הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח פרוטאומי השוואתי של כליות שלמות, מדולה וצינורות קליפת המוח בפתוגנזה סוכרתית של פגיעה בכליות בעכברים

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68177

⸱

2 במאי 2025

 ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Hypertension and Proteomics Technology Center, Department of Medicine, University of Louisville School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לניתוח פרוטאומי של הכליה כולה, צינורית קליפת המוח המבודדת ופרוטאומים מדולריים. המחקר גם משווה פרוטאומים אזוריים במודל עכבר סוכרתי ועכברים שאינם סוכרתיים.

תקציר

הגדרת רצף האירועים במחלת כליות היא אבן הפינה של הפרקטיקה הקלינית בארגז הכלים של הנפרולוג. ניתוחים פרוטאומיים של רקמות הם גישה משמעותית להבנת התהליכים הפיזיולוגיים והמולקולריים הבסיסיים של פתופיזיולוגיה של הכליות. השיטות והפרוטוקולים שאנו מציגים כאן יאפשרו דיסקציה מולקולרית של הכליה בכל אזור עניין ספציפי הקשור להשלכות המחלה. כדי לקבוע את השפעות המחלה על אזורי כליה ומבנים ספציפיים עם פונקציות ייחודיות, מטרות פרוטוקול זה הן להדגים טכניקות פשוטות של מידור כליות עכבר ובידוד צינוריות קליפת הכליה במקביל לתהליכי עבודה פרוטאומיים כמותיים יעילים ללא תוויות. שילוב שיטות אלה יסייע בזיהוי דפוסים מולקולריים מופרעים בכליה כולה, בתאים המדולריים ובמבני הצינוריות בקליפת המוח של הכליות, כאשר המטרה הסופית והסופית של פרוטאומיקה של תא בודד בהקשרים פתולוגיים. יישום שיטות אלה כמעט בכל מודל מחלה יעזור בתיאור מנגנוני פתולוגיה הקשורים לתפקוד לקוי של הכליות.

מבוא

מחלת כליות כרונית (CKD) היא דאגה מרכזית ברפואה המודרנית, בהיקף של למעלה מ-86 מיליארד דולר בהוצאות בריאות בארצות הברית לבדה1. ברחבי העולם, שכיחות CKD עולה עם שכיחות הסוכרת ומחלות נלוות לכליות הנלוות. קרוב ל-14% מאוכלוסיית ארה"ב סובלים מ-CKD (דוח שנתי של USRDS 2024). יתר על כן, נפרופתיה סוכרתית היא סוג של CKD והגורם המוביל למחלת כליות סופנית (ESRD), ו-60% מחולי ESRD סובלים מסוכרת 1,2,3. סוכרת משפיעה על כל מבני הכליות וסוגי התאים של הנפרונים, היחידה התפקודית של הכליות. כפי שמוצג באיור 1, חלקים שונים של נפרונים כלולים בקליפת הכליה ובאזורי המדולה. רוב הכליה מורכבת מצינורות. תפקוד לקוי של צינוריות הכליה ונגעים מבניים תורמים באופן משמעותי להתפתחות נפרופתיה סוכרתית (DN), ושינויים אלה מתאמים היטב עם קצב הירידה בתפקוד הכליות 4,5,6,7,8. בשלב מוקדם של סוכרת, בתגובה לעלייה בגלוקוז ולספיגת נתרן נלווית ודרישות חלבון הובלת ממברנה בכל מקטעי הצינוריות, הצינוריות עוברות היפרטרופיה. עם פגיעה מיקרו-וסקולרית מוגברת מאוחר יותר בסוכרת, צינוריות מציגות ניוון והתרחבות, בעוד שיש פיברוזיס והתרחבות של האינטרסטיציום9. מחקרים קודמים מהמעבדה שלנו מצאו פרוטאומים משתנים ושפע של חלבוני תגובת עקה בצינורות קליפת המוח של עכברים סוכרתיים10,11. המדולה חשובה לוויסות ריכוז השתן, ותפקוד לקוי במהלך מחלת כליות קשור לעקה חמצונית, כאשר סוכרת מובילה לירידה במתח החמצן באזור זה של הכליה עקב צריכת חמצן מוגברת מפעילויות מטבוליות, פעילות מוגברת של חלבוני הובלת ממברנה ופגיעה מיקרו-וסקולרית 12,13,14.

