הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תדירות והתפלגות של הצלבות במיוזה Caenorhabditis elegans על ידי גנוטיפ SNP באמצעות PCR בזמן אמת

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68183

⸱

11 ביולי 2025

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 2Department of Genetic Engineering, Faculty of Biology-Oriented Science and Technology, Kindai University, 3Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק שיטה למדידת תדרי הצלבה והתפלגות במהלך מיוזה ב- Caenorhabditis elegans. גנוטיפ פולימורפיזם חד-נוקלאוטידי עם PCR בזמן אמת שימש לקביעת מקור הכרומוזומים. מיפוי 4 הנקודות איפשר לקבוע את התפלגות ההצלבה של אזורי הזרוע השמאלית, המרכז והימנית של כל כרומוזום.

תקציר

Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר מיוזה. בנוסף ליתרונות כלליים, כגון מחזור רבייה קצר, צאצאים רבים וגוף שקוף להדמיה, ישנם שישה זוגות של כרומוזומים הולוצנטריים הומולוגיים. יש הפרעות מוצלבות חזקות וויסות של התפלגות מוצלבת. כדי למדוד את תדירות ההצלבה, פותחו מיפוי סמנים גלויים, מיפוי snip-SNP וכימות של סמנים ציטולוגיים כמבשרים להיווצרות הצלבה. כאן, אנו מציגים שיטת גנוטיפ SNP שונה למדידת תדירות ההצלבה וההתפלגות בביציות C. elegans . שיטה זו יכולה להשמיט את השלבים המייגעים של הגבלה, עיכול ואלקטרופורזה בג'ל ולהימנע משיפוט מעורפל של רצועות DNA לא חתוכות. גנוטיפ פולימורפיזם חד-נוקלאוטידי (SNP) מבוצע באמצעות הזן ההיברידי בריסטול/הוואי. הכלאה של הרמפרודיטים עם זכרים המבטאים myo-3p::GFP מאפשרת לנו להתמקד בביציות. ליזאט תולעת בודד מייצר תבנית DNA מספקת לכל ששת הכרומוזומים. בדיקות הכימיה של TaqMan מבוססות אקסונוקלאז 5' וקלסר חריץ מינורי (MGB) ספציפי ל-SNP מאפשרות זיהוי מדויק של SNP בשיעור גנוטיפ של כ-97.7%. אנו משתמשים בזיהוי מדויק של SNPs כדי למדוד את תדירות ההצלבה ב - C. elegans. ניתן ליישם שיטה זו גם כדי לקבוע את תדירות ההצלבה במוטציות זכריות או פגומות מוצלבות, כמו גם עבור מרווחים כרומוזומליים ספציפיים יותר.

מבוא

היווצרות הצלבה בין כרומוזומים הומולוגיים חיונית להפרדה נכונה של כרומוזומים וגם ליצירת מגוון גנטי1. שגיאות בהיווצרות מוצלבת גורמות לאנופלואידיה, שעלולה להוביל לאי פוריות, הפלה ומומים מולדים2. תדירות ההצלבה משתנה לפי אזור הכרומוזום, סוג המוטציה, הגיל והמין, מה שמדגיש את הצורך למדוד במדויק את תדירות ההצלבה בכל אחד מהתנאים הללו 3,4,5. המטרה הכוללת של שיטה זו היא למדוד במדויק את תדירות ההצלבה של כל תחום כרומוזומלי ובכך לקבוע במדויק את התפלגות ההצלבות לכל אורך כרומוזום C. elegans.

