מאמר שיטה

מודל עכבר של מחלת כבד סטאטוטית הקשורה להפרעות בתפקוד מטבולי עם פיברוזיס

DOI:

10.3791/68294

⸱

18 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brooklyn College, City University of New York

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודל עכבר של מחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי (MASLD) עם תפקוד לקוי מטבולי, שינויים בביטוי גנים בכבד ושינויים היסטופתולוגיים בכבד הדומים ל-MASLD אנושי, כולל פיברוזיס המתקדם לפיברוזיס מתקדם שלב 3. מודל זה יכול לשמש במחקרים על פתופיזיולוגיה של MASLD ובמחקרים פרה-קליניים של טיפולים חדשים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיברוזיס בכבד הוא המנבא החשוב ביותר לתוצאות שליליות במחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי (MASLD). במחקרים פרה-קליניים של MASLD, עכברים הם מודל המחלה הנפוץ ביותר. עם זאת, במודלים אלה, קשה לגרום לפיברוזיס בכבד. פרוטוקול זה מתאר מודל עכברי של MASLD שבו עכברי Ay היפרפגיים ניזונים מתזונה עשירה בשומן ופרוקטוז, הדומה לתזונה הממוצעת בארה"ב. העכברים מפתחים סטיאטוזיס בכבד, פציעה, דלקת ופיברוזיס. פיברוזיס מתקדמת מפיברוזיס פרי-צלולרי, שלב 1 לאחר 16 שבועות, לפיברוזיס גישור, שלב 3 לאחר 12 חודשים. עכברים אלה מפתחים גם השמנת יתר, היפרטריגליצרידמיה, אי סבילות לגלוקוז והיפראינסולינמיה. מודל מחלה זה משכפל את ההיסטופתולוגיה של הכבד, את השינויים בביטוי הגנים בכבד ואת התפקוד המטבולי הלקוי של המחלה האנושית. פרוטוקול זה כולל שתי שיטות לכימות פיברוזיס: צביעה היסטולוגית של קולגן על ידי פיקרו-סיריוס אדום, וכימות תכולת הכבד של הידרוקסיפרולין. ניתן להשתמש בשיטות אלה לחקר פתופיזיולוגיה של MASLD ולמחקרים פרה-קליניים של טיפולים פוטנציאליים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת כבד סטאטוטית הקשורה לתפקוד מטבולי (MASLD) היא מחלת הכבד השכיחה ביותר, עם שכיחות של 31% עד 40% בארה"ב ו-42% ברחבי העולם 1,2,3,4. חולים עם MASLD יכולים לפתח דלקת כבד כבד הקשורה להפרעות מטבוליות (MASH), שנקראה בעבר דלקת כבד לא אלכוהולית (NASH), שחמת וקרצינומה של הכבד 5,6. MASLD מגביר את הסיכון לקרצינומה של הכבד, ובעקבות העלייה האחרונה בשכיחות MASLD, היא הפכה למחלת הכבד השכיחה ביותר בחולים המפתחים קרצינומה של הכבד 7,8. ב-MASLD, פיברוזיס הוא המנבא העיקרי להתקדמות לשחמת ולתוצאות קליניות שליליות, כולל תחלואה הקשורה לכבד (הפחתת פיצוי בכבד, אי ספיקת כבד או סרטן הכבד) ותמותה הקשורה לכבד 6,9,10,11. בהתאם לכך, מינהל המזון והתרופות מעודד פיתוח טיפולים המתמקדים ב-MASH/NASH עם פיברוזיס, כמו גם שימוש במודלים מתאימים של בעלי חיים12.

במחקרים פרה-קליניים של תרופות ובמחקרים מכניסטיים של MASLD, מודלים של עכברים משמשים לרוב13. תוארו אלפי דגמי עכברים של MASLD, מה שמרמז על חוסר הסכמה על מודל אופטימלי13,14. הקמת מודלים אופטימליים עומדת בפני מספר אתגרים. למרות שקל יחסית לגרום להשמנת יתר וסטיאטוזיס בעכברים על ידי האכלתם בתזונה עתירת שומן, קשה יותר לגרום לפיברוזיס בכבד 13,14,15,16. במודלים של MASLD המונעים על ידי דיאטות השמנת יתר, פיברוזיס מתפתחת לאט17 למרות שהתקדמות איטית זו עשויה לחקות טוב יותר את המחלה האנושית18, היא מגדילה את משך הזמן והעלות של מחקרים בבעלי חיים. דיאטות עם תכולת כולסטרול גבוהה (למשל, 2%) מקדמות התפתחות פיברוזיס; עם זאת, הם גם מפחיתים את הסינתזה האנדוגנית של כולסטרול, שהיא ההפך מהעלייה המתוארת במחלה האנושית15,16. חלק מהמודלים של MASLD משתמשים בעכברים מוטנטיים או מהונדסים גנטית; עם זאת, עשויות להיות להם אזהרות: עכברי OB/OB מפתחים השמנת יתר, סטיאטוזיס ותנגודת לאינסולין, אך חסר להם לפטין, שהוא מתווך של פיברוזיס; עכברי PTEN null מפתחים סטיאטוזיס אך אינם מפתחים עמידות לאינסולין15,17. לכן, מודלים של עכברים של MASLD דורשים לעתים קרובות משכי מחקר ארוכים, דיאטות עם תכולת כולסטרול גבוהה או מניפולציות גנטיות כדי לפתח פיברוזיס משמעותי14. כדי לטפל בחלק מהבעיות הללו, פיתחנו מודל עכברי שבו בעלי החיים מפתחים MASLD עם פיברוזיס המתקדם מפיברוזיס פרי-תאי/פריסינוסידלי (שלב 1) לפיברוזיס מגשר (שלב 3)19.

מטרת מאמר זה היא לתאר מודל זה של MASLD עם פיברוזיס בכבד ושתי שיטות לכימות פיברוזיס: צביעה היסטולוגית של קולגן על ידי picro-sirius red וכימות תכולת הידרוקסיפרולין בכבד.

הרציונל לפיתוח מודל זה היה שהמודלים השימושיים ביותר של בעלי חיים הם אלה המשכפלים בצורה הטובה ביותר את המחלה האנושית, הן במניעי המחלה והן בשינויים בהיסטופתולוגיה ובביטוי גנים. לכן, השתמשנו בתזונה הדומה לתזונה הממוצעת בארה"ב, הכוללת כמויות גבוהות למדי של שומן ופרוקטוז19,20. האכלנו את הדיאטה הזו לעכברים הנושאים את המוטציה הצהובה Agouti (Ay), ששימשה באופן נרחב כמודלים להשמנת יתר21. עכברים אלה מבטאים בכל מקום את חלבון האגוטי, אנטגוניסט של קולטני המלנוקורטין, כולל MC4R, הגורם להיפרפגיה ומשכפל את צריכת המזון המוגברת הנפוצה בהשמנת יתר אנושית 21,22,23. מודל זה מסכם את השינויים המגדירים MASH, כולל סטיאטוזיס, פגיעה בכבד, דלקת, פיברוזיס ותפקוד מטבולי לקוי.

היתרונות העיקריים של מודל זה הם המאפיינים שהופכים אותו לדומה למחלה האנושית. המודל משתמש בתזונה מערבית, שתוכננה להידמות לדיאטה האמריקאית הטיפוסית והוכחה כדיאטה היעילה ביותר בשכפול הפנוטיפ של MASLDאנושי 14,20. העכברים מפתחים שינויים היסטופתולוגיים בכבד הדומים לאלה המתוארים בכבד של בני אדם עם MASH19,24. העכברים מפתחים תפקוד מטבולי לקוי, המהווה קריטריון חיוני לאבחון MASLD5. הכבדים של עכברים עם MASH מראים שינויים בביטוי הגנים המסכמים את אלה בבני אדם עם MASH/NASH19. מחקר שנערך לאחרונה השווה 39 מודלים של עכברים של MASLD לדמיון שלהם למחלה האנושית. הוא כלל עכברי נוק-אאוט MC4R, החולקים את אותו מנגנון של היפרפגיה וקיבלו את אותה תזונה כמו המודל שתיארנו14. מודל זה דורג במקום החמישי (מתוך 39) בשל הדמיון שלו ל-MASLD אנושי כפי שהוערך על ידי פנוטיפ, היסטופתולוגיה של הכבד וטרנסקריפטומיקה14.

יתרונות נוספים של מודל זה הם: עכברי Ay זמינים מסחרית ממעבדת ג'קסון, וזמינים בזן C57BL/6J, הנמצא בשימוש נפוץ במחקרים מטבוליים21,25; עכברים מוטנטיים ניתנים לזיהוי בקלות לפי צבע פרוות השיער שלהם; ניתן לשלב את המודל עם מודלים של רווח או אובדן תפקוד כדי לחקור את תפקידם של גנים ספציפיים בהתפתחות MASLD; ולבסוף, המודל אינו משתמש בחסרים תזונתיים (מחסור בכולין או מתיונין), רכיבי מזון חריגים (חומצה כולית, אתיונין), תכולה גבוהה במיוחד של חומרים מזינים ספציפיים (שומני טראנס), או הפטוטוקסינים (פחמן טטרכלוריד), שאינם גורמים שכיחים ל-MASLD ועשויים שלא לשכפל את המחלה האנושית 13,14,17.

שיטה זו מתאימה לחקירת מנגנונים התורמים להתפתחות והתקדמות MASLD וכן להערכת התערבויות לטיפול או למניעתו. מודל זה שימושי במיוחד מכיוון שבעלי החיים לא רק מפתחים הן דלקת כבד והן תפקוד מטבולי לקוי, אלא גם מפתחים פיברוזיס המתקדם לשלב 3. ייתכן שהמודל אינו מתאים לחקר מנגנונים המשפיעים על התנהגות האכילה (למשל, אגוניסטים של GLP1R), מכיוון שלעכברים אלה יש היפרפגיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים של מכללת ברוקלין; פרוטוקול IACUC מספר 318.

1. מודל עכבר של MASLD עם פיברוזיס

  1. לגדל עכברים כדי לייצר צאצאי איי. הקימו זוגות רבייה עם עכברי Ay (B6. Cg-Ay/J). רשום את תאריך הלידה של הגורים.
  2. ודא שלהמלטות יש מספר דומה של גורים כדי לקדם האכלה וצמיחה נאותים ואחידים. שאפו ללדת חמישה עד שישה גורים בכל המלטה, מכיוון שזהו גודל ההמלטה הממוצע עבור עכברי C57BL/6J. גורים נוספים, רצוי כאלה מהמין שאינם נחוצים, ניתנים להמתת חסד או לאומץ.
    הערה: שימוש בזכרי Ay ונקבות מסוג בר (C57BL/6J Jax 0000664) עשוי לשפר את יעילות הרבייה מכיוון שעכברים נקבות C57BL/6J מסוג בר קלים להשגה ועשויים להיות מגדלים טובים יותר מעכברי Ay נקבות.
  3. הגדר כלובים לניסויים כמתואר להלן.
    1. זהו את עכברי האי לפי צבע הפרווה הצהוב שלהם. הקצו זיהוי ייחודי לכל עכבר ותייגו או סמנו את העכברים.
      הערה: האלל הצהוב אגוטי (Ay) של גן האגוטי מעניק צבע פרווה צהוב. האלל דומיננטי למחצה בהטרוזיגוטים. הומוזיגוטיות גורