מאמר שיטה

העברת גנים וביטוי משופרים באמצעות הזרקה תוך גרמית של חלקיקי צ'יטוזן עטופים בעריכת אדנין בסיס פלסמידים

DOI:

10.3791/68181

⸱

16 במאי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים גישת ריפוי גנטי המספקת צ'יטוזן מצופה ABE ישירות למח העצם על ידי הזרקה תוך גרמית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אספקת פלסמידים אקסוגניים לבעלי חיים ניסיוניים היא חיונית במחקר ביו-רפואי, כולל חקירת תפקודי גנים, הבהרת מנגנוני מחלה והערכת יעילות התרופות. עם זאת, יעילות הטרנספקציה של השיטה הנוכחית נמוכה יחסית, והכנסת פלסמידים לביטוי גנים לטווח ארוך עשויה להיות מושפעת ממערכת החיסון. כדי להתמודד עם מגבלות אלו, פיתחנו וחקרנו שיטה חדשה המשתמשת בצ'יטוזן כדי לעטוף פלסמידים של עורך בסיס אדנין (ABE) ולאחר מכן להעביר ישירות את הקומפלקס למח העצם של עכברים על ידי הזרקה תוך גרמית. במחקר זה, כדי למקד את הגן CaMK II δ , הקשור קשר הדוק להתמיינות אוסטאוקלסטים, השתמשנו בצ'יטוזן כדי לעטוף את ABE CaMK II δ פלסמידים. הזרקנו ישירות את מטען הפלסמיד לחלל מח העצם על ידי הזרקה תוך גרמית. התוצאות הראו יעילות עריכה גבוהה in vivo של 14.27% בלוקוס A1 ו-10.69% בלוקוס A2 בעכברים מקבלים. אסטרטגיה חדשנית זו לא רק מתאימה במיוחד למחלות הנגרמות על ידי תפקוד לא תקין של אוסטאוקלסטים, אלא גם טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי לקידום תחום הריפוי הגנטי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריפוי גנטי התגלה כגישה מבטיחה בתחום המחקר הביו-רפואי 1,2. הוא מציע פוטנציאל לטפל במגוון הפרעות על ידי החדרת פלסמידים זרים בחיות ניסוי כדי לווסת את הביטוי של גנים ספציפיים ולחקור את ההשפעות הטיפוליות שלהם. עם זאת, שיטות אספקה קונבנציונליות נתקלו בכמה בעיות המגבילות את יעילותן ובטיחותן3. החששות כוללים יעילות טרנספקציה נמוכה, נזק ביולוגי גבוה ויעילות ביטוי גנים נמוכה. לכן, יש צורך לבסס שיטת אספקה חדשה לטיפול גנטי שיכולה להתגבר על מגבלות אלו.

צ'יטוזן הוא פוליסכריד טבעי עם התכלות ביולוגית טובה ותאימות ביולוגית 4,5,6, מה שמקל על ההתכלות בגוף בעלי חיים מבלי לגרום לרעילות ביולוגית חמורה. הוא נמצא בשימוש נרחב במתן תרופות בשל שיעור הטמעת התרופות הגבוה שלו 7,8, יעילות אספקה משופרת והפחתת נזק לבעלי חיים.

טכנולוגיית עריכת גנים ABE, המאפשרת המרה ישירה של זוגות בסיסים של A-T ל-G-C, מבטיחה במחקר גנטי ורפואי. בהשוואה לטכנולוגיית עריכת הגנים המיינסטרים הנוכחית, טכנולוגיית ABE יכולה להשיג מוטציה מדויקת של בסיס יחיד, ובכך להפחית את העריכה של רצפי DNA שאינם מטרה, להפחית את ההשפעות מחוץ למטרה 9,10, ולהוביל לאפס שבירות של גדיל כפול DNA11, מה שמפחית מאוד את הסיכון לעריכת גנים12. טכנולוגיית ABE היא גם תואמת ביולוגית מאוד ומתאימה יותר למחקר טיפול במחלות.

הזרקת וריד זנב היא שיטה נפוצה המשמשת לאספקה in vivo של פלסמידים, במיוחד בריפוי גנטי. גן המטרה למחקר זה הוא CaMK II δ, הקשור קשר הדוק להתמיינות אוסטאוקלסטים13,14. השימוש בהזרקה תוך גרמית במקום בווריד הזנב מאפשר לפלסמיד הערוך להיכנס לאוסטאוקלסטים ישירות למח העצם. העברה ישירה זו למח העצם מגבירה את היעילות והיציבות של ביטוי הגנים, מה שמועיל לטיפול במחלות הקשורות לתפקוד לקוי של אוסטאוקלסטים.

