הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שימוש בחיישנים ביולוגיים של תאים שלמים למדידת כספית יונית בדגימות מים

641 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68257

⸱

3 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Moléculas Individuales, Laboratorios de Investigación y Desarrollo, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 2Kenniscentrum AI, Erasmushogeschool Brussel, 3Open BioLab Brussels, Erasmushogeschool Brussel

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקולים לשימוש בשני חיישנים ביולוגיים של תאים שלמים (Mer-Blue ו-Mer-RFP) לגילוי כספית יונית. על ידי מתן נהלים מפורטים להפעלתם וניתוח התפוקה, המחקר נועד להקל על אימוץ רחב יותר ופיתוח נוסף של טכנולוגיות אלה לניטור מזהמים ספציפיים.

תקציר

חיישנים ביולוגיים של תאים שלמים (WCBs) הם פלטפורמות אינסטרומנטליות לגילוי ואפיון אלמנטים רגולטוריים ולקידום ביו-הנדסה. הם גם טומנים בחובם הבטחה עצומה לניטור סביבתי ומזון. בעוד שהושקעו מאמצים משמעותיים בשיפור הרגישות והניידות שלהם, הסטנדרטיזציה של הטיפול בהם וניתוח הנתונים נותרה לא מפותחת יחסית. מאמר זה מציג מדריך מקיף לשימוש בשני WCBs שפותחו לאחרונה, Mer-Blue ו-Mer-RFP, שהוכחו כמסוגלים לזהות כספית יונית ברמות מתחת למגבלות מי השתייה של ארגון הבריאות העולמי. הפרוטוקולים המפורטים כאן כוללים הכנת תרבית מיקרוביאלית, כיול חיישנים, רכישת נתונים וניתוח. עבור החיישן הביולוגי הפלואורומטרי Mer-RFP, נעשה שימוש במשפט הקצאת ביוסינתזה חדש כדי לזהות את מרווח הזמן למדידות מינון-תגובה אמינות ומדויקות. עבור החיישן הביולוגי הקולורימטרי Mer-Blue, מערך מצלמה בעלות נמוכה מאפשר מדידות קפדניות בסביבות חסרות ספקטרופוטומטרים ופלואורמטרים יקרים, מה שמקל על ניטור זיהום מבוזר. מתוארים ההליכים המשמשים לבדיקת דגימות מים מתוקים, ונדונות המגבלות של חיישנים ביולוגיים אלה ביחס לסוגי הדגימות. על ידי שיתוף טכניקות טיפול וניתוח אלה, אנו מעודדים קבוצות מחקר רחבות יותר לאמץ ולשפר את המכשירים הביולוגיים הללו לפיתוח פתרונות ניטור סביבתיים יעילים. בסופו של דבר, מחקר זה נועד להקל על אימוץ נרחב של טכנולוגיות חיישנים ביולוגיים בקהילת מדעי הסביבה, ולתרום לניטור יעיל ויעיל יותר של זיהום יסודות קורט במערכות אקולוגיות שונות.

מבוא

ככל שהחששות גוברים לגבי זיהום סביבתי ובטיחות אספקת המים והמזון, חיישנים ביולוגיים התגלו כחלופה אטרקטיבית ובמחיר סביר לשיטות כימיה אנליטיות מסורתיות. מתכות כבדות הן מזהמים רעילים ביותר שהפכו נפוצים יותר ויותר עקב פעילות אנושית 1,2,3,4. עם זאת, שיטות זיהוי קונבנציונליות5 הן לרוב יקרות ובלתי נגישות.

WCBs רגישים לכספית רותמים את הספציפיות והרגישות המדהימות של גורם השעתוק MerR 6,7,8. בתפקידו המקורי, MerR מווסת את הביטוי של חלבוני אפקטור, שפעילותם לניקוי רעלים מעניקה עמידות לכספית9. היכולת של MerR לווסת את ביטוי הגנים באופן תלוי כספית שימשה מחדש לוויסות חלבונים מדווחים במערכות גילוי כספית 10,11,12,13,14,15,16. למרות מחקר מבטיח, WCBs אלה עדיין לא אומצו לניטור בעולם האמיתי. גורמים כמו שבריריות ביולוגית, דרישות טיפול מיוחדות והיעדר פרוטוקולים סטנדרטיים וחומרי עזר מוסמכים עיכבו את היישום המעשי 17,18,19,20.

