הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

התמרה נרחבת של נוירונים ניאוקורטיקליים של עכברים על ידי הזרקה תת-עכבישית של AAV2

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68235

⸱

23 במאי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences, 2Faculty of Biology and Biotechnology, National Research University High School of Economics

במאמר זה

סיכום

מתוארת טכניקה חדשה להעברה נרחבת של נגיף הקשור לאדנו, המשתמשת בעירוי וירוס תת-עכבישי. שיטה זו לא רק מבטיחה התמרה נרחבת של נוירונים ניאו-קורטיקליים של עכברים בשכבות שטחיות, אלא גם מביאה לביטוי סלקטיבי של הטרנסגן בנוירונים פירמידליים בשכבה חמש, גם כאשר משתמשים במקדם לא סלקטיבי.

תקציר

נגיפים רקומביננטיים הקשורים לאדנו-הם כלי גמיש ורב עוצמה להעברה וביטוי של גנים שונים בעלי עניין בתחומים רבים של ביולוגיה ניסויית, במיוחד במדעי המוח. השיטה הפופולרית ביותר להניע את הביטוי של טרנסגן רצוי באזור מסוים במוח היא הזרקת וקטור AAV ישירות לפרנכימה של המוח. עם זאת, שיטה זו אינה מאפשרת התמרה עצבית נרחבת הנדרשת לחלק מניסויי in vivo . במאמר זה, אנו מציגים טכניקה חדשה לביטוי גנים נרחב בניאו-קורטקס של עכברים המבוססת על עירוי ויראלי לחלל התת-עכבישי של המוח. שיטת תיוג עצבית זו לא רק מבטיחה התמרה נרחבת של נוירונים בשכבות ניאו-קורטיקליות שטחיות של עכבר בוגר, אלא גם מביאה לביטוי של הטרנסגן באוכלוסייה גדולה של נוירונים פירמידליים בשכבה חמש עם ספציפיות גבוהה גם בעת שימוש במקדם חזק ולא סלקטיבי כגון CAG. יתר על כן, מכיוון שהתמרת תאים מתרחשת במרחק משמעותי מאתר ההזרקה, שיטה זו יכולה לסייע בשימור רקמת המוח לצורך הקלטות אופטיות או אלקטרופיזיולוגיות של פעילות עצבית לאחר מכן.

מבוא

מוח היונקים מורכב מתאים מעכבים, מעוררים ומווסתים רבים המחוברים זה לזה למעגלים על ידי טריליוני סינפסות1. אחד האתגרים המרכזיים של מדעי המוח הוא לפענח את תפקידם של סוגי תאים שונים בארגון ובתפקוד של מעגלי מוח והתנהגות. מניפולציה של תאים מוגדרים גנטית בתוך המוח דורשת שיטות להחדרה ולביטוי של טרנסגנים. מערכות העברת גנים מבוססות ויראלים הן ללא ספק השיטה היעילה והפשוטה ביותר להעברת גנים למערכת העצבים המרכזית2. מערכות אספקה ויראליות מבוססות על שכפול וירוסים (אדנו-וירוסים, וירוסים הקשורים לאדנו-וירוסים (AAVs), לנטי-וירוסים ורטרו-וירוסים) שיש להם את היכולת להעביר מידע גנטי לתא מארח 2,3.

וקטורים מבוססי AAV הפכו כעת לאחד הכלים הנפוצים ביותר להעברת טרנסגנים רצויים לתאים במוח, הן למטרות מחקר בסיסי במדעי המוח והן לפיתוח ריפוי גנטי למחלות נוירולוגיות. בהשוואה לנגיפים אחרים, ל-AAV פגומים בשכפול יש תכונות רבות שהופכות אותם לווקטורים אידיאליים למטרות אלה. בעיקר, וקטורי AAV מתמרים ביעילות תאים שאינם מתחלקים (מובחנים סופנית) כגון נוירונים ותאי גליה, וכתוצאה מכך רמות גבוהות של ביטוי טרנסגנים in vivo2. ניתן לייצר את הווקטורים בקלות בטיטר פונקציונלי גבוה המתאים לשימוש in vivo 3,4,5. חשוב לציין, העברת גנים בתיווך נגיף הקשור לאדנו in vivo אינה מייצרת שינויים היסטופתולוגיים ורעילות הקשורה לווקטור6. בניגוד לווקטורים אדנו-ויראליים, מתן in vivo של וקטורי AAV במודלים של בעלי חיים בדרך כלל אינו מעורר תגובות חיסוניות של המארח כנגד תאים מותמרים, ומאפשר ביטוי טרנסגנים יציב בתוך פרנכימת המוח לפרקי זמן ממושכים 2,7,8.

סיבה נוספת לפופולריות של וקטורי AAV היא המגוון הרחב של סרוטיפים AAV עם טרופיזמים ייחודיים של רקמות ותאים 9,10,11,12,13,14. חלבוני קפסיד מובהקים המתבטאים על ידי סרוטיפים שונים של AAV מביאים לשימוש בקולטנים שונים על פני התא לכניסת תאים ובכך לטרופיזמים ספציפיים10,14.