כאן, אנו מציגים שיטה חדשה הכוללת עטיפת פלסמיד ABE עם צ'יטוזן ולאחר מכן החדרת הקומפלקס ישירות לעכברים על ידי הזרקה תוך גרמית. באמצעות שיטה זו, אנו מקווים לסלול את הדרך לטיפולים יעילים יותר בריפוי גנטי לפלסמידים זרים הנכנסים לאורגניזמים, במיוחד מחלות הקשורות לתפקוד לקוי של אוסטאוקלסטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי הוועדה לבריאות בעלי חיים של אוניברסיטת אנהוי על שימוש וטיפול בבעלי חיים. במחקר זה, ABE נתרם בנדיבות על ידי פרופסור טיאן צ'י (אוניברסיטת שנחאי למדע וטכנולוגיה, שנחאי, סין; איור 1D).

1. בניית פלסמיד ABE

  1. תכנן gRNA עם הרצף TCCATGATGCACAGACAGGA שבו PAM מוצג על ידי GAC.
  2. על פי מדריך רשימת הפריימרים של החברה, הוסף את הפריימר לנפח המתאים של ddH2O כדי להשיג ריכוז של 100 מיקרומטר. לאחר מכן, יש לנער ולערבב היטב כדי להבטיח פיזור אחיד. לתגובת החישול, הכינו תמיסה של 10 מיקרומטר על ידי הוספת 10 מיקרוליטר מתמיסת פריימר המלאי לצינור המיקרוצנטריפוגה החדש, 90 מיקרוליטר של ddH2O, וערבבו היטב.
  3. הוסף 5 מיקרוליטר של פריימר במעלה הזרם, 5 מיקרוליטר של פריימר במורד הזרם ו-40 מיקרוליטר של ddH2O בצינור מיקרוצנטריפוגה. כדי להקל על תגובת החישול, טבלו את הצינור במיכל מלא במים רותחים למשך 5 דקות. ודא שמפלס המים לא יגיע לפתח הצינור כדי למנוע כניסת מים ולזהם את הפריימרים. מצננים לטמפרטורת החדר כדי להשלים את תגובת החישול.
  4. הוסף 2 μg pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP (איור 1D), 1 μL של ESP3I, 4 μL של מאגר ו-33 μL של ddH2O לתוך שפופרת מיקרו-צנטריפוגה ואפשר להגיב באמבט מים בטמפרטורה קבועה ב-37 °C למשך 45 דקות.
  5. בצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. הכינו ג'ל אגרוז 1% במשקל 0.5 גרם אגרוז ושפכו אותו לבקבוק זכוכית. הוסף 50 מ"ל של מאגר TAE 1x לבקבוק הזכוכית ונער כדי להמיס את אבקת האגרוז. מחממים במיקרוגל למשך 2 דקות עד להמסה מלאה. מוסיפים 5 מיקרוליטר של כתם ג'ל חומצת גרעין YeaRed, מערבבים היטב ויוצקים לתבנית הג'ל; לאחר שהג'ל מתמצק, התחל להוסיף את הדגימות.
    הערה: כדי להכין 1xTAE, השתמש בריאגנטים המפורטים בטבלה 1.
  6. הוסף 1x TAE למיכל האלקטרופורזה והכניס את בלוק ג'ל האגרוז המוגדר, אותו יש לטבול ב-TAE. הוסף 5 מיקרוליטר של מאגר טעינה 1x למוצר העיכול משלב 1.4 וערבב. מוסיפים את הדגימה לג'ל. בנוסף, הוסף לג'ל גם 6 מיקרוליטר של טוש.
  7. הפעל את תוכנית האלקטרופורזה במתח קבוע של 110 וולט למשך 35 דקות. לאחר אלקטרופורזה, קבעו את מיקום הלהקה בדגימה על פי הסמן וחתכו את רצועת הג'ל בעזרת להב נקי להתאוששות ג'ל.
  8. בצע את פעולת שחזור הג'ל לפי הוראות ערכת הטיהור של ג'ל מקסי. הגדר אמבט מים ל-50 מעלות צלזיוס. הוסף את הנפח המתאים של תמיסת PN לצינור המכיל את הג'ל החתוך לפי הערכה. תקעו את הג'ל עם קצה פיפטה כדי להקל על הפירוק ואז הכניסו אותו לאמבט המים. יש לנער את השפופרת מדי פעם ולהתבונן בתהליך הפירוק עד להמסה מלאה של גוש הג'ל.
  9. קח עמוד ספין, CA3, מהערכה. הוסף 500 μL של תמיסת BL מהערכה לתוך עמודת הספין וצנטריפוגה אותה ב-2,000 x g למשך דקה אחת כדי לאזן את העמודה. לאחר הצנטריפוגה, הסר את נוזל הפסולת בתחתית צינור האיסוף והחזיר את עמוד הספיחה לצינור האיסוף.
  10. המשך בצנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך דקה אחת. השליכו את נוזל הפסולת בתחתית צינור הצנטריפוגה, הוסיפו 600 מיקרוליטר של תמיסת PN וצנטריפוגה 2,000 x גרם למשך 30 שניות; השלך שוב את נוזל הפסולת. חזור על הפעולה והשליך שוב את נוזל הפסולת.
  11. לאחר הצנטריפוגה, החלף את צינור האיסוף של 2 מ"ל בצינור חדש של 1.5 מ"ל. פתח את המכסה והניח להתייבש במקום מאוורר למשך 30 דקות כדי להסיר את האתנול לחלוטין. לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר מחומם מראש של ddH2O, צנטריפוגה והוציא את ה-DNA הנדרש.
