ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעינים טריגמינליים שלמים

נוירונים חושיים ראשוניים מעצבבים ישירות רקמות, כולל העור, ומעבירים אותות חושיים למערכת העצבים המרכזית (חוט השדרה או גזע המוח). נוירונים של גנגליון טריגמינלי (TG) מעצבבים את הראש ומגיבים לגירויים חושיים, כולל כאבים מהשיניים, האזור הפריאורביטלי, אזורי הפה והגולגולת, המפרק הטמפורומנדיבולרי ^1,2 וקרומי המוח ^3,4,5. נוירונים TG משתנים בגודל, ברמת המיאלינציה ובפרופילי ביטוי הגנים 6,7,8,9. נוירונים קטנים יותר הם נוסיספטיביים, בעוד שתאי עצב גדולים יותר מגיבים בדרך כלל לגירויים מכניים לא כואבים^10,11. תפקוד לקוי של נוירונים של גנגליון טריגמינלי יכול לעורר רגישות הן לנוירונים עצמם והן לנוירונים חושיים של מערכת העצבים המרכזית (CNS)^11,12.

בהקשר פיזיולוגי רגיל בתנאים לא פתולוגיים, ירי נוירונים in vivo הכרחי לכאב, אך עד שני העשורים האחרונים, כלים לחקר גנגליונים חושיים שלמים in vivo הוגבלו לניטור יחסית מעט נוירונים^בכל פעם. בשל ריכוזי סידן ציטופלזמיים נמוכים בדרך כלל, זרם סידן במהלך פוטנציאל הפעולה והשימוש בסידן כאות ציטופלזמי, דינמיקת סידן היא תחליף רב עוצמה לניטור פוטנציאל פעולה או פעילות תאית in vivo באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן. הרציונל לשיטה זו הוא שמיקרוסקופיה פלואורסצנטית יכולה לנטר בו זמנית אינדיקטורים אלה במאות עד אלפי נוירונים בו זמנית בגרעינים חושיים היקפיים של עכברים 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ו חולדות ^25,26. זהו יתרון רב עוצמה על פני שיטות שיכולות לנטר מספר מוגבל יותר של נוירונים in vivo.

מטרת שיטה זו היא תצפית ישירה על דינמיקת Ca²⁺ ציטופלזמית in vivo ב-TG בתגובה לגירויים מכניים, טמפרטורה, כימיים והורמונליים במודלים של כאבי ראש 19,23,24. שיטה זו יכולה לשמש כהשלמה לכאב או לבדיקות סומטוסנסוריות אחרות באזור הפה והפנים. נעשה שימוש בהדמיית Ca²⁺ in vivo trigeminal לאפיון קידוד תרמי וחושי^19,22, לימוד מחלקות של קולטנים מכניים²⁷, גילוי מחלקה חדשה של נוירון רגיש למכניקה²⁸, ניטור תגובות טריגמינליות ללחצים מכניים רגילים על קרומי המוח²⁹, חקר השפעות ההורמונים על רגישות לכאב²⁴, אפיון מודלים של כאב פה ופנים³⁰ותורמים למחקר לכאב הנגרם על ידי גמילה מאלכוהול²³.,

עכברי Pirt-GCaMP3 מאפשרים ניטור של פעילות עצבית in vivo מכיוון שיש להם חיישן Ca²⁺ GCaMP3 מוחדר לאזור המקדם של הגן Pirt, אשר מתבטא מאוד בכל (>95%) נוירונים חושיים ראשוניים^12,18. מאמר זה מדגים טכניקה לביצוע חשיפה כירורגית in vivo TG ואיסוף וניתוח של נתוני מיקרוסקופיה של אינדיקטור סידן עבור TG בצד ימין של עכברי Pirt-GCaMP3 באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

כל ההליכים המתוארים כאן מבוצעים על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. הניתוח אינו הישרדותי. יש לבצע את סעיפים 1 ו-2 של הליך זה מיד עם ההתחלה. סעיף 3 עשוי להתבצע במועד מאוחר יותר.