טרופיזם AAV נקבע לא רק על ידי חלבוני קפסיד אלא על ידי גורמים רבים אחרים14. הוכח כי סרוטיפים 1, 2, 6, 7, 8 ו-9 של AAV התמירו הן נוירונים והן אסטרוציטים בתרבית ראשונית15,16, אך הפגינו טרופיזם עצבי חזק לאחר הזרקת מוח תוך-פרנכימלית17,18. השיטה המשמשת להכנת וקטור AAV יכולה גם להשפיע על טרופיזם של תאי עצבים, אפילו עבור אותו סרוטיפ. לדוגמה, AAV8 מטוהר CsCl היה בעל טרופיזם אסטרוגליאלי חזק לאחר הזרקת מוח תוך-פרנכימלית, בעוד ש-AAV8 מטוהר יודיקסאנול, שהוזרק בתנאים זהים, התמיר רק נוירונים19. טרופיזם AAV עשוי להיות מושפע גם מהמינון המוזרק ומנפח14. לדוגמה, טיטר גבוה rAAV2/1 התמיר ביעילות הן נוירונים מעוררים קליפת המוח והן נוירונים מעכבים, אך השימוש בטיטרים נמוכים יותר חשף העדפה חזקה להתמרה של נוירונים מעכבים בקליפת המוח20.

לפיכך, לא ניתן להשיג ספציפיות חזקה של סוג התא המבוססת אך ורק על סרוטיפ הקפסיד. ניתן להשתמש במקדמים ספציפיים לסוג תא כדי להתגבר על הטרופיזם הטבעי הרחב של קפסיד AAV. לדוגמה, סינפסין I אנושי משמש להתמקדות בנוירונים21, מקדם CaMKII יכול להניע ביטוי טרנסגנים בנוירונים מעוררים גלוטמטרגיים עם ספציפיות גבוהה20, מקדם ppHcrt מכוון לנוירונים המבטאים היפוקרטין (HCRT) בהיפותלמוס הצדדי22, מקדם PRSx8 מכוון לנוירונים נוראדרנרגיים ואדרנרגיים המבטאים דופמין בטא-הידרוקסילאז23, ומקדם GFAP יכול להניע ביטוי ספציפי לאסטרוציטים24. עם זאת, לחלק מהמקדמים הספציפיים לתא יש פעילות שעתוק חלשה ואינם יכולים להניע רמות מספיקות של ביטוי טרנסגנים25. יתר על כן, המקדמים הקצרים המתאימים לווקטורים נגיפיים של AAV לרוב אינם שומרים על ספציפיות סוג התא 1,26. לדוגמה, הוכח שמבנה CaMKII התמיר גם נוירונים מעכבים12.

מלבד ספציפיות סוג התא (טרופיזם), מאפיין משמעותי נוסף של AAVs הוא יעילות התמרה. לסרוטיפים השונים של AAV יש תכונות דיפוזיה שונות. AAV2 וארבעה וקטורים נגיפיים מתפזרים פחות בקלות דרך פרנכימת המוח ולכן מתווכים התמרה על פני שטח קטן יותר17,27. ההתמרה העצבית הנפוצה ביותר נצפית עם סרוטיפים AAV 1, 9 ו-rh.10 11,17,18,19,28.

השיטה הפופולרית ביותר להניע את הביטוי של טרנסגן רצוי באזור מסוים במוח היא להזריק את וקטור ה-AAV ישירות לאזור המוח המעניין (פרנכימה)3. לאחר הזרקה תוך-פרנכימלית, אפילו סרוטיפים של AAV עם דיפוזיה יעילה יותר דרך המוח מתמרים בדרך כלל רק אזור מקומי סביב אתר ההזרקה 12. יתרה מכך, הזרקה תוך פרנכימלית היא הליך פולשני ומוביל לנזק לרקמות הסמוכות לאזור העניין. לפיכך, שיטה זו של הזרקת וירוסים אינה מתאימה למשימות ניסיוניות מסוימות. לדוגמה, תיוג נרחב של תאים רצוי מאוד בניסויים שמטרתם לחקור תפקודי נוירונים בקליפת המוח בבעלי חיים הנעים בחופשיות, כולל באמצעות מיקרוסקופיה של פוטון אחד או שניים 29,30,31,32.

כאן, אנו מתארים טכניקת הזרקת וירוסים חדשה הקשורה לאדנו, המשתמשת בעירוי וירוסים תת-עכבישיים כדי לספק התמרה נרחבת של נוירונים ניאו-קורטיקליים בעכברים בוגרים ולשמר רקמת מוח להקלטות אופטיות או אלקטרופיזיולוגיות של פעילות עצבית. שיטה זו לא רק הבטיחה התמרה נרחבת של נוירונים בשכבות ניאו-קורטיקליות שטחיות, אלא הביאה לביטוי של הטרנסגן באוכלוסייה גדולה של נוירונים פירמידליים בשכבה חמש עם ספציפיות גבוהה גם בעת שימוש במקדם חזק ולא סלקטיבי כגון CAG.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

נערכו ניסויים בעכברים בוגרים C57Black/6 משני המינים (מרכז גידול פושצ'ינו, סניף המכון לכימיה ביואורגנית ע"ש שמיאקין-אובצ'יניקוב של RAS). העכברים שוכנו בוויווריום מבוקר טמפרטורה (22 מעלות צלזיוס ± 2 מעלות צלזיוס, מחזור אור/חושך של 12 שעות, אורות דולקים בשעה 08:00) עם מזון ומים אד ליביטום. כל הליכי הניסוי נערכו בהתאם להנחיות ARRIVE ולהנחיה 2010/63/EU לניסויים בבעלי חיים. פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של IHNA RAS (פרוטוקול N1 מיום 01.02.2022). נעשה כל מאמץ למזער את סבלם של בעלי החיים ולהבטיח את אמינות התוצאות.

