מאמר שיטה

שינוי אנזימטי והערכת ציטומטריית זרימה של חלבונים המוצגים על פני השטח של שמרים

DOI:

10.3791/68208

⸱

30 במאי 2025

 ,  , 
1Department of Chemical, Biological, and Materials Engineering, University of South Florida

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במצעים המוצגים על פני השטח של שמרים לבדיקות שינוי אנזימטיות. הפלטפורמה הודגמה באמצעות ניתוח פעילות הדפוספורילציה של טירוזין פוספטאז SHP-2 כנגד אחד המצעים שלו כבדיקת שינוי אנזימטי מייצגת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תצוגת משטח שמרים היא אסטרטגיית קישור גנוטיפ-פנוטיפ המאפשרת סינון תפוקה גבוהה של תפקוד החלבון. באופן מסורתי, תצוגת פני השטח של שמרים יושמה על האבולוציה של חלבוני קישור חדשים, כאשר ציטומטריית זרימה משמשת להערכה ומיון לפי רמות חוזק קשירה. לאחרונה, יש עניין גובר ביישום תצוגת פני שמרים לסינון שינויים אנזימטיים של גרסאות סובסטרט, עם שינויים תוספים (למשל, זרחון) או חיסור (למשל, פרוטאוליזה) המספקים פנוטיפ הניתן לקריאה על ידי ציטומטריית זרימה. שינויים כאלה מיושמים באופן קבוע באמצעות לוקליזציה תוך-תאית, אך היכולת להשיג שינוי אנזימטי חוץ-תאי של מצעים מוצגים יכולה לפתוח תגובות רבות נוספות לחקירה. כאן, אנו מתארים טכניקות לתכנון ויישום מבחני סינון לשינוי אנזימטי חוץ-תאי למצעים מועמדים המוצגים על פני השמרים והערכה לאחר מכן באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה. אנו מספקים פרוטוקולים אלה בהקשר של מצעים מוצגים של שמרים זרחניים המכילים שאריות טירוזין זרחניות ומגיבים כיצד ניתן להתאים את המסגרת המיושמת הזו לפיתוח מבחני סינון עבור זוגות אנזימים-סובסטרט אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת האינטראקציות בין אנזימים למטרותיהם הפכה לתחום מחקר מעניין יותר ויותר בשל נחיצותה באפיון הביולוגי של המסלולים השולטים בהומאוסטזיס תאי ובהתפתחות מחלות 1,2. אנזימים אחראים לקטליזה של רבות מהתגובות השומרות על החיים הביולוגיים, ושולטים במסלולים נחוצים כגון חילוף חומרים תאי 3,4, איתות 5, ואפילו תהליכים בסיסיים כמו תיקון גנום 6,7. בשל תפקידם בתהליכים אלה, האינטראקציות ביניהם ממלאות תפקיד גם בהתפתחות מחלות רבות, שכן סטיות בפעילותן עלולות לגרום לחוסר ויסות חמור בפעילות התאים, ולגרום לאפופטוזיס או לשגשוג של תאים סרטניים מזיקים2. לחקר הפעילות האנזימטית היו יישומים חשובים בפיתוח טיפולים חדשים 8,9, הדורשים בדיקות המותאמות לכל אינטראקציה ספציפית של אנזים-סובסטרט10. מבחנים אנזימטיים מרובים נקבעו כפרוטוקולים סטנדרטיים להערכה ואפיון של אינטראקציות אלה. בדיקות שפותחו לניתוח אינטראקציות אנזימטיות מסווגות למבחני זיהוי המנטרים את הקישור להפעלה/עיכוב11 או מבחנים המנטרים את שינוי הסובסטרט על ידי אנזימים12.

תפקיד עיקרי אחד של אנזימים הוא ויסות התנהגות התאים. העברת אותות, התגובה התוך-תאית של תא לטריגר חוץ-תאי13, אחראית להישרדות התא ולתפקודו. התפשטות תאים, התמיינות ותהליכים תפקודיים רבים אחרים כוללים כולם מסלולי איתות עם אינטראקציות אנזימטיות השולטות בהם14,15. אנזימים מזרזים שינויים לאחר התרגום, אשר לעתים קרובות מווסתים את רשתות האיתות המסיביות האחראיות להעברה נכונה של מסרים חוץ-תאיים16. זרחון חלבון הוא השינוי הנפוץ ביותר לאחר התרגום, בכל מקום באיתות תאים ובמספר מסלולים תאיים אחרים. כתוצאה מכך, חלבון קינאזות התגלו כחלק משמעותי מהמטרות הטיפוליות הפוטנציאליות בשל תפקידם הרגולטורי הקריטי17. פוספטאזים הם המולקולות המווסתות הטבעיות עבור קומפלקסי איתות תאים מבוססי פוספט18,19, בעלי יכולת להסיר שאריות פוספט מחלבוני המטרה שלהם20. בעשור האחרון, פוספטזים הפכו למטרה טיפולית עיקרית לטיפול בסרטן21 ומחלות דלקתיות22 בהתבסס על מעורבותם בוויסות מסלולי איתות במורד הזרם בסוגי תאים מרובים. יחד, חלבון קינאז ופוספטאזות מספקים מגוון רחב של אינטראקציות, שניתן לחקור באמצעות פיתוח פרוטוקולי בדיקה אנזימטיים ספציפיים.