1. אבטחה וניתוח של העכבר להדמיית TG בצד ימין

הערה: עכברי Pirt-GCaMP3 C57BL/6J¹⁸ צריכים להיות בגודל גוף מבוגר (בדרך כלל 8 שבועות ומעלה), ללא קשר למין. הדמיית TG דו-צדדית אפשרית. הזמנים המפורטים כאן הם הערכות של טכנאי מנוסה. אם הדימום הוא יותר מהרגיל, זה עשוי לקחת מספר דקות יותר לכל זמן נתון.

1. הכינו תמיסת מלח סטרילית עם 40 מ"ג/מ"ל קטמין ו-6 מ"ג/מ"ל קסילזין. הכן מספיק נפח לניתוח והמתת חסד לאחר הדמיה (מינימום 9 מיקרוליטר לגרם משקל גוף עכבר).
   הערה: סוגים רבים של הרדמה שימשו במהלך הדמיה in vivo . אזהרה: קטמין מזיק במקרה של הזרקה, בליעה או מגע עם העיניים. טפל בזהירות.
2. עקר את כל המכשירים הכירורגיים במעקר חרוזים. שטפו מכשירים עם 70% אתנול.
   הערה: לחלופין, בצע חיטוי של המכשירים מראש.
3. יש להזריק 2.25 מיקרוליטר קטמין/קסילזין לכל גרם משקל גוף (90 מ"ג/ק"ג ו-13.5 מ"ג/ק"ג קטמין וקסילזין, בהתאמה) i.p. לעכברי Pirt-GCaMP3 15-25 דקות לפני הניתוח. אין לחרוג מ-120 מ"ג/ק"ג קטמין.
4. לאחר 15-25 דקות של הזרקת הרדמה (שלב 1.3), צבט את כף הרגל האחורית עם מלקחיים כדי לוודא שהעכבר נמצא במישור הרדמה כירורגי.
   הערה: הצביטה צריכה להיות חזקה מספיק כדי לגרום לקול בעכבר בהכרה, אך לא חזקה מספיק כדי לגרום לפציעה. חשוב לא להשאיר את העכבר בשלב זה יותר מהנדרש כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף. שמירה על חום הכלוב מועילה, במידת האפשר.
5. הניחו את העכבר על כרית חימום כדי להבטיח שטמפרטורת הגוף נשמרת על 37 מעלות צלזיוס, והניחו את ראש העכבר במסכה סטריאוטקטית (איור 1A,B), כשהראש מוטה כ-15° שמאלה (איור 1B).
   הערה: מסיכה סטריאוטקטית שגם מייצבת את הראש וגם מספקת מסלול למתן איזופלורן. אם הליך אינו משתמש באיזופלורן או שלא נעשה שימוש במסכה סטריאוטקטית, יש להשתמש בשיטה אחרת לייצוב הראש כדי למנוע תנועה.
6. יש למרוח משחה עיניים על העיניים כדי למנוע יובש וגירוי, מכיוון שגירוי גורם לפעילות עצבית טריגמינלית.
7. לגלח את הצד הימני של ראש העכבר.
   הערה: שלב זה לוקח 90 שניות. החוקר עשוי להוציא לזמן קצר את החיה מכרית החימום לצורך גילוח.