באופן מסורתי, מיפוי דו-נקודתי באמצעות סמנים מורפולוגיים שימש למדידת תדירות הצלבה 6,7,8,9,10. ב- C. elegans, פנוטיפים של גוף, קצר ושמן (Dpy) ותנועה לא מתואמת (Unc) משמשים לעתים קרובות ליצירת מפות כרומוזומים6. היתרונות של שיטה זו הם עלותה הנמוכה ויכולתה לנתח צאצאים רבים. החסרונות של שיטות אלה כוללים את המגבלה של בחירת מוקדי העניין וחוסר היכולת להשתמש בצאצאים קטלניים מכיוון שהפנוטיפים שלהם אינם נראים לעין. על מנת להתגבר על אי הנוחות של בחירת האתר, טרנספוזונים Tc1 שימשו כסמנים לאתרים מתויגים ברצף פולימורפי (STS)11,12. ניתן לזהות Tc1s באמצעות PCR ואלקטרופורזה. בעוד שלזן הסטנדרטי של בריסטול N2 היו 30 עותקים של טרנספוזון Tc1, לבודדי C. elegans מברגרק בצרפת (RW7000 ו-DP13) היו 500 עותקים של Tc1. לפיכך, המספר והתפוצה של טרנספוזונים Tc1 משתנים בין מבודדים, וזה משמש לניתוח הכרומוזומים של צאצאי תולעים היברידיות בין מבודדים על ידי PCR. לאחר מכן, SNPs שימשו גם למדידת תדירות והפצה מוצלבת13,14. ה-SNP בין זני בריסטול N2 והוואי CB4856 הופיע כל 1,000 נקודות בסיס15,16. SNPs מזוהים כפולימורפיזמים באורך שבר הגבלה (RFLP) באמצעות PCR, עיכול הגבלה ואלקטרופורזה. לאחרונה, אתרי הכנסה/מחיקה קטנים (InDel) כמו גם SNPs בין בריסטול N2 ל-CB4856 הוואי הוצעו כסמנים יעילים יותר17. עם זאת, מדידת תדר הצלבה באמצעות Tc1, RFLP ו-InDel דורשת תהליכים עתירי עבודה כגון PCR, טיפול באנזימי הגבלה ואלקטרופורזה. אם כל תהליך אינו מותאם בניתוח בקנה מידה גדול, התוצאות עלולות להתפרש בצורה שגויה עקב גורמים כגון דיוק ה-PCR, סוג אנזים ההגבלה בו נעשה שימוש, יעילות מחשוף ה-DNA ובהירות והפרדת הרצועות במהלך אלקטרופורזה. לעומת זאת, השיטה המוצעת משתמשת בגנוטיפ SNP על ידי PCR בזמן אמת כדי להקל על כימות מדויק ומדויק.

הצלבות אינן מופצות באופן אקראי לאורך הכרומוזומים. ב- C. elegans, קרוסאוברים בודדים נוטים להיווצר בתדירות גבוהה יותר בזרועות ומדוכאים במרכז 3,5. מיפוי מורפולוגי דו-נקודתי אינו יכול לזהות היכן מתרחשים הצלבות מחוץ לגנים של סמן. לעומת זאת, מיפוי SNP מאפשר עלייה בסמנים והוכח כמקל על קביעת האזור המדויק של הצלבה לאורך כל הכרומוזום 5,14,18. במחקר זה, השתמשנו בגבולות התחום הכרומוזומלי שהוצעו על ידי רוקמן וקרויגליאק5 ובחרנו ארבעה SNPs לניתוח: בשני קצוות הכרומוזום, ובשני קצוות גבולות המרכז/זרוע.

על ידי ניצול השיטות הקודמות, הצענו שיטת זיהוי SNP מדויקת ומהירה על ידי PCR בזמן אמת באמצעות TaqMan, נוקלאז5' 19 כדי למדוד את ההצלבה בין הזרוע השמאלית, המרכז והזרוע הימנית של כל כרומוזום. היתרונות של השיטה שלנו על פני טכנולוגיות חלופיות, בהשוואה למחקרים קודמים 20,21,22, הם דיוק ופשטות. שיטה זו היא שיטת ניתוח מוצלבת המיושמת על ידי qPCR עבור C. elegans ומתאימה באופן נרחב לחוקרים החוקרים מיוזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. צלב גנטי ראשון