תצוגת משטח שמרים שימשה ככלי לאפיון והערכה של פעילות אנזימטית23,24. הוא מספק פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה לסינון תהליכי שינוי לאחר תרגום בשילוב עם אסטרטגיות קיבוע רשתית אנדופלזמית25,26. זה מאפשר לזוגות קינאז-סובסטרט להיות ממוקמים ולשמור ברטיקולום האנדופלזמי באמצעות קשירה לקולטני KDEL27, כאשר זרחון של המצע יכול להתרחש בקצב מוגבר עקב הקרבה בין קינאזות למטרותיהם. קשירת קולטן KDEL מתווכת על ידי רצף שימור רשתית אנדופלזמית FEHDEL C-terminal שהוכח כבעל יכולת שימור חזקה יותר מרצפי HDEL אחרים25,28. לאחר מכן, המצע הזרחני מעוגן למשטח השמרים לצורך הערכתו לאחר מכן באמצעות ציטומטריית זרימה29. נכון לעכשיו, לא נקבעו פרוטוקולים הניתנים להכללה לשינוי אנזימטי של מצעים המוצגים על פני השמרים. אנו מרחיבים את היכולות של תצוגת פני השטח של שמרים על ידי ניצול גרסאות המצע הזרחני המתבטאות מחוץ לתאים ושינוים באמצעות דה-פוספורילציה על ידי הפוספטאז הידוע שלהם. ניתוח ציטומטריית זרימה מספק פלטפורמה להערכה פנוטיפית של המצעים הנ"ל באמצעות מדידת שינויים בחציון הזרחן כתוצאה מהדגירה עם הפוספטאז הידוע. זה מספק שיטה ניתנת להתאמה לשינוי לאחר תרגום של חלבונים המוצגים על פני השטח תוך מתן שיטה לניתוח שינוי אנזימטי של אינטראקציות בעת שימוש בפלטפורמת תצוגת משטח השמרים.

אנו מציגים טכניקות לפיתוח ויישום של מבחן שינוי אנזימטי המתאר הכנסת אינטראקציה של קינאז-סובסטרט לפלטפורמת תצוגת פני השטח של השמרים, הדגירה המשותפת של המצע הזרחני המתבטא עם פוספטאז רקומביננטי, והניתוח שלאחר מכן של פעילות הדפוספורילציה באמצעות ציטומטריית זרימה. בדוח זה, זה מושג על ידי לוקליזציה משותפת של התחום הציטופלזמי של CD28 עם לימפוציטים קינאז (LCK) ברטיקולום האנדופלזמי של השמרים, ואחריו הצגת ה-CD28 הזרחני על פני השמרים ודפוספורילציה לאחר מכן על ידי הומולוגיה של Src אזור 2 המכיל פוספטאז-2 (SHP-2). נוגדן פאן אנטי-פוספוטירוזין (במחקר זה, 4G10), המזהה שאריות טירוזין זרחני במגוון רחב של רצפי פפטידים, משמש לכימות רמת הזרחן כפונקציה של טיפול בפוספטאז. התהליך המפורט מספק גישה הניתנת להכללה לחקירת אינטראקציות אנזים-סובסטרט; דרך פרוספקטיבית לחקור אנזימים ומצעים בצורה מטוהרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. גידול תאים של שמרים המכילים פלסמיד ואינדוקציה של ביטוי חלבון

  1. בהתאם למתכון המתואר בטבלה 1, הכינו את המדיה הנדרשת לגידול שמרים שאינם מכילים פלסמיד (YPD), גידול תאי שמרים המכילים פלסמיד (SD-CAA) ואינדוקציה של ביטוי חלבון (SRG-CAA) כמו גם צלחות SD-CAA.
  2. הפוך DNA פלסמיד של תצוגת שמרים המכילים את זוג מצע הקינאז לתאי שמרים EBY-100 בשיטה מבוססת קטיון ליתיום30,31, המאומצת בדרך כלל לשימוש בערכות טרנספורמציה של שמרים ממגוון יצרנים.
    הערה: ניתן להשתמש באלקטרופורציה32 או בטכניקות טרנספורמציה מועדפות אחרות של פלסמיד שמרים בהתאם למבנה הפלסמיד שעובר טרנספורמציה.
  3. הכן צינור תרבית של 14 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיה YPD. יש לחסן תאי EBY-100 ולגדול באינקובטור רועד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, 300 סל"ד עד שהתרבית מגיעה לצפיפות אופטית (OD600nm) של 0.8-1.0 (8 x 106- 1 x 107 תאים/מ"ל).
    הערה: OD600nm נמדד על ידי הכנת קובטות דגימה של 3 מ"ל המכילות דילול של 1:10 של תרביות שמרים במדיה שלהן ו-3 מ"ל קובטות ריקות המכילות את המדיה המשמשת לדילול דגימה. תוכנית OD600nm בספקטרופוטומטר משמשת למדידה תחילה של הקובטה הריקה, ולאחר מכן כל קובטה דגימה על ידי הגדרת הדילול המתאים שהוכן עבור כל דגימה. 1 OD600 ננומטר מתאים ל-1 × 107 שמרים/מ"ל.
  4. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה של התרבית ב-1,000 x גרם למשך 3 דקות, ושטפו עם תמיסתהכביסה הראשונה המסופקת בערכת טרנספורמציה של שמרים, או TE (10 מ"מ Tris-HCl ו-1.0 מ"מ EDTA)31.
  5. גלולה את התאים שוב ב-1,000 x גרם למשך 3 דקות והשעו מחדש ב-1 מ"ל של מאגר הטרנספורמציה המסופק בערכת טרנספורמציה של שמרים, או מים סטריליים. יש לחלק את התאים ל-50 מיקרוליטר וניתן לאחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
  6. לצורך טרנספורמציה של פלסמיד, מכינים מנה אחת לכל פלסמיד ומופשרים על קרח, ולאחר מכן, 0.5-1.5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד המכיל את מבנה תצוגת השמרים מתווסף ישירות לתאים. מתווסף 0.5 מ"ל מתמיסת הטרנספורמציה המסופקת בערכת טרנספורמציה של שמרים, או 0.5 מ"ל של 50% פוליאתילן גליקול סטרילי ותמיסת LiOAc0.1 M 31. שלב היטב את תערובת התאים, ה-DNA של הפלסמיד ותמיסת הטרנספורמציה על ידי פיפטינג.
  7. דגירה של תערובת טרנספורמציה באופן סטטי למשך 30-60 דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, תערובת מערבולת במרווחים של 15 דקות. קציר תאים על ידי צנטריפוגה בחום של 1,000 × גרם למשך 3 דקות.
  8. הכן צינור תרבית של 14 מ"ל עם 4.5 מ"ל של מדיה SD-CAA. השעו מחדש את התאים המכילים את הפלסמיד הרצוי ב-500 מיקרוליטר של SD-CAA וחסן את 4.5 מ"ל המוכן.
  9. היזהר לא לנקב את האגר, פזר 50 מיקרוליטר מתוך 5 מ"ל של תרבית מחוסנת על צלחת SD-CAA ודגר סטטית ב-30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות כדי לקבוע את יעילות הטרנספורמציה.
  10. דגרו את 5 מ"ל תרבית התאים SD-CAA בחממה רועדת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, 300 סל"ד למשך 18 שעות לפחות. עקוב אחר הצפיפות האופטית (OD600nm) לאחר 16 שעות ו-20 שעות. לאחר שהדגימה גדלה לצפיפות אופטית מספקת שאינה עולה על 6, צנטריפוגה את התרבית למשך 3 דקות ב-2,500 × גרם. השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור השמרים.
  11. השעו מחדש את כדור השמרים ב-SRG-CAA ל-OD סופישל 600 ננומטר פחות מ-1 (<1 × 107 שמרים/מ"ל).
  12. דגרו את תרבות השמרים בחממה רועדת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, 300 סל"ד למשך 8 שעות לפחות אך לא יותר מ-24 שעות.
    הערה: אינדוקציה של ביטוי חלבון בתאי שמרים יכולה להיות מגוונת בכל מקום בין 20-37 מעלות צלזיוס. 30 מעלות צלזיוס מתאים לסינתזה של זוגות קינאז/סובסטרט29,33 אך ניתן לכוונן אותו במידת הצורך עבור החלבונים הספציפיים הנחקרים.
  13. מדוד OD600nm כדי לקבוע את צפיפות התא.
    הערה: ניתן להפסיק את הפרוטוקול בשלב זה על ידי אחסון תרביות השמרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

2. ביוטינילציה של נוגדן 4G10 נגד פוספוטיזין

  1. השעו בקבוקון של 2 מ"ג של PEG4-NHS-ביוטין לריכוז סופי של 5 מ"מ על ידי הוספת 680 מיקרוליטר של PBS סטרילי.
    הערה: השעיה מחדש של PEG4-NHS-ביוטין צריכה להיעשות טרי מיד לפני ביצוע תגובת הביוטינילציה. NHS עובר הידרוליזה בתמיסה מימית. השימוש ב-PBS ובבקבוקונים סטריליים חשוב להכנת ריאגנטים לאחסון לטווח ארוך ולשימוש במבחנים מבוססי תאים כדי להפחית את ההשפעות הפוטנציאליות של מזהמים על כדאיות הריאגנטים או הבדיקות הרגישות המבוצעות.
  2. בהתבסס על ריכוז הנוגדנים 4G10, הוסף 100 מיקרוגרם נוגדן לבקבוקון סטרילי של 1.7 מ"ל.
  3. הוסף 1 מיקרוליטר של 5 מ"מ PEG4-NHS-ביוטין משלב 2.1 לבקבוקון המכיל 100 מיקרוגרם של נוגדן 4G10 כדי להשיג יחס מולארי של ביוטין לנוגדנים של 7.5:1. פיפטו את התערובת בעדינות כדי להומוגני את התגובה.
  4. דגרו את התגובה בטמפרטורת החדר עם סיבוב קבוע למשך שעתיים לפחות.
  5. עקוב אחר פרוטוקול היצרן עבור עמודות התפלה ספין של 0.5 מ"ל כדי להחליף את המאגר מה-4G10 הביוטיניל (B-4G10) ל-PBS.
    הערה: עמודות התפלה עם חיתוך משקל מולקולרי (MWCO) של 7 kDa משמשות בדרך כלל לביוטינילציה של נוגדנים כדי לאפשר הסרת ביוטין ומולקולות קטנות אחרות שלא הגיבו תוך שמירה על הנוגדן הגדול יותר.
  6. יש לדלל את הנוגדן B-4G10 לריכוז סופי של 1 מיקרומטר ב-PBSA (PBS עם 1 גרם/ליטר אלבומין בסרום בקר). יש לצרף את הנוגדן B-4G10 לנפחים קטנים יותר כדי למנוע מחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים.
    הערה: ניתן לאחסן נוגדנים ביוטיניים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש יומיומי עד 3 חודשים מבלי לאבד יעילות משמעותית. אחסן את שאר המינונים שאינם בשימוש בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שנתיים לכל היותר.

3. דה-פוספורילציה של מצעים המתבטאים על פני תא השמרים

  1. הכן את פתרון מאגר העבודה פי 2 כפי שתואר קודם לכן בספרות34.
    הערה: מומלץ פי 2 כדי להקל על מדידת המרכיבים הדרושים.
  2. הכן את מאגר העבודה עבור הדגימות בבקבוקון של 1.7 מ"ל על ידי דילול תמיסת החיץ 2x שהוכנה בשלב 3.1 1:2 במים נטולי יונים.
    הערה: נפח התגובה הכולל עבור כל דגימה יהיה 20 מיקרוליטר, וכל דגימה תדרוש בין 10 מיקרוליטר ל-18 מיקרוליטר של מאגר עבודה. הכן מספיק מאגר עבודה עבור כל הדגימות או הבקרות.
  3. בעקבות הכנת הדגימה המומלצת המתוארת בטבלה 2, סמן בקבוקונים של 1.7 מ"ל עם שם הבקרה או המדגם המתאים.
  4. בהתבסס על OD600nm שנמדד בשלב 1.9, חשב את נפח התרבית הדרוש לשחזור שני מיליון (2 × 106) תאי שמרים מתרבית השמרים המתאימה עבור כל דגימה.
  5. הוסף את נפח תרבית השמרים שחושב בשלב הקודם לבקבוקון של 1.7 מ"ל עבור כל דגימה.
  6. צנטריפוגה את הבקבוקון למשך דקה אחת במשקל 4,500 × גרם. הסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות מיקרופיפטה והשליך כפסולת מסוכנת ביולוגית.
  7. השעו מחדש את התאים הגלולים ב-1 מ"ל של PBSA וחזרו על שלב 3.6.
    הערה: חשוב להסיר כמה שיותר סופרנטנט מבלי להפריע לתאים הגלולים.
  8. בהתבסס על ריכוז המלאי שלו, חשב את נפח ה-SHP-2 האנושי הרקומביננטי הנדרש לריכוז סופי של 1,000 ננומטר בנפח תגובה כולל של 20 מיקרוליטר.
    הערה: יש לצטט SHP-2 רקומביננטי בכמויות קטנות כך שכל חלבון המשמש בכל בדיקה לא עבר יותר משני מחזורי הקפאה-הפשרה. יש להשליך כל שאריות SHP-2 מאליקוט לאחר שכל הדגימות הוכנו לבדיקה.
    ריכוזי המלאי של אנזימים רקומביננטיים יכולים להשתנות בהתאם למספר האצווה. SHP-2 רקומביננטי מנוסח בדרך כלל בריכוז מלאי של 0.2-0.4 מ"ג/מ"ל. עבור ריכוז מלאי של 0.324 מ"ג/מ"ל SHP-2, זה מתאים לריכוז מלאי של 4.696 מיקרומטר (ל-SHP-2 יש משקל מולקולרי של 69 kDa). 4.26 מיקרוליטר ממלאי SHP-2 בתגובה של 20 מיקרוליטר מביא לריכוז תגובה סופי של 1,000 ננומטר SHP-2.
  9. הוסף 7.7 מ"ג DTT ל-10 מ"ל מים נטולי יונים שהוכנו בחרוט של 15 מ"ל ליצירת תמיסת DTT של 5 מ"ל. אם מגבלות הציוד מקשות על שקילת מיליגרם, הוסף 0.77 גרם DTT ל-10 מ"ל מים נטולי יונים, ולאחר מכן בצע דילול של פי 100 כדי ליצור את פתרון ה-DTT של 5 מ"מ המשמש לבדיקה.
    הערה: ניתן להכין את תמיסת ה-DTT בתמיסות מלאי בריכוז גבוה יותר לדילול ל-5 מ"מ אם לא ניתן למדוד כמויות בקנה מידה של מיליגרם באמצעות הציוד הזמין. יש להכין תמיסת DTT טרייה לפני השעיית התאים במאגר עבודה בשל נטייתו להידרוליזה, מה שהופך אותו לבלתי יציב לאורך תקופות ארוכות כאשר הוא מדולל במים.
  10. השעו מחדש את התאים הגלולים במאגר העבודה שהוכן בשלב 3.2 כך שנפח התגובה הסופי בכל דגימה או בקרה יהיה 20 מיקרוליטר.
    הערה: יש לחשב את כמות מאגר העבודה שנוספה על סמך כמות ה-DTT (2 μL) ו-SHP-2 (המחושבת בשלב 3.8) שתהיה בכל דגימה.
  11. הוסף 2 μL של תמיסת DTT של 5 mM שהוכנה בשלב 3.9 לכל דגימה או בקרה לריכוז תגובה סופי של 0.5 mM DTT.
  12. הוסף את נפח SHP-2 המחושב בשלב 3.8 לכל דגימה לנפח סופי של 20 מיקרוליטר וערבב בעדינות באמצעות מיקרופיפטה.
  13. עטפו את מכסי בקבוקון הדגימה בפרפילם כדי למנוע דליפה או זיהום צולב.
  14. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים על רוטור במהירות קבועה.
  15. הסר דגימות מהרוטור ועצור את התגובה על ידי הוספת 1 מ"ל PBSA לכל דגימה.
  16. חזור על שלב 3.6.

4. תיוג תאים וניתוח ציטומטריית זרימה של מצעים דה-זרחניים

  1. השעו מחדש דגימות משלב 3.16 בתערובת של 20 מיקרוליטר של הריאגנטים הראשוניים המתאימים להם כמתואר בטבלה 2. דגירה של דגימות למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: כל ריכוזי הריאגנטים המשמשים חושבו כמוגזמים ביחס למספר החלבונים המתבטאים על פני תאי השמרים. החישוב מניח ביטוי של 10,000 חלבונים לתא מכל 2 x 106 שמרים בדגימה35, כאשר באופן שגרתי רק ~50% מהם עושים זאת. טבלה 3 מציגה את יחס ריאגנט התיוג העודף עבור כל אחד מהריאגנטים המבוטאים בטבלה 2, מחושב באופן הבא:
    figure-protocol-1
  2. דגימות צנטריפוגות ב-4,500 × גרם למשך דקה אחת והשליכו את הסופרנטנט כפסולת ביולוגית מסוכנת.
  3. שטפו תאים פעם אחת על ידי השעיה של 1 מ"ל של PBSA. חזור על שלב 4.2.
  4. השעו מחדש דגימות בתערובת של 20 מיקרוליטר של הריאגנטים המשניים המתאימים להם כמתואר בטבלה 2. דגירה של דגימות למשך 15 דקות בהיעדר אור.
  5. חזור על שלב 4.2.
  6. חזור על שלב 4.3.
  7. השעו מחדש את הדגימות השטופות ב-300-500 מיקרוליטר של PBSA והעבירו לצינורות פוליסטירן של 5 מ"ל כדי לנתח מיד באמצעות ציטומטר זרימה מתאים.
    הערה: אם יש צורך להעביר דגימות, שמור על קרח רטוב. זה לא מומלץ, אך ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לכל היותר ככדורים רטובים.
  8. לאחר ביצוע ההפעלה וההכנה הדרושים של הציטומטר לניסוי חדש, לחץ על כפתור ניסוי חדש בתפריט קובץ , תן שם לניסוי ולחץ על שמור כדי להבטיח שהנתונים שנרכשו יישמרו בנתיב הקובץ הרצוי.
  9. בחר בסמל תרשים הנקודות בסרגל הכלים העליון כדי ליצור שתי עלילות נקודות או יותר עבור כל דגימה שתרוץ. עבור אחד מעלילות הנקודות, בחר את שם ציר ה-X כדי להציג את ערוץ FSC-A ואת שם ציר ה-Y כדי להציג את ערוץ SSC-A. תרשים זה מציג את אזור פיזור הצד - שטח לעומת פיזור קדימה - ומשמש לשער תאי שמרים לניתוח נוסף.
  10. בתרשים נקודות אחר, בחר את שם ציר ה-X כדי להציג את הערוץ שבו המגיב המשני המכוון לנוגדני תג האנטי-אפיטופ העיקריים זוהר. בחר את שם ציר ה-Y כדי להציג את הערוץ שבו המגיב המשני של סטרפטווידין זוהר. תרשים זה יציג רק את האירועים המגודרים מהצד לעומת עלילת הפיזור קדימה כתאי שמרים ומשמשת להצגת זרחון טירוזין על ציר ה-Y וביטוי פני השטח של המצע על ציר ה-X.
    הערה: המגיב המשני המכוון לנוגדנים העיקריים של תג האנטי-אפיטופ פלואורסצס בערוץ FITC (AF-488) והמגיב המשני סטרפטווידין פלואורסצס בערוץ AF-647 בדוגמה זו. הערוצים המשמשים עשויים להשתנות בהתאם לריאגנטים הראשוניים והמשניים המשמשים במהלך התיוג.
  11. הנח כל צינור דגימה במחזיק הצינור של הציטומטר ובחר הפעל עבור הציטומטר כדי להתחיל לטעון את הדגימה ולרכוש נתונים. התאם אירועים להצגה, אירועים להקלטה, זמן להקלטה וקצב זרימה לדוגמה לפי הצורך.
  12. הגדר שער המקיף את תאי השמרים הבריאים בתרשים SSC-A לעומת FSC-A שנוצר בשלב 4.9. איור 1 ממחיש ייצוג תיאורי של אסטרטגיית השער שיש ליישם.
    הערה: בתרשים SSC-A לעומת FSC-A, 100,000 אירועים להצגה ו-50,000 אירועים לתיעוד בתוך שער השמרים המוגדר הוא הנחיה טובה להמחשה ואיסוף נתונים מספיקים להמשך ניתוח. ניתן ליישם אסטרטגיות שער מחמירות יותר לבחירה עבור שמרים בודדים על סמך עלילה של גובה פיזור קדימה לעומת אזור פיזור קדימה כפי שדווח לאחרונה36. אסטרטגיית השער המוצגת באיור 1 תואמת לגישה פחות מחמירה, כולל סינגלט וכמה שמרים כפולים דרך שער פיזור.
  13. רשום פלואורסצנטיות של כל דגימות הבקרה באמצעות מנתח ציטומטריית זרימה. דגימות בקרה נאספות תחילה באופן שגרתי כדי לסייע בהגדרת אסטרטגיית שער, כמתואר להלן בשלב 4.14.
  14. הגדר אסטרטגיית שער עבור החלקה שלך שנוצרה בשלב 4.10 לפני ניתוח דגימות מטופלות. איור 1 ממחיש ייצוג תיאורי של אסטרטגיית השער שיש ליישם.
  15. רשום פלואורסצנטיות של דגימות דה-זרחניות באמצעות ציטומטר הזרימה ואסטרטגיית השער המוגדרת בשלבים 4.12 ו-4.14.
  16. לנתח נתוני זרימה ציטומטרית שנרכשו באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה.
  17. הערך את הדפוספורילציה על ידי מדידה והשוואה של חציון ציר ה-Y של תאים המבטאים חלבון על פני השטח שלהם והזרחון הבסיסי המסופק על ידי תאים שאינם מציגים בין דגימות לבקרות. חשב את הפרש הזרחן החציוני באחוזים באופן הבא:
    figure-protocol-2

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח ציטומטריית זרימה משכפול בודד של מערכת המודל שלנו מודגר במשך שעתיים ללא (איור 1A) ועם (איור 1B) SHP-2 1,000 ננומטר חושף הפרש זרחון חציוני של 63.6%, המוגדר כיחס בין חציון ציר Y (זרחון) מכל האירועים המוצגים על פני השטח פחות אות הזרחן הבסיסי המוגדר כחציון ציר ה-Y של האירועים הלא מוצגים בין הדגימה המטופלת לבקרה הלא מטופלת כמתואר במשוואה מוגדר בפרוטוקול שלב 4.12. לפני ניתוח החציונים, הדגימות היו מגודרות על סמך גודלן (פיזור קדימה) ומורכבותן (פיזור צדדי) כדי להקיף...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוצג מאפשר ניתוח של אינטראקציות אנזימטיות באמצעות תצוגה חוץ-תאית של חלבונים על פני השמרים. שילוב קיבוע רשתית אנדופלזמית בפלסמיד תצוגת פני השטח המשמש מציג את היכולת לנתח אינטראקציות ספציפיות בין אנזימים ומצעים ששונו לאחר תרגום מחוץ לתא עקב האינטראקציות התוך תאיות שניתן לתכנן להתרחש27,29. מבחני האינטראקציה האנזימטית שהוקמו בעבר באמצעות תצוגת פני השטח של שמרים כוללים ביטוי של החלבונים המעניינים תוך תאיים, כאשר תצוגת פני ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים הקשורים לעבודה זו לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרס NSF CAREER ל-L.A.S. (CBET - 2339172) וקרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת דרום פלורידה.

באיור 2A, סמל מיקרו-צינור-פתוח-שקוף של Servier https://smart.servier.com/ מורשה תחת CC-BY 3.0 Unported https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/. השינויים כוללים תוספת של בופר ותא שמרים (משמאל) והוספת נוגדן (מרכז-ימין).

המבחנה, החממה וציטומטר הזרימה באיור 2A סופקו דרך www.bioicons.com בגישה פתוחה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקבוקי מדיה 1 ליטר קורנינג06-414-1D
1.7/2.0 מ"ל מיקרו-צינורותAxygenMCT-175-C
10 ומיקרו; L טיפים ל-SureOne Pipetפישר סיינטיפיק02-707-438
1000 ומיקרו; L SureOne Pipet Tipsפישר סיינטיפיק02-707-408
12 מ"ל פוליסטירן צינורות תחתונים עגוליםגריינר07-000-212
3 מ"ל קובטות פלאטיותBRAND759076D
300 ומיקרו; L SureOne Pipet Tipsפישר סיינטיפיק02-707-411
5 מ"ל פיפטות סרולוגיותפישר סיינטיפיק13-678-11D
חומצה קזאין (חומצות קסאמינו)פישר סיינטיפיקBP-1424-500
איזון אנליטי מטלר טולדו30243397
צלחת פטרי בקטריולוגית קורנינגפלקון 351008
ארונות בטיחות ביולוגיתLabconcoLogic Class II, סוג A2  302310102
ביוספקטרומטרEppendorfKinetic 6136000010
בקר סרום אלבומיןפישר ביו-ריאגנטיםBP1600-100
חומצת לימוןפישר סיינטיפיקA940-500
CytoFLEX זרימה ציטומטריה מנתח בקאם קולטרציטופלקס C09745תוכנת CytExpert
דקסטרוזפישר סיינטיפיקD16-1
דיתיותרייטולפישר ביוריאגנטיםBP172-5
חמור נגד עזים FITCInvitrogenA16000
EDTAאלפא AesarH56165.30
Ez-Link PEG4-NHS-ביוטיןתרמו מדעיA39259
ערכת טרנספורמציה II של שמרים קפואים Zymo ResearchT2001
GalactoseFisher ScientificBP656-500
מקרר לשימוש כלליMarvel ScientificMS24RAS4RW
נוגדן נגד תג עזים BethylA190-104A
צנטריפוגה Mictrotube Eppendorf5425 R 5406000313
מיני חממה מקוררת בטמפרטורה נמוכהפישר סיינטיפיק15-015-2632
נוגדן נגד פוספוטיזין עכבר 4G10BioXcellBE0194
Parafilm MBemisM PM999
פוספט חוצץ מלח ביו-ריאגנטים של פישרBP399-500
בקר פיפטה Eppendorfeasypet 3 4430000018
RaffinoseThermo ScientificJ21060-36
רקומביננטי אנושי פעיל חלבון SHP-2R& D Systems1894-SH
צנטריפוגה מקוררת Eppendorf5910 R
Saccharomyces cerevisiae שמרים משטח תצוגה זן EBY 100ATCCMYA-4941
חממת שייקרEppendorfM1335-0002 ניו ברונסוויק Innova 42 
סט פיפטות חד ערוץ Eppendorf05-403-151
נתרן כלוריפישר מדעיS671-500
נתרן ציטראט דיהידראטפישר סיינטיפיקS279-500
נתרן פוספט דו-בסיסי HeptahydrateFisher ScientificS373-500
נתרן פוספט מונו-בסיסי מונוהידראטפישר סיינטיפיקS468-500
Streptavidin Alexa Fluor 647InvitrogenS32357
איזון טעינה עליונהמטלר טולדו
טריס הידרוכלורידEMD Millipore648317-100GM
מסובב אקדח צינורפישר סיינטיפיק11-676-341
נייר שקילה פישר סיינטיפיק09-898-12B
בסיס חנקן שמריםBD Difco291940
עמודי התפלה של Zeba Spin תרמו סיינטיפיק89883

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lea, M. A., Weber, G. Role of enzymes in homeostasis: VIII. Inhibition of the activity of glycolytic enzymes by free fatty acids. J Biol Chem. 243 (6), 1096-1102 (1968).
  2. Mahé, M., Rios-Fuller, T. J., Karolin, A., Schneider, R. J. Genetics of enzymatic dysfunctions in metabolic disorders and cancer. Front Oncol. 13, 1230934(2023).
  3. Fernandez-de-Cossio-Diaz, J., Vazquez, A. A physical model of cell metabolism. Sci Rep. 8 (1), 8349(2018).
  4. Metallo, C. M., Vander Heiden, M. G. Understanding metabolic regulation and its influence on cell physiology. Mol Cell. 49 (3), 388-398 (2013).
  5. Mildvan, A. S. Mechanisms of signaling and related enzymes. Proteins. 29 (4), 401-416 (1997).
  6. Frosina, G. Overexpression of enzymes that repair endogenous damage to DNA. Eur J Biochem. 267 (8), 2135-2149 (2000).
  7. Schärer, O. D. Chemistry and biology of DNA repair. Angew Chem Int Ed. 42 (26), 2946-2974 (2003).
  8. de la Fuente, M., et al. Enzyme therapy: Current challenges and future perspectives. Int J Mol Sci. 22 (17), 9181(2021).
  9. Robertson, J. G. Enzymes as a special class of therapeutic target: clinical drugs and modes of action. Curr Opin Struct Biol. 17 (6), 674-679 (2007).
  10. Goddard, J. -P., Reymond, J. -L. Enzyme assays for high-throughput screening. Curr Opin Biotechnol. 15 (4), 314-322 (2004).
  11. Helm, J. S., Hu, Y., Chen, L., Gross, B., Walker, S. Identification of active-site inhibitors of MurG using a generalizable, high-throughput glycosyltransferase screen. J Am Chem Soc. 125 (37), 11168-11169 (2003).
  12. Veldhuyzen, W. F., Nguyen, Q., McMaster, G., Lawrence, D. S. A light-activated probe of intracellular protein kinase activity. J Am Chem Soc. 125 (44), 13358-13359 (2003).
  13. Torres, M., Forman, H. J. Encyclopedia of Respiratory. Laurent, G. J., Shapiro, S. D. , Academic Press. 10-18 (2006).
  14. Blume-Jensen, P., Hunter, T. Oncogenic kinase signalling. Nature. 411 (6835), 355-365 (2001).
  15. Martin, G. S. Cell signaling and cancer. Cancer Cell. 4 (3), 167-174 (2003).
  16. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  17. Graves, J. D., Krebs, E. G. Protein phosphorylation and signal transduction. Pharmacol Ther. 82 (2), 111-121 (1999).
  18. Hafen, E. Kinases and phosphatases--A marriage is consummated. Science. 280 (5367), 1212-1213 (1998).
  19. Westphal, R. S., Anderson, K. A., Means, A. R., Wadzinski, B. E. A signaling complex of Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase IV and protein phosphatase 2A. Science. 280 (5367), 1258-1261 (1998).
  20. Barford, D., Das, A. K., Egloff, M. -P. The structure and mechanism of protein phosphatases: Insights into catalysis and regulation. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 27, 133-164 (1998).
  21. Liu, Q., Qu, J., Zhao, M., Xu, Q., Sun, Y. Targeting SHP2 as a promising strategy for cancer immunotherapy. Pharmacol Res. 152, 104595(2020).
  22. Pan, J., Zhou, L., Zhang, C., Xu, Q., Sun, Y. Targeting protein phosphatases for the treatment of inflammation-related diseases: From signaling to therapy. Signal Transduct Targeted Ther. 7 (1), 177(2022).
  23. Denard, C. A., et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 10 (1), 63-71 (2021).
  24. Lim, S., Glasgow, J. E., Filsinger Interrante, M., Storm, E. M., Cochran, J. R. Dual display of proteins on the yeast cell surface simplifies quantification of binding interactions and enzymatic bioconjugation reactions. Biotechnol J. 12 (5), (2017).
  25. Yi, L., et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (18), 7229-7234 (2013).
  26. Yi, L., et al. Yeast endoplasmic reticulum sequestration screening for the engineering of proteases from libraries expressed in yeast. Methods Mol Biol. 1319, 81-93 (2015).
  27. Semenza, J. C., Hardwick, K. G., Dean, N., Pelham, H. R. ERD2, a yeast gene required for the receptor-mediated retrieval of luminal ER proteins from the secretory pathway. Cell. 61 (7), 1349-1357 (1990).
  28. Mei, M., et al. Characterization of aromatic residue-controlled protein retention in the endoplasmic reticulum of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 292 (50), 20707-20719 (2017).
  29. Ezagui, J., Russell, B., Mairena, Y., Stern, L. A. Endoplasmic reticulum sequestration empowers phosphorylation profiling on the yeast surface. AIChE J. 68 (12), e17931(2022).
  30. Kawai, S., Murata, K. Genetic Transformation Systems in Fungi. van den Berg, M. A., Maruthachalam, K. 1, Springer International Publishing. 187-192 (2015).
  31. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  32. Loock, M., et al. High-efficiency transformation and expression of genomic libraries in yeast. Methods Protoc. 6 (5), 89(2023).
  33. Huang, D., Gore, P. R., Shusta, E. V. Increasing yeast secretion of heterologous proteins by regulating expression rates and post-secretory loss. Biotechnol Bioeng. 101 (6), 1264-1275 (2008).
  34. Yu, B., et al. Targeting protein tyrosine phosphatase SHP2 for the treatment of PTPN11-associated malignancies. Mol Cancer Ther. 12 (9), 1738-1748 (2013).
  35. Stern, L. A., et al. Geometry and expression enhance enrichment of functional yeast-displayed ligands via cell panning. Biotechnol Bioeng. 113 (11), 2328-2341 (2016).
  36. Pan, X., et al. Optimized single-cell gates for yeast display screening. Protein Eng Design Sel. 38, gzae018(2025).
  37. Margittai, É, et al. Production of H2O2 in the endoplasmic reticulum promotes in vivo disulfide bond formation. Antioxid Redox Signal. 16 (10), 1088-1099 (2012).
  38. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev. 57 (2), 383-401 (1993).
  39. Ezagui, J., Stern, L. A. Tyrosine phosphorylation screening on the yeast surface by magnetic bead selection and FACS. Methods Mol Biol. 2681, 275-290 (2023).
  40. Yarnall, M. T. N., Kim, S. H., Korntner, S., Bishop, A. C. Destabilization of the SHP2 and SHP1 protein tyrosine phosphatase domains by a non-conserved “backdoor” cysteine. Biochem Biophys Rep. 32, 101370(2022).
  41. Dustin, C. M., Heppner, D. E., Lin, M. J., van der Vliet, A. Redox regulation of tyrosine kinase signalling: more than meets the eye. J Biochem. 167 (2), 151-163 (2020).
  42. Stern, L. A., Csizmar, C. M., Woldring, D. R., Wagner, C. R., Hackel, B. J. Titratable avidity reduction enhances affinity discrimination in mammalian cellular selections of yeast-displayed ligands. ACS Comb Sci. 19 (5), 315-323 (2017).
  43. Waldman, A. C., Rao, B. M., Keung, A. J. Mapping the residue specificities of epigenome enzymes by yeast surface display. Cell Chem Biol. 28 (12), 1772-1779.e4 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Yeast Surface DisplayProtein DephosphorylationSubstrate ScreeningPhosphorylation AnalysisSHP 2 PhosphataseExtracellular Enzyme AssayHigh Throughput ScreeningGating Strategy

מאמרים קשורים