1. הכנה לניתוח

  1. עקר את כל המכשירים הכירורגיים לפני תחילת הניתוח. נקה את אזור הניתוח באמצעות 70% אתנול.
  2. בדוק את רמת האיזופלורן במערכת ההרדמה ומלא אותה במידת הצורך. הניחו מגבת נייר נקייה בתחתית תא האינדוקציה.
  3. הנח כרית חימום על המסגרת הסטריאוטקסית. מכסים את הכרית במגבת נייר נקייה.
  4. הכינו בקבוק עם אקונומיקה של 2% כדי לאסוף קצות מיקרופיפטות, צינורות, צמר גפן ופריטים אחרים שבאים במגע עם הנגיף.
  5. מוציאים כמות של AAV מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס ומניחים אותה על קרח להפשרה.

2. הכנת מזרק

  1. נקה מיקרו-מזרק המילטון 5 מיקרוליטר עם מחט RN קהה 33G. שאפו ואז חלקו 70% אתנול. חזור על הפעולה 3 פעמים עם אתנול טרי. שוטפים את המזרק במים מזוקקים כדי להסיר את עודפי האתנול. חזור על הפעולה 3x.
  2. הוציאו את הבוכנה ומלאו את הקנה בשמן וזלין דרך האוגן באמצעות מזרק אינסולין. וודאו כי אין בועות אוויר במיקרו-מזרק.
    הערה: אוויר כלוא ניתן לדחיסה ומשפיע על דיוק ודיוק המזרק.
  3. החזירו את הבוכנה למיקרו-מזרק והוציאו טיפת שמן. הנח את המזרק לתוך המזרק הסטריאוטקסי כך שהסולם יהיה גלוי לניטור נפח התמיסה המחולקת.

3. הכנת עכברים לניתוח

  1. שקלו עכבר. הנח את העכבר בתא האינדוקציה של ההרדמה המחובר לאיזופלורן. הפעל את מכשיר האידוי איזופלורן המוגדר ל-5% והתאם את קצב הזרימה ל-250 מ"ל/דקה. עומק הרדמה הולם מושג תוך 5 עד 7 דקות.
  2. כדי לאמת את רמת ההרדמה הכירורגית, בדוק אם יש היעדר רפלקס הקצפה ונסיגה במהלך צביטה כואבת בכף האחורית, והיעדר מצמוץ בקשר עין.
  3. העבר את שסתום יציאת הוופורייזר מתא האינדוקציה למסכה הסטריאוטקסית. הפחת את האיזופלורן ל-1.8%-2.0% והגדר את קצב הזרימה בהתאם למשקל העכבר (70-90 מ"ל/דקה לעכברים במשקל שבין 25 ל-35 גרם).
  4. הסר את העכבר מתא האינדוקציה והנח אותו במנגנון הסטריאוטקטי על גבי כרית חימום (37 מעלות צלזיוס) למניעת היפותרמיה במהלך הרדמה כירורגית. הנח את השיניים הקדמיות במוט השיניים ולאחר מכן הרכיב את מסכת החיה.
  5. מקם בזהירות את החיה על מוטות האוזניים. תנוחת הראש הנכונה במנגנון הסטריאוטקטי מאפשרת תנועה אנכית אך לא רוחבית של הראש. ודא שמיקום החיה אינו גורם למצוקה. עקוב בקפידה אחר עומק ההרדמה, נשימת בעלי החיים וטמפרטורת הגוף לאורך כל הניתוח.
  6. לגלח את הראש מהעיניים אל מאחורי האוזניים. נקו את פני השטח המגולחים של הראש על ידי ספוגית עם 70% אתנול, ולאחר מכן ספוג עם תמיסת אלכוהול של 5% יוד.
  7. מרחו ג'ל עיניים למניעת ייבוש בעיניים. יש למרוח תמיסת לידוקאין 4% באופן מקומי ודקסמתזון (0.02 מ"ל ב-4 מ"ג/מ"ל) תת עורית כדי למנוע כאבים הקשורים לניתוח ולהפחית את התגובה הדלקתית האפשרית.
  8. בעזרת להב אזמל סטרילי ומספריים, בצע חתך באורך 4-5 מ"מ לאורך קו האמצע של הראש כדי לפתוח את הקרקפת. התחל בחתך קטן בין האוזניים ולאחר מכן הרחב אותו באמצעות מספריים כדי למנוע נזק לגולגולת.
  9. ספוג את פני הגולגולת בכמות קטנה של 3% מי חמצן כדי לדמיין את ציוני הדרך הסטריאוטקסיים: ברגמה ולמבדה. עצור את התגובה עם 0.9% NaCl מלח מיד. מגרדים רקמות על גבי הגולגולת בעזרת מגרד עצם.
  10. התקן את המזרק הממונע שהוכן מראש עם מזרק המילטון על הזרוע הסטריאוטקסית. כוון מקור אור כירורגי על הגולגולת החשופה ומקד את המיקרוסקופ על הברגמה.
  11. בהסתכלות דרך המיקרוסקופ, תפעל את הזרוע של המנגנון הסטריאוטקטי כדי למרכז את החלק העליון של המחט ישירות מעל הברגמה.
  12. בעזרת קצה המחט, יישר את הברגמה והלמבדה אופקית ולאחר מכן הזז את הזרוע לאחור לברגמה ורשום את הקואורדינטות. השתמש בקואורדינטות ברגמה אלה ובקואורדינטות האטלס של אזור העניין כדי לחשב את הקואורדינטות היחסיות של אזור היעד.
  13. העבר את המחט לאזור הממוקד. הורד את המחט בקואורדינטות החדשות וסמן מיקום זה. בחר את האתר למיקרו-הזרקה ויראלית בסמיכות לאזור היעד תוך התחשבות בהתפשטות הנגיף.
    הערה: זה ימנע פגיעה ברקמה באזור העניין. השתמשנו בקואורדינטות הבאות עבור אזור העניין: AP-3.4, ML -2.0, ולמיקרו-הזרקה ויראלית: AP-2.0, ML -1.4. הקואורדינטות לעיל הן אופטימליות אם נוירונים ראשוניים בקליפת המוח הראייתית אמורים להיות נגועים.
  14. במידת האפשר, הימנע מאזורים עם כלי דם גדולים. תחת מיקרוסקופ כירורגי, תאורה בהירה וקרה וטבילה של 0.9% NaCl במי מלח, אמורים להתגלות כלי דם גדולים בגולגולת ועל פני המוח.