  1. הכן לוחות הזדווגות הכוללים לוחות רגילים של מדיום גידול נמטודות (NGM) עם נקודת OP50 קטנה (קוטר ~5 מ"מ) בצלחת 35 מ"מ.
  2. הוסיפו שלושה הרמפרודיטים L4 מזן בריסטול N2 (או מוטאנטים עם רקע בריסטול) ותשעה זכרים בוגרים צעירים מזן הוואי CB4856 על צלחת הזדווגות (איור 1A).
    הערה: כדי לנתח מוטציות עם קטלניות עוברית גבוהה, יש צורך להשתמש במוטאנטים מאוזנים עם רקע בריסטול והוואי בהכלאה זו. כדי להשיג מוטאנטים עם רקע הוואי, יש להצליב את המוטאנטים של בריסטול עם הזן ההוואי לפחות שש פעמים עד שלכל אתרי העניין של SNP יש רקע הוואי. כתוצאה מכך, המוטציה של הוואי מכילה רקע בריסטול רק באזור המוטנטי וכרומוזום המאזן.
  3. דגרו את הצלחת למשך 1.5 ימים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי להזדווג בין שני הזנים. העבירו כל הרמפרודיטה לצלחת NGM בודדת חדשה עם OP50.
  4. מניחים את הצלחות באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס למשך יום אחד כדי לאפשר להן להטיל ביצים מופרות. העבירו כל הרמפרודיטה לצלחת NGM בודדת חדשה עם OP50.
  5. מניחים את הצלחות בחממה של 20 מעלות צלזיוס למשך יום אחד כדי לאפשר להטיל שוב ביצים מופרות. הסר את ההרמפרודיטים. שמור את הצלחות למשך 0.5 - יום אחד בחממה של 20 מעלות צלזיוס כדי לגדל את הצאצאים ל- L4.

2. צלב שני

  1. בחר שישה הרמפרודיטים מוצלבים L4 (כלאיים של בריסטול/הוואי) ו-12-15 ccIs4251[(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::GFP מיטוכונדריאלי + dpy-20(+)] I (TTS24) זכרי בריסטול על לוחית הזדווגות חדשה (איור 1B).
    הערה: הזן המוחדר ccIs4251 מתקבל מהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis, ויש להכליא אותו עם זן N2 מסוג בר יותר משש פעמים.
  2. שמור את הצלחת למשך 1.5 ימים בחום של 20 מעלות צלזיוס בחממה להזדווגות. העבירו כל הרמפרודיטה לצלחת NGM חדשה עם OP50.
  3. מניחים את הצלחות באינקובטור של 20 מעלות צלזיוס למשך יום אחד כדי לאפשר להן להטיל ביצים מופרות. העבירו כל הרמפרודיטה לצלחת NGM בודדת חדשה עם OP50.
  4. שמור את הצלחות למשך יום אחד בחממה של 20 מעלות צלזיוס כדי לאפשר להן להטיל שוב ביצים מופרות. העבירו כל הרמפרודיטה הורית לצינור PCR עם 3 מיקרוליטר של מאגר ליזה כדי לבדוק אם ההכלאה הראשונה הצליחה.
  5. בדוק את הגנוטיפים של ההורים כהכלאה של בריסטול/הוואי על ידי PCR באזור של כרומוזום V. הפרד את הרצועות על ידי 2.5% אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
    1. ב-SNP, WBVar01973670, אורך אמפליקון ה-PCR מהגנום של בריסטול הוא 220 bp, ומהגנום של הוואי הוא 196 bp. אם תוצאות ה-PCR מצביעות על כך שההורים הם הומוזיגוטים מבריסטול, הדבר נובע מהפריה עצמית של הצלב הראשון. אל תשתמש בצאצאים של תולעים אלה לניתוח נוסף.

3. דגימה

  1. הכן מאגר ליזה תולעים באופן הבא: 50 מ"מ KCL, 10 מ"מ Tris pH 8.2, 2.5 מ"מ MgCl2, 0.45% IGEPAL CA-630 (NP-40), 0.45% טווין 20 ו-0.01% ג'לטין. מעקרים על ידי סינון ומאחסנים בטמפרטורת החדר. מיד לפני השימוש, הוסף 3 מיקרוליטר של 20 מ"ג/מ"ל פרוטאינאז K (ב-H2O) ל-1 מ"ל של מאגר ליזה ואחסן בקצבעות ב-20 מעלות צלזיוס.
  2. בדוק את ביטוי ה-GFP בשריר דופן הגוף של צאצאי הצלב השני על ידי מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי לפני הוספת התולעים לצינורות PCR בודדים. ההגדלה היא 6.1-55x, ואורך הגל המשמש הוא 440-460 ננומטר.
  3. בחר תולעת בודדת חיובית ל-GFP והוסף לכל צינור PCR המכיל 3 מיקרוליטר של מאגר ליזיס תולעת (איור 1C). אסוף בסך הכל 360 (90 x 4 שכפולים ביולוגיים) צאצאים זכרים בוגרים בכל אחד מ-360 צינורות PCR.
    הערה: כדי להימנע מקטיף צאצאים מופרים עצמית, יש לבחור תולעים חיוביות ל-GFP לדגימה. הרמפרודיטים לא מזווגים צעירים מ-L4 זמינים גם לניתוח אוטוזומים, אך מכיוון שיש להם מספרים שונים של כרומוזומי X, יש לזהות זכרים והרמפרודיטים לאחר שגדלו ל-L4 ולדגום אותם בעת ניתוח כרומוזום X.
  4. מניחים את הדגימות במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שניתן להתחיל ליזה.
  5. בעת ניתוח מוטציות עם קטלניות עוברית גבוהה, אסוף את העוברים המתים במקום זחלים חיים כדי לקבל תוצאות בלתי מוטות. כדי לאסוף עוברים, השתמש בקצה פיפטה עם 0.5 מיקרוליטר של תמיסת כיטינאז (20 מ"ג/מ"ל כיטינאז, 50 מ"מ NaCl, 70 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ MgCl2, 2.5 מ"מ CaCl2). אסוף עוברים תוך 4 שעות מההטלה.
    הערה: עוברים מתים שהוטלו לפני יותר מ-4 שעות אינם מתאימים לניתוח PCR, כנראה בגלל פירוק ה-DNA הגנומי.

4. ליזה לדוגמא

  1. הגדר את צינורות ה-PCR במחזור התרמי ל-60 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. מוסיפים 100 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לכל שפופרת ומערבבים היטב.
  2. אחסן דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד להתחלת גנוטיפ SNP על ידי PCR בזמן אמת.

5. גנוטיפ SNP

  1. הכינו תערובת באופן הבא (איור 2). בשפופרת של 1.5 מ"ל, הוסף 125 מיקרוליטר של מאסטר מיקס, 6 מיקרוליטר של בדיקת גנוטיפ SNP (40x), 280 מיקרוליטר של מים מזוקקים (DW), פריימר קדימה (450 ננומטר), פריימר הפוך (450 ננומטר), בדיקה 1 (100 ננומטר), בדיקה 2 (100 ננומטר).
    הערה: הבדיקות והפריימרים מפורטים בטבלה 1.
  2. מערבבים היטב על ידי פיפטינג מספר פעמים כדי להבטיח ריכוז אחיד. הוסף 4 מיקרוליטר מהתערובת לכל באר של צלחת PCR של 96 בארות על בסיס התמיכה עם מיקרופיפטה בעלת 12 ערוצים.
  3. הוסף 1 מיקרוליטר של ליזט המכיל כל DNA גנומי לכל באר וערבב על ידי פיפטינג מספר פעמים.
  4. הכינו בקרות חיוביות, כלומר, הומוזיגוטים של בריסטול, הומוזיגוטים של הוואי והיברידיות של בריסטול/הוואי, ושלושה בקרות ללא תבנית כבקרות שליליות (איור 3A).
  5. אטום את הצלחת עם סרט דבק אופטי. לחץ על הסרט תוך התמקדות בשולי כל באר באמצעות מוליך.
  6. צנטריפוגה את הצלחת לזמן קצר כדי לאסוף את הנוזל בתחתית ולהסיר בועות אוויר מהנוזל.
  7. טען את הצלחת על מכשיר ה-PCR בזמן אמת. לחץ על כפתור צור ניסוי חדש בתוכנה.
  8. בהגדרת המאפיינים, הגדר את סוג המכשיר למערכת QuantStudio 1, סוג בלוק לבלוק 96 בארות 0.2 מ"ל, סוג ניסוי לגנוטיפ, כימיה לריאגנטים של TaqMan ומצב הפעלה למהיר.
  9. בהגדרת השיטה, הגדר את עוצמת הקול ל-5 μL (ודא שנפח התגובה הנכון תואם את ההגדרה), ספירת מחזורים ל-40 מחזורים (ברירת מחדל). הגדר את הגדרות הטמפרטורה והזמן כדלקמן: קריאה מוקדמתtagה ב-25 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, החזקת שלב (הפעלת אנזים, התחלה חמה) ב-95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, PCR Stage ב-95 מעלות צלזיוס למשך 1 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, ו-Post-Read Stage ב-25 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
  10. בהגדרת הצלחת, התאם את מיקומי הדגימות והפקדים לכל באר במסך התוכנה.
  11. שמור את הניסוי בהתקן USB, טען אותו למכשיר ה-PCR בזמן אמת ולחץ על כפתור ההפעלה .

