הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעינים טריגמינליים שלמים

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68284

⸱

1 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Department of Endodontics, School of Dentistry, University of Alabama at Birmingham, 3Division of Life Sciences, College of Life Sciences and Bioengineering, Incheon National University, 4Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר הדמיית סידן in vivo GCaMP של נוירונים שלמים של גנגליון טריגמינלי (TG). תיאור זה כולל ניתוח חשיפה ל-TG, הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית in vivo של נוירונים TG, יישום גירויים סומטיים במהלך הדמיה מיקרוסקופית של נוירונים TG וניתוח נתוני הדמיית סידן in vivo GCaMP.

תקציר

הדמיית סידן היא כלי חשוב לניטור מנגנוני איתות המזרימים Ca2+ לתוך הציטוזול או משחררים Ca2+ ממאגרי Ca2+ תוך-תאיים. השימוש בעכברי Pirt-GCaMP3, שיש להם חיישן Ca2+GCaMP3 מוכנס במורד הזרם של אזור מקדם Pirt ומתבטא כמעט בכל (>95%) נוירונים חושיים ראשוניים, מאפשר ניטור סימולטני של הפעילות של >3,000 נוירונים באמצעות הדמיית Ca2+ של נוירונים חושיים ראשוניים של גנגליון טריגמינלי (TG). זה מאפשר לחוקרים לחקור את תגובות הרשת העצבית לגירויים מזיקים ולתגובות סומטוסנסוריות והורמונליות in vivo, שאחרת יהיה קשה מאוד לזהות בשיטות אחרות.

באופן ספציפי, היכולת לנטר את אזור ה-TG המעצבב את הפנים ואזורים אחרים בראש בנפרד מאפשרת ניטור נוירונים חושיים ראשוניים המופעלים על ידי גירויים של אזור הפנים לפני שכבות מאוחרות יותר של עיבוד נוירונים. ניתן לראות גם את מספר הנוירונים המייצרים ארעי Ca2+ ואת המשרעת של מעברי Ca2+ , המעידים על רגישותם לשיטות חושיות שונות. בנוסף, חוקרים יכולים למדוד את קוטר הנוירונים, המהווה אינדיקטור לסוג הסיבים המופעלים (סיבים מכניים לא מזיקים לעומת סיבים מזיקים, סיבי Aβ, Aδ ו-C). לכן, הדמיית סידן Pirt-GCaMP3 של TG תהיה כלי רב עוצמה לניתוח שיטות חישה ספציפיות וסוגי תאים עצביים כדי לחקור כאב ממקור טריגמינלי (כאבי פה ופנים וגולגולת, כאבי שיניים או שיניים, כאבי ראש, מיגרנה, כאבי מפרקים זמניים, נוירלגיה טריגמינלית), גירוד ומגע וכל תחושות סומטוניות אחרות, כמו גם תגובות הורמונליות.

מבוא

נוירונים חושיים ראשוניים מעצבבים ישירות רקמות, כולל העור, ומעבירים אותות חושיים למערכת העצבים המרכזית (חוט השדרה או גזע המוח). נוירונים של גנגליון טריגמינלי (TG) מעצבבים את הראש ומגיבים לגירויים חושיים, כולל כאבים מהשיניים, האזור הפריאורביטלי, אזורי הפה והגולגולת, המפרק הטמפורומנדיבולרי 1,2 וקרומי המוח 3,4,5. נוירונים TG משתנים בגודל, ברמת המיאלינציה ובפרופילי ביטוי הגנים 6,7,8,9. נוירונים קטנים יותר הם נוסיספטיביים, בעוד שתאי עצב גדולים יותר מגיבים בדרך כלל לגירויים מכניים לא כואבים10,11. תפקוד לקוי של נוירונים של גנגליון טריגמינלי יכול לעורר רגישות הן לנוירונים עצמם והן לנוירונים חושיים של מערכת העצבים המרכזית (CNS)11,12.

בהקשר פיזיולוגי רגיל בתנאים לא פתולוגיים, ירי נוירונים in vivo הכרחי לכאב, אך עד שני העשורים האחרונים, כלים לחקר גנגליונים חושיים שלמים in vivo הוגבלו לניטור יחסית מעט נוירוניםבכל פעם. בשל ריכוזי סידן ציטופלזמיים נמוכים בדרך כלל, זרם סידן במהלך פוטנציאל הפעולה והשימוש בסידן כאות ציטופלזמי, דינמיקת סידן היא תחליף רב עוצמה לניטור פוטנציאל פעולה או פעילות תאית in vivo באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים רגישים לסידן. הרציונל לשיטה זו הוא שמיקרוסקופיה פלואורסצנטית יכולה לנטר בו זמנית אינדיקטורים אלה במאות עד אלפי נוירונים בו זמנית בגרעינים חושיים היקפיים של עכברים 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ו חולדות 25,26. זהו יתרון רב עוצמה על פני שיטות שיכולות לנטר מספר מוגבל יותר של נוירונים in vivo.

מטרת שיטה זו היא תצפית ישירה על דינמיקת Ca2+ ציטופלזמית in vivo ב-TG בתגובה לגירויים מכניים, טמפרטורה, כימיים והורמונליים במודלים של כאבי ראש 19,23,24. שיטה זו יכולה לשמש כהשלמה לכאב או לבדיקות סומטוסנסוריות אחרות באזור הפה והפנים. נעשה שימוש בהדמיית Ca2+ in vivo trigeminal לאפיון קידוד תרמי וחושי19,22, לימוד מחלקות של קולטנים מכניים27, גילוי מחלקה חדשה של נוירון רגיש למכניקה28, ניטור תגובות טריגמינליות ללחצים מכניים רגילים על קרומי המוח29, חקר השפעות ההורמונים על רגישות לכאב24, אפיון מודלים של כאב פה ופנים30ותורמים למחקר לכאב הנגרם על ידי גמילה מאלכוהול23.,

עכברי Pirt-GCaMP3 מאפשרים ניטור של פעילות עצבית in vivo מכיוון שיש להם חיישן Ca2+ GCaMP3 מוחדר לאזור המקדם של הגן Pirt, אשר מתבטא מאוד בכל (>95%) נוירונים חושיים ראשוניים12,18. מאמר זה מדגים טכניקה לביצוע חשיפה כירורגית in vivo TG ואיסוף וניתוח של נתוני מיקרוסקופיה של אינדיקטור סידן עבור TG בצד ימין של עכברי Pirt-GCaMP3 באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים המתוארים כאן מבוצעים על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. הניתוח אינו הישרדותי. יש לבצע את סעיפים 1 ו-2 של הליך זה מיד עם ההתחלה. סעיף 3 עשוי להתבצע במועד מאוחר יותר.

1. אבטחה וניתוח של העכבר להדמיית TG בצד ימין

הערה: עכברי Pirt-GCaMP3 C57BL/6J18 צריכים להיות בגודל גוף מבוגר (בדרך כלל 8 שבועות ומעלה), ללא קשר למין. הדמיית TG דו-צדדית אפשרית. הזמנים המפורטים כאן הם הערכות של טכנאי מנוסה. אם הדימום הוא יותר מהרגיל, זה עשוי לקחת מספר דקות יותר לכל זמן נתון.

  1. הכינו תמיסת מלח סטרילית עם 40 מ"ג/מ"ל קטמין ו-6 מ"ג/מ"ל קסילזין. הכן מספיק נפח לניתוח והמתת חסד לאחר הדמיה (מינימום 9 מיקרוליטר לגרם משקל גוף עכבר).
    הערה: סוגים רבים של הרדמה שימשו במהלך הדמיה in vivo . אזהרה: קטמין מזיק במקרה של הזרקה, בליעה או מגע עם העיניים. טפל בזהירות.
  2. עקר את כל המכשירים הכירורגיים במעקר חרוזים. שטפו מכשירים עם 70% אתנול.
    הערה: לחלופין, בצע חיטוי של המכשירים מראש.
  3. יש להזריק 2.25 מיקרוליטר קטמין/קסילזין לכל גרם משקל גוף (90 מ"ג/ק"ג ו-13.5 מ"ג/ק"ג קטמין וקסילזין, בהתאמה) i.p. לעכברי Pirt-GCaMP3 15-25 דקות לפני הניתוח. אין לחרוג מ-120 מ"ג/ק"ג קטמין.
  4. לאחר 15-25 דקות של הזרקת הרדמה (שלב 1.3), צבט את כף הרגל האחורית עם מלקחיים כדי לוודא שהעכבר נמצא במישור הרדמה כירורגי.
    הערה: הצביטה צריכה להיות חזקה מספיק כדי לגרום לקול בעכבר בהכרה, אך לא חזקה מספיק כדי לגרום לפציעה. חשוב לא להשאיר את העכבר בשלב זה יותר מהנדרש כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף. שמירה על חום הכלוב מועילה, במידת האפשר.
  5. הניחו את העכבר על כרית חימום כדי להבטיח שטמפרטורת הגוף נשמרת על 37 מעלות צלזיוס, והניחו את ראש העכבר במסכה סטריאוטקטית (איור 1A,B), כשהראש מוטה כ-15° שמאלה (איור 1B).
    הערה: מסיכה סטריאוטקטית שגם מייצבת את הראש וגם מספקת מסלול למתן איזופלורן. אם הליך אינו משתמש באיזופלורן או שלא נעשה שימוש במסכה סטריאוטקטית, יש להשתמש בשיטה אחרת לייצוב הראש כדי למנוע תנועה.
  6. יש למרוח משחה עיניים על העיניים כדי למנוע יובש וגירוי, מכיוון שגירוי גורם לפעילות עצבית טריגמינלית.
  7. לגלח את הצד הימני של ראש העכבר.
    הערה: שלב זה לוקח 90 שניות. החוקר עשוי להוציא לזמן קצר את החיה מכרית החימום לצורך גילוח.
  8. בצע חתך מלבני בגודל 9 מ"מ על 5 מ"מ בין האוזן הימנית לעין ימין (איור 2A). הפסק את הדימום בעזרת מטוש המוסטטי או מגבון מעבדה.
    הערה: שלב זה אורך 2 דקות. החוקר עשוי להשתמש במלקחיים המוסטטיים או במחזיר כדי לשמור על החתך פתוח. זהו הליך שאינו הישרדותי, כלומר ניקוי נוסף מיותר. עם זאת, החוקר עשוי לספוג את אתר הניתוח ביוד פובידון. גודל החתך הגדול ביותר המותר ניתן. אם המנתח מיומן מספיק, חתך קטן יותר עדיף על חתך גדול יותר כדי למזער נזק לרקמות. ה-TG מעצבב את הרקמה הזו ועלול להינזק.
  9. חתכו את הרקמה (periosteum) על פני הגולגולת ממש גחוניים לעין (איור 2B).
  10. באמצעות מקדחה דנטלית וסדק מתחדד TNT בור 31p, קדחו חור בגודל של כ-9 מ"מ על 5 מ"מ בגולגולת הגבית שבמרכזה אתר החתך (איור 2C). מרחו את הבור קלות ככל האפשר על משטח הגולגולת.
    הערה: שלב זה אורך כ-2 דקות. אם המנתח מיומן מספיק, חור קטן יותר עדיף על חור גדול יותר.
  11. הטה את הראש עד שה-TG נראה בבירור (איור 2C). אם יש דימום על ה-TG, שאפו את הדם או הסירו את הדם על ידי פתילה עם מטוש המוסטטי או מגבון מעבדה. ודא שה-TG נראה בבירור מבלי להסיר רקמה קליפת המוח (איור 2C).
    הערה: אנו מדמים TG באופן שגרתי במשך 3-6 שעות או יותר ללא סימני מצוקה בתאי עצב, אך חוקר יכול לבחור למקם כיסוי או כיסוי אחר כדי למנוע את התייבשות ה-TG.
  12. העבר את החיה וכרית החימום לשלב המיקרוסקופ והנח את אף העכבר לתוך חרוט האף הסטריאוטקסי. חברו את קווי החמצן/איזופלורן כך שהעכבר יקבל הרדמה איזופלורן רציפה (איור 3A).
    הערה: שלב זה אורך 3 דקות. איזופלורן רציף דורש מיכלי חמצן, צינורות אספקת גז ומכשיר אידוי הרדמה. כמו כן, ניתן לשמור על הרדמה לאורך כל ההליך על ידי הזרקות תקופתיות של חומר הרדמה.
  13. מקמו את המסגרת הסטריאוטקסית כך שמטרת המיקרוסקופ תהיה 9 מ"מ ישירות מעל פתח הגולגולת (איור 3B).
    הערה: המרחק המדויק תלוי במטרה, במיקרוסקופ ובעכבר.
  14. הכנס את מדחום פי הטבעת. חבר את כבל החשמל למדחום פי הטבעת ולכרית החימום. חבר את מסכת ההרדמה לאיזופלורן בקו החמצן עם 1% איזופלורן.

2. הדמיית TG

הערה: השתמש בהגדרה ירוקה (FITC) 495 ננומטר, פליטה 519 ננומטר, אורך גל זיהוי 500-580 ננומטר, מכשיר הדמיה GaAsP-Pmt1, גלאי GaAsP-PMT, או השתמש בהגדרות המומלצות למיקרוסקופ. ראה טבלה 1 לסיכום של הגדרות התוכנה.

  1. השתמש באובייקט 5x/0.25 M27, בתוכנת יצרן המיקרוסקופ ובמיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי אנכי. אתר את משטח ה- TG באמצעות המיקרוסקופ.
    הערה: הבחירה האובייקטיבית תלויה במיקרוסקופ ובהעדפת החוקר.
  2. כוונן את המטרה ואת חרוט האף כדי להפוך את משטח ה-TG לשטוח ככל האפשר ובעל שטח הפנים הגדול ביותר האפשרי במישור המוקד.
    הערה: TG שטוח יותר מספק תמונה חדה יותר, גורם לתוכנה להרכיב סרטים חדים יותר, תמונות יותר נוירונים ומפשט ומשפר את דיוק הניתוח בהשוואה ל-TG מוטה יותר.
  3. שמור על העכבר בהרדמה על ידי מריחת 1-1.5% איזופלורן על זרימת החמצן דרך מסכת ההרדמה.
    הערה: יש לעקוב מקרוב אחר בעל החיים לאורך כל ההליך על ידי צביטה של כף הרגל האחורית כל 20-30 דקות כדי להבטיח שהחיה תישאר תחת הרדמה. אחוז האיזופלורן הנדרש לשמירה על הרדמה יהיה תלוי בעכבר הבודד. אם החיה נעה במהלך צביטת מבחן, יש להגדיל את האיזופלורן. אם הנשימה הופכת רדודה, יש להפחית את האיזופלורן. אזהרה: איזופלורן מזיק בשאיפה ועלול לגרום לסחרחורת או נמנום. הימנע משאיפה וודא שלאזור העבודה יש אוורור מספיק.
  4. טען את פרוטוקול הסריקה המהיר של המיקרוסקופ: גודל ווקסל 4.160 מיקרומטר x 4.160 מיקרומטר x 14 מיקרומטר, 512 x 512 פיקסלים, 10 פרוסות אופטיות Z-stack, 1.02 יחידות אווריריות (AU)/33 מיקרומטר, 15% הספק לייזר 488 ננומטר/75 mW, זמן פיקסל 1.52 מיקרון, זמן קו 0.91 אלפיות השנייה, זמן מסגרת 465 אלפיות השנייה, מהירות סריקת LSM 8, סריקה דו-כיוונית, רווח גלאי GaAsP-PMT 550 וולט, רווח דיגיטלי 1.
    הערה: ההגדרות האופטימליות עשויות להשתנות בין מיקרוסקופים ובעלי חיים.
  5. סרוק את ה-TG בפרצים קצרים של 6-8 מחזורים. צור הקרנות אורתוגונליות של הסריקות (סריקה אחת יוצרת פריים סרט אחד) כדי ליצור סרט ולבדוק את בהירות התמונה והעקביות בין הפריימים. במידת הצורך, התאימו את מיקום המסגרת הסטריאוסקופית ואת עובי המקטע האופטי וחזרו על שלב זה עד ליצירת סרטון ברור ועקבי.
    הערה: יש לחזור על שלב זה אם ראש העכבר זז או שהחוקר ממקם מחדש את העכבר או מכוון את מישור המוקד.
  6. טען את פרוטוקול הסריקה ברזולוציה גבוהה של המיקרוסקופ: גודל ווקסל 0.520 מיקרומטר x 0.520 מיקרומטר x 14 מיקרומטר, 4096 x 4096 פיקסלים, 6 פרוסות אופטיות Z-stack, 1.02 יחידה אוורירית (AU)/33 מיקרומטר, 20% הספק לייזר 488 ננומטר/100 mW, זמן פיקסל 0.52 מיקרון, זמן קו 4.95 אלפיות השנייה, זמן מסגרת 20.26 שניות, מהירות סריקת LSM 6, סריקה דו-כיוונית, רווח גלאי GaAsP-PMT 550 וולט, רווח דיגיטלי 1.
    הערה: ההגדרות האופטימליות תלויות במיקרוסקופ ובבעל החיים. אם תאים מסומנים בעגבניות td, הגדר את המיקרוסקופ לסרוק את התעלה האדומה עירור 592 ננומטר/פליטה של 614 ננומטר, אורך גל זיהוי 600-700 ננומטר בנוסף לתעלה הירוקה.
  7. צור תמונה ברזולוציה גבוהה של ה-TG.
    הערה: תמונה זו יכולה להיות שימושית לספירת נוירונים, למדידת הקוטר של תאי עצב עמומים, או לספק תמונה מפורטת כדי להבחין אם אותו תא עצב הגיב לשני גירויים שונים או שני תאי עצב שונים הגיבו.
  8. טען את פרוטוקול הסריקה המהיר של המיקרוסקופ (ראה שלב 2.4).
  9. תעד פעילות ספונטנית במשך 80 מחזורים (כ-10 דקות). צור סרט הקרנה אורתוגונלי ובדוק שהתמונות ברורות ועקביות מספיק לניתוח.
    הערה: זה מייצר מספיק מסגרות כדי לנתח פעילות ספונטנית. ניתן להקטין או להגדיל את המספר בהתאם לחשיבות הפעילות הספונטנית לניסוי מסוים.
  10. כדי להפעיל גירוי, הגדר את המיקרוסקופ לסרוק 15-20 מחזורים.
    הערה: היזהר בעת הפעלת גירויים כדי לא להזיז את ראש העכבר. הזזת ה-TG אפילו במיקרון במהלך הגירוי עלולה לשבש את ההדמיה. הסריקה מאפשרת למחזורים לבסס קו בסיס, גירוי, ולהתבונן בתאי העצב לאחר הסרת הגירוי.
  11. המתן עד להשלמת מחזורים 1-5 כדי ליצור קו בסיס. הפעל גירוי במהלך סריקות 6-10. המתן לפחות 5 דקות לאחר כל גירוי כדי להימנע מחוסר רגישות של נוירונים.
    הערה: כל גירוי דורש סריקה נפרדת של 15-20 מחזורים. הפעל תחילה גירוי מכני, ולאחר מכן גירוי קור, חום וכימי. הפעל גירוי בתדר נמוך (למשל, כוח מכני נמוך, טמפרטורה קרובה לטמפרטורת החדר) לפני גירוי בתדר גבוה (כוח מכני גבוה, טמפרטורה רחוקה מטמפרטורת החדר). היזהר לא להזיז את ה-TG בעת הפעלת גירוי. אם ניתן לשמוע סריקות בבירור, ניתן להפעיל גירוי מיד לאחר סריקה 5. עם זאת, כל שיטה המספקת תזמון עקבי של גירוי תעבוד. ראה את הדיון על סדר התמריצים.
  12. עבור פון פריי באזור המוטבע על ידי חלק V2 של ה-TG, החזק את החוט והחל אותו שוב ושוב על האזור המקביל מתחת לעין ומעל הפה מיד לאחר סריקה 5 ועד מיד לאחר סריקה 10.
  13. עבור פון פריי באזור המוטבע על ידי חלק V3 של ה-TG, החזק את החוט והחל שוב ושוב על האזור המקביל ממש מתחת לאוזן מיד לאחר סיום סריקה 5 ועד מיד לאחר סיום סריקה 10.
  14. לגירויים קרים וחומים, יש לקרר או לחמם את המים למעט מתחת (לקור) או מעל (לחימום) לטמפרטורה הרצויה ולאחר מכן, התחל לסרוק באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק. החל את הגירוי עם פיפטת ההעברה מיד לאחר סריקה 5 על האזור המקביל ממש מתחת לעין, מעל הפה (עבור V2), או ממש מתחת לאוזן (עבור V3).
    הערה: ודא שהטמפרטורה נמצאת בטווח של 1 מעלות צלזיוס מהטמפרטורה הרצויה לסריקה 5. כדי להימנע מפגיעה ברגישות של הנוירונים, אל תפעילו את הגירוי אם טמפרטורת הכוס אינה נכונה. במקום זאת, קררו או חממו את המים שוב ונסו שוב.
  15. בתום הניסויים, יש להזריק 50 מ"מ אשלגן כלורי תת עורי לאזורי V2 או V3 החל ממחזור 6 כדי להפעיל ולזהות את כל הנוירונים המגיבים.
  16. לאחר שכל הגירויים ניתנו ותועדו, המתת חסד של בעל החיים על ידי מנת יתר של קטמין/קסילזין (200 מ"ג לק"ג קטמין, 30 מ"ג לק"ג קסילזין, או 5 מיקרוליטר לכל גרם של התמיסה שהוכנה בשלב 1.1), ולאחר מכן ערוף את הראש.

3. פרוטוקול לאנליזה

  1. פתח את קובץ ההקרנה האורתוגונלי באמצעות אפשרות הגרירה והשחרור . בחר את סוג התמונה מתוך תמונה | סוג | צבע RGB. אופציונלי: השתמש בתוסף StackReg31 תחת תוספים | jars | StackReg לתיקון חפצי תנועה ויישור.
    הערה: החוקר יכול לבחור את סוג התמונה על פי העדפה. RGB מפשט את היצירה של תמונות צבעוניות לפרסום.
  2. פתיחת מנהל ההחזר על ההשקעה באמצעות ניתוח | כלים | מנהל החזר ROI.
  3. בחר נוירונים פעילים על ידי ציור החזר ROI באמצעות הכלי Ellipse או Rectangle בסרגל הכלים ולאחר מכן מקם אותו בקובץ ה-ROI על ידי לחיצה על כפתור הוספה בחלון מנהל ה-ROI או על ידי לחיצה על מקש "t".
    הערה: שמור קובצי החזר ROI לעתים קרובות. ניתן לשחזר את החזר ה-ROI על ידי גרירה ושחרור של קובץ ה-ROI ל-ImageJ ולחיצה על הצג הכל תיבה בתחתית חלון מנהל ה-ROI. שמירת קובץ .zip ROI מפשטת את הניתוח בהשוואה לשמירת החזר ROI כשכבת-על. יש לשלול תא עצב שמשתנה במהלך תקופת הבסיס כפעיל באופן ספונטני, ולא כמגיב לגירוי.
  4. בניתוח | הגדרות מדידה, סמן ערך אפור ממוצע (אופציונלי, אך מומלץ: בטל את הסימון בכל התיבות האחרות תחת הגדרות מדידה).
  5. השתמש בחלון החזר ההשקעה בדף עוד | רב מדידה למדידת עוצמה.
    הערה: לפעמים, נוירונים סמוכים קרובים מדי מכדי למשוך החזר השקעה נפרד. נוירונים אלה יכולים להיכלל בספירת הנוירונים הפעילים אך לא ניתן לכלול אותם במדידות עוצמה חולפות.
  6. Multi-measure יוצר קובץ CSV בחלון חדש שכותרתו "תוצאות". שמור את קובץ ה-CSV על-ידי לחיצה על קובץ | שמירה בשם. פתח את קובץ .csv באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני ושמור את הקובץ כגיליון אלקטרוני.
    הערה: ראה קובץ משלים 1 לתבנית ניתוח.
  7. חשב את עוצמת החולף Ca2+ כ-ΔF/F0 = (Ft-F 0)/F0, כאשר Ft היא עוצמת הפיקסלים ב-ROI בנקודת הזמן המעניינת ו-F0 היא עוצמת קו הבסיס הנקבעת על ידי העוצמה הממוצעת של 2-4 הפריימים הקודמים לחולף Ca2+ לפעילות ספונטנית או 1-5 המסגרות הראשונות עבור ארעי Ca2+ המושרים על ידי גירוי. אל תכלול את כל הנוירונים המייצרים שיאי Ca2+ לפני הגירוי ואל תנתח פעילות לאחר הגירוי.
  8. עבור ניתוח עוצמה חולפת Ca2+ , דגימה אקראית של בערך אותו מספר נוירונים מכל גנגליון כדי למנוע מהגנגליונים המייצרים את המספר הגדול ביותר של נוירונים מגיבים לשלוט בניתוח. אל תכלול שיאים עם ΔF/F0 < 0.15.
    הערה: ישנן שיטות חלופיות שפורסמו לניתוח והכללה והכללה של נוירונים 15,16,19,22,32,33,34,35.
  9. מדוד את קוטר הנוירון על ידי חישוב האורך הממוצע של קו המשורטט ב-ImageJ לאורך הקטרים הארוכים והקצרים ביותר באמצעות הכלי Line בסרגל הכלים.
    הערה: חוקר יכול גם למדוד את השטח והפרמטרים האליפטיים של החזר ROI כדי להעריך את הקוטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הדמיה של מספר רב של נוירונים וענפים טריגמינליים ספציפיים על ידי סריקה קונפוקלית של הגנגליון הטריגמינלי Pirt-GCaMP
לאחר חשיפה כירורגית ל-TG בעכברי Pirt-GCaMP3, מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת הדמיה של יותר מ->3,000 תאי עצב בו-זמנית (איור 4). זה מספק את היתרון העוצמתי של התבוננות באלפי נוירונים TG בו זמנית בהקשר הפיזיולוגי הרגיל שלהם. ניתן לנטר ארעי Ca2+ ספונטניים בהיעדר גירוי (איור 4A,B ווידאו 1). נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרעות כאב של המפרק הזמני-מנדיבולרי ודלקת חניכיים אפיקלית משפיעות על כ-5%36 ו-30-70%37,38 מהאוכלוסייה הכללית, בהתאמה. נוירונים חושיים ראשוניים מזהים גירויים מזיקים בעור, ברירית הפה, בשיניים ובאזורים פריאורביטליים, והפלסטיות שלהם תורמת לכאב מתמשך. ניתן להשתמש בתרבית תאים ובצמחים חיצוניים לחקר תאי עצב אך הם מוסרים מההקשר הפיזיולוגי הרגיל שלהם. הדמיית סידן Pirt-GCaMP3 לאחר חשיפה כירורגית של ה-TG מאפשרת לחוקרי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01NS0128574 ו-R01DE031477 (ל-Y.S.K.), ופרס RISING STAR ממערכת אוניברסיטת טקסס (Y.S.K).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
הזרקת Anased (קסילזין)Covetrus , אקורן33197
Flurar 5x/0.25 M27 obejctiveכאל זייס420130-9900-000
אפליקטורים עם קצה כותנהמק'קסון24-106-1
המוסטט מעוקלכלים מדעיים עדינים13007-12
בקר טמפרטורת DCFHC40-90-8ד
כרית חימום בקר טמפרטורת DCFHC40-90-2-05
מלקחיים מצופים קרמיקה של Dumontכלים מדעיים עדינים11252-50
בקר טמפרטורה FHC DCFHC40-90-8ד
פלוריסו (איזופלורן)MWI בריאות בעלי חיים, קבוצת פיראמל501017
פרידמן-פירסון רונגרסכלים מדעיים עדינים16221-14
ג'ל קצףפייזר09-0353-01
תמונהJמכוני הבריאות הלאומייםאיי 153
קטסט (קטמין)אנונימיKET-00002R2
דגם 923-B מחזיק ראש הרדמה בגז עכבר (עכבר למבוגרים)קופף אינסטרומנטס923-ב
סרט במה ירוק זוהרJSITON/ אמזוןB803YW8ZWL
מערכת ידית מעבדה חשמלית קומפקטית M35באפלו ייצור שיניים ושות 'בע"מM35
Matrx VIP 3000 וופורייזר איזופלורןסימן ביניים91305430
מספריים לניתוח מיקרורובוזRS-5882
מספריים קפיציים לניתוח מיקרוכלים מדעיים עדינים15023-10
מספריים קפיציים לניתוח מיקרורובוזRS-5677
בדיקת תרמיסטור מיני רקטליתFHC40-90-5D-02
מספריים הפעלהרובוזRS-6812
עכברי Pirt-GCaMP3 C57/BL/6Jאוניברסיטת ג'ונס הופקינסלא ישיםניתן לדמיין את שני המינים באותה מידה. עכברים צריכים להיות בני 8 שבועות לפחות עקב ביטוי מקדם Pirt חלש או לסירוגין בעכברים צעירים יותר.
אשלגן כלוריפישר סיינטיפיקBP366-500
מסגרת סטריאוטקסיתקופף דגם 923-B923-ב
מסכה סטרוטקטית (פעילה) לעכברים ועוד; 30 גרם עם צינורותRWD מדעי החיים68663
סדק מתחדד TNT Bur (31P)באפלו ייצור שיניים ושות 'בע"מזהב 31P
עכברי td-עגבניות C57BL/6Jמעבדת ג'קסון7909
צלחת עליונה, 6 אינץ' x 10 אינץ'ניופורט290-TP
פיפטת העברה, 3 מ"לקול פארמרUX-06226-23
עכברי TrpV1-Cre C57BL/6Jמעבדת ג'קסון17769
מיקרוסקופ קונפוקלי Zeiss LSM 800כאל זייסLSM800
תוכנת Zeiss Zen 2.6 Blue Editionכאל זייסזן (מהדורה כחולה) 2.6

מקורות

  1. Kuramoto, E., et al. Three-dimensional topography of rat trigeminal ganglion neurons using a combination of retrograde labeling and tissue-clearing techniques. J Comp Neurol. 532 (2), e25584(2024).
  2. Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. Int J Mol Sci. 22 (11), 5810(2021).
  3. Levy, D., Burstein, R., Kainz, V., Jakubowski, M., Strassman, A. M. Mast cell degranulation activates a pain pathway underlying migraine headache. Pain. 130 (1-2), 166-176 (2007).
  4. Moskowitz, M. A., Macfarlane, R. Neurovascular and molecular mechanisms in migraine headaches. Cerebrovasc Brain Metab Rev. 5 (3), 159-177 (1993).
  5. Strassman, A. M., Raymond, S. A., Burstein, R. Sensitization of meningeal sensory neurons and the origin of headaches. Nature. 384 (6609), 560-564 (1996).
  6. Avraham, O., et al. Profiling sensory neuron microenvironment after peripheral and central axon injury reveals key pathways for neural repair. Elife. 10, e68457(2021).
  7. Bhuiyan, S. A., et al. Harmonized cross-species cell atlases of trigeminal and dorsal root ganglia. Sci Adv. 10 (25), eadj9173(2024).
  8. Chu, Y., et al. Single-cell transcriptomic profile of satellite glial cells in trigeminal ganglion. Front Mol Neurosci. 16, 1117065(2023).
  9. Mapps, A. A., et al. Diversity of satellite glia in sympathetic and sensory ganglia. Cell Rep. 38 (5), 110328(2022).
  10. Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Curr Biol. 9 (12), R429-R431 (1999).
  11. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  12. Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of trpv1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
  13. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).
  14. Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Sci Rep. 9 (1), 7651(2019).
  15. Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., Mcmahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
  16. Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Sci Adv. 2 (11), e1600990(2016).
  17. Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. J Neurosci. 41 (41), 8494-8507 (2021).
  18. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  19. Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: Modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. J Physiol. 597 (7), 2045-2061 (2019).
  20. Macdonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  23. Son, H., et al. Mast-cell-specific receptor mediates alcohol-withdrawal-associated headache in male mice. Neuron. 112 (1), 113-123.e4 (2024).
  24. Son, H., Zhang, Y., Shannonhouse, J., Gomez, R., Kim, Y. S. PACAP38/mast-cell-specific receptor axis mediates repetitive stress-induced headache in mice. J Headache Pain. 25 (1), 87(2024).
  25. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225(2020).
  26. Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
  27. Moayedi, Y., et al. The cellular basis of mechanosensation in mammalian tongue. Cell Rep. 42 (2), 112087(2023).
  28. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954.e4 (2017).
  29. Blaeser, A. S., et al. Trigeminal afferents sense locomotion-related meningeal deformations. Cell Rep. 41 (7), 111648(2022).
  30. Son, H., et al. Elucidation of neuronal activity in mouse models of temporomandibular joint injury and inflammation by in vivo GCaMP Ca2+ imaging of intact trigeminal ganglion neurons. Pain. 165 (12), 2794-2803 (2024).
  31. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  32. Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  33. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nat Commun. 7, 11450(2016).
  34. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nat Commun. 6, 8171(2015).
  35. Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nat Neurosci. 19 (9), 1201-1209 (2016).
  36. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine 2020. Temporomandibular disorders: Priorities for research and care. Yost, O., Liverman, C. T., English, R., Mackey, S., Bond, E. C. , The National Academic Press. Washington, DC. (2020).
  37. Eriksen, H. M. Endodontology--epidemiologic considerations. Endod Dent Traumatol. 7 (5), 189-195 (1991).
  38. Sidaravicius, B., Aleksejuniene, J., Eriksen, H. M. Endodontic treatment and prevalence of apical periodontitis in an adult population of vilnius, lithuania. Endod Dent Traumatol. 15 (5), 210-215 (1999).
  39. Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Nav1.8-positive and Nav1.8-negative sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (9), 3811-3816 (2019).
  40. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. (192), e64826(2023).
  41. Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca2+ activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. J Neurosci. 42 (31), 6020-6037 (2022).
  42. Zheng, Q., et al. Synchronized cluster firing, a distinct form of sensory neuron activation, drives spontaneous pain. Neuron. 110 (2), 209-220.e6 (2022).
  43. Mahadevan, A. S., et al. Cytonet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Comput Biol. 18 (6), e1009846(2022).
  44. Chen, C., et al. Long-term imaging of dorsal root ganglia in awake behaving mice. Nat Commun. 10 (1), 3087(2019).
  45. Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca2+ responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. J Pharmacol Sci. 137 (1), 101-104 (2018).
  46. Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
  47. Li, J., et al. Engineering of nemo as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
  48. Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nat Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
  49. Tan, C. H., Mcnaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
  50. Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nat Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
  51. Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
  52. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  53. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with genetically-encoded voltage indicator, ASAP4.4-kv. bioRxiv. , (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

גנגליון טריגמינלידימות בתוך הגוף (In Vivo)עכברי GCaMP3דימות קונפוקאליתמודליות תחושתיותגירוי פון פריי (Von Frey)תנודות סידן
ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעינים טריגמינליים שלמים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.