4. הזרקת וירוסים

  1. קח בור שיניים סטרילי (קוטר 0.5 - 0.8 מ"מ). התבוננות במשטח הגולגולת דרך המיקרוסקופ הכירורגי, קדחו קרניוטומיה קטנה באופן ידני (ביד) או באמצעות מיקרו-מקדחה. הקפד לא להפעיל לחץ מוגזם על הגולגולת.
  2. הזז את הזרוע מהדרך כדי למנוע נזק למחט המיקרו-מזרק במהלך קידוח הגולגולת (חור). יש למרוח טבילה במי מלח של 0.9% NaCl ולעצור לסירוגין כדי למנוע חימום העצם ופגיעה בדורה מאטר. השתמש באוויר בלחץ כדי לפוצץ אבק עצמות.
    הערה: הסוגים הבאים של בורות שיניים מקרביד מתאימים: בצורת אגס (רצוי), גליל מעוגל ועגול.
    1. בעת דילול העצם עם הבור, ודא שהדילול אחיד על פני כל ההיקף. זה יקל על הסרת העצם מבלי לפגוע בדורה מאטר. לשם כך, השתמש בתחילה בבור עם קצה עגול ולאחר מכן בבור עם קצה שטוח. שמור על הבור בניצב לעצם; אחרת, צד אחד יהיה דק יותר מהשני.
      הערה: בנוסף, ככל שגודל הבור קטן יותר וככל שהגולגולת המבוצעת קטנה יותר, כך המניפולציה תהיה מורכבת יותר. מומלץ לבצע קרניוטומיה בקוטר קטן יותר (0.5-0.6 מ"מ) בעת שימוש נוסף בבעל החיים לעבודה in vivo . אם מתכננים להשתמש במוח החיה לעבודה מחוץ לגוף , מקובל קוטר גולגולת גדול יותר כדי לפשט את ההליך.
  3. כאשר העצם הדלילה רכה ושקופה, הפסק לקדוח. כאשר נוצר שקע גדול מספיק בעצם, עצור לעתים קרובות את הסיבוב ופקח על עובי העצם. הופעת סדקים בעצם מעידה על כך שדילול מספיק.
  4. רחצו את החור במי מלח סטריליים ואז הסירו את עודפי המלח בעזרת צמר גפן. הסר את שכבת העצם הנותרת באמצעות מחט 27 גרם עם קצה בצורת וו / או באמצעות פינצטה עדינה. הימנע מפגיעה בדורא.
  5. מכסים את פני הגולגולת בפיסת מגבת נייר סטרילית לחה במי מלח. הנח פיסת סרט נקי ושקוף על משטח גולגולת העכבר מעל הנייר.
  6. הזז את הזרוע הסטריאוטקסית לאחור ומקם את מחט המיקרו-מזרק במקומה ישירות מעל הסרט. מוציאים את עודפי השמן עד שמגיעים לנפח של 2 מיקרוליטר.
    הערה: הנפח הסופי של השמן עשוי להשתנות בהתאם לנפח מזרק המיקרו. השתמשנו במזרק מיקרו 5 μL 75-RN Hamilton.
  7. פיפטה נפח וירוס השווה לנפח המוזרק + 2 מיקרוליטר על פיסת סרט שקוף.
  8. בהסתכלות דרך המיקרוסקופ הכירורגי, הורד את הזרוע כלפי מטה עד שקצה המחט נמצא במרכז טיפת הנגיף. טען את הנגיף לתוך המיקרו-מזרק באמצעות מזרק ממונע. השלך את קצה המיקרופיפטה והסרט השקוף לבקבוק עם אקונומיקה 2%.
  9. הסר את הנייר הרטוב במי מלח מעל פני הגולגולת וייבש את הגולגולת בעזרת צמר גפן. השתמש בזרוע הסטריאוטקסית כדי למקם את המחט מעל מקום ההחדרה.
  10. יש להוציא טיפה מהנגיף כדי לוודא שהמחט אינה סתומה. צור חריץ קטן בדורה באמצעות מחט 30 גרם עם קצה בצורת וו.
    הערה: חשוב ליצור את החריץ הקטן ביותר האפשרי בדורה מאטר, ולאפשר למחט להיכנס מבלי להשאיר רווח בין המחט לדורה מאטר, שממנו הנגיף עלול לדלוף.
  11. הורד את מחט המזרק עד לדורה ובצע את החישובים המתאימים לעומק. העריכו את עומק קליפת המוח של ההחדרה ביחס לנקודה שבה המחט נגעה לראשונה בפני השטח של קליפת המוח.
  12. הכנס לאט את קצה המחט לקליפת המוח לעומק של 300 מיקרומטר. המתן 2-3 דקות כדי לאפשר לדורה להיצמד למחט, ולאחר מכן החזר לאט את המחט לעומק של 200 מיקרומטר. המתן עוד 2-3 דקות כדי לאפשר לרקמת המוח להתייצב. התוצאה היא שהמחט מושכת את הדורה כלפי מעלה, ויוצרת מרחב תת-דוראלי להתפשטות הנגיף.
    הערה: כדי למזער את הנזק לקליפת המוח, השתמש במחט 33 גרם או במחטים נמוכות יותר. זכור שככל שהקוטר הפנימי של הקצה קטן יותר, כך גדל הסיכוי שזרימה חוזרת של רקמות תסתום אותו. חשוב להשתמש במחט קהה במקום משופעת מכיוון שמחט קהה מוציאה טיפה מבוקרת יותר של תמיסה ויראלית.
    1. אם המחט לא עוברת דרך הדורה מאטר כשהיא מונמכת ל 150-200 מיקרומטר ובמקום זאת מכופפת אותה, הפסק להנמיך. הרם את המחט ובצע חתך מעט גדול יותר בדורה מאטר, ולאחר מכן נסה להוריד את המחט שוב.
    2. אם נוזל המוח מתחיל לדלוף באופן פעיל מהחתך תוך כדי הורדת המחט, המתן עד שהוא יפסיק לדלוף; אחרת, קשה לשלוט במחט העוברת דרך הדורה. כתם את עודפי נוזל המוח עם קצה רקמה. ברגע שהנוזל מפסיק לזרום, הרם את המחט ונסה שוב.
  13. התחל להזריק את התרחיף הנגיפי בקצב של 0.06 מיקרוליטר לדקה תוך ניטור הנפח המופץ. הזרקו 1 מיקרוליטר של נגיף. להזריק את הנגיף בעומק אחד על מנת לא לשבור את האיטום בין המחט לרקמת קליפת המוח.
    1. פתרון בעיות: בתחילת ההזרקה, עלולה להתרחש זרימה חוזרת של הנגיף אל פני השטח של המוח. הפסק להזריק, המתן 2-3 דקות ולאחר מכן המשך בהזרקת הנגיף. חזור על פעולות אלה (שלבים) עד שהזרימה החוזרת של הנגיף תיפסק. וירוסים ונוזלי מוח השדרה יידבקו למחט וימנעו זרימה חוזרת.
    2. דרך נוספת לעצור את הזרימה החוזרת של הנגיף, לשים כמות קטנה של אגרוז על פני קליפת המוח. זה ידכא את פעימת קליפת המוח וגם יעזור לאטום את המחט. אך וודאו כי הפיפטה אינה סתומה על ידי האגרוז.
    3. מכיוון שייתכן שהמחט לא תעבור במלואה דרך הדורה מאטר כאשר היא מונמכת, אלא רק באופן חלקי, ייתכן שצד אחד של המחט לא יתאים היטב לדורה, מה שעלול לגרום לזרימה חוזרת של הנגיף. במקרה זה, משוך לאט את המחט מהרקמה ונסה להוריד אותה שוב.
  14. לאחר השלמת העירוי, שמור את המחט במיקום היעד למשך 10 דקות נוספות. זה מאפשר לנגיף להתפזר הרחק מאתר ההזרקה. הוצא את המחט מהמוח באיטיות כדי למנוע מהנגיף להציף בחזרה ממערכת המחט.
  15. לאחר השלמת משיכת המחט, בדוק שהיא אינה סתומה על ידי הוצאת טיפה קטנה של נגיף. סגור את חתך העור באמצעות 5-0 תפרים נספגים או לא נספגים.