6. ניתוח נתונים

  1. שמור את התוצאות ב-USB והעבר אותן למחשב לניתוח נתונים.
  2. נתח נתוני דלתא Rn (dRn) בזמן אמת באמצעות הנוסחה שלהלן, כאשר Rn (מדווח מנורמל) הוא אות הקרינה מצבע המדווח, VIC ו-FAM, מנורמל על ידי חלוקה באות הקרינה של צבע הייחוס הפסיבי, ROX.
    dRn = Rn - קו בסיס
  3. סקור את עלילת האפליה האללית.
  4. אשר את הפרדת האשכולות (איור 3B). בתרשים אפליית האללים, הומוזיגוטים של בריסטול מקובצים בפינה הימנית התחתונה, הכלאות בריסטול/הוואי מקובצות בפינה הימנית העליונה, הומוזיגוטים הוואי מקובצים בפינה השמאלית העליונה, ובקרות שליליות מקובצות בפינה השמאלית התחתונה. השתמש בקודי הצבע הבאים:
    אדום: אלל בריסטול
    כחול: אלל הוואי
    ירוק: הטרוזיגוט
    שחור: שליטה שלילית
  5. ייצא את התוצאות לקובץ גיליון אלקטרוני והרכיב את נתוני הגנוטיפ מכל ארבעת עמדות ה-SNP. אם יש קריאות לא מוגדרות בארבעה מיקומים רצופים, אל תכלול את הנתונים בערך N. השתמש ב-90 דגימות לצלחת לניתוח.
    1. זהה את הקרוסאוברים באופן הבא: אם ה-SNP במיקום #1 הוא הכלאה של בריסטול/הוואי, ומיקומים #2-#4 הם כולם הומוזיגוטים של בריסטול [B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/B] או מיקום #1 הוא הומוזיגוטה של בריסטול ומיקום #2-#4 הם כולם הכלאות בריסטול/הוואי [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/H], תוצאות אלה מצביעות על הצלבה בודדת בין מיקומים #1 ו-#2 (איפשהו על הזרוע השמאלית של הכרומוזום). באופן דומה, במקרה של [B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/B] או [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/H], הצלבה בודדת מתרחשת בין #2 ל-#3 (איפשהו באזור המרכזי של הכרומוזום), ובמקרה של [B/H]-[B/H]-[B/H]-[B/B] או [B/B]-[B/B]-[B/B]-[B/H], הצלבה בודדת מתרחשת בין #3 ל-#4 (איפשהו על הזרוע הימנית של הכרומוזום).
      הערה: ישנם שישה דפוסים של קרוסאוברים כפולים. שמאל וימין: [B/B]-[B/H]-[B/H]-[B/B] ו-[B/H]-[B/B]-[B/B]-[B/H], שמאל ומרכז: [B/B]-[B/H]-[B/B]-[B/B] ו-[B/H]-[B/B]-[B/H]-[B/H], מרכז וימין: [B/B]-[B/B]-[B/H]-[B/B] ו-[B/H]-[B/H]-[B/B]-[B/H].

7. ניתוח סטטיסטי

  1. הכנס את הערכים לתוכנת SPSS Statistics (IBM). להשוואה בין התפלגות ההצלבה בזרוע שמאל, באזור המרכזי ובזרוע ימין של הכרומוזומים, הכנס 82 כרומוזומים עם הצלבה בזרוע שמאל, 20 כרומוזומים עם הצלבה באזור המרכזי ו-68 כרומוזומים עם הצלבה בזרוע ימין.
  2. בצע תיקון ANOVA ו-Bonferroni וקבע מובהקות סטטיסטית באמצעות ערך p דו-זנבי. בצע השוואות רבות ככל הנדרש, כגון זרוע שמאל לעומת מרכז או WT מול מוטאנט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זיהינו את ארבעת אתרי ה-SNP בכרומוזום II ב-C. elegans על ידי בדיקת גנוטיפ SNP כדי לכמת היווצרות הצלבה לכל אורך הכרומוזום, בזרוע שמאל, באזור המרכזי ובזרוע ימין. איתור SNPs מתבצע על פי הוראות היצרן. תערובת המאסטר מכילה Taq DNA Polymerase, Heat-labile uracil-N-glycosylase (UNG), dNTP עם dUTP וצבע ROX ייחוס פסיבי. Taq DNA פולימראז מופעל ב-95 מעלות צלזיוס, ומאפשר עיכוב של הגברה לא ספציפית בטמפרטורות נמוכות. UNG ו-dUTP מאפשרים פירוק של מוצרי PCR מוגברים בעבר, ומונעים זיהום העברה ותוצאות חיוביות כוזבות פוטנציאליות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, הצגנו שיטה למדידת תדירות ההצלבה והתפוצה במיוזה של C. elegans המבוססת על גנוטיפ SNP של צאצאים מוצלבים מהמינים ההיברידיים של בריסטול/הוואי. בעוד ששיטת snip-SNP הקונבנציונלית (RFLP) דורשת אלקטרופורזה של ג'ל לאחר PCR, וזיהוי רצועות DNA דורש מערכת תיעוד ג'ל14,18, גנוטיפ SNP על ידי בדיקת נוקלאז 5' באמצעות PCR בזמן אמת אינו דורש הליך אלקטרופורזה מייגע.