    הערה: יש להוסיף PN עם אתנול נטול מים לפי ההוראות. השימוש במים שחוממו מראש יכול להגדיל את התשואה.
  12. הוסף 7 מיקרוליטר של מוצר חישול משלב 1.3, 3 מיקרוליטר של מוצר התאוששות ג'ל משלב 1.11, 1 מיקרוליטר של T4 DNA Ligase, 2 מיקרוליטר של 10x T4 Ligase Buffer, ו-7 מיקרוליטר של ddH2O לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה, ושמור למשך הלילה ב-16 מעלות צלזיוס כדי להשיג את מוצר הקשירה.
  13. הוסף 10 מיקרוליטר של תוצר קשירה ו-70 מיקרוליטר של DH5α בצינור מיקרו-צנטריפוגה על קרח למשך 30 דקות. הגדר את אמבט המים ל-42 מעלות צלזיוס. לאחר אמבט הקרח, הכניסו את הצינור לאמבט המים למשך 90 שניות ואז שוב על קרח למשך 2 דקות.
  14. מוסיפים 600 מיקרוליטר של מדיום נוזלי לוריא-ברטאני (LB) לשפופרת ומנערים על שייקר למשך 30 דקות. במקביל, הקרינו צלחת בינונית מוצקה LB בתוך ארון זרימה למינרי למשך 30 דקות. לאחר הדגירה יש לחלק באופן שווה 100 מיקרוליטר מהתמיסה על הצלחת. לאחר הציפוי, הניחו את הצלחת הפוכה בחממת חיידקים של 37 מעלות צלזיוס לתרבית.
    הערה: DH5α מאוחסן בדרך כלל בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. מדיום מוצק LB מוכן באמצעות הריאגנטים המפורטים בטבלה 2. מדיום נוזלי LB מוכן באמצעות הריאגנטים המפורטים בטבלה 3.
  15. בחר מושבה בודדת והרחיב את מושבת החיידקים למשך 14 שעות על צלחת טרייה. קח צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, הוסף 50 מ"ל מדיום נוזלי LB, הוסף 50 מיקרוליטר אמפיצילין ביחס של 1:1000 וערבב היטב. חלקו את זה לצינורות חדשים ב-15 מ"ל לצינור.
  16. בדוק את צלחת התרבות אם יש מושבות לבנות עגולות עם צמיחה טובה. בחר אותם עם פיפטה של 10 מיקרוליטר והעביר אותם למדיום LB. תרבו את זה בשייקר למשך 12 שעות ואז שלחו את הדגימה הזו לריצוף.
  17. השווה את תוצאות הריצוף עם ה-gRNA היעד כדי לזהות את הזן עם הרצף התואם, Camk II δ-sgRNA, כזן המטרה, ולאחר מכן חלץ את הפלסמיד.
  18. בצע מיצוי פלסמיד על פי ההוראות של ערכת הפלסמיד המיני. הוסף 500 מיקרוליטר של BL לעמודת הספיחה CP3, צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-2,000 x גרם, והשליך את נוזל הפסולת. החזר את עמוד הספיחה לצינור האיסוף. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת חיידקים וצנטריפוגה ב -4,000 x גרם למשך 10 דקות.
  19. אסוף את הזרימה דרך. שוב צנטריפוגה, ולאחר הסרת הסופרנטנט, הוסף 250 מיקרוליטר של P1 לצינור הצנטריפוגה עם משקעים חיידקיים ואז העביר אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה ומערבולת. הוסיפו 250 מיקרוליטר של P2 והפכו בעדינות ל-6x-8x. הוסיפו 350 מיקרוליטר של P3 ושוב הפכו בעדינות ל-6x-8x. מופיעים משקעים פלוקולנטיים לבנים.
  20. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-2,000 x גרם. העבירו את הסופרנטנט לעמודת ספיחה חדשה CP3, צנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך 30 שניות, והוציאו את נוזל הפסולת. הוסף 600 מיקרוליטר PW, צנטריפוגה שוב ב-2,000 x גרם למשך 30 שניות, והסר את נוזל הפסולת. הוסף שוב 600 מיקרוליטר PW, צנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך 30 שניות, והסר את נוזל הפסולת.
  21. הנח את עמוד הספיחה בצינור האיסוף ובצנטריפוגה למשך 2 דקות בטמפרטורה של 2,000 x גרם כדי להסיר שאריות PW. לאחר מכן, הנח את עמוד הספיחה בצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי, הניח לו להתייבש במשך 30 דקות, והוסף 35 מיקרוליטר של ddH2O שחומם מראש לאמצע סרט הספיחה, ולאחר מכן אחסן את המוצר המתקבל ב-20 מעלות צלזיוס לבדיקות הבאות.
    הערה: יש להוסיף PW עם אתנול נטול מים לפי ההוראות. השימוש במים שחוממו מראש יכול להגדיל את התשואה.

2. מיצוי תאי מח

  1. עכברי KM נבחרים בגילאי 8-9 שבועות, זכרים ובמשקל של כ-30 גרם. מקבעים את העכברים ביד שמאל כשהראש פונה כלפי מטה והזרקו 150 מיקרוליטר של נתרן פנטוברביטל 1% מצד הבטן בעזרת מזרק בעזרת יד ימין. אשר את ההרדמה על ידי צביטת הבוהן.
  2. בצע פריקת צוואר הרחם של עכברים, הסר את השוקה בעזרת מספריים ופינצטה כירורגית, והפשיט את רקמת השריר העודפת שמסביב. משרים את השוקה שהוסרה ב- PBS ושוטפים ומשאירים רק עצמות נקיות.
  3. קח 1 מ"ל של PBS במזרק כדי לשטוף תאי מח עצם מקצה אחד של השוקה עד שהעצם לבנה.
  4. אסוף תרחיף תאים וצנטריפוגה ב-800 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, ליזה את תאי הדם האדומים עם 500 מיקרוליטר של ליזאט של תאים אדומים. לאחר דקה אחת, הוסף 1 מ"ל של מאגר הפרדה כדי לסיים את הליזאט של התא האדום. לאחר צנטריפוגה ב-800 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, הסר את הסופרנטנט והניח את התאים על קרח לשימוש מאוחר יותר.
    הערה: אם תאי הדם האדומים עוברים ליזה מלאה, התאים משקעים, ולא נראים תאים אדומים. אם עדיין אפשר לראות את התאים האדומים, אפשר לליז אותם שוב, אולם זמן הדגירה לא צריך להיות ארוך מדי כדי למנוע נזק לתאים אחרים.

3. טרנספקציה של צ'יטוזן

  1. הכנת צ'יטוזן: שוקלים 4 מ"ג צ'יטוזן וממיסים ב-20 מ"ל של תמיסת חומצה אצטית של 0.2 מ"ג/מ"ל. התאם את ה-pH ל-5.5 עם 10 M NaOH. קח 500 מיקרוליטר מתמיסה זו והוסף אותה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה בודדים.
  2. הוסף פלסמידים של 2 מיקרוגרם, 3 מיקרוגרם, 4 מיקרוגרם ו-5 מיקרוגרם ABE לצינורות בודדים והמיס אותם ב-500 מיקרוליטר של 30 מ"מ Na2SO4. מערבבים 500 מיקרוליטר תמיסת צ'יטוזן ו -500 מיקרוליטר של הפלסמיד.
  3. דגרו אותם באמבט מים בטמפרטורה של 50-55 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר ערבוב שני הפתרונות היטב, מערבולת למשך 15-30 שניות ומניחים לעמוד למשך 30 דקות.
  4. אפיון צ'יטוזן: נתח את הקוטרים ופוטנציאל הזטה של צ'יטוזן באמצעות פיזור אור דינמי (DLS), כאשר ריכוז הצ'יטוזן נשמר על 0.1 מ"ג/מ"ל ב-ddH2O. הפעל כל דגימה פי 3.
  5. יצוק דגימות של 0.1 מ"ג/מ"ל על שבב סיליקון. הוסף 20 מיקרוליטר מהדגימות התלויות לרשתות של 200 רשת ודגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מכתימים את הרשתות בחומצה פוספוטונגסטית 2% למשך 3 דקות ומסירים את הנוזל הנותר בעזרת נייר פילטר. התבונן במיקרוסקופ אלקטרונים שידור.
  6. יעילות אנקפסולציה של ננו-חלקיקים: סנן את הסופרנטנט עם מסנן של 0.1 מיקרומטר כדי להסיר את החלקיקים הלא משקעים. העלה את הפלסמיד ומדוד את הריכוז בעזרת ספקטרופוטומטר ב -260 ננומטר. היעילות המחושבת של פלסמיד ABE ופלסמיד gRNA הייתה 84% ±-0.37% ו-85% ±-0.53%, בהתאמה.
  7. הזרקו 100 מיקרוליטר של צ'יטוזן משובץ בפלסמיד לעכברים דרך חלל מח העצם (שלב 5). לאחר 7 ימים של הזרקה יש לבודד את תאי מח העצם וליז את כדוריות הדם האדומות כמתואר בשלב 2.
  8. הוסף 2 מ"ל של מדיום DMEM המכיל סרום לצלחות תרבית תאים עם 6 בארות והוסף את תאי מח העצם (כ-1 x 106) תלויים ב-500 מיקרוליטר של מדיום DMEM המכיל סרום. מדוד את עוצמת הקרינה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לפלסמיד CaMK II δ-sgRNA יש פלואורסצנטיות אדומה TagRFP כאשר הוא נרגש ב-580 ננומטר (איור 2B).
    הערה: מדיום DMEM המכיל סרום מוכן באמצעות הריאגנטים המפורטים בטבלה 4.

4. ציטומטריית זרימה

  1. הכן מינונים שונים של פלסמידים ABE: 2 מיקרוגרם, 3 מיקרוגרם, 4 מיקרוגרם ו-5 מיקרוגרם, והעבירו לעכברים הנמענים כמתואר בשלב 3. לאחר 7 ימים, בודדו את תאי מח העצם מהעכברים כמתואר בשלב 3.
  2. אוספים את תאי מח העצם והצנטריפוגה בטמפרטורה של 800 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט וליזו את כדוריות הדם האדומות עם 500 מיקרוליטר של ליזאט תאי דם אדומים. לאחר דקה אחת, סיים את התגובה עם 1 מ"ל של מאגר הפרדה וספור את מספר התאים עם מונה תאים.
  3. העבירו 1 x 106 תאים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה וצנטריפוגה חדשים עם 800 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים עם 500 מיקרוליטר PBS והעבירו אותם לצינור זרימה. מדוד את היעילות על ידי ציטומטריית זרימה. הכן קבוצת ביקורת ציטומטריית זרימה כמתואר בשלב 2.
    הערה: פסולת תאים ותאים מתים עם אותות FSC נמוכים יותר וממוקמים בפינה השמאלית התחתונה של עלילת הפיזור FSC לעומת SSC (פחות מ-400) לא נכללו (איור 3). מכיוון שלפלסמידים יש פלואורסצנטיות אדומה של TagRFP, ניתן למיין אותם.

5. הזרקת חלל מח עצם

  1. עכברים זכרים נבחרים בגילאי 8 עד 9 שבועות, במשקל של כ-30 גרם. להרדים אותם בהזרקה תוך צפקית של 150 מיקרוליטר של 1% נתרן פנטוברביטל (שלב 2.1). אשר את עומק ההרדמה על ידי צביטת הבוהן.
  2. תקן את העכבר המורדם במצב שכיבה על שולחן הניתוחים ותקן את הגפה הקדמית של העכבר בעזרת סרט.
  3. יש לחטא את השוקה האחורית של עכברים בעזרת ספוגית אלכוהול. מלאו את הפלסמיד להזרקה במזרק של 1 מ"ל עם מחט 26G. הסר בועות אוויר והתכוננו להזרקה.
  4. גע בשוק העכבר והחזק את שוק העכבר באצבעותיך. קבע את מיקום מחט ההזרקה כך שציר השוק יחדור מרמת השוק במפרק הברך של העכבר. סובב את מחט ההזרקה במקביל לשוקה, דקר לתוך חלל מח העצם והזריק לאט (כ-3 שניות) כדי למזער את הנזק לעכברים.
  5. לאחר ההזרקה, שלפו לאט את המחט (כ-3 שניות) והשתמשו מיד במקלון אלכוהול כדי לעצור את הדימום ולחטא את מקום הניקוב.
  6. הניחו בעדינות את העכברים בסביבה חמה (20-26 מעלות צלזיוס), המתינו עד שהעכברים יתאוששו מההרדמה וצפו בהחלמתם.

6. ריצוף סנגר

  1. לאחר 7 ימים של הזרקה, אסוף תאי מח עצם של עכבר כמתואר בשלב 2 ובודד DNA גנומי באמצעות ערכת מיצוי. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב -2,000 x גרם למשך דקה אחת. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת GA ורטטו בעזרת מערבל מערבולת. מוסיפים 20 מיקרוליטר של פרוטאינאז K ו-200 מיקרוליטר של GB, מערבבים ואז מניחים באמבט מים של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  2. לאחר הדגירה מוסיפים 200 מיקרוליטר אתנול נטול מים, מנערים למשך 15 שניות ואז מכניסים את הנוזל המעורב לעמוד הספיחה התומך. צנטריפוגה בטמפרטורה של 2,500 x גרם למשך דקה אחת, השליכו את נוזל הפסולת בתחתית הצינור והוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת GD. צנטריפוגה והשליכו את נוזל הפסולת, שטפו את הגלולה פי 2 עם PW, ולבסוף יבשו אותה, והסירו אותה ב-40 מיקרוליטר מים טהורים.
    הערה: יש להוסיף PW עם אתנול נטול מים לפי ההוראות.
  3. הגביר את גן המטרה CaMKIIδ על ידי PCR עם רצף הפריימר הקדמי gctaaggtgataaatgtggcact ורצף הפריימר ההפוך של ctagtgtgcgggccagattc. הכן את תגובת ה-PCR על ידי הוספת 25 מיקרוליטר של מאגר 2x, 1 מיקרוליטר של dNTP Mix, 2 מיקרוליטר של פריימר קדימה, 2 מיקרוליטר של פריימר הפוך, 1 מיקרוליטר של DNA פולימראז, 2 מיקרוליטר של DNA תבנית ו-17 מיקרוליטר של ddH2O. הפעל את תוכנית ה-PCR הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 53.7 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, 12 מעלות צלזיוס לשימור חום.
  4. לאחר PCR, הכינו ג'ל אגרוז 1% ובצעו אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ב-110 וולט למשך 35 דקות (שלב 1.5, שלב 1.6). חותכים את אזור ג'ל המטרה לאחר אלקטרופורזה ושולחים לריצוף סנגר (איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלסמידים במבחנה הוזרקו לעכברים על ידי הזרקה תוך גרמית (איור 1A). גודל החלקיקים הממוצע של הננו-חלקיקים היה כ-202.9 ננומטר, הפוטנציאל היה 2.77 mV וה-PDI היה 0.22 (איור 1B). איור 1C מציג את צורת פני השטח של הננו-חלקיקים שנצפו ככדוריים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. איור 1D מציג את מפת הפלסמיד של וקטור ה-ABE ואת מפת הפלסמיד של וקטור ה-gRNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור מחקר ביו-רפואי, האתגר באספקת פלסמידים אקסוגניים לבעלי חיים כרוך בשיפור יעילות המסירה וביטוי הגנים ובמקביל מזעור הנזק לבעלי חיים כדי להשיג את האפקט הטיפולי הרצוי15,16. אנו מציגים שיטה חדשה להזרקה תוך גרמית של אספקת פלסמיד ABE בתיווך צ'יטוזן לתאי מח העצם של עכברים מקבלים. אסטרטגיה זו משפרת את יעילות אספקת הפלסמיד ואת ביטוי הגנים.