5. טיפול לאחר הניתוח

  1. לאחר סגירת החתך יש למרוח משחה אנטיבקטריאלית באופן מקומי. יש להזריק תערובת של מי מלח (5 מ"ל/ק"ג) ו-5% גלוקוז (5 מ"ל/ק"ג) תת עורית כדי למנוע התייבשות ולהקל על ההחלמה לאחר ההרדמה. יש להזריק קטופרופן תוך שרירי (2.5 מ"ג/ק"ג) כדי להפחית את הכאב.
  2. הניחו את החיה בכלוב טרי על גבי כרית חימום ועקבו אחריה עד שהיא מתאוששת מההרדמה. לאחר שהעכבר מגיב, הניחו את החיה בכלוב הביתי שלהם.

6. היסטולוגיה

  1. לא לפני 21 יום לאחר הזרקת הנגיף יש להרדים עכברים עם איזופלורן כמתואר בשלב 3.
  2. בצע חתך בקו האמצע (10-15 מ"מ) לאורך אזור בית החזה בעזרת מספריים צרים וחשוף את חלל החזה. הפרד בזהירות את הסרעפת ופתח את החזה בעזרת מספריים.
  3. הכנס מחט 22G 1 1/2 לחדר השמאלי ובצע חתך באטריום הימני בעזרת מספריים. פרפיוז עם 50 מ"ל של 100 מ"מ מלח פוספט חוצץ (PBS) מקורר מראש, ואחריו 100 מ"ל של פורמלין 10% חוצץ מקורר מראש.
  4. חלץ בזהירות את כל מוח העכבר. לשם כך, בצע חתך סגיטלי לאורך מרכז הקרקפת בעזרת מספריים. לאחר מכן, הסר את עצם הגולגולת חתיכה אחר חתיכה באמצעות צבת עצם עם קצוות שטוחים החל מההצטלבות של התפרים הסגיטלים והלמבדואידים וממשיכים קדימה לעצם האף. כאשר המוח חשוף, חתכו את פקעות הריח, שחררו את המוח בעזרת מרית מעוקלת והשליכו אותו לתוך שפופרת של 50 מ"ל המכילה 10% פורמלין חוצץ.
  5. תקן את המוח בן לילה. הרכיבו את רקמת המוח על פלטפורמת מתכת של ויברטום באמצעות דבק רקמות. חותכים חלקים קדמיים בעובי של 50 מיקרומטר באמצעות להבי פלדת פחמן.