מערכת WCB לזיהוי כספית יונית פותחה באמצעות MerR בשילוב עם שני חלבוני דיווח שונים. Mer-Blue מבטא חלבון כרומוגני ומשמש כחיישן ביולוגי קולורימטרי, המאפשר זיהוי חזותי או מבוסס מצלמה. Mer-RFP, חיישן ביולוגי פלואורסצנטי, מאפשר ניטור רציף של הצטברות האות. על ידי בקרה קפדנית על תזמון החשיפה לדגימה בשלב הגידול, הושגה יכולת שחזור חזקה בשתי המערכות15.

מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים להפעלת הן Mer-Blue והן Mer-RFP, יחד עם ניתוח מקיף של יציאות האותות שלהם. עבור Mer-RFP, הניתוח מבוסס על משפט שהוצג לאחרונה של הקצאת ביוסינתזה של חלבון21. עבור Mer-Blue, ניתן לבצע דיגיטציה של ניתוח קולורימטרי באמצעות תוכנת עיבוד תמונה כגון ImageJ. כדי להבטיח הגדרות עקביות של רכישת תמונות, מוצגת מצלמת עשה זאת בעצמך בעלות נמוכה בשם PelletCam. בשני המקרים, תוכנה אוטומטית מסופקת כדי להקל על התפעול. על ידי שיתוף מתודולוגיות ניסוי נגישות וסטנדרטיות וטכניקות ניתוח נתונים, מעודדים אימוץ רחב יותר של WCBs לפיתוח פתרונות ניטור מבוססי חיישנים ביולוגיים אמינים וחסכוניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת תמיסות כספית יוניות

  1. שקלו מסה קטנה של אבקת HgBr2 (בדרך כלל בין 0.1 ל-0.2 גרם) באמצעות כפפות מגן מתאימות ומסכה למניעת שאיפה וחשיפה לעור.
  2. חשב את כמות המים הדרושה לקבלת תמיסה של 4 מ"מ על ידי המסת המסה הנמדדת של אבקה מוצקה ב- ddH2O באמצעות הנוסחה:
    figure-protocol-1
    הערה: הנפח הצפוי קרוב ל-100 מ"ל; ניתן להשתמש בנוסחה פשוטה:
    figure-protocol-2
    1. לחלופין, בעת שימוש ב-HgCl2, החל את הנוסחה:
      figure-protocol-3
  3. יש לאחסן את תמיסת המלאי בכלי אטום הרמטית בסביבת קירור (4 מעלות צלזיוס) למניעת אידוי.
  4. הכן דילולים סדרתיים לפני כל בדיקת טיטרציה, החל מ-1 מ"ל של 2 מ"מ כספית2+ ודילול עד 40 ננומטר, כפי שמוצג בטבלה 1.
    הערה: ריכוז הכספית היונית עשוי להשתנות במהלך האחסון, ככל הנראה עקב הפחתה ספונטנית ואידוי של כספית יסודית (Hg°). למרות שקירור ושימוש במיכלים הרמטיים איכותיים עשויים להפחית את ההשפעות הללו, הימנע משימוש בתמיסות המאוחסנות במשך יותר מ-6 שבועות - במיוחד עבור ריכוזים של 250 ננומטר של Hg2+ ומטה.

2. הכנת M9 בינוני

  1. ממיסים אבקות ריאגנטים בצלוחיות נפרדות באמצעות מים טהורים במיוחד להכנת תמיסות המלאי הבאות: M9 5×, 1 M MgSO4, 1 M CaCl2, 20% (w/v) גלוקוז ו-20% (w/v) חומצות קסאמינו.
  2. בבקבוק זכוכית של 500 מ"ל או 1 ליטר, מערבבים 50 מ"ל של M9 5×, 2.5 מ"ל של 20% (w/v) חומצות קסאמינו, ומוסיפים מים טהורים במיוחד כדי להגיע לנפח כולל של 246.475 מ"ל.
  3. חיטוי התערובת ותמיסות המלאי המפורטות לעיל ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  4. אפשר לכל התמיסות להתקרר לחלוטין כדי למנוע משקעים של CaCl2.
  5. מוסיפים לתערובת המצוננת: 25 מיקרוליטר של 1 M CaCl2, 500 מיקרוליטר של 1 M MgSO4 ו-3 מ"ל של 20% (w/v) גלוקוז.
    הערה: התוצאה היא מדיום M9 עשיר בתוספת עם הריכוזים הסופיים הבאים: 0.24% (w/v) גלוקוז, 0.2% (w/v) חומצות קסאמינו, 2 מ"מ MgSO4, 1 מ"מ CaCl2, 3 גרם/ליטר KH2PO4, 0.5 גרם/ליטר NaCl, 6.78 גרם/ליטר Na2HPO4, 1 גרם/ליטר NH4Cl.