ראשית, במחקר זה, צ'יטוזן, המוצע כמערכת וקטורית לא ויראלית, שימש כשיטה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה הזו מומנה על ידי הקרן למדעי הטבע של מחוז אנהוי (2208085MC74, 2208085MC51) וקרן המחקר המדעי ממחלקת החינוך של מחוז אנהוי, סין (KJ2021A0055).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות PCR 0.2 מ"ל, מכסה שטוחמעבדה  PT-02-C
מזרק 1 מ"לAnhui Jiangnan ציוד רפואי ושות', בע"מ/
1% נתרן פנטוברביטל//
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהמעבדהMCT-001-150
10 ופעמים; מאגר טעינת DNAואזיםעמ' 022-01
10X T4 DNA Ligase Buffer 1 מ"לTaKaRa ביוטכנולוגיה (דאליאן) ושות', בע"מ2011א
1250 μ l קצה פיפטה 102.1 מ"ממעבדהT-001-1250
200 μ l קצות פיפטות 50.55 מ"ממעבדה  T-001-200
2x Phanta Max BufferaואזיםP505-d1
4 ? צנטריפוגהתרמו פישר75002425
צינור צנטריפוגה 50 מ"למעבדהT-012-50
צלחות תרבית תאים 6 בארותמעבדה11110
אגרסנגון ביוטקA505255-0250
המגבראביוול/
צ'יטוזןסנגון ביוטקA600614-0500
שייקר תרבות בטמפרטורה קבועהשנחאי Zhicheng מכשיר אנליטי ייצור ושות', בע"מZWY-200D
מונה סלולרי אוטומטי של הרוזנתתרמו פישר סיינטיפיקהרוזנת השנייה/השנייה פלורידה
שקופיות ומחזיק תא ספירת תאים של רוזנת, חד פעמיתרמו פישר סיינטיפיקC10228
מאגר CutSmartמעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדB7204SVIAL
DH5 ואלפא;ג'נרל ביוסיסטמסCS01010
DMEMג'יבקוC11995500BT
תערובת dNTPואזיםP505-d1
אנזים Esp3IנביולאבסR0734S
חומצה אתילנדיאמינטטראצטיתVETEC (סיגמא-אולדריך)V900106
סרום בקר עובריאורי סלFBSAD-01011-500
ציטומטר זרימהBD FACSקליבור342975
צינור זרימהביוטיים ביוטכנולוגיהFFC005-1תיק
מיקרוסקופ פלואורסצנטילייקה427019
ערכת טיהור ג'ל מקסיטיאנגןDP210
ערכת מיצוי DNA גנומיטיאנגןDP304
חומצה אצטית קרחוניתתאגיד קבוצת התרופות הלאומית של סין10000218
סמן DNA של GoldBand DL2,000YESENברקוד 10501ES60
מכונת קרחשנגחאיז'נגצ'יאוBNS-30מעבדה שמורה
מאגר ImunoSepדיוק ביומדיקל ושות', בע"מ604050
סדרת צנטריפוגות ספסל קטנות Megafuge 8תרמו פישר סיינטיפיק75004250
מםטכנולוגיית חיים11140050
ננו-דרופ 2000 תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב
נאוהסיגאםS5881-500G
PBSשיג'יןXG3650
וקטור PCMV-SPRY-ABE8E//
מכשיר הגברה PCRתרמו פישרAKC96300441
פניצילין/סטרפטומיצין סולארביועמ' 1400
פפטוןסנגון ביוטקA505247-0500
פנטה מקס סופר-פידליטי DNA פולימראזואזיםP505-d1
ליזאט תאים אדומיםביוטייםC3702
נתרן כלוריתאגיד קבוצת התרופות הלאומית של סין10019318
נתרן גופרתיאלאדיןS433911
T-001-10 10μ l קצות פיפטות 31.65 מ"ממעבדה  ט-001-10
T4 DNA ליגאזTaKaRa ביוטכנולוגיה (דאליאן) ושות', בע"מ2011א
טריסביופרוקסברקוד 1115KG001
טריפטוןסנגון ביוטקA505250-0500
מערבל מערבולתסיגמאZ258423
אמבט מיםשנגחאיYiihengDK-80
כתם ג'ל חומצה גרעינית YeaRedYESENברקוד 10203ES76
תמצית שמריםבי.בי.אייA610961-0500
זטאסייזר ננומלברן פאליטיקסZetasizer Nano ZS
&בטא;-מרקפטואתנול סיגמא444203