שלבים קריטיים בשיטה
פרו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

הזנים סופקו באדיבות על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC), במימון המשרד לתוכניות תשתית מחקר של ה-NIH (P40 OD010440). אנו מודים לחברי מעבדת סאיטו על הדיונים המועילים שלהם בנוגע לעבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענק KAKENHI JP23K05868 ל-TTS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
101-1000μ l קצה פיפטהQSP111-נ-קיו
תמיסת 0.5mol/I-EDTA (pH 8.0)נקלאי טסקה14347-21
תמיסת נתרן הידרוקסיד 10mol/Iנקלאי טסקה94611-45
10X מאגר ירוק DreamTaqתרמו פישר סיינטיפיק EP0713
10μ L, קצה ארוך, מוגדלתFUKAEKASEI, ווטסון110-207 מעלות צלזיוס
200μ L, קצה סטנדרטי, מדורגFUKAEKASEI, ווטסון110-705 מעלות צלזיוס
אבקת אגרנקלאי טסקה01028-14
אגרוזPH, יפןPH108
אוטוקלאב TOMY דגם ES-215 מעקר קיטור בלחץ גבוהטומי סייקוES-215
Bacto Peptone עיכול אנזימטי של חלבוןתרמו פישר סיינטיפיק 211677
חומצה בוריתנקלאי טסקה05215-05
Caenorhabditis elegans בריסטול סוג פראי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditisנ2
Caenorhabditis elegans סוג בר הוואיהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditisסי.בי.4856
סידן כלורינקלאי טסקה06729-55
ccIs4251 [(pSAK2) myo-3p::GFP::LacZ::NLS + (pSAK4) myo-3p::GFP מיטוכונדריאלי + dpy-20(+)] Iמעבדת סאיטוTTS24במקור מ-PD4251
כולסטרולנקלאי טסקה08721-62
מבחני גנוטיפ מותאמים אישית של TaqMan SNPתרמו פישר סיינטיפיק 4332077
תערובת תמיסות דאוקסינוקלאוטיד (dNTP).מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדN04470
DigPrint Doc Tablet DP-T130zביו טולסDP-T130z
די-אשלגן הידרוגנפוספטנקלאי טסקה28726-05
ניתוח מיקרוסקופניקוןSMZ-745 C-DS
חלום טאק DNA פולימראזתרמו פישר סיינטיפיק EP0713
תמיסת אתידיום ברומידנקלאי טסקה14631-94
פריימר קדימה עבור WBVar01973670IDT103988736atgtctcacccaaggttgaa
ג'לטיןנקלאי טסקה166-31
גילסון פיפטמן פיפטמן קלאסיתרמו פישר סיינטיפיק 
IGEPAL CA-630סיגמא-אולדריץ'18896
מגנזיום גופרתי הפטהידרטנקלאי טסקה21003-75
מיקרו-אמפ אופטי 96 בארות צלחת ריאקטוןתרמו פישר סיינטיפיק N8010560
סרט אדדיב אופטי מיקרו-אמפרתרמו פישר סיינטיפיק 4311971
מיני-Amp  מחזור תרמיתרמו פישר סיינטיפיק מיני-אמפר
Mini-Sub Cell GT מערכת אלקטרופורזה אופקית, מגש בגודל 7 x 10 ס"ממעבדות ביו-ראד1704466
Nichipet EXIIניצ'יריו00-NPX2-2
ניצ'יפט EXII מולטיניצ'יריו00-NPM-12VP
פיפט מאטה NEOניצ'יריו00-PMNEO
אשלגן כלורינקלאי טסקה285-38
אשלגן דיהידרוגנפוספטנקלאי טסקה28720-65
פרוטאינאז Kתרמו פישר סיינטיפיק EO0491
מערכת PCR בזמן אמת QuantStudio 1, 96 בארות, 0.2 מ"לתרמו פישר סיינטיפיק א40426
טעינה מהירה סגול 1kb פלוס סולם DNAמעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדN0550S
פריימר הפוך עבור WBVar01973670IDT103988737tggctactcctagtcactga
נתרן כלורידיםנקלאי טסקה31319-45
TaqPath ProAmp מאסטר מיקסתרמו פישר סיינטיפיק א30866
צלחת TC 35, סטנדרטיתסרשטדט83.3900
טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאןנקלאי טסקה35406-75
בסיס טריזמהסיגמא-אולדריץ'  T1503-1 ק"ג
טווין 20ריאגנט יוניאמה03706
WormStuff בחירת תולעתג'נסי סיינטיפיק59-AWP
טיפים לבחירת תולעת WormStuff (90/10% pt/ir, 30 מד)ג'נסי סיינטיפיק59-30PI36

מקורות

  1. Jones, G., Kleckner, N., Zickler, D. Meiosis through three centuries. Chromosoma. 133 (2), 93-115 (2024).
  2. Hassold, T. J., Hunt, P. A. Missed connections: Recombination and human aneuploidy. Prenat Diagn. 41 (5), 584-590 (2021).
  3. Barnes, T. M., Kohara, Y., Coulson, A., Hekimi, S. Meiotic recombination, noncoding DNA and genomic organization in caenorhabditis elegans. Genetics. 141 (1), 159-179 (1995).
  4. Lim, J. G., Stine, R. R., Yanowitz, J. L. Domain-specific regulation of recombination in Caenorhabditis elegans in response to temperature, age, and sex. Genetics. 180 (2), 715-726 (2008).
  5. Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 5 (3), e1000419(2009).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  7. Li, W., Yanowitz, J. L. Atm and atr influence meiotic crossover formation through antagonistic and overlapping functions in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 431-443 (2019).
  8. Rose, A. M., Baillie, D. L. The effect of temperature and parental age on recombination and nondisjunction in Caenorhabditis elegans. Genetics. 92 (2), 409-418 (1979).
  9. Villeneuve, A. M. A cis-acting locus that promotes crossing over between X chromosomes in Caenorhabditis elegans. Genetics. 136 (3), 887-902 (1994).
  10. Youds, J. L., et al. Rtel-1 enforces meiotic crossover interference and homeostasis. Science. 327 (5970), 1254-1258 (2010).
  11. Emmons, S. W., Yesner, L., Ruan, K. S., Katzenberg, D. Evidence for a transposon in Caenorhabditis elegans. Cell. 32 (1), 55-65 (1983).
  12. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131 (3), 609-624 (1992).
  13. Hillers, K. J., Villeneuve, A. M. Chromosome-wide control of meiotic crossing over in C. elegans. Curr Biol. 13 (18), 1641-1647 (2003).
  14. Wicks, S. R., Yeh, R. T., Gish, W. R., Waterston, R. H., Plasterk, R. H. Rapid gene mapping in Caenorhabditis elegans using a high-density polymorphism map. Nat Genet. 28 (2), 160-164 (2001).
  15. Campos, T. L., Korhonen, P. K., Sternberg, P. W., Gasser, R. B., Young, N. D. Predicting gene essentiality in Caenorhabditis elegans by feature engineering and machine-learning. Comput Struct Biotechnol J. 18, 1093-1102 (2020).
  16. Fay, D., Bender, A. Snps: Introduction and two-point mapping. WormBook. , (2008).
  17. Hwang, H. Y., Wang, J. Fast genetic mapping using insertion-deletion polymorphisms in Caenorhabditis elegans. Sci Rep. 11 (1), 11017(2021).
  18. Davis, M. W., et al. Rapid single nucleotide polymorphism mapping in C. elegans. BMC Genomics. 6, 118(2005).
  19. Livak, K. J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay. Genet Anal. 14 (5-6), 143-149 (1999).
  20. Li, Q., et al. The tumor suppressor BRCA1-BARD1 complex localizes to the synaptonemal complex and regulates recombination under meiotic dysfunction in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 14 (11), e1007701(2018).
  21. Saito, T. T., Lui, D. Y., Kim, H. M., Meyer, K., Colaiacovo, M. P. Interplay between structure-specific endonucleases for crossover control during Caenorhabditis elegans meiosis. PLoS Genet. 9 (7), e1003586(2013).
  22. Saito, T. T., Youds, J. L., Boulton, S. J., Colaiacovo, M. P. Caenorhabditis elegans him-18/slx-4 interacts with slx-1 and xpf-1 and maintains genomic integrity in the germline by processing recombination intermediates. PLoS Genet. 5 (11), e1000735(2009).
  23. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  24. Kutyavin, I. V., et al. 3'-minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at pcr extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28 (2), 655-661 (2000).
  25. Hammarlund, M., Davis, M. W., Nguyen, H., Dayton, D., Jorgensen, E. M. Heterozygous insertions alter crossover distribution but allow crossover interference in Caenorhabditis elegans. Genetics. 171 (3), 1047-1056 (2005).
  26. Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
  27. Meneely, P. M., Farago, A. F., Kauffman, T. M. Crossover distribution and high interference for both the X chromosome and an autosome during oogenesis and spermatogenesis in Caenorhabditis elegans. Genetics. 162 (3), 1169-1177 (2002).
  28. Nabeshima, K., Villeneuve, A. M., Hillers, K. J. Chromosome-wide regulation of meiotic crossover formation in Caenorhabditis elegans requires properly assembled chromosome axes. Genetics. 168 (3), 1275-1292 (2004).
  29. Phillips, C. M., Dernburg, A. F. A family of zinc-finger proteins is required for chromosome-specific pairing and synapsis during meiosis in C. elegans. Dev Cell. 11 (6), 817-829 (2006).
  30. Mancera, E., Bourgon, R., Brozzi, A., Huber, W., Steinmetz, L. M. High-resolution mapping of meiotic crossovers and non-crossovers in yeast. Nature. 454 (7203), 479-485 (2008).
  31. Qi, J., et al. Characterization of meiotic crossovers and gene conversion by whole-genome sequencing in Saccharomyces cerevisiae. BMC Genomics. 10, 475(2009).
  32. Miller, D. E., et al. A whole-chromosome analysis of meiotic recombination in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2 (2), 249-260 (2012).
  33. Carlton, P. M., Farruggio, A. P., Dernburg, A. F. A link between meiotic prophase progression and crossover control. PLoS Genet. 2 (2), e12(2006).
  34. Tsai, C. J., et al. Meiotic crossover number and distribution are regulated by a dosage compensation protein that resembles a condensin subunit. Genes Dev. 22 (2), 194-211 (2008).
  35. Bhalla, N., Wynne, D. J., Jantsch, V., Dernburg, A. F. Zhp-3 acts at crossovers to couple meiotic recombination with synaptonemal complex disassembly and bivalent formation in C. elegans. PLoS Genet. 4 (10), e1000235(2008).
  36. Yokoo, R., et al. Cosa-1 reveals robust homeostasis and separable licensing and reinforcement steps governing meiotic crossovers. Cell. 149 (1), 75-87 (2012).
  37. Almanzar, D. E., et al. Meiotic DNA exchanges in C. elegans are promoted by proximity to the synaptonemal complex. Life Sci Alliance. 6 (4), e202301906(2023).
  38. De Los Santos, T., et al. The mus81/mms4 endonuclease acts independently of double-holliday junction resolution to promote a distinct subset of crossovers during meiosis in budding yeast. Genetics. 164 (1), 81-94 (2003).
  39. Saito, T. T., Colaiacovo, M. P. Regulation of crossover frequency and distribution during meiotic recombination. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 82, 223-234 (2017).
  40. Zalevsky, J., Macqueen, A. J., Duffy, J. B., Kemphues, K. J., Villeneuve, A. M. Crossing over during Caenorhabditis elegans meiosis requires a conserved mutS-based pathway that is partially dispensable in budding yeast. Genetics. 153 (3), 1271-1283 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תדירות שחלוףרקומבינציה מייוטיתמיפוי כרומוזומיםכימיית TaqManניתוח אוגנזהמוטנטים גנטייםהתפלגות שחלוף
תדירות והתפלגות של הצלבות במיוזה Caenorhabditis elegans על ידי גנוטיפ SNP באמצעות PCR בזמן אמת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.