8. בצע חתך מלבני בגודל 9 מ"מ על 5 מ"מ בין האוזן הימנית לעין ימין (איור 2A). הפסק את הדימום בעזרת מטוש המוסטטי או מגבון מעבדה.
   הערה: שלב זה אורך 2 דקות. החוקר עשוי להשתמש במלקחיים המוסטטיים או במחזיר כדי לשמור על החתך פתוח. זהו הליך שאינו הישרדותי, כלומר ניקוי נוסף מיותר. עם זאת, החוקר עשוי לספוג את אתר הניתוח ביוד פובידון. גודל החתך הגדול ביותר המותר ניתן. אם המנתח מיומן מספיק, חתך קטן יותר עדיף על חתך גדול יותר כדי למזער נזק לרקמות. ה-TG מעצבב את הרקמה הזו ועלול להינזק.
9. חתכו את הרקמה (periosteum) על פני הגולגולת ממש גחוניים לעין (איור 2B).
10. באמצעות מקדחה דנטלית וסדק מתחדד TNT בור 31p, קדחו חור בגודל של כ-9 מ"מ על 5 מ"מ בגולגולת הגבית שבמרכזה אתר החתך (איור 2C). מרחו את הבור קלות ככל האפשר על משטח הגולגולת.
    הערה: שלב זה אורך כ-2 דקות. אם המנתח מיומן מספיק, חור קטן יותר עדיף על חור גדול יותר.
11. הטה את הראש עד שה-TG נראה בבירור (איור 2C). אם יש דימום על ה-TG, שאפו את הדם או הסירו את הדם על ידי פתילה עם מטוש המוסטטי או מגבון מעבדה. ודא שה-TG נראה בבירור מבלי להסיר רקמה קליפת המוח (איור 2C).
    הערה: אנו מדמים TG באופן שגרתי במשך 3-6 שעות או יותר ללא סימני מצוקה בתאי עצב, אך חוקר יכול לבחור למקם כיסוי או כיסוי אחר כדי למנוע את התייבשות ה-TG.
12. העבר את החיה וכרית החימום לשלב המיקרוסקופ והנח את אף העכבר לתוך חרוט האף הסטריאוטקסי. חברו את קווי החמצן/איזופלורן כך שהעכבר יקבל הרדמה איזופלורן רציפה (איור 3A).
    הערה: שלב זה אורך 3 דקות. איזופלורן רציף דורש מיכלי חמצן, צינורות אספקת גז ומכשיר אידוי הרדמה. כמו כן, ניתן לשמור על הרדמה לאורך כל ההליך על ידי הזרקות תקופתיות של חומר הרדמה.
13. מקמו את המסגרת הסטריאוטקסית כך שמטרת המיקרוסקופ תהיה 9 מ"מ ישירות מעל פתח הגולגולת (איור 3B).
    הערה: המרחק המדויק תלוי במטרה, במיקרוסקופ ובעכבר.
14. הכנס את מדחום פי הטבעת. חבר את כבל החשמל למדחום פי הטבעת ולכרית החימום. חבר את מסכת ההרדמה לאיזופלורן בקו החמצן עם 1% איזופלורן.

2. הדמיית TG

הערה: השתמש בהגדרה ירוקה (FITC) 495 ננומטר, פליטה 519 ננומטר, אורך גל זיהוי 500-580 ננומטר, מכשיר הדמיה GaAsP-Pmt1, גלאי GaAsP-PMT, או השתמש בהגדרות המומלצות למיקרוסקופ. ראה טבלה 1 לסיכום של הגדרות התוכנה.

1. השתמש באובייקט 5x/0.25 M27, בתוכנת יצרן המיקרוסקופ ובמיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי אנכי. אתר את משטח ה- TG באמצעות המיקרוסקופ.
   הערה: הבחירה האובייקטיבית תלויה במיקרוסקופ ובהעדפת החוקר.
2. כוונן את המטרה ואת חרוט האף כדי להפוך את משטח ה-TG לשטוח ככל האפשר ובעל שטח הפנים הגדול ביותר האפשרי במישור המוקד.
   הערה: TG שטוח יותר מספק תמונה חדה יותר, גורם לתוכנה להרכיב סרטים חדים יותר, תמונות יותר נוירונים ומפשט ומשפר את דיוק הניתוח בהשוואה ל-TG מוטה יותר.
3. שמור על העכבר בהרדמה על ידי מריחת 1-1.5% איזופלורן על זרימת החמצן דרך מסכת ההרדמה.
   הערה: יש לעקוב מקרוב אחר בעל החיים לאורך כל ההליך על ידי צביטה של כף הרגל האחורית כל 20-30 דקות כדי להבטיח שהחיה תישאר תחת הרדמה. אחוז האיזופלורן הנדרש לשמירה על הרדמה יהיה תלוי בעכבר הבודד. אם החיה נעה במהלך צביטת מבחן, יש להגדיל את האיזופלורן. אם הנשימה הופכת רדודה, יש להפחית את האיזופלורן. אזהרה: איזופלורן מזיק בשאיפה ועלול לגרום לסחרחורת או נמנום. הימנע משאיפה וודא שלאזור העבודה יש אוורור מספיק.
4. טען את פרוטוקול הסריקה המהיר של המיקרוסקופ: גודל ווקסל 4.160 מיקרומטר x 4.160 מיקרומטר x 14 מיקרומטר, 512 x 512 פיקסלים, 10 פרוסות אופטיות Z-stack, 1.02 יחידות אווריריות (AU)/33 מיקרומטר, 15% הספק לייזר 488 ננומטר/75 mW, זמן פיקסל 1.52 מיקרון, זמן קו 0.91 אלפיות השנייה, זמן מסגרת 465 אלפיות השנייה, מהירות סריקת LSM 8, סריקה דו-כיוונית, רווח גלאי GaAsP-PMT 550 וולט, רווח דיגיטלי 1.
   הערה: ההגדרות האופטימליות עשויות להשתנות בין מיקרוסקופים ובעלי חיים.
5. סרוק את ה-TG בפרצים קצרים של 6-8 מחזורים. צור הקרנות אורתוגונליות של הסריקות (סריקה אחת יוצרת פריים סרט אחד) כדי ליצור סרט ולבדוק את בהירות התמונה והעקביות בין הפריימים. במידת הצורך, התאימו את מיקום המסגרת הסטריאוסקופית ואת עובי המקטע האופטי וחזרו על שלב זה עד ליצירת סרטון ברור ועקבי.
   הערה: יש לחזור על שלב זה אם ראש העכבר זז או שהחוקר ממקם מחדש את העכבר או מכוון את מישור המוקד.
6. טען את פרוטוקול הסריקה ברזולוציה גבוהה של המיקרוסקופ: גודל ווקסל 0.520 מיקרומטר x 0.520 מיקרומטר x 14 מיקרומטר, 4096 x 4096 פיקסלים, 6 פרוסות אופטיות Z-stack, 1.02 יחידה אוורירית (AU)/33 מיקרומטר, 20% הספק לייזר 488 ננומטר/100 mW, זמן פיקסל 0.52 מיקרון, זמן קו 4.95 אלפיות השנייה, זמן מסגרת 20.26 שניות, מהירות סריקת LSM 6, סריקה דו-כיוונית, רווח גלאי GaAsP-PMT 550 וולט, רווח דיגיטלי 1.
   הערה: ההגדרות האופטימליות תלויות במיקרוסקופ ובבעל החיים. אם תאים מסומנים בעגבניות td, הגדר את המיקרוסקופ לסרוק את התעלה האדומה עירור 592 ננומטר/פליטה של 614 ננומטר, אורך גל זיהוי 600-700 ננומטר בנוסף לתעלה הירוקה.
7. צור תמונה ברזולוציה גבוהה של ה-TG.
   הערה: תמונה זו יכולה להיות שימושית לספירת נוירונים, למדידת הקוטר של תאי עצב עמומים, או לספק תמונה מפורטת כדי להבחין אם אותו תא עצב הגיב לשני גירויים שונים או שני תאי עצב שונים הגיבו.
8. טען את פרוטוקול הסריקה המהיר של המיקרוסקופ (ראה שלב 2.4).
9. תעד פעילות ספונטנית במשך 80 מחזורים (כ-10 דקות). צור סרט הקרנה אורתוגונלי ובדוק שהתמונות ברורות ועקביות מספיק לניתוח.
   הערה: זה מייצר מספיק מסגרות כדי לנתח פעילות ספונטנית. ניתן להקטין או להגדיל את המספר בהתאם לחשיבות הפעילות הספונטנית לניסוי מסוים.
10. כדי להפעיל גירוי, הגדר את המיקרוסקופ לסרוק 15-20 מחזורים.
    הערה: היזהר בעת הפעלת גירויים כדי לא להזיז את ראש העכבר. הזזת ה-TG אפילו במיקרון במהלך הגירוי עלולה לשבש את ההדמיה. הסריקה מאפשרת למחזורים לבסס קו בסיס, גירוי, ולהתבונן בתאי העצב לאחר הסרת הגירוי.
11. המתן עד להשלמת מחזורים 1-5 כדי ליצור קו בסיס. הפעל גירוי במהלך סריקות 6-10. המתן לפחות 5 דקות לאחר כל גירוי כדי להימנע מחוסר רגישות של נוירונים.
    הערה: כל גירוי דורש סריקה נפרדת של 15-20 מחזורים. הפעל תחילה גירוי מכני, ולאחר מכן גירוי קור, חום וכימי. הפעל גירוי בתדר נמוך (למשל, כוח מכני נמוך, טמפרטורה קרובה לטמפרטורת החדר) לפני גירוי בתדר גבוה (כוח מכני גבוה, טמפרטורה רחוקה מטמפרטורת החדר). היזהר לא להזיז את ה-TG בעת הפעלת גירוי. אם ניתן לשמוע סריקות בבירור, ניתן להפעיל גירוי מיד לאחר סריקה 5. עם זאת, כל שיטה המספקת תזמון עקבי של גירוי תעבוד. ראה את הדיון על סדר התמריצים.
12. עבור פון פריי באזור המוטבע על ידי חלק V2 של ה-TG, החזק את החוט והחל אותו שוב ושוב על האזור המקביל מתחת לעין ומעל הפה מיד לאחר סריקה 5 ועד מיד לאחר סריקה 10.
13. עבור פון פריי באזור המוטבע על ידי חלק V3 של ה-TG, החזק את החוט והחל שוב ושוב על האזור המקביל ממש מתחת לאוזן מיד לאחר סיום סריקה 5 ועד מיד לאחר סיום סריקה 10.
14. לגירויים קרים וחומים, יש לקרר או לחמם את המים למעט מתחת (לקור) או מעל (לחימום) לטמפרטורה הרצויה ולאחר מכן, התחל לסרוק באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק. החל את הגירוי עם פיפטת ההעברה מיד לאחר סריקה 5 על האזור המקביל ממש מתחת לעין, מעל הפה (עבור V2), או ממש מתחת לאוזן (עבור V3).
    הערה: ודא שהטמפרטורה נמצאת בטווח של 1 מעלות צלזיוס מהטמפרטורה הרצויה לסריקה 5. כדי להימנע מפגיעה ברגישות של הנוירונים, אל תפעילו את הגירוי אם טמפרטורת הכוס אינה נכונה. במקום זאת, קררו או חממו את המים שוב ונסו שוב.
15. בתום הניסויים, יש להזריק 50 מ"מ אשלגן כלורי תת עורי לאזורי V2 או V3 החל ממחזור 6 כדי להפעיל ולזהות את כל הנוירונים המגיבים.
16. לאחר שכל הגירויים ניתנו ותועדו, המתת חסד של בעל החיים על ידי מנת יתר של קטמין/קסילזין (200 מ"ג לק"ג קטמין, 30 מ"ג לק"ג קסילזין, או 5 מיקרוליטר לכל גרם של התמיסה שהוכנה בשלב 1.1), ולאחר מכן ערוף את הראש.

3. פרוטוקול לאנליזה

1. פתח את קובץ ההקרנה האורתוגונלי באמצעות אפשרות הגרירה והשחרור . בחר את סוג התמונה מתוך תמונה | סוג | צבע RGB. אופציונלי: השתמש בתוסף StackReg³¹ תחת תוספים | jars | StackReg לתיקון חפצי תנועה ויישור.
   הערה: החוקר יכול לבחור את סוג התמונה על פי העדפה. RGB מפשט את היצירה של תמונות צבעוניות לפרסום.
2. פתיחת מנהל ההחזר על ההשקעה באמצעות ניתוח | כלים | מנהל החזר ROI.
3. בחר נוירונים פעילים על ידי ציור החזר ROI באמצעות הכלי Ellipse או Rectangle בסרגל הכלים ולאחר מכן מקם אותו בקובץ ה-ROI על ידי לחיצה על כפתור הוספה בחלון מנהל ה-ROI או על ידי לחיצה על מקש "t".
   הערה: שמור קובצי החזר ROI לעתים קרובות. ניתן לשחזר את החזר ה-ROI על ידי גרירה ושחרור של קובץ ה-ROI ל-ImageJ ולחיצה על הצג הכל תיבה בתחתית חלון מנהל ה-ROI. שמירת קובץ .zip ROI מפשטת את הניתוח בהשוואה לשמירת החזר ROI כשכבת-על. יש לשלול תא עצב שמשתנה במהלך תקופת הבסיס כפעיל באופן ספונטני, ולא כמגיב לגירוי.
4. בניתוח | הגדרות מדידה, סמן ערך אפור ממוצע (אופציונלי, אך מומלץ: בטל את הסימון בכל התיבות האחרות תחת הגדרות מדידה).
5. השתמש בחלון החזר ההשקעה בדף עוד | רב מדידה למדידת עוצמה.
   הערה: לפעמים, נוירונים סמוכים קרובים מדי מכדי למשוך החזר השקעה נפרד. נוירונים אלה יכולים להיכלל בספירת הנוירונים הפעילים אך לא ניתן לכלול אותם במדידות עוצמה חולפות.
6. Multi-measure יוצר קובץ CSV בחלון חדש שכותרתו "תוצאות". שמור את קובץ ה-CSV על-ידי לחיצה על קובץ | שמירה בשם. פתח את קובץ .csv באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני ושמור את הקובץ כגיליון אלקטרוני.
   הערה: ראה קובץ משלים 1 לתבנית ניתוח.
7. חשב את עוצמת החולף Ca²⁺ כ-ΔF/F₀ = (F_{t-F 0})/F₀, כאשר F_t היא עוצמת הפיקסלים ב-ROI בנקודת הזמן המעניינת ו-F₀ היא עוצמת קו הבסיס הנקבעת על ידי העוצמה הממוצעת של 2-4 הפריימים הקודמים לחולף Ca²⁺ לפעילות ספונטנית או 1-5 המסגרות הראשונות עבור ארעי Ca²⁺ המושרים על ידי גירוי. אל תכלול את כל הנוירונים המייצרים שיאי Ca²⁺ לפני הגירוי ואל תנתח פעילות לאחר הגירוי.
8. עבור ניתוח עוצמה חולפת Ca²⁺ , דגימה אקראית של בערך אותו מספר נוירונים מכל גנגליון כדי למנוע מהגנגליונים המייצרים את המספר הגדול ביותר של נוירונים מגיבים לשלוט בניתוח. אל תכלול שיאים עם ΔF/F₀ < 0.15.
   הערה: ישנן שיטות חלופיות שפורסמו לניתוח והכללה והכללה של נוירונים 15,16,19,22,32,33,34,35.
9. מדוד את קוטר הנוירון על ידי חישוב האורך הממוצע של קו המשורטט ב-ImageJ לאורך הקטרים הארוכים והקצרים ביותר באמצעות הכלי Line בסרגל הכלים.
   הערה: חוקר יכול גם למדוד את השטח והפרמטרים האליפטיים של החזר ROI כדי להעריך את הקוטר.

הדמיה של מספר רב של נוירונים וענפים טריגמינליים ספציפיים על ידי סריקה קונפוקלית של הגנגליון הטריגמינלי Pirt-GCaMP
לאחר חשיפה כירורגית ל-TG בעכברי Pirt-GCaMP3, מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת הדמיה של יותר מ->3,000 תאי עצב בו-זמנית (איור 4). זה מספק את היתרון העוצמתי של התבוננות באלפי נוירונים TG בו זמנית בהקשר הפיזיולוגי הרגיל שלהם. ניתן לנטר ארעי Ca2+ ספונטניים בהיעדר גירוי (איור 4A,B ווידאו 1). ניתן ליישם גירויים על אזורים המופנים על ידי V2 (איור 4D, E ווידאו 2) או V3 (איור 4G, H ווידאו 3). ניתן לנטר ארעיות Ca2+ ספונטניות (איור 4C) וטרנזיינטים המתרחשים בתגובה לגירויים אלה (איור 4F ואיור 4I).

מספר מוגבר של תאים המייצרים ארעי Ca2+ ומשרעת מוגברת של ארעי Ca2+ עקב גירויים חזקים יותר
גירוי חזק או חום מזיק מגבירים את תגובות Ca2+. בהשוואה לחוטי פון פריי של 0.4 גרם, היישום של חוטים של 2 גרם הגדיל את מספר הנוירונים המייצרים Ca2+ ארעיים (איור 5A, מבחן t של סטודנט מזווג t = 3.786, df = 6, p = 0.0091). הייתה גם עלייה במשרעת הממוצעת ΔF/F0 של ארעי Ca2+ (איור 5B,C, זמן ANOVA דו-כיווני × אינטראקציה עם גירוי F5,2796 = 3.605, df = 5, p = 0.0030) ובמשרעת במהלך מסגרת הגירוי הראשונה (מבחן ההשוואה המרובה של Šidák, t = 3.758, df = 2796, מתואם p = 0.0010).

איור 1: מחזיק ראש הרדמה סטריאוטקסית עם מסכה להדמיה. (A) תצלום של מחזיק ראש העכבר עם מסכת ההרדמה המוברגת ללוחית מתכת עם כרית חימום. מחזיק השיניים ומסכת חרוט האף/הרדמה מוצגים. כרית החימום מכוסה בנייר אלומיניום למניעת נזק. (B) תצלום של העכבר מוטה ב-15 מעלות במחזיק ראש ההרדמה כהכנה לניתוח ולהדמיה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: חשיפה כירורגית של גנגליון טריגמינלי להדמיה. (A) עכבר עם חתך קטן שנעשה בעור. (B) העכבר עם רקמה שנוקה מהגולגולת כדי להכין חור לחשיפה לגנגליון טריגמינלי. (C) הגנגליון הטריגמינלי הימני חשוף ומוכן להדמיה. לא הוסרה רקמת מוח. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הנחת העכבר על במת המיקרוסקופ לצורך הדמיה. (A) העכבר במנגנון הסטריאוטקסי על במת המיקרוסקופ. מדחום פי הטבעת וצינורות איזופלוראן מוצגים. (B) העכבר מוכן להדמיה. המטרה היא כ-9 מ"מ מעל החור המוכן בניתוח בגולגולת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: יישום של גירויי חום מזיקים על אזורים המופנים על ידי אזורי V2 (מקסילרי) ו-V3 (לסת תחתונה) של הגנגליון הטריגמינלי. (A) סכום הקרנת העוצמה של ה-TG על פני 200 פריימים (ב-ImageJ, לחץ על תמונה |ערימות |פרויקט Z |סוג הקרנה |פרוסות סכום). (ב) הקרנה בעוצמה מקסימלית של ה-TG מעל 200 פריימים (ב-ImageJ, לחץ על תמונה |ערימות |פרויקט Z |סוג הקרנה |עוצמה מקסימלית). הסברי חצים צהובים מצביעים על תאי עצב מגיבים. (C) תרשימי עוצמה ΔF/F0 של ששת תאי העצב שמסומנים על-ידי הסברים בפאנל B. כל תא עצב מתואר בגרף בצבע שונה. (ד) הקרנה בעוצמה מקסימלית של ה-TG לפני מריחת מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס על העור המועצב על ידי אזור V2. (E) הקרנה בעוצמה מקסימלית של ה-TG במהלך מריחת מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס על העור המועצב על ידי אזור V2. הסברי חצים צהובים מצביעים על תאי עצב מגיבים. (F) תרשימי עוצמה ΔF/F0 של ששת תאי העצב שמסומנים על ידי הסברים בפאנל E (חום מזיק המופעל על האזור המועצב על ידי אזור V2). (G) הקרנה בעוצמה מקסימלית של ה-TG לפני מריחת מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס על העור המוטבע על ידי אזור V3. (H) הקרנה בעוצמה מקסימלית של TG במהלך מריחת מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס על העור המוטבע על ידי אזור V3. הסברי חצים צהובים מצביעים על תאי עצב מגיבים. (I) עלילות עוצמה ΔF/F0 של שישה תאי עצב המסומנים בהסברים בפאנל H (חום מזיק המופעל על האזור המועצב על ידי V3). פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר (A,B,D,E,G,H). קיצורים: TG = גנגליון טריגמינלי; ΔF/F0 = Ca2+ עוצמה חולפת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: Ca2+ פעילות הנגרמת על ידי שני כוחות שונים באזור המוטבע על ידי V2. (A) גרף של מספר תאי העצב בשבעה גנגליונים שמועצבים על ידי V2, שמראה ארעיות Ca2+ במהלך יישומי 0.4 גרם פון פריי ו-2 גרם פון פריי, ואת ההבדל במספר תאי העצב המופעלים בין 2 גרם פון פריי ל-0.4 גרם פון פריי בשבעת הגרעין. ממוצע ו- SEM מוצגים. (B) גרף של עוצמת ΔF/F0 של ארעי Ca2+ שנוצרו על ידי יישומי 0.4 גרם פון פריי (למעלה) ו-2 גרם פון פריי (למטה) באזור המועצב על ידי V2. קווים אפורים הם תאים בודדים, קו אדום הוא העוצמה הממוצעת. (C) גרף של עוצמת ΔF/F 0 הממוצעת של מעברי Ca2+ שנוצרו על ידי יישומי 0.4 g von Frey ו-2 g von Frey באזור המועצב על ידי V2. ממוצע ו- SEM מוצגים. נתונים סטטיסטיים עבור ספירת תאים משויכים למבחן t של סטודנט. הסטטיסטיקה עבור עוצמות חולפות היא ANOVA דו-כיוונית ואחריה מבחן השוואה מרובה Šidák. **עמ' < 0.01. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: סיכום של הגדרות מיקרוסקופ סריקה קונפוקלי המשמשות להדמיית Pirt-GCaMP3 ב-TG. עמודה 3 מספקת הסבר קצר על מה שכל הגדרה עושה. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

סרטון 1: פעילות ספונטנית של Ca2+ בגנגליון הטריגמינלי בצד ימין. גנגליון טריגמינלי המראה ארעיות Ca2+ ספונטניות וריכוז גבוה קבוע של Ca2+ בהיעדר גירויים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

סרטון 2: ארעי Ca 2+ המושרים על ידי מריחת מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס על אזור הפה והפנים המועצב על ידי ענף V2 של הגנגליון הטריגמינלי. גנגליון טריגמינלי המציג ארעיות Ca2+ בתגובה ליישום מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס על אזור הפה והפנים V2. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

סרטון 3: ארעי Ca 2+ המושרים על ידי מריחת מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס על אזור הפה והפנים המועצב על ידי ענף V3 של הגנגליון הטריגמינלי. גנגליון טריגמינלי המציג ארעיות Ca2+ בתגובה למריחת מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס על אזור הפה והפנים V3. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 1: גיליון אלקטרוני לניתוח לדוגמה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.