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ikawa, Y., et al. Gene therapy of hemoglobinopathies: Progress and future challenges. Hum Mol Genet. 28 (R1), R24-R30 (2019).
  2. Ginn, S. L., Mandwie, M., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2023-an update. J Gene Med. 26 (8), e3721(2024).
  3. Chen, J., Wang, K., Wu, J., Tian, H., Chen, X. Polycations for gene delivery: Dilemmas and solutions. Bioconjug Chem. 30 (2), 338-349 (2019).
  4. Tong, H., et al. Progress and prospects of chitosan and its derivatives as non-viral gene vectors in gene therapy. Curr Gene Ther. 9 (6), 495-502 (2009).
  5. Alizadeh, L., Zarebkohan, A., Salehi, R., Ajjoolabady, A., Rahmati-Yamchi, M. Chitosan-based nanotherapeutics for ovarian cancer treatment. J Drug Target. 27 (8), 839-852 (2019).
  6. Dimassi, S., Tabary, N., Chai, F., Blanchemain, N., Martel, B. Sulfonated and sulfated chitosan derivatives for biomedical applications: A review. Carbohydr Polym. 202, 382-396 (2018).
  7. Maity, S., Mukhopadhyay, P., Kundu, P. P., Chakraborti, A. S. Alginate coated chitosan core-shell nanoparticles for efficient oral delivery of naringenin in diabetic animals-an in vitro and in vivo approach. Carbohydr Polym. 170, 124-132 (2017).
  8. Abnoos, M., et al. Chitosan-alginate nano-carrier for transdermal delivery of pirfenidone in idiopathic pulmonary fibrosis. Int J Biol Macromol. 118 (Pt A), 1319-1325 (2018).
  9. Lee, H. K., Smith, H. E., Liu, C., Willi, M., Hennighausen, L. Cytosine base editor 4 but not adenine base editor generates off-target mutations in mouse embryos. Commun Biol. 3 (1), 19(2020).
  10. Lee, S. N., Jang, H. S., Woo, J. S. Heterologous expression and purification of a CRISPR-cas9-based adenine base editor. Methods Mol Biol. 2606, 123-133 (2023).
  11. Tang, J., Lee, T., Sun, T. Single-nucleotide editing: From principle, optimization to application. Hum Mutat. 40 (12), 2171-2183 (2019).
  12. Newby, G. A., et al. Base editing of hematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice. Nature. 595 (7866), 295-302 (2021).
  13. Lu, D. Z., et al. Camkii(δ) regulates osteoclastogenesis through erk, jnk, and p38 mapks and creb signalling pathway. Mol Cell Endocrinol. 508, 110791(2020).
  14. Sato, K., et al. Regulation of osteoclast differentiation and function by the camk-creb pathway. Nat Med. 12 (12), 1410-1416 (2006).
  15. Li, X., et al. Viral vector-based gene therapy. Int J Mol Sci. 24 (9), 7736(2023).
  16. Gonçalves, G. A. R., Paiva, R. M. A. Gene therapy: Advances, challenges and perspectives. Einstein. 15 (3), 369-375 (2017).
  17. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV in clinical trials. Curr Gene Ther. 11 (4), 321-330 (2011).
  18. Mingozzi, F., et al. Cd8(+) t-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat Med. 13 (4), 419-422 (2007).
  19. Dong, L., Li, Y., Cong, H., Yu, B., Shen, Y. A review of chitosan in gene therapy: Developments and challenges. Carbohydr Polym. 324, 121562(2024).
  20. Rizeq, B. R., Younes, N. N., Rasool, K., Nasrallah, G. K. Synthesis, bioapplications, and toxicity evaluation of chitosan-based nanoparticles. Int J Mol Sci. 20 (22), 5776(2019).
  21. Mansouri, S., et al. Chitosan-DNA nanoparticles as non-viral vectors in gene therapy: Strategies to improve transfection efficacy. Eur J Pharm Biopharm. 57 (1), 1-8 (2004).
  22. Zhou, C., et al. Off-target rna mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature. 571 (7764), 275-278 (2019).
  23. Betzler, B. K., Chee, Y. J. Bin Abd Razak, H.R. Intraosseous injections are safe and effective in knee osteoarthritis: A systematic review. Arthrosc Sports Med Rehabil. 3 (5), e1557-e1567 (2021).
  24. Lin, Y. W., Aplan, P. D. Leukemic transformation. Cancer Biol Ther. 3 (1), 13-20 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים