עמיתים של Sistema Nacional de Investigadores, Agencia Nacional de Investigación e Innovación, Uruguay. (https://www.anii.org.uy/). המממנים (התוכנית לתואר שני בביוטכנולוגיה - Facultad de Ciencias -Universidad de la República; FOCEM - Fondo para la Converg....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.22 ומיקרו; מסנן M | סרטוריוס | 16534 | מסנן מזרק Minisart 0.2 ומיקרו; L |
| 0.5 מ"ל קש | מיני-טיוב | 13408/0044 | פאייט בינוני מסוג צרפתי |
| מכלול צינור אספירטור | סיגמא | א5177 | |
| מבער בונסן | אינדולאב | 7000134 | |
| דימתיל סולפוקסיד | סיגמא | D2650 | |
| אתילן גליקול | סיגמא | 102466 | |
| פיקול PM70 | סיגמא | פ2878 | מדיום שיפוע צפיפות |
| קצה מעמיס ג'ל | אפנדורף | 10411193 | |
| נימי זכוכית | מרינפלד | 2900000 | צינור נימי מיקרוהמטוקריט |
| כפפות לטיפול LN2 | מגן טמפ | CE0338 | קריוגלאב |
| גביעים | מיני-טיוב | 16913/1133 | |
| משקפי מגן לטיפול ב-LN2 טיפול | 3 דקות | 40661-00000-10 | ציפוי נגד ערפל, נגד שריטות |
| פלטה חשמלית | לאבק | לה-ש-ב-5ב | מודל דיגיטלי |
| מוט זיהוי | טכנולוגיות IMV | 6326 | לא סטרילי LG48 מ"מ |
| מיכל קלקר מבודד | |||
| אחסון LN2 אחסון | טיילור-וורטון | XT21-AI | מדע קריו-סיינס |
| טווזירים ארוכים מפלדת אל-חלד | כלים מדעיים עדינים | 11000-25 | |
| M2 | סיגמא | M7167 | |
| PBS | תוצרת בית | פוספט מי מלח חוצץ. בדרך כלל מכינים 1 ליטר של מאגר מרוכז פי 5 ואז מדוללים ל-1x. מתכון: 40 גרם נתרן כלורי, 1 גרם אשלגן כלורי, 7.2 גרם דיסודיום פוספט נטול מים, 1.2 גרם מונופוטסיום פוספט. מוסיפים מים מזוקקים ומעקרים על ידי חיטוי. | |
| צלחת פטרי מפלסטיק | בז | 351029 | צלחת פטרי בקטריולוגית לא מטופלת TC |
| סטריאומיקרוסקופ | אולימפוס | SZ2-LGB | |
| סוכרוז | סיגמא | S1888 | |
| שען' s #5 מלקחיים | כלים מדעיים עדינים | 11254-20 |
מקורות
- Crispo, M., Meikle, M. N., Rülicke, T. Cryopreservation of Valuable Mouse and Rat Lines. Rodent Quality Control: Genes and Bugs. Laboratory Animal Science and Medicine. , Springer. Cham. (2024).
- Lloyd, K., Franklin, C., Lutz, C., Magnuson, T. Reproducibility: use mouse biobanks or lose them. Nature. 5....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
