הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טרנספורמציה גנטית בתיווך Agrobacterium tumefaciens in Solanum nigrum

908 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68212

⸱

24 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Agriculture and Life Science, Liaocheng University

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט של שיטת הטרנספורמציה הגנטית המתווכת על ידי Agrobacterium tumefaciens לייצור Solanum nigrum.

תקציר

Solanum nigrumהוא קרוב משפחה סולני יתום של תפוחי אדמה ועגבנייה, והפירות הטריים שלו הם פירות יער מזינים וטעימים. כל הצמח של S. nigrum יכול לשמש כתרופה. עם זאת, ל-S. nigrum הפראי יש כמה תכונות לא רצויות. למרבה המזל, טכניקות הנדסה גנטית, במיוחד טכנולוגיות לעריכת גנים כמו CRISPR/Cas9, מציעות הזדמנויות יקרות ערך לשפר במהירות את S. nigrum על ידי טיפול בחוסרים אלה. ברוב הצמחים, השבחת צמחים באמצעות טכנולוגיית עריכת גנים מושגת באמצעות טרנספורמציה גנטית בתיווך Agrobacterium tumefaciens. במאמר זה, פירטנו את פרוטוקולי הטרנספורמציה הגנטית המתווכים על ידי A. tumefaciens ב-S. nigrum. הקוטילדון וההיפוקוטיל של שתילי S. nigrum שימשו כצמחים חיצוניים לטרנספורמציה גנטית. מכיוון ש-S. nigrum עמיד לקנמיצין, הגן DsRed שימש כסמן חזותי לזיהוי צמחים מהונדסים. ניתן להשלים ביעילות את הטרנספורמציה הגנטית של S. nigrum על פי פרוטוקולי פעולה אלה. ניתן לזהות ישירות את הזיהוי של צמחים טרנסגניים T1 על ידי האם הם פולטים פלואורסצנטיות אדומה, ללא צורך בזיהוי PCR.

מבוא

סולנום ניגרום (שם מדעי: Solanum nigrum) הוא סוג של תפוח אדמהועגבנייה. הפרי הוא פירות יער כדוריים שמשחירים לאחר ההבשלה. הפרי הטרי הוא פירות יער מזינים וטעימים. כל הצמח של S. nigrum יכול לשמש כתרופה, עם השפעות של פיזור קיפאון דם, הפחתת נפיחות, פינוי חום וניקוי רעלים. S. nigrum מסנתז שתי קבוצות נפרדות של מטבוליטים מיוחדים מקודמן כולסטרול נפוץ: ספונינים סטרואידים בעלים שלו וגליקואלקלואידים סטרואידים (SGAs) בפירות היער שלו. Uttroside B, ספונין סטרואידי, שמקורו ב-S. nigrum, אושר לאחרונה על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי כתרופת יתום לטיפול בקרצינומה הפטו-תאית2. הנוקאאוט של הגן GAME15 ב-S. nigrum הביא לכך שלצמחים חסרים גם ספונינים וגם אלקלואידים סטרואידים, וגם גילה שספונינים סטרואידים שולטים במזיקים חקלאיים חקלאיים רציניים2. פוליפנולים ב- S. nigrum מפחיתים משקל ושומן בגוף על ידי השפעה על אדיפוציטים וחילוף חומרים של שומנים3. S. nigrum יכול להעשיר קדמיום ומשמש כצמח מודל לחקר העשרת קדמיום 4,5. S. nigrum הוא צמח לא מבוית, והבסיס המחקרי שלו חלש יחסית. זה מעורר השראה שהמחקר על S. nigrum גדל בהדרגה בשנים האחרונות. הגנום של ההקספלואיד S. nigrum הורכב לאחרונה, וייתכן ש-S. nigrum התפתח מהדיפלואיד שלו Solanum americanum (2n = 2x = 24)6,7. לכן, S. nigrum הוא צמח בעל ערך רפואי ואכיל. המחקר על S. nigrum לא רק תורם להבנה מעמיקה יותר של היישומים הפוטנציאליים שלו בטיפול במחלות אנושיות, אלא גם מספק תובנות חשובות לגבי שיפור הייצור החקלאי. לכן, הקמת מערכת טרנספורמציה גנטית ב-S. nigrum היא הבסיס לשיפור גנטי באמצעות טכנולוגיה טרנסגנית ועריכת גנים.

ישנם מספר דיווחים המתמקדים בטרנספורמציה הגנטית בתיווך Agrobacterium tumefaciens של S. nigrum 8,9,10,1 1. בעבודתנו הקודמת, הקמנו מערכת טרנספורמציה גנטית בתיווך LBA4404 A. tumefaciens עבור S. nigrum, והפכנו את AcMYB110 ל-S. nigrum, וקיבלנו גרמפלזמות חדשות של S. nigrum עם תכולת אנתוציאנין מוגברת1. צמחי S. nigrum טרנסגניים וערוכים גנטית התקבלו עם טרנספורמציה גנטית בתיווך A. tumefaciens EHA10510. לחלבונים פלואורסצנטיים שונים יש פליטות פלואורסצנטיות ירוקות, אדומות, צהובות, כתומות וכחולות והם נמצאים בשימוש נרחב בציון פעילויות חיים תאיות12. בתהליך הטרנספורמציה הגנטית של צמחים, גנים פלואורסצנטיים אדומים משמשים לעתים קרובות כגנים מדווחים כדי להבחין בין אירועים מהונדסים גנטית לאירועים שאינם מהונדסים גנטית13. השימוש בגן DsRed כגן מדווח מאפשר הבחנה נוחה של אירועים טרנסגניים, בעוד ששימוש בגורם השעתוק R2R3-MYB כגן מדווח עשוי להיות מושפע מהגנוטיפ של הצמחים14. בצאצאים טרנסגניים, ניתן להבחין בקלות בין צמחים טרנסגניים לצמחים שאינם טרנסגניים באמצעות מכשירים אופטיים (למשל, מיקרוסקופים פלואורסצנטיים או מערכות הדמיה), מה שמבטל את הצורך בזיהוי מבוסס PCR. על ידי שילוב הגן המדווח על חלבון פלואורסצנטי עם טכנולוגיית עריכת גנים CRISPR, גני הפוריות בתירס נמחקו במדויק, וכתוצאה מכך נוצר קו סטרילי גרעיני וקו תחזוקה סטרילי גרעינימבוקר 15. האבקה עצמית ופרי של צמחי תחזוקה ייצרו צאצאים 1:1 של קווים מתחזקים וסטריליים. בהתבסס על מאפיינים זוהרים שונים, ניתן להשיג מיון לא הרסני של זרעי תחזוקה וקו סטרילי באמצעות זיהוי חזותי או מכונה15. לפיכך, שימוש בגן החלבון הפלואורסצנטי כגן מדווח מפשט את הזיהוי של זרעים או צמחים טרנסגניים ללא צורך בניתוח PCR. זה מייצג יתרון משמעותי בתחום הטרנספורמציה הגנטית. שיטה זו נועדה לתאר את הפרוטוקול של טרנספורמציה גנטית בתיווך Agrobacterium tumefaciens ב-S. nigrum, תוך שימוש בגן הפלואורסצנטי האדום, DsRed, כגן מדווח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. גידול שתילים אספטיים

הערה: השלבים הבאים מבוצעים על ספסל נקי במיוחד.

  1. אספו זרעי בר של S. nigrum בעיר ליאוצ'נג, סין, וקראו להם Snlc1. קח 50 זרעי בר של S. nigrum והניח אותם בצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל. לאחר השרייה של 1 מ"ל של 5% ג'יברלין למשך 30 דקות, השליכו את תמיסת הג'יברלין.
  2. מוסיפים 1 מ"ל של 75% אתנול, מנערים למשך דקה ואז זורקים את האתנול.
  3. הוסף 1 מ"ל של תמיסת נתרן היפוכלוריט 2% וחטא את פני הזרעים למשך 10 דקות. יש לנער היטב את צינור הצנטריפוגה כדי לעקר את פני הזרע. לאחר 10 דקות, השליכו את הנתרן היפוכלוריט.
  4. שוטפים את הזרעים פי 5 במים מעוקרים כדי להסיר שאריות נתרן היפוכלוריט. מניחים את הזרעים בכלי פטרי בקוטר 90 מ"מ המכילים 1/2 MS מדיום מוצק. תרבית הלוחות בתא גידול צמחים תחת תקופת אור של 16 שעות אור / 8 שעות חושך ב-25 מעלות צלזיוס (איור 1A).

2. התרבות של A. tumefaciens LBA4404

  1. הפוך את הווקטור הבינארי pRed130516 המכיל גן פלואורסצנטי אדום, DsRed2, ל-A. tumefaciens LBA4404 על ידי אלקטרופורציה עם MicroPulser עם פרמטרים: מתח 1800 וולט, קיבול 25 μF, התנגדות 200 Ω, קובט 1 מ"מ. תרבית את החיידקים על מדיום LB מוצק עם 50 מ"ג/ליטר קנמיצין ו-50 מ"ג/ליטר ריפמפיצין ב-28 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
  2. הרם שיבוט אחד של LBA4404 המכיל pRed1305 ותרבית אותו ב-1 מ"ל של מדיום LB נוזלי עם 50 מ"ג/ליטר קנמיצין ו-50 מ"ג/ליטר ריפמפיצין בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ברכז שולחן עם 180 סל"ד ב-28 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
  3. הוסף 50 מ"ל של LB נוזלי עם אותה אנטיביוטיקה ל-1 מ"ל של תמיסת חיידקים ולאחר מכן תרבית ברכז שולחן עם 200 סל"ד ב-28 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות.
  4. הפסק את התרבות כאשר ה-OD600 של מדיום תרבית החיידקים הוא 0.4, ולאחר מכן צנטריפוגה את תמיסת החיידקים ב-2200 x גרם למשך 10 דקות ב-25 מעלות צלזיוס.
  5. השעו מחדש את החיידקים הצנטריפוגים עם תמיסת זיהום (IS: M519 4.43 גרם/ליטר, סוכרוז 30 גרם/ליטר, 6-BA 2 מ"ג/ליטר, AS, 100 מיקרומול/ליטר, pH 5.8) והתאימו את ריכוז תמיסת החיידקים ל-OD600=0.6 עם ספקטרופוטומטר.

3. הוצאת זיהום עם A. tumefaciens

הערה: השלבים הבאים מבוצעים על ספסל נקי במיוחד.

  1. גדלו את הזרעים במשך 7 ימים עד שהקוטילונים של השתילים נפרשו (איור 1B). חותכים את שני הקוטילדון וההיפוקוטיל באורך של כ -1 ס"מ מהשתילים בעזרת אזמל מעוקר וחד בכלי תרבית עם נייר פילטר רטוב ב- IS חיידקי והשליכו את השורשים הראשוניים. היזהר בעת שימוש באזמל.
  2. להחדיר את האקספלנטים בתמיסת הזיהום למשך 30 דקות. הנח את האקספלנטים על נייר סינון יבש כדי לאפשר לתמיסת החיידקים על פני הצמח להיספג
  3. מניחים את הצמחים במדיום מוצק IS (0.7% אגר; איור 1C). מניחים את האקספלנטים בתא גידול צמחים ללא אור בטמפרטורה של 19 מעלות צלזיוס ותרבית למשך 3 ימים.

4. התמיינות של אקספלנטים

הערה: השלבים הבאים מבוצעים על ספסל נקי במיוחד.

  1. הרם את האקספלנטים מתא גידול הצמח בטמפרטורה של 19 מעלות צלזיוס. שטפו את הצמחים באמצעות מים מעוקרים פי 5 והניחו את הצמחים על נייר סינון יבש ומעוקר.
  2. מניחים את האקספלנטים במדיום התמיינות יורה (SD) (SD: M519 4.43 גרם/ליטר, סוכרוז 30 גרם/ליטר, 6-BA 2 מ"ג/ליטר, ZT 0.5 מ"ג/ליטר, Cef 100 מ"ג/ליטר, פחמימה 100 מ"ג/ליטר, 0.7 גרם/ליטר אגר, pH 5.8), ותרבית ב-25 מעלות צלזיוס למשך 4 שבועות (איור 1D,E).
  3. חתכו את היבלות/ניצנים של צמחים שמראים פלואורסצנטיות אדומה מתחת לאור העירור הירוק של מנורת פלורסנט ידנית באמצעות אזמל, ואז העבירו אותם למדיום SD חדש, והמשיכו לתרבית במשך 4 שבועות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס (איור 1F,G).

5. השתרשות והשתלה

  1. חתכו את הניצנים המראים פלואורסצנטיות אדומה בעזרת מנורת פלורסנט ידנית, העבירו אותם למדיום ההשרשה (RM: M519 4.43 גרם/ליטר, סוכרוז 30 גרם/ליטר, 6-BA 2 מ"ג/ליטר, ZT 0.5 מ"ג/ליטר, Cef 100 מ"ג/ליטר, פחמימות 100 מ"ג/ליטר, 0.7 גרם/ליטר אגר, pH 5.8), ותרבו אותם במשך 2-4 שבועות ב-25 מעלות צלזיוס כדי לקדם את ייצור השורשים.
  2. השתל את השתילים המראים פלואורסצנטיות אדומה באורך שורש של יותר מ-2 ס"מ לאדמה (איור 1H-K). לפני ההשתלה, הסר את האגר מהשורשים ביד כדי למנוע צמיחה מוגזמת של חיידקים בשורשים.

6. בדיקת צמחי T0 מהונדסים גנטית עם הגברת PCR

  1. חלץ את ה-DNA הגנומי של קו טרנסגני עצמאי בשיטת צטיל טרימתיל אמוניום ברומיד (CTAB)17.
  2. הגבירו את הגן DsRed עם סט פריימר, RedF (5'-TGGCCTCCTCCGAGAAC-3') ו-RedR (5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3') באמצעות DNA גנומי של 10 ננוגרם כתבנית בנפח תגובה של 15 מיקרוליטר המכיל 7.5 מיקרוליטר של 2x PCR Master Mix ו-0.3 מיקרוליטר מכל פריימר (10 מיקרומול/ליטר). שבר ה-DNA הצפוי היה 393 bp. הכניסו את מוצרי ה-PCR לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 1% כדי לקבוע אם הם צמחים מהונדסים.

7. זיהוי צמחים טרנסגניים בדור T1 עם מנורת פלורסנט

  1. קצרו את הפירות של צמחים טרנסגניים T0 של S. nigrum שצבעם שחור-סגול לחלוטין ולאחר מכן סחטו את הזרעים בתוך הפרי ביד. יש לייבש את הזרעים באופן טבעי בטמפרטורת החדר למשך כשבוע.
  2. תרבית את הזרעים המיובשים במדיום 1/2 MS לפי שלבים 1.1 עד 1.4 של פרוטוקול זה והנח בתא גידול צמחים למשך שבוע. הבחין בין שתילים טרנסגניים לשתילים לא טרנסגניים עם מנורת פלורסנט כף יד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

טרנספורמציה גנטית בתיווך Agrobacterium tumefaciens לייצור S. nigrum טרנסגני.
לאחר הדבקת הקוטילדון וההיפוקוטיל של שתילי S. nigrum ב-A. tumefaciens, יכולנו לקבוע אם זיהום ה-Agrobacterium הצליח מכיוון ש-DsRed שימש כגן מדווח. פלואורסצנטיות אדומה הופיעה באתר הפצע לאחר הדבקה 3-4 שבועות (איור 1D,E), מה שהצביע על כך שזיהום ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עד כה, שיטות טרנספורמציה גנטית ל-S. nigrum בתיווך A. tumefaciens נקבעו במעבדות שונות 8,9,10,11. רוב שיטות הטרנספורמציה הללו משתמשות בקנאמיצין כחומר הבחירה 8,9,10,11. עם זאת, S. nigrum אינו רגיש לקנמיצין. לכן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר של אוניברסיטת ליאוצ'נג (318012028) והקרן למדעי הטבע של מחוז שאן-דונג (ZR2020MC034).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2X SanTaq PCR מאסטר מיקס (עם צבע כחול)סנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מB532061תערובת ה-2X SanTaq PCR כוללת MgCl?, dNTPs, Taq DNA Polymerase, מאגר PCR, צבע טעינה ומשפר PCR.
6-BAסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מC14819266ציטוקינינים מלאכותיים
AgarTianjin Damao Chemical Reagent Partnership Enterprise (שותפות מוגבלת)CAS NO:9002-18-0מוצקים
ASSangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"מK914BA0002לגרום לביטוי יעיל של Agrobacterium
CarbSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.אנטיביוטיקה
CefSangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"מI526BA0010אנטיביוטיקה
ג'יברליןסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מK514BA0009מקדם נביטת זרעים
קנמיציןסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מI614BA0013 אנטיביוטיקה
LB בינוניסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מB540113לגדל את החיידק
MicroPulser ( Gene Pulser Xcell)Bio-Rad, US617BR1 06783Gene Pulser
Xcell MS מוצק בינוניphytotech Co., Ltd., USHCA0519228A  מוראשיג'ה & Skoog בזאלי בינוני עם ויטמינים, קופסת פלסטיק M519
LiaoSu, סיןT909Hקופסת שתילת צמחים
rifampicinסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מS180305אנטיביוטיקה
סוכרוזSangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"ממס' CAS:57-50-1     כמקור פחמן
Tanon-5200Multi מכונהTanon Co., Ltd., סין5200Multiהפרדה מואצת
פראית Solanum nigrumשנאספה בעיר Liaocheng
ZTSangon Biotech (שנחאי) ושות', בע"מJ921BA0014מווסתי צמיחה של צמחים

מקורות

  1. Wang, X., et al. Ectopic overexpression of AcMYB110 causes significantly increased content of anthocyanins in Solanum nigrum. Biologia plant. 67, 200-203 (2023).
  2. Boccia, M., et al. A scaffold protein manages the biosynthesis of steroidal defense metabolites in plants. Science. 386 (6728), 1366-1372 (2024).
  3. Peng, C. H., et al. Solanum nigrum polyphenols reduce body weight and body fat by affecting adipocyte and lipid metabolism. Food Funct. 11 (1), 483-492 (2020).
  4. Wang, J., et al. Influence of Cd toxicity on subcellular distribution, chemical forms, and physiological responses of cell wall components towards short-term Cd stress in Solanum nigrum. Environ Sci Pollution Res. 28 (11), 13955-13969 (2021).
  5. Wang, J., et al. Comparative cytology combined with transcriptomic and metabolomic analyses of Solanum nigrum L. in response to Cd toxicity. J Hazardous Mater. 423, 127168(2022).
  6. Lee, E. S., et al. Engineering homoeologs provide a fine scale for quantitative traits in polyploid. Plant Biotech J. 21 (12), 2458-2472 (2023).
  7. Lin, X., et al. Solanum americanum genome-assisted discovery of immune receptors that detect potato late blight pathogen effectors. Nat Genetics. 55 (9), 1579-1588 (2023).
  8. Bhattacharya, A., et al. Engineering gibberellin metabolism in Solanum nigrum L. by ectopic expression of gibberellin oxidase genes. Plant Cell Rep. 31 (5), 945-953 (2012).
  9. Chhon, S., Jeon, J., Kim, J., Park, S. U. Accumulation of Anthocyanins through Overexpression of AtPAP1 in Solanum nigrum Lin (Black Nightshade). Biomolecules. 10 (2), 277(2020).
  10. Park, S., et al. Rapid generation of transgenic and gene-edited Solanum nigrum plants using Agrobacterium-mediated transformation. Plant Biotech Rep. 14 (4), 497-504 (2020).
  11. Peng, W., et al. A convenient, reliable and directly visual selection marker for identifying transgenic lines of Solanum nigrum. Plant Cell Tiss Organ Cult. 152 (2), 369-375 (2023).
  12. Schlechter, R. O., et al. Chromatic Bacteria - A Broad Host-Range Plasmid and Chromosomal Insertion Toolbox for Fluorescent Protein Expression in Bacteria. Front Microbio. 9, 3052(2018).
  13. Hao, H., et al. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of Lotus corniculatus using DsRed2 positive selection and vermiculite-based rooting method. Plant Cell Tiss Organ Cult. 156 (2), 58(2024).
  14. Fan, Y., et al. a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Meth. 16 (1), 94(2020).
  15. Qi, X., et al. Genome Editing Enables Next-Generation Hybrid Seed Production Technology. Mol Plant. 13 (9), 1262-1269 (2020).
  16. Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell Tiss Organ Cult. 141 (1), 207-216 (2020).
  17. Schenk, J. J., Becklund, L. E., Carey, S. J., Fabre, P. P. What is the "modified" CTAB protocol? Characterizing modifications to the CTAB DNA extraction protocol. Appl Plant Sci. 11 (3), e11517(2023).
  18. Li, Q., et al. An Improved and Simplified Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation Protocol for Solanum nigrum with a Shorter Growth Time. Plants. 13 (15), 2015(2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CRISPR Cas9DsRed

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.