3. הפעלת החיישן הביולוגי Mer-Blue / Mer-RFP

  1. השתמש בתאי Escherichia coli DH5α שעברו טרנספורמציה עם הפלסמיד pUC-Mer-RFP או pUC-Mer-Blue (ראה טבלת חומרים).
  2. מכינים צלחת פטרי LB-אגר המכילה 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין.
  3. תאי זרעים ממאגר גליצרול שמור בהקפאה על צלחת LB-אגר בשיטת הפסים.
  4. דוגרים את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
  5. למחרת, בחרו מושבה בודדת מלוח ה-LB-אגר כדי לחסן תרבית של 10 מ"ל באמצעות מדיום M9 (איור 1A).
  6. דגרו את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול מתמיד ב-220 סל"ד במהלך הלילה (~16 שעות) (איור 1B).

4. ניסוי טיטרציה באמצעות Mer-RFP

  1. מדוד את הצפיפות האופטית של תרבית חיידקי הלילה ב-600 ננומטר (OD600).
  2. חשב את נפח תרבית הלילה הנדרש כדי להגיע ל-OD600 של 0.05 בנפח כולל של 10 מ"ל של מדיום M9 טרי באמצעות הנוסחה:
    figure-protocol-4
    כאשר C1 הוא ה-OD600 של תרבית הלילה, ו-V1 הוא הנפח שיש לקחת ממנו.
  3. צנטריפוגה V1 מ"ל של קדם החיסון ב 3500 × גרם למשך 5 דקות. השליכו את מדיום ה-M9 הישן והשעו מחדש את הגלולה החיידקית ב-10 מ"ל של מדיום M9 טרי (איור 1C).
  4. הוסף 195 מיקרוליטר של התרבית המושעה לכל באר של מיקרו-צלחת של 96 בארות. ודא שכל מיקרו-תרבית מוכנה בשלוש עותקים למדידות מדויקות.
  5. הוסף 5 μL של תמיסות כספית יוניות של 40 nM עד 40 μM, כמתואר בשלב 1, לכל באר כדי להשיג ריכוזים סופיים הנעים בין 1 nM ל- 1 μM (איור 1D).
  6. הנח את המיקרו-לוח בקורא מיקרו-פלטות רב-מצבי עם בקרת טמפרטורה, מוגדר לפרמטרים הבאים (איור 1E) - טמפרטורה: 37 מעלות צלזיוס, רעידות: טלטול קבוע ב-60 סל"ד, מרווח זמן: קרא כל 15 דקות למשך 16 שעות, מדידת צפיפות אופטית: קרא ב-600 ננומטר, מדידת פלואורסצנטיות: עירור ב-570 ננומטר ופליטה ב-615 ננומטר.
  7. לאחר השלמת תקופת הדגירה של 16 שעות, אספו את הנתונים מקורא המיקרו-פלטות (איור 1F).