הבנת המנגנונים המפורטים של התפתחות והתקדמות DN היא מאמץ מתמשך שידרוש גישות חדשות ומשולבות המעוררות מודלים של מחלות ופרופיל מולקולרי של תהליכי איתות, שינויים אדפטיביים בדינמיקה של חלבון תאי תא והגדרה מדויקת של רכיבי תאי כליה ורקמות המושפעים מפגיעה במצבים כרוניים. פרוטאומיקה, מטבולומיקה וטרנסקריפטומיקה מציעים את האפשרות לחקור באופן אנליטי את המנגנונים המולקולריים של מחלות כליות. אומיקס הוא תחום חדש יחסית המשתמש בגישות של ביולוגיה מערכתית כדי להשיג הבנה גלובלית יותר של מערכות ביולוגיות. פרוטאומיקה הייתה כלי אומיקס רב עוצמה בנפרולוגיה בעשורים האחרונים. מחקר הסמנים הביולוגיים התרחב במהלך 20 השנים האחרונות, כפי שעולה מהגידול בפרסומים, אם כי נדרשת עבודה נרחבת כדי ליישם את הממצאים הללו במלואם במרפאה15. עם אוכלוסיות תאי הצינוריות השונות מאוד והתפקידים התפקודיים בהתאמה בתוך קליפת הכליה והמדולה, ניתוח פרוטאומי של כליות שלמות יכול להסוות שינויים ייחודיים הקשורים למבנים ספציפיים באזורים שונים אלה. לכן, מטרות מחקר זה הן להדגים את ההפרדה של קליפת הכליה והמדולה, כמו גם את ההפרדה של צינורות קליפת המוח מהגלומרולים, ואחריהם פרוטוקולים מפורטים להכנת תמציות חלבון ממבנים מבודדים לספקטרומטריית מסה מתקדמת וניתוחים ביואינפורמטיים. מודלים עכבריים של נפרופתיה סוכרתית הם חיוניים בהגדרת מנגנוני התקדמות המחלה. למחקר זה, השתמשנו בעכבר הטרנסגני OVE26, המפתח סוכרת מסוג I עם הופעה מוקדמת ומראה מאפיינים של DN בשלב מוקדם ומאוחר בבני אדם, כולל 1) עלייה מוקדמת וירידה מאוחרת יותר בקצב הסינון הגלומרולרי, 2) היפרטרופיה כלייתית, 3) עיבוי קרום הבסיס הגלומרולרי והתרחבות מזנגיאלית, 4) פרוטאינוריה חמורה, ו-5) פיברוזיס טובולואינטרסטיציאלי9, 16,17. עכברים בני חודשיים נבחרו כדי להדגים שינויים פרוטאומיים בתאי הצינוריות לפני נגעים מבניים גלויים. כפי שדווח בעבר ומוצג באיור 2, עכברי OVE26 בני חודשיים מציגים התרחבות מטריצה מזנגיאלית גלומרולרית (איור 2, חץ ירוק) ופרוטאינוריהחמורה 17, ללא שינויים היסטולוגיים גלויים בצינוריות הפרוקסימליות (איור 2, חץ צהוב) בעכברים סוכרתיים צעירים. כאן אנו מציגים גישה פרוטאומיקה כמותית משולבת לאפיון של כל הכליה, המדולה וצינורות קליפת המוח כדי להבהיר ולהמחיש את ההבדלים בפרוטאום בכל תא עם סוכרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקרים עם עכברי OVE26 ו-FVB אושרו על ידי הנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת לואיוויל (IACUC). נקבה טרנסגנית OVE26 (סוכרת; זן #:005564) ו-FVB (לא סוכרתי; מתח רקע; זן #:001800) עכברים נרכשו ממעבדות ג'קסון (בר הרבור, מיין). בעלי החיים הוחזקו במחזור אור/חושך של 12 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, וניתנה להם גישה חופשית למים ולמזון. כל המחקרים נערכו על עכברים בני חודשיים.

1. מודל בעלי חיים

  1. בידוד כליות
    1. להרדים עכברים על ידי מתן תוך-צפקי של 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו-12 מ"ג/ק"ג קסילזין.
    2. בצע חתך בטן בקו האמצע עם מספריים כירורגיות קטנות והזיז בעדינות את המעיים החוצה לצד העכבר באמצעות ספוגיות כדי לחשוף את הווריד הנבוב.
    3. בצע חתך קטן בווריד הנבוב מעל הכליה הימנית.
    4. החדרו את העכבר דרך החדר השמאלי עם 20 מ"ל של מי מלח קרים עם חוצץ פוספט (PBS: pH 7.4; 210 מ"ג/ליטר KH2PO4, 9 גרם/ליטר NaCl, 726 מ"ג/ליטר Na2HPO4·7H2O) באמצעות משאבה פריסטלטית, בקצב של 10 מ"ל לדקה.
      הערה: שלב זה אינו נדרש אם הכללת חלבוני ותאי דם בכליות אינה גורם קריטי בניתוחים במורד הזרם.
    5. הסר כליות באמצעות מספריים כירורגיות קטנות. הסר עודפי שומן מהחלק החיצוני של הכליות. שקלו את הכליות והניחו אותן ב-PBS קר על קרח.
    6. הסר את קפסולת הכליה.
    7. מניחים כליות על צלחת זכוכית או צלחת פטרי מונחת על קרח. בצעו כמה חתכים רוחביים דרך הכליות באמצעות סכין גילוח (איור 3) כדי להגיע ל-3-4 פרוסות בין הקוטב העליון והקוטב התחתון של הכליות.
    8. שמור 1-2 פרוסות אמצעיות ושני הקטבים (פרוסות כליה מעוגלות באיור 3) מכל כליה בצד כדי לשמש כדגימות "כליה שלמה". מניחים מנה לתוך צינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ומוסיפים מאגר הומוגניזציה קר כקרח (10% גליצרול, 50 מ"מ HEPES, 100 מ"מ KCl, 2 מ"מ EDTA, 0.1% NP40, 10 מ"מ NaF, 0.25 מ"מ NaVO3, 1x מעכב פרוטאז HALTS) בכ-10 מיקרוליטר/מ"ג של דגימת רקמה (בהתבסס על מסה משוערת של פרוסות כליה, הנגזרת ממשקל הכליה הנרכש). השאירו את הצינור על קרח.
    9. עבור שאר הפרוסות הרוחביות האמצעיות, הניחו את הפרוסה שטוחה ופרסו בזהירות את קליפת המוח (1 מ"מ חיצונית) מכל פרוסה באמצעות סכין גילוח או אזמל (איור 3, זרימת עבודה סכמטית). שמור על קליפת המוח מופרדת מאזורי המדולה לפרוטוקול בידוד צינוריות קליפת המוח (להלן, שלב 1.3).
    10. מניחים חלק מהמדולה המנותחת לתוך צינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, מוסיפים מאגר הומוגניזציה קר כקרח כמו בשלב 1.1.8, ומשאירים את הצינור על קרח.
    11. מקפיאים בחנקן נוזלי את כל חלקי הכליה והמדולה השלמים שנותרו שאינם משמשים להומוגניזציה ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. לחלופין, הקפיאו את כל תאי הכליה והמדולה המופרדים ואחסנו אותם כמתואר בשלב 1.1.11. הסר אותם מהאחסון במועד מאוחר יותר להוספת מאגר הומוגניזציה כמו בשלב 1.1.8.
  3. בידוד צינוריות בקליפת המוח
    1. טוחנים את קליפת המוח המנותחת לחתיכות בגודל 1-3 מ"מ על צלחת זכוכית או צלחת פטרי בעזרת סכין גילוח, ויוצרים משחה.
    2. עכל את קליפת המוח הטחונה ב-1 מ"ל של קולגנאז מסוג IA (1 מ"ג/מ"ל) למשך 30 דקות, ב-37 מעלות צלזיוס, באמבט מים מתנדנד.
    3. הניחו מסננת תאים של 100 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל על קרח.
    4. הנח את התרחיף הקורטיקלי המעוכל על מסננת התאים של 100 מיקרומטר ולחץ בעדינות דרך המסננת באמצעות הבוכנה של מזרק 10 מ"ל. שוטפים את החלק העליון של המסננת עם 1 מ"ל PBS ואת החלק התחתון של המסננת עם 1 מ"ל PBS.
    5. העבירו את המסנן בצינור של 50 מ"ל דרך מסננת נוספת של 100 מיקרומטר, ולאחר מכן שטפו את החלק העליון של המסננת עם 1 מ"ל PBS.
    6. העבירו את המסנן דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר המונחת על צינור חרוטי של 50 מ"ל על קרח. צינורות יעברו דרך מסננת זו לתוך המסנן (גלומרולי יישמר על מסננת 70 מיקרומטר). שוטפים את המסננת עם 1 מ"ל PBS.
    7. סובב את המסנן הסופי ב-120 × גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השלך עודפי PBS מכדור הצינור.
    8. בדוק את טוהר גלולת הצינורית בקליפת המוח על ידי הדמיה במיקרוסקופ, באמצעות מטרה פי 10. אם יותר מ -10% מהשבר מכיל גלומרולי, השעו מחדש את המסנן עם 1 מ"ל PBS והעבירו דרך מסננת תאים נקייה של 70 מיקרומטר ללא כל שטיפה נוספת של המסננת.
    9. מחלקים שבר צינורי מועשר לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל וסובבים ב-2000 × גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט.
    10. הוסף מאגר הומוגניזציה לגלולת הצינורית כמו עם כל הכליה והמדולה (שלבים 1.1.8 ו-1.1.10).
  4. הומוגניזציה/מיצוי חלבון
    1. הומוגניזציה של כל סוג דגימה בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל באמצעות עלי פלסטיק במיוחד עבור צינורות של 1.5 מ"ל. אם המתלה ההומוגני עבה מדי, הוסף מאגר הומוגניזציה נוסף לפי הצורך.
    2. השאירו תרחיף הומוגני על קרח למשך 15 דקות ואחריו סוניקציה למשך 5 דקות בסוניקטור אמבטיה (מתג הפעלה/כיבוי בלבד, ללא הגדרות מתכווננות ביחידה), עם מים באמבטיה ב-25 מעלות צלזיוס. השאירו את הדגימות על קרח למשך 10 דקות.
    3. מערבולת קצרה (1000-1500 סל"ד) הומוגנית, ואז טריטורציה 20 פעמים עם פיפטה ומשאירה על קרח למשך 15 דקות נוספות.
    4. יש לשלש את הדגימות מספר פעמים לפני הצנטריפוגה ב-13,000 × גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    5. העבירו תמציות חלבון מנוקות לצינורות נקיים.
    6. Aliquot 30 מיקרוליטר של תמצית מנוקה להערכת חלבון והכנת דגימה לניתוח ספקטרומטריית מסה. אחסן את שאר הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

2. פרוטוקול עיכול עמוד ספין מיני מלכודת השעיה

  1. עיכול פרוטאוליטי של חלבונים לשברים טריפטיים לאנליזות פרוטאומיות
  2. לדלל ~40-50 מיקרוגרם של דגימה (ב-~2 מיקרוגרם/מיקרוליטר) לתוך מאגר ליזה של דגימה (10% w/v נתרן דודציל סולפט [SDS] ב-100 מ"מ טריאתילאמוניום ביקרבונט (TEA-BC) pH 8.5, 40 מ"מ טריס (2-קרבוקסיאתיל)פוספין [TCEP]) לנפח סופי של 46 מיקרוליטר.
  3. הפחתה ואלקילציה של חלבונים
    1. דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (הריכוז הסופי של TCEP הוא 20 מ"מ).
    2. הוסף 4 מיקרוליטר של 0.5 M יודואצטמיד במים בדרגת כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS) ודגירה בטמפרטורת החדר (RT) בחושך למשך 30 דקות (הריכוז הסופי של יודואצטמיד הוא 40 מ"מ).
  4. הוסף 5 מיקרוליטר של 12% w/w חומצה זרחתית במים בדרגת LC-MS (לדלל 141 מיקרוליטר של 85% חומצה זרחתית ל-859 מיקרוליטר מים לתמיסה של 12%).
    1. חלופה לחומצה זרחתית, השתמש בחומצה טריפלואורואצטית או בחומצה פורמית אם מבצעים העשרת פוספופפטיד18.
  5. הוסף 350 מיקרוליטר של חוצץ קשירת מלכודת השעיה (100 מ"מ TEA-BC ב-90% מתנול/10% v/v מים pH 7.55).
  6. הוסף דוגמה לעמודת מלכודת המתלים. צנטריפוגה ב-4,000 × גרם למשך 30 שניות ב-RT ברוטור בעל זווית קבועה כדי להעביר כל נפח דרך העמודה.
  7. שטפו עם 4x 400 מיקרוליטר של מאגר קשירת מלכודת מתלה. צנטריפוגה ב-4,000 x g למשך 30 שניות ב-RT ברוטור בזווית קבועה כדי להעביר כל שטיפה דרך העמוד.
    הערה: כדי לסייע בהסרת SDS, סובב את העמוד ברוטור 180° לאחר כל כביסה.
  8. צנטריפוגה ב-4,000 גרם למשך דקה אחת ב-RT להסרה מלאה של מאגר הקישור (מונע טפטוף במהלך העיכול).
  9. העבירו את עמוד מלכודת המתלים לצינור איסוף נקי.
  10. הוסף 2.5-5 מיקרוגרם טריפסין ב-125 מיקרוליטר של 50 מ"מ תה-BC pH 8.5 במים בדרגת LC-MS (טריפסין פרוטאז, דרגת MS). היחס הסופי בין טריפסין לדגימה הוא 1:20 עד 1:10.
  11. דגירה בטמפרטורה של 47 מעלות צלזיוס למשך שעתיים (אין להדק את המכסה; עדיף מערבל תרמי המוגדר על 0 סל"ד). תקיעת חור במכסה עם מחט עשויה למנוע הצטברות לחץ בתא העליון של מלכודת המתלים (לחץ מוגבר יגרום לתמיסת טריפסין לטפטף דרך העמוד).
  12. הוסף 80 מיקרוליטר של 50 מ"מ TEA-BC pH 8.5 במים בדרגת LC-MS. צנטריפוגה ב-4,000 גרם ב-RT למשך דקה אחת ברוטור בעל זווית קבועה כדי להעביר כל תקציר דרך העמודה.
  13. הוסף 80 מיקרוליטר של 0.2% חומצה פורמית v/v במים בדרגת LC-MS. צנטריפוגה ב-4,000 גרם למשך דקה אחת ב-RT ברוטור בזווית קבועה לאיסוף עם תקציר משלב 2.11.
  14. הוסף 80 מיקרוליטר של 50% v/v אצטוניטריל במים בדרגת LC-MS. צנטריפוגה ב-4,000 גרם ב-RT למשך דקה אחת ברוטור בזווית קבועה לאיסוף עם תקציר משלב 2.11.
  15. אחסן את מלכודת המתלים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  16. יבש את הדגימה ברכז ואקום.
  17. אחסן את הדגימה המיובשת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

3. ניקוי עם עמודת איזון הידרופילי-ליפופילי (HLB).

  1. הכינו תמיסות A (2% v/v acetonitrile/0.1% v/v חומצה פורמית) ו-B (80% v/v acetonitrile/0.1% v/v חומצה פורמית).
  2. ממיסים את הדגימה ב-500 מיקרוליטר של תמיסה A.
  3. הנח את העמוד בסעפת ואקום והפעל לחץ גז ב-~1-2 מ"ל/דקה.
  4. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסה B לעמודת HLB והתפנה במהירות של 1-2 מ"ל/דקה; חזור על הפעולה פעמיים.
  5. הוסף 750 מיקרוליטר של תמיסה A לעמודת HLB והתפנה במהירות של 1-2 מ"ל/דקה; חזור על הפעולה פעמיים.
  6. הנח מיקרו-צינור נקי של 2 מ"ל במדף מתחת לעמודת HLB, טען את הדגימה ב-500 מיקרוליטר של תמיסה A, ולחץ גז כאמור לעיל; העבירו את הזרימה לתוך העמודה בפעם השנייה.
  7. הנח את עמודת HLB מעל צינור הפסולת, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסה A ופנה כאמור לעיל; חזור על הפעולה פעמיים.
  8. הנח את העמוד מעל מיקרו-צינור נקי של 2 מ"ל, הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסה B ופנה כאמור לעיל; חזור על הפעולה פעמיים.
  9. מקפיאים את הנוזל בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, ואז מייבשים ברכז ואקום. אחסן את השאריות המיובשות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  10. ממיסים את השאריות ב-20 מיקרוליטר של 2% v/v אצטוניטריל/0.1% v/v חומצה פורמית לפני ניתוח MS. השתמש בספקטרופוטומטר כדי להעריך את ריכוז הפפטידים בספיגה של 205 ננומטר.

4. ניתוח ספקטרומטריית מסה

  1. כרומטוגרפיה נוזלית חד מימדית הפוכה (LC)-MS/MS
    1. הזרקו מסה שווה של פפטידים (~600 ננוגרם) על ננו-LC חד-ממדי ושברו אותה על עמודות פאזה C18 הפוכה.
    2. הוציא את הפפטידים ישירות לתוך MS במתח ריסוס של 1.8 קילו וולט, עם צינור העברת יונים הנשמר ב-250 מעלות צלזיוס.
    3. רכוש את הספקטרום במצב 20 היונים העליונים התלוי בנתונים שבו שבר ה-MS/MS האינטנסיבי ביותר מוסר מתור הניתוח כדי לשפר את עומק מיפוי היונים על יונים בשפע נמוך יותר.

5. ניתוח נתונים וביואינפורמטיקה

  1. נהלי טיפול בנתונים
    1. לאחר הקצאה ספקטרלית וזיהוי פפטידים וחלבונים ב-PEAKS 12.0 (תוכנת ניתוח נתונים LC-MS/MS), הגש את רשימות החלבונים לניתוח ב-MetaboAnalyst 6.0 (פלטפורמת ניתוח נתונים מטבולומיים) באמצעות גישת הניתוח הסטטיסטי החד-גורמי (https://www.metaboanalyst.ca/).
    2. השתמש בתוכנת ניתוח נתונים LC-MS/MS כדי לחפש ולסנן ספקטרום באמצעות קריטריונים מחמירים של שיעור גילוי שווא (FDR) (1% חלבון ופפטיד) מול מסד הנתונים של FASTA שנבדק על ידי עכבר.
      הערה: תוכניות חיפוש חלופיות הזמינות כוללות את Maxquant, Proteome Discoverer, בין אפשרויות נפוצות אחרות.
    3. ציין קרבמידומתילציה של ציסטאין כשינוי קבוע. ציין חמצון של מתיונין כשינוי משתנה.
    4. המר את הרשימות לתבנית ערכים מופרדים באמצעות פסיקים (CSV) ולתוויות קבוצתיות/דוגמאות שהוקצו לכל עמודה ושורה. פורמט זה גמיש בפלטפורמת ניתוח הנתונים המטבולומיים.
    5. ייחוס הערכים החסרים באמצעות כלל הערך המינימלי של 1/5 למשתנים חסרים.
    6. סנן את הנתונים כדי לא לכלול ערכים משתנים מאוד באמצעות הטווח הבין-רבעוני, שבו נעשה שימוש בשונות של 40% עבור החיתוך.
    7. נרמלו את הערכים לעוצמה חציונית,ל-log 10 שהשתנו וממוצע ממורכז לשינוי קנה מידה. השתמש בגישות נורמליזציה אחרות, תוך התחשבות בכך שהתוצאות עשויות להשתנות.
    8. בצע בדיקות T בצורה לא מותאמת עם חתך ערך p < 0.05. בצע תיקוני בדיקה מרובים בשלב זה.
      הערה: מחקר זה לא ביצע תיקון זה עבור מערך הנתונים המייצג למטרות הצגת נתונים.
    9. ציין עלילות הר געש לשינוי פי 1.5 (FC) ו-p < 0.05.
    10. צור מפות חום ובצע ניתוח מבחין חלקי של ריבועים מינימליים (PLSDA) וניתוח סטטיסטי (משתנה חשיבות ההקרנה [VIP]) של קבוצות המדגם.
    11. מועמדים פוטנציאליים למעקב חזקים מספיק כדי לעלות על 1.5FC ו-p-val <-0.05 או VIP >-1.0, כפי שמצוין בניתוח PLSDA.
    12. צור דיאגרמות ון כדי להמחיש את ההבדלים בפרוטאום של כל הכליה, הצינורית והמדולה בעכברי OVE26.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בסך הכל, זיהויי החלבון הכוללים מכל סוג דגימה היו 1) כליה שלמה (1438) 2) מדולה (2145) וצינורות קליפת המוח (1859). לאחר עיבוד נתונים ב-MetaboAnalyst 6.0, סינון נתונים וחישוב, זיהויי חלבון שנותחו לבסוף עבור כל תא כליה היו: כליה שלמה (455), מדולה (997) וצינורות קליפת המוח (896). איור 4 מראה שינויים פרוטאומיים גלובליים בכליות עכבר סוכרתי OVE26. ניתוח כמותי ללא תוויות (LFQ) מאפשר כיסוי פרוטאום מעמיק תוך הצגת שונות רבה יותר במערך הנתונים הכולל בהשוואה לתיוג יונים מדווח (TMT, iTRAQ וכו'). גישה אחת ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטות המוצגות בגישה טכנית זו נועדו להמחיש ניתוח פרוטאום השוואתי של אזורים שונים בכליה. כאן, השתמשנו בשיטות לבידוד מדולה וצינוריות קליפת המוח בעכברים סוכרתיים (OVE26) ובקרה (FVB) וביצענו ניתוח LC-MS/MS וביואינפורמטיקה חד-ממדי כדי להמחיש את ההבדלים הבסיסיים בפרוטאום בכל חלק של הכליה, בנוסף לפרוטאום של כליות שלמות.

בידוד תאי הכליה דורש דיסקציה זהירה של קליפת המוח הרחק מהמדולה. עם חיתוך רוחבי ראשוני של כליות, פרוסות דקות יאפשרו דיסקציה אמינה יותר של קליפת המוח. ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין גילוי נאות.

תודות

העבודה עבור פרויקט זה נתמכה באופן חלקי במימון MTB (NIH K01DK080951) ו-TDC (קונסורציום מחקר נפרולוגיה לילדים NephCure-Pediatric NKI-2023-04) והתוכנית למחלות כליות של אוניברסיטת לואיוויל והמרכז הטכנולוגי לפרוטאומיקה (TDC, MTB).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קולגנאז מסוג 1A Millipore SignalC9891
Exploris 480 Orbitrap Thermofisherhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539
מסננת תאי פלקון MS, 100 ומיקרו; mVWR21008-950
מסננת תאי פלקון, 70 ומיקרו; mVWR21008-952
Gibco PBS pH 7.4 מעכב תרמו1001023
הפסקת פרוטאז ופוספטאזVWRPI78440
יודואצטמידסיגמא אולדריץ'I1149
MetaboAnalyst 6.0 MetaboAnalyst 6.0 https://www.metaboanalyst.ca/פלטפורמת ניתוח נתונים מטבולומיקה
NanoDrop 2000 תרמופישרhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000
טור אואזיס HLB Waters186002034
PEAKS 12.0Bioinformatics Solutions IncLC-MS/MS תוכנת ניתוח נתונים
Pestle for 1.5 מ"ל MicrotubeFisher ScientificNC0782485
מלכודת השעיה (S-trap)ProtifiC02-micro-10
TCEPThermoFisher Scientific20490
TEABCSigma AldrichT7408
טריפסין פרוטאז, MS-GradeThermoFisher Scientific90057
מנקה אולטרסאונדCole-Parmer   דגם: 0884900
קוקטייל

מקורות

  1. Ding, X., et al. Epidemiological patterns of chronic kidney disease attributed to type 2 diabetes from 1990-2019. Front Endocrinol. 15, 1383777(2024).
  2. Liu, W., et al. Global trends in the burden of chronic kidney disease attributable to type 2 diabetes: an age-period-cohort analysis. Diabetes Obes Metab. 26 (2), 602-610 (2024).
  3. Xie, D., et al. Global burden and influencing factors of chronic kidney disease due to type 2 diabetes in adults aged 20-59 years, 1990-2019. Sci Rep. 13 (1), 20234(2023).
  4. Giunti, S., Barit, D., Cooper, M. E. Mechanisms of diabetic nephropathy: role of hypertension. Hypertension. 48 (4), 519-526 (2006).
  5. Thomas, M. C., Burns, W. C., Cooper, M. E. Tubular changes in early diabetic nephropathy. Adv Chronic Kidney Dis. 12 (2), 177-186 (2005).
  6. Thomas, M. C., et al. Diabetic kidney disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15018(2015).
  7. Nath, K. A. Tubulointerstitial changes as a major determinant in the progression of renal damage. Am J Kidney Dis. 20 (1), 1-17 (1992).
  8. Bonventre, J. V. Can we target tubular damage to prevent renal function decline in diabetes. Semin Nephrol. 32 (5), 452-462 (2012).
  9. Powell, D. W., et al. Renal tubulointerstitial fibrosis in OVE26 type 1 diabetic mice. Nephron Exp Nephrol. 111 (1), e11-e19 (2008).
  10. Cummins, T. D., et al. Quantitative mass spectrometry of diabetic kidney tubules identifies GRAP as a novel regulator of TGF-beta signaling. Biochim Biophys Acta. (4), 653-661 (2010).
  11. Barati, M. T., et al. Differential expression of endoplasmic reticulumstress-response proteins in different renal tubule subtypes of OVE26 diabetic mice. Cell Stress Chaperones. 21 (1), 155-166 (2016).
  12. Zheleznova, N. N., et al. Mitochondrial proteomic analysis reveals deficiencies in oxygen utilization in medullary thick ascending limb of Henle in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 44 (17), 829-842 (2012).
  13. Nordquist, L., Palm, F. Diabetes-induced alterations in renal medullary microcirculation and metabolism. Curr Diabetes Rev. 3 (1), 53-65 (2007).
  14. dos Santos, E. A., Li, L. -P., Ji, L., Prasad, P. V. Early changes with diabetes in renal medullary hemodynamics as evaluated by fiberoptic probes and BOLD magnetic resonance imaging. Invest Radiol. 42 (3), 157-162 (2007).
  15. Cummins, T. D., et al. Quantitative Mass Spectrometry Normalization in UrineBiomarker Analysis in Nephrotic Syndrome. Glomerular Dis. (3), 121-131 (2022).
  16. Carlson, E. C., Audette, J. L., Klevay, L. M., Nguyen, H., Epstein, P. N. Ultrastructural and functional analyses of nephropathy in calmodulin-induced diabetic transgenic mice. Anat Rec. 247 (1), 9-19 (1997).
  17. Zheng, S., et al. Development of late-stage diabetic nephropathy in OVE26 diabetic mice. Diabetes. 53 (12), 3248-3257 (2004).
  18. Wang, F., Veth, T., Kuipers, M., Altelaar, M., Stecker, K. E. Optimized suspension trapping method for phosphoproteomics sample preparation. Anal Chem. 95 (25), 9471-9479 (2023).
  19. Mather, A., Pollock, C. Glucose handling by the kidney. Kidney Int Suppl. 120, S1-S6 (2011).
  20. Ross, B. D., Espinal, J., Silva, P. Glucose metabolism in renal tubular function. Kidney Int. 29 (1), 54-67 (1986).
  21. Roger, F., Martin, P. Y., Rousselot, M., Favre, H., Féraille, E. Cell shrinkage triggers the activation of mitogen-activated protein kinases by hypertonicity in the rat kidney medullary thick ascending limb of the Henle's loop: requirement of p38 kinase for the regulatory volume increase response. J Biol Chem. 274 (48), 34103-34110 (1999).
  22. Yang, J., Lane, P. H., Pollock, J. S., Carmines, P. K. PKC-dependent superoxide production by the renal medullary thick ascending limb from diabetic rats. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (5), F1220-F1228 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

פרוטאומיקה של הכליותפגיעה כלית סוכרתיתבידוד תאי צינוריות קורטיקליותפרוטאומיקה של המוחהספקטרומטריית מסותפרוטאומיקה כמותית ללא סימוןמדורי כליה של עכברפרוטאומיקה של תא בודדזיהוי חלבוניםניתוח תרשים הר געש (Volcano Plot)
ניתוח פרוטאומי השוואתי של כליות שלמות, מדולה וצינורות קליפת המוח בפתוגנזה סוכרתית של פגיעה בכליות בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.