7. צביעה חיסונית

  1. יום 1
    1. שטפו את פרוסות המוח 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחת עם 1x PBS המכיל 0.3% טריטון X-100 (PBS-T). דגרו את החלקים ב-PBS-T למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    2. חסום קשירה לא ספציפית למשך שעה אחת ב-RT באמצעות מאגר חוסם המורכב מ-5% סרום עיזים רגיל (NGS) ו-0.3% טריטון X-100 ב-1x PBS.
    3. דגרו את החלקים למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד פרוואלבומין או קלבינדין מדולל 1:500 במאגר החוסם (5% NGS ו-0.3% טריטון X-100 ב-1x PBS).
  2. יום 2
    1. שטפו את החלקים 3 פעמים למשך 10 דקות ב-PBS-T. דגירה בחושך למשך שעתיים ב-RT עם נוגדנים משניים (עז נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 546) מדולל 1:500 במאגר החוסם (5% NGS ו-0.3% טריטון X-100 ב-1x PBS).
    2. שטפו את החלקים 3 פעמים למשך 5 דקות כל אחד ב-1x PBS. העבירו פרוסות מוח על שקופיות זכוכית בעזרת מברשת רכה.
    3. הוסף מיד 0.1 מ"ל של אמצעי הרכבה נגד דהייה לכל חלק. מכסים את הפרוסות בכיסוי בגודל 22 מ"מ על 50 מ"מ.
    4. הגדר את המיקרוסקופ הקונפוקלי להגדלה של פי 20 או פי 60 (A/1.4, שמן). השתמש בלייזרים באורכי גל של 488 ננומטר ו-594 ננומטר כדי לרכוש תמונות רב-ערוציות של אזורי המוח המעניינים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בסדרת ניסויים פיילוט, השתמשנו בשיטת ההזרקה התוך-קורטיקלית המסורתית כדי להמיר נוירונים פירמידליים בשכבה חמש בניאו-קורטקס העכבר על ידי AAV2 הנושא את הגן המהיר channelrhodopsin (oChIEF) שהתמזג עם חלבון פלואורסצנטי EGFP תחת מקדם CaMKII. בהתאם למאפיין האופייני של AAV212, קיבלנו אזור זיהום קטן יחסית, שרוחבו אינו עולה על 1 מ"מ (איור 1A). אולם בחלק מהניסויים ראינו התפשטות גדולה באופן יוצא דופן של AAV2, בחלק מהמקרים מכסה את הניאו-קורטקס של יותר ממחצית מחצי הכדור של המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פיתחנו שיטה חדשה להתמרת נוירונים ניאו-קורטיקליים של עכברים על ידי הזרקת תרחיף של חלקיקים נגיפיים AAV2 לחלל התת-עכבישי של המוח. זה מספק תפוצה נרחבת של הנגיף, כמעט פי ארבעה מנפח הרקמה הנגועה כאשר אותה כמות של וירוס מוזרקת ישירות לפרנכימה של המוח.

הזרקת וקטורים של נגיף ישירות לנוזל המוח השדרתי (CSF) דרך מסלולים שונים (למשל, תוך מוחי, תוך-מוחי, או תוך-ציסטרנלי) היא אסטרטגיה פופולרית להעברת גנים נרחבת ברחבי מערכת העצבים המרכזית 33,34,35.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

העבודה בוצעה בתמיכה כספית של קרן המדע הרוסית, מענק 20-15-00398P.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד
10 ומיקרו; מזרק אטום לגז L דגם 1701 RN (5 uL 75 RN המילטון מיקרו-מזרק)חברת המילטוןחלק / REF # 7634-01, המילטון או חתול מס. HAM7634-01, מרק
מחט RN 33 G, סגנון נקודה 3חברת המילטוןחלק / REF # 7803-05, המילטון
מיקרוסקופ דו-עיניניקון או מיקרומדדגם MC-4 ZOOM
מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר מבוסס Cernaמעבדות תור
מקור אור קרRWDדגם 76312
Leica VT1000 S מיקרוטום להב רוטטלייקה ביוסיסטמס76001-014
מערכת הרדמה בזרימה נמוכה עם ערכת התחלהקנט סיינטיפיק קורפוריישן13-005-111 (דגם SomnoSuite)
פיפטה מכנית 0.1 – 2.5 ומיקרו; ל אפנדורף מחקר פלוסאפנדורף3123000012
פיפטה מכנית 10 – 100 ומיקרו; ל אפנדורף מחקר פלוסאפנדורף3123000047
מכונת גילוח עכבריםRWDדגם CP-5200
מיקרו-מקדחה עם מקדחים (0.5 מ"מ, עגול)RWD78001, 78040
או מכשיר סטריאוטקסי דיגיטלי Desctop, מסכת הרדמה לעכבר, מוטות אוזניים לעכבר (60 מעלות)RWDדגמים 68027, 68665, 68306
מדחס אווירבמביב8
פיפטה ידנית חד ערוץ 0.5-10 ומיקרו; Lריין17008649
מכשיר סטריאוטקסי לבעלי חיים קטניםקופףדגם 962
מזרק סטריאוטקסיסטולטינג10-000-004
<חזק>מכשירים כירורגיים (כלים)
מחט דנטלית 30 גרם (Ni-pro)ביודנט בע"מלחתוך את הדורה
מגרד עצמותכלים מדעיים עדינים10075-16
צבת עצםכלים מדעיים עדינים16025-14להסרת עצם הגולגולת
מרית מעוקלתמפעל ציוד רפואי Mozhaiskלהוציא את המוח מהקמרון הגולגולתי
בור שינייםדרנדל + צוויילינגלקרניוטומיה; צורה: גליל בצורת אגס/קצה עגול/עגול; קוטר קצה: קוטר 0.55-0.8 מ"מ
מחזיק מחט (מחזיק מחט מיקרו Halsey)כלים מדעיים עדינים12500-12
תפר כירורגי מפוליפרופילן או תפר כירורגי ויקריל (5-0, נספג)מוצרי וולטר (אתיקון)S139044 (W9442)
ידית אזמל (# 3) עם להבי אזמל (#11)כלים מדעיים עדינים10003-12, 10011-00
מספריים (מספריים צרים במיוחד)כלים מדעיים עדינים14088-10לחתוך את העור
מספריים (מספריים עדינים)כלים מדעיים עדינים14094-11לחיתוך תפרים
תפר כירורגי פרולן (פוליפרופטלן)Ethicon (ג'ונסון & ג'ונסון)
פינצטה (מלקחיים #5)כלים מדעיים עדינים11252-20
פינצטה (מלקחיים מלוטשים של Inox)כלים מדעיים עדינים11210-20
<חזק>חד פעמי
מזרק אינסולין 1 מ"לSITEKMEDלהעמיס שמן וזלין למיקרו-מזרק, לתת תרופות
צלחת תרבית תאיםSPL מדעי החיים
צמר גפן
משקפי כיסויפישר סיינטיפיק12-545E
מחט מזרק אינסולין (27 גרם)SITEKMEDלהסרת דברים מחור (קרניוטומיה)
מגבונים ללא מוך CLEANWIPERנטלינק
שקופיות מיקרוסקופפישר סיינטיפיק12-550-15
מגבות ניירלוסקאן
פרפילםסטאטלאבSTLPM996
כפפות כירורגיות סטריליותדרמגריפ
מסנן מזרק סטרילי (0.2 μ m)קורנינג431229
<חזק>תרופות/כימיקלים (ריאגנטים)
10% פורמלין חומצי או 4% פרפורמלדהידכימיקלים תרמו סיינטיפיקJ61899. א.ק.
תמיסת אלכוהול של יוד (5%))חידוש
משחה אנטיביוטית Baneocin (בציטראצין + ניאומיצין)סנדוז.חומר אנטיבקטריאלי לשימוש חיצוני
אקווה פולימאונטמדעים רב-לאומיים18606-20
ג'ל עיניים Carbomer Vidisic (ג'ל עיניים)באוש+לומב (סנטן)
מיקרוספירות FluoSphere שעברו שינוי קרבוקסילט (אדום)תרמו פישר סיינטיפיקפ-8801
דקסמתזון (4 מ"ג/מ"ל)אלרה (KRKA)גלוקוקורטיקואיד סינטטי
מזוקק H2O
אתנול (70%)
פלקסופרופן 2.5% (קטופרופן)ויקתרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs)
תמיסת גלוקוז 5%סולופארם
עיזים נגד ארנב IgG (H+L) נספג צולב, Alexa Fluor 546תרמו פישר סיינטיפיקא-11010
איזופלורןקריזו
תמיסת לידוקאין (2% / 4%)סולופארם
סרום עיזים רגיל (NGS)אבקםאילן אלכסנדר
מי מלח חומציים פוספט (PBS)אקו-סרוויס
נוגדן ארנב נגד פרוואלבומיןמרק מיליפורAB15736
ארנב רקומביננטי מונוקלינלי נוגדן נגד קלבינדיןאבקםab108404
מי מלח (0.9% NaCl ב-H2O)סולופארם
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'50-178-1844
שמן וזליןג'נל