5. ניתוח נתונים לתוצאות Mer-RFP

  1. השתמש בתוכנת גיליונות אלקטרוניים מועדפים או בכלי ניהול נתונים כדי להמחיש ערכי OD600 גולמיים לאורך זמן עבור כל התרבויות הבודדות (איור 1G). ודא שסוף שלב הפיגור ותחילת השלב הנייח מתרחשים בערך באותו זמן על פני כל השכפולים בכל תנאי ריכוז כספית. אל תכלול תרביות שסוטות ביותר משעה אחת מהתזמון הממוצע.
  2. חשב את ה-ODהממוצע 600 עבור כל נקודת זמן על פני כל השכפולים בכל תנאי ריכוז כספית. עבור כל מצב תרבית משולש, עקומת צמיחה OD600 ממוצעת אחת ושלוש תפוקות עוצמה פלואורסצנטיות יהיו זמינות בנקודות זמן שונות.
  3. שרטט את ה-OD הממוצע600 לעומת הגיע הזמן לתרבית ללא כספית. זהה ובחר חזותית את מרווח הזמן שבו קצב הגידול חיובי (ראה איור 2). אל תכלול את נקודות הנתונים הנותרות מכל התרבויות.
  4. עבור כל תרבית, חשב את קצב הגידול הספציפי בכל נקודת זמן על ידי מציאת השינוי ב-OD600 מנקודת הזמן הקודמת וחלוקת השינוי בערך OD600 באותה נקודת זמן, באמצעות הנוסחה הבאה:
    figure-protocol-5
  5. באופן דומה, חשב את קצב ייצור הקרינה הספציפי עבור כל תרבית על ידי מציאת השינוי בעוצמת הקרינה מנקודת הזמן הקודמת וחלוקת השינוי בערך OD600 באותה נקודת זמן, באמצעות הנוסחה:
    figure-protocol-6
  6. עבור כל תרבית, שרטטו את קצב הגידול הספציפי מול קצב ייצור הקרינה (ראו איור 3). זהה טווח ליניארי בנקודות הזמן המאוחרות. אל תכלול נקודות זמן מוקדמות עד להשגת רגרסיה ליניארית עם ה-R2 הגבוה ביותר, המבוסס על מינימום של 12 נקודות (כ-3 שעות).
    הערה: השיפוע של רגרסיה ליניארית זו מייצג את שבר הביטוי, כלומר, החלק של סינתזת החלבון הכוללת המוקצה לחלבון המדווח21.
  7. עבור כל התרבויות, חלץ מגמות ליניאריות מאותו מרווח זמן בערך ורשום את ערך השיפוע עבור כל תנאי.
    הערה: השגת ערך R2 הגבוה ביותר האפשרי בכל התרבויות המשתמשות באותו מרווח זמן עשויה לדרוש ניסיונות מרובים. לניתוח אוטומטי, מחברת Jupyter הבאה (מסגרת Google Colab) זמינה בכתובת https://github.com/frank-britto/Mer_RFP. מחברת זו משמשת כתבנית לאופטימיזציה של מיצוי מגמות ליניאריות ופרופיל מינון-תגובה נוסף.
  8. קח את השיפוע הממוצע על פני שכפולים עבור כל ריכוז כספית.
  9. שרטט את ערכי השיפוע הממוצעים מול ריכוז הכספית (ראה איור 4A). התאם את הפונקציה Hill לנתונים:
    figure-protocol-7
    כאשר: fRFP הוא שבר הביטוי עבור חלבון פלואורסצנטי אדום, H מייצג את הביטוי המקסימלי האפשרי למעגל, [Hg2+] הוא ריכוז הכספית היונית, kHg קשור לזיקה לכספית יונית, n הוא מקדם היל המבטא את שיתוף הפעולה של התגובה ל-Hg2+.

6. ניסוי טיטרציה באמצעות חיישן ביולוגי Mer-Blue

  1. צנטריפוגה תרבית צפופה בן לילה המתקבלת כמתואר בשלב 3 ב-3,500 × גרם למשך 10 דקות.
  2. השליכו את מדיום ה-M9 המושקע והשעו מחדש את הגלולה החיידקית במדיום M9 טרי ל-OD600 של 1.0. ודא שמתקבל מינימום של 5 מ"ל של תרבית בצפיפות זו (איור 1C).
    הערה: אם ספקטרופוטומטר אינו זמין, הערך את התנאים הראשוניים על ידי השעיית הגלולה החיידקית בנפח של מדיום M9 טרי השווה לכפול מהנפח המקורי של התרבית הצפופה.
  3. הוסף 9.5 מ"ל של M9 בינוני ו-10 מיקרוליטר של תמיסת מלאי אמפיצילין של 100 מ"ג/מ"ל לצינורות תרבית זכוכית מעוקרים (איור 1H).
  4. יש לחסן את מדיום ה-M9 הנוסף ב-500 מיקרוליטר של תרבית החיישן הביולוגי שהוכנה בשלב 6.2 (OD600 = 1.0).
  5. הוסיפו 10 מיקרוליטר מתמיסות הכספית היוניות המוכנות (ראו שלב 1) כדי להגיע לריכוזים סופיים של 0 ננומטר, 1 ננומטר, 2 ננומטר, 5 ננומטר, 10 ננומטר, 25 ננומטר, 50 ננומטר, 100 ננומטר, 125 ננומטר ו-250 ננומטר.
  6. דגרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות עם ניעור נמרץ ב-220 סל"ד (איור 1I).

7. איסוף וניתוח נתונים לתוצאות Mer-Blue

  1. העבירו כ-1.3 מ"ל מכל תרבית למיקרו-שפופרת של 1.5 מ"ל (איור 1J).
  2. צנטריפוגה את המיקרו-צינורות במהירות מרבית למשך 3 דקות כדי להשיג כדורים הדוקים. השליכו את הסופרנטנט.
  3. (אופציונלי) כדי להשיג כדורים גדולים יותר, חזור על צנטריפוגה והסרת סופרנטנט עד שש פעמים.
  4. צלמו את החלק התחתון של כל מיקרו-צינורית, תוך התמקדות בגלולה (איור 1K). השתמש במחזיק מיקרו-צינור ובחצובה או ב-PelletCam (ראה שלב 8) כדי להבטיח הגדרות כיוון, תאורה וצבע עקביות וניתנות לשחזור בכל התמונות (ראה איור 5).
  5. קבעו את ערכי עוצמת הצבע של כל תמונת כדורגלת בערוצים האדום, הירוק והכחול (RGB).
    1. בשעת שימוש ב- ImageJ: טען את התמונה ונווט אל Image > Type > RGB Stack ליצירת אוסף של שלוש פרוסות (ערוצים אדומים, ירוקים וכחולים). השתמשו בכלי הבחירה כדי לצייר אזור עניין (ROI) סביב אזור הגלולה. נווט אל ניתוח > מדידה כדי לקבל את ערכי העוצמה הממוצעת עבור האזור שנבחר בכל ערוץ.
    2. בשעת שימוש ב- PelletCam: פתחו את קובץ .csv הכולל ערכי עוצמת צבע ממוצעים לאזור מייצג של תשעה פיקסלים בתמונת הגלולה.
  6. חשב את תגובת החיישן הביולוגי עבור כל דגימה על ידי חישוב המרחק האוקלידי במרחב RGB ביחס לתמונת כדור ייחוס לבנה ( E. coli לא מותמר), כפי שתואר קודםלכן 22, באמצעות המשוואה:
    figure-protocol-8
    כאן, דגימת R,דגימת G ודגימת B מייצגים את עוצמות הצבע הממוצעות מכל ערוץ RGB באזור שנבחר של תמונת הגלולה מהדגימה של החיישן הביולוגי, בעוד ש-R ref, Gref ו-Bref מציינים את הערכים המתאימים עבור גלולת ייחוס של E. coli שאינו מותמר.
  7. שרטט את המרחקים האוקלידיים המחושבים מול ריכוזי הכספית היונית המתאימים (ראה איור 6). התאם פונקציית Hill לנתונים (ראה איור 4B) באמצעות המשוואה הבאה:
    figure-protocol-9
    כאן, E הוא המרחק האוקלידי, H מייצג את הצבע המקסימלי האפשרי עבור המעגל, [Hg2+] הוא ריכוז הכספית היונית, kHg קשור לזיקה לכספית יונית, ו-n הוא מקדם היל המבטא את שיתוף הפעולה של התגובה ל-Hg2+.