מקורות

  1. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).
  2. Sena-Esteves, M., Gao, G. Introducing Genes into Mammalian Cells: Viral Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (8), (2020).
  3. Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene Therapy with Viral Vectors. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 43 (1), 413-439 (2003).
  4. Paterna, J. C., Feldon, J., Büeler, H. Transduction profiles of recombinant adeno-associated virus vectors derived from serotypes 2 and 5 in the nigrostriatal system of rats. J Virol. 78 (13), 6808-6817 (2004).
  5. Monahan, P. E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus vectors for gene therapy: more pros than cons. Mol Med Today. 6 (11), 433-440 (2000).
  6. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21 (4), 583-593 (2008).
  7. Jooss, K., Chirmule, N. Immunity to adenovirus and adeno-associated viral vectors: implications for gene therapy. Gene Ther. 10 (11), 955-963 (2003).
  8. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L. 3rd, Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  9. Gao, G., Vandenberghe, L., Wilson, J. New Recombinant Serotypes of AAV Vectors. Curr Gene Ther. 5 (3), 285-297 (2005).
  10. Büning, H., Perabo, L., Coutelle, O., Quadt-Humme, S., Hallek, M. Recent developments in adeno-associated virus vector technology. J Gene Med. 10 (7), 717-733 (2008).
  11. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PloS One. 8 (9), e76310-e76310 (2013).
  12. Watakabe, A., et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex. Neurosci Res. 93, 144-157 (2015).
  13. de Solis, C. A., et al. Adeno-associated viral serotypes differentially transduce inhibitory neurons within the rat amygdala. Brain Res. 1672, 148-162 (2017).
  14. Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV Tropism in the Nervous System with Natural and Engineered Capsids. Meth Mol Biol. 1382, 133-149 (2016).
  15. Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
  16. Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
  17. Burger, C., et al. Recombinant AAV Viral Vectors Pseudotyped with Viral Capsids from Serotypes 1, 2, and 5 Display Differential Efficiency and Cell Tropism after Delivery to Different Regions of the Central Nervous System. Mol Ther. 10 (2), 302-317 (2004).
  18. Cearley, C. N., Wolfe, J. H. Transduction characteristics of adeno-associated virus vectors expressing cap serotypes 7, 8, 9, and Rh10 in the mouse brain. Mol Ther. 13 (3), 528-537 (2006).
  19. Klein, R. L., Dayton, R. D., Tatom, J. B., Henderson, K. M., Henning, P. P. AAV8, 9, Rh10, Rh43 vector gene transfer in the rat brain: effects of serotype, promoter and purification method. Mol Ther. 16 (1), 89-96 (2008).
  20. Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
  21. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  22. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  23. Abbott, S. B. G., et al. Photostimulation of retrotrapezoid nucleus phox2b-expressing neurons in vivo produces long-lasting activation of breathing in rats. J Neurosci. 29 (18), 5806-5819 (2009).
  24. Lawlor, P. A., Bland, R. J., Mouravlev, A., Young, D., During, M. J. Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates. Mol Ther. 17 (10), 1692-1702 (2009).
  25. Adamantidis, A. R., Zhang, F., de Lecea, L., Deisseroth, K. Optogenetics: Opsins and Optical Interfaces in Neuroscience. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (8), (2014).
  26. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat Protoc. 5 (3), 439-456 (2010).
  27. Passini, M. A., Watson, D. J., Wolfe, J. H. Gene Delivery to the Mouse Brain with Adeno-Associated Virus. Methods Mol Biol. 246, 225-236 (2004).
  28. Davidson, B. L., et al. Recombinant adeno-associated virus type 2, 4, and 5 vectors: Transduction of variant cell types and regions in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci. 97 (7), 3428-3432 (2000).
  29. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  30. Harris, K. D., Shepherd, G. M. G. The neocortical circuit: themes and variations. Nat Neurosci. 18 (2), 170-181 (2015).
  31. Carrillo-Reid, L., Yang, W., Kang Miller, J., Peterka, D. S., Yuste, R. Imaging and Optically Manipulating Neuronal Ensembles. Ann Rev Biophy. 46 (1), 271-293 (2017).
  32. Smirnov, I. V., et al. Plasticity of Response Properties of Mouse Visual Cortex Neurons Induced by Optogenetic Tetanization In Vivo. Curr Issues Mol Biol. 46 (4), 3294-3312 (2024).
  33. Snyder, B. R., et al. Comparison of Adeno-Associated Viral Vector Serotypes for Spinal Cord and Motor Neuron Gene Delivery. Human Gene Ther. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  34. Schuster, D. J., et al. Biodistribution of adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) vector after intrathecal and intravenous delivery in mouse. Front Neuroanat. 8, 42(2014).
  35. Bedbrook, C. N., Deverman, B. E., Gradinaru, V. Viral Strategies for Targeting the Central and Peripheral Nervous Systems. Ann Rev Neurosci. 41 (1), 323-348 (2018).
  36. Lo, W. D., et al. Adeno-Associated Virus-Mediated Gene Transfer to the Brain: Duration and Modulation of Expression. Human Gene Ther. 10 (2), 201-213 (1999).
  37. Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., McCown, T. J., Ju de Samulski, R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
  38. Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 55-73 (2009).
  39. Daci, R., Flotte, T. R. Delivery of Adeno-Associated Virus Vectors to the Central Nervous System for Correction of Single Gene Disorders. Int J Mol Sci. 25 (2), 1050(2024).
  40. Dasgupta, K., Jeong, J. Developmental biology of the meninges. Genesis. 57 (5), e23288-e23288 (2019).
  41. Mestre, H., Mori, Y., Nedergaard, M. The Brain's Glymphatic System: Current Controversies. Trends Neurosci. 43 (7), 458-466 (2020).
  42. Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
  43. Hordeaux, J., et al. Long-term neurologic and cardiac correction by intrathecal gene therapy in Pompe disease. Acta Neuropathol Comm. 5 (1), 66(2017).
  44. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
  45. Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood-brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. Mol Ther. 19 (8), 1440-1448 (2011).
  46. Radhiyanti, P. T., Konno, A., Matsuzaki, Y., Hirai, H. Comparative study of neuron-specific promoters in mouse brain transduced by intravenously administered AAV-PHP.eB. Neurosci Lett. 756, 135956(2021).
  47. Li, X., et al. Skin suturing and cortical surface viral infusion improves imaging of neuronal ensemble activity with head-mounted miniature microscopes. J Neurosci Meth. 291, 238-248 (2017).
  48. Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nat Comm. 10 (1), 4174(2019).
  49. Thomson, A. M. Neocortical layer 6, a review. Front Neuroanat. 4, 13(2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

AAV2
התמרה נרחבת של נוירונים ניאוקורטיקליים של עכברים על ידי הזרקה תת-עכבישית של AAV2
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.