8. בניית PelletCam

  1. הורד את הקבצים לבניית מערכת מיקרו-בקר סגורה למדידת צבע בכדורי חיידקים מהאתר (https://github.com/EhbAIGit/PelletCam-OPENBIOLAB-AI).
    הערה: ידע בסיסי בחיתוך לייזר, הדפסת תלת מימד, ESP32 וארדואינו מועיל. מדריך מבוא ל-ESP32-CAM זמין בכתובת (https://lastminuteengineers.com/getting-started-with-esp32-cam/?utm_content=cmp-true). מומלץ לרכוש את ה-ESP32-CAM יחד עם מתאם ה-MB לתכנות קל יותר. למשתמשים שאינם מכירים את ה-ESP32, מומלץ לעקוב אחר המדריך https://lastminuteengineers.com/esp32-arduino-ide-tutorial/ תחילה.
  2. השתמש בקובץ LasercutterBox.ai כדי לחתוך ולחרוט מולטיפלקס 3 מ"מ עם חותך לייזר.
  3. בנה את החלקים מקובץ ESP32SET.stl עם מדפסת תלת מימד. ניתן לייבא קובץ .stl זה ישירות על ידי כמעט כל תוכנות מדפסת התלת מימד; לדוגמא, סטודיו במבו (https://bambulab.com/en/download/studio).
  4. התקן את ESP32 (ESP32-CAM-MB 2640 WiFi Bluetooth-camera מודול) על ידי הצבת .cpp ו -.h ו -.ino files בתיקיה אחת. לאחר מכן, פתח את קובץ ה - .ino עם תוכנת Arduino IDE ולחץ על >העלה. לאחר ההעלאה, ה-ESP32 יתחיל אוטומטית.
  5. בשלב זה, המשתמש אמור להיות מסוגל להתחבר לנקודת הגישה ל-WiFi בשם >PELLET ולסיסמה >PELLETCAM, כמפורט בקובץ .ino של ה-ESP32. כתובת ה-IP של ה-PelletCam תוצג בצג הטורי של ה-Arduino IDE. פתח דפדפן אינטרנט ונווט לכתובת: http://192.168.4.1.
    הערה: פעולה זו תאפשר view התמונה או לצלם תמונה חדשה (>CAPTURE PHOTO), לסובב את התמונה (>ROTATE) או להגדיר את הבהירות של פס ה-LED (>נוריות).
  6. חבר את ה-ESP32 Arduino לפס ה-LED (NeoPixel Stick - 8 x 5050 RGB LED עם דרייברים משולבים) וכבל USB 5V בהתאם לתוכנית בקובץ InstallationManual.pptx.
  7. השתמש באקדח דבק כדי להדביק את פס ה-ESP32 וה-LED לתומכים המודפסים בתלת מימד.
  8. הכנס מיקרו-שפופרת עם תחתית צבעונית (או גלולה חיידקית) בחזית המודפסת בתלת מימד של ה-PelletCam. מקם את תומך ה-ESP32-LED כ-5 ס"מ נוסף וצלם תמונה דרך webעמוד. אם מתקבלת תמונה חדה ומוארת כהלכה, הדביקו את תומך ה-ESP32-LED בתחתית קופסת העץ. אם לא, כוונן את המרחק בין החלק הקדמי לתמיכת ESP32-LED וחזור על ההליך עד לקבלת מרחק מספק.
  9. הרכיבו את הקופסה באמצעות נייר דבק והדבקת כל החלקים יחד עם דבק עץ.
  10. חבר את ה-PelletCam באמצעות כבל ה-USB לספק כוח USB שיכול לספק לפחות 1 A.
    הערה: הקפד להתקין את Python 3.9 או גרסה מתקדמת יותר.
  11. פתח שורת פקודה או חלון מסוף. נווט אל הספרייה המכילה את קובץ pellet.py . הפעל את הסקריפט באמצעות הפקודה >python pellet.py.
  12. אם סקריפט pellet.py לא יכול לרוץ, ייתכן שזה נובע מספריות Python חסרות. התקן את הספריות הנדרשות באמצעות הפקודה >pip install pillow tkinter pathlib statistics. לקבלת הדרכה נוספת להגדרת מערכת משלך, עיין במסמך PelletCam Example.docx.

9. מדידת דגימות מים סביבתיות

  1. אסוף דגימות ממקורות סביבתיים כגון נהרות או בריכות ואחסן אותן במיכלים אטומים בטמפרטורות נמוכות כדי למזער את האידוי. לפרטים, עיין בסעיף דיון.
  2. צנטריפוגה של הדגימות ב-3,500 × גרם למשך 10 דקות כדי לסחוט חול ופסולת אורגנית, ולבודד את החלק הימי.
  3. עקר את הדגימה המובהרת באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר.
    הערה: הימנע מעיקור בחום, מכיוון שהכספית נדיפה ועלולה להתאדות במהלך התהליך.
  4. (אופציונלי) הכן מנה מחומצת נפרדת על ידי הוספת 5% HCl למדידה עצמאית באמצעות טכניקות כימיה אנליטיות סטנדרטיות. השתמש רק בדגימה הלא מחומצת לבדיקות חיישנים ביולוגיים.
  5. מערבבים 5 מ"ל מהדגימה הסביבתית המסוננת סטרילית עם 4.5 מ"ל של מדיום 2× M9, וכתוצאה מכך דילול של 1:2 של הדגימה.
  6. יש לחסן את תערובת הדגימה המדוללת ב-0.5 מ"ל של תרבית לילה (שהוכנה כמתואר בשלב 5.4). חיסון זה מתאים לדילול של פי 20 של התרבית, ומניב OD600 של 0.05 כדי להתחיל את הבדיקה.
    1. אם משתמשים ב-Mer-RFPTransfer 200 מיקרוליטר מתערובת הדגימה-בינונית לבאר מיקרופלייט והתחל מדידות באמצעות קורא מיקרופלייט כמתואר בשלב 3.6.
    2. אם משתמשים ב-Mer-Blue: דגרו את התערובת הבינונית של 10 מ"ל ב-37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות עם ניעור נמרץ ב-220 סל"ד, כמתואר בשלב 5.6.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שני החיישנים הביולוגיים אינם מציגים ביטוי בסיסי ניתן לזיהוי של חלבוני המדווח שלהם בתנאים נטולי כספית. תרביות Mer-Blue מתחילות בדרך כלל להציג צבע גלוי לעין בלתי בין 6-8 שעות לאחר החיסון בריכוזי HgBr2 של 25 ננומטר ומעלה. כאשר הם נערכים כראוי, ניסויי טיטרציה המשתמשים ב-Mer-RFP או Mer-Blue מניבים תגובות המתאימות לפונקציית היל עם מקדם היל קרוב ל-1, מה שמעיד על התנהגות קשירה לא שיתופית23.

Mer-RFP הציג טווח זיהוי אמין מ-1 ננומטר עד 1 מיקרומטר HgBr2. ב-2 מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מעגלי החיישנים הביולוגיים המשמשים כאן זהים, נבדלים רק בחלבון המדווח. שניהם מקודדים לחלוטין על פלסמידים בעלי עותק גבוה, מה שמאפשר את פריסתם בתאי Escherichia coli של זנים שונים. בזמן תפקוד בתאי זן E. coli B, נצפה אות צבעוני חזק יותר מ-Mer-Blue בזני K-12, במיוחד DH5α ותאי E. coli בעלי יכולת כימית15.

ראינו כי השגת תפוקה אמינה דורשת צפיפות תאים משמעותית בזמן החשיפה לכספית יונית. ניתן להשיג זאת על ידי התחלת התרבית ב-OD600 של 0.05 או 0.1, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

מחקר זה מוצג הודות לתמיכתה של התוכנית הלאומית למחקר מדעי מדעי ואקדמי Avanzados PROCIENCIA באמצעות התוכנית EF-041-2024-01 "Proyectos de Investigación aplicada", חוזה מענק PE501086520-2024-PROCIENCIA. הפיתוח של חיישני הכספית הביולוגיים מומן על ידי VLIR-UOS באמצעות קוד המענק של יוזמת הדרום PE2020SIN292B122. M.D. מודה ל-VLIRUOS, DGD ולמועצת האוניברסיטאות הפלמיות למדעים שימושיים ואמנויות על מענק XREI במסגרת פרויקט Global Minds BE2017GMHVLHC106.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עץ מולטיפלקס בעובי 3 מ"ממפיצים
כבל USB 5 Vמפיצים
96 בארות שקוף שטוח תחתון פוליסטירן מטופל TC מיקרופלטותקורנינג3599
אגר HiMediaGRM026
AmpicillinGold Biotechnology, Inc.A-301-100
CaCl2Millipore208290
חומצות קסאמינוCalbiochem2040OP
D-(+)-גלוקוזסנטרל בית תרופות (P) בע"מ506250
ESP32-CAM-MB 2640 Bluetooth WiFi מצלמה מודול USB לטורי יציאה פיתוח לוח הורדה אוטומטית (סוג C)מפיצים
צינורות תרבות זכוכיתקורנינג9825
HgBr2, כספית(II) ברומידMerck200085
HgCl2, כספית(II) כלורידMerck21465
מרק לוריא (מילר)Sigma-AldrichL3522
M9 מלחי מינימוםSigma-AldrichM6030
MgSO4HiMediaGRM684
NeoPixel Stick - 8 x 5050 RGB LED עם דרייברים משולביםAdafruit1426
פלסמיד: pUC-Mer-Blue הקבוצתי המלא שלנוזמין
בפלסמיד https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1: pUC-Mer-RFP הקבוצתי המלא שלנוזמין במסנני מזרק
https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1, הידרופילי, גודל נקבוביות 0.22 מיקרוןMilliporeSLGV004SLלעיקור דגימות סביבתיות.
רביםרביםרביםהרצף הרצף

מקורות

  1. Cooke, C. A., Balcom, P. H., Biester, H., Wolfe, A. P. Over three millennia of mercury pollution in the Peruvian Andes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (22), 8830-8834 (2009).
  2. Gautam, R. K., Sharma, S. K., Mahiya, S., Chattopadhyaya, M. C. Contamination of heavy metals in aquatic media: transport, toxicity and technologies for remediation. Heavy Metals in Water: Presence, Removal and Safety. Sharma, S. K. , Royal Society of Chemistry. Cambridge. 1-24 (2014).
  3. Chen, C. Y., et al. A critical time for mercury science to inform global policy. Environ Sci Technol. 52 (17), 9556-9561 (2018).
  4. Ali, H., Khan, E., Ilahi, I. Environmental chemistry and ecotoxicology of hazardous heavy metals: environmental persistence, toxicity, and bioaccumulation. J Chem. 2019, 6730305(2019).
  5. Gao, Y., et al. Determination and speciation of mercury in environmental and biological samples by analytical atomic spectrometry. Microchem J. 103, 1-14 (2012).
  6. Ralston, D. M., O'Halloran, T. V. Ultrasensitivity and heavy-metal selectivity of the allosterically modulated MerR transcription complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3846-3850 (1990).
  7. Brown, N. L., Stoyanov, J. V., Kidd, S. P., Hobman, J. L. The MerR family of transcriptional regulators. FEMS Microbiol Rev. 27 (2-3), 145-163 (2003).
  8. Wang, D., et al. Structural analysis of the Hg(II)-regulatory protein Tn501 MerR from Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 6, 33391(2016).
  9. Nucifora, G., Chu, L., Silver, S., Misra, T. K. Mercury operon regulation by the merR gene of the organomercurial resistance system of plasmid pDU1358. J Bacteriol. 171 (8), 4241-4247 (1989).
  10. Cai, S., et al. Engineering highly sensitive whole-cell mercury biosensors based on positive feedback loops from quorum-sensing systems. Analyst. 143 (3), 630-634 (2018).
  11. Guo, M., et al. Using the promoters of MerR family proteins as "rheostats" to engineer whole-cell heavy metal biosensors with adjustable sensitivity. J Biol Eng. 13, 70(2019).
  12. Wang, D., et al. Engineered cells for selective detection and remediation of Hg2+ based on transcription factor MerR regulated cell surface displayed systems. Biochem Eng J. 150, 107289(2019).
  13. Wang, D., et al. Visual detection of Hg2+ by manipulation of pyocyanin biosynthesis through the Hg2+-dependent transcriptional activator MerR in microbial cells. J Biosci Bioeng. 129 (2), 223-228 (2020).
  14. Guo, Y., Hui, C., Liu, L., Chen, M., Huang, H. Development of a bioavailable Hg(II) sensing system based on MerR-regulated visual pigment biosynthesis. Sci Rep. 11, 13516(2021).
  15. Zevallos-Aliaga, D., et al. Highly sensitive whole-cell mercury biosensors for environmental monitoring. Biosensors. 14 (1), 246(2024).
  16. Zhang, N. -X., et al. Versatile artificial mer operons in Escherichia coli towards whole-cell biosensing and adsorption of mercury. PLoS One. 16 (5), e0252190(2021).
  17. Chen, Y., et al. Advances in bacterial whole-cell biosensors for the detection of bioavailable mercury: a review. Sci Total Environ. 868, 161709(2023).
  18. Chen, S., Chen, X., Su, H., Guo, M., Liu, H. Advances in synthetic-biology-based whole-cell biosensors: principles, genetic modules, and applications in food safety. Int J Mol Sci. 24 (7), 7989(2023).
  19. Yu, W., et al. Genetically encoded biosensors for microbial synthetic biology: From conceptual frameworks to practical applications. Biotechnol Adv. 62, 108077(2023).
  20. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (6), 2000187(2020).
  21. Vaccari, N. A., Zevallos-Aliaga, D., Peeters, T., Guerra, D. G. Biosensors characterisation: Formal methods from the perspective of proteome fractions. Synth Biol. 10 (1), ysaf002(2025).
  22. Liljeruhm, J., et al. Engineering a palette of eukaryotic chromoproteins for bacterial synthetic biology. J Biol Eng. 12, 8(2018).
  23. Alon, U. An Introduction to Systems Biology. , Chapman and Hall/CRC. Boca Raton. (2019).
  24. Lineweaver, H., Burk, D. The determination of enzyme dissociation constants. J Am Chem Soc. 56 (3), 658-666 (1934).
  25. Wyatt, L., et al. Spatial, temporal, and dietary variables associated with elevated mercury exposure in Peruvian riverine communities upstream and downstream of artisanal and small-scale gold mining. Int J Environ Res Public Health. 14 (12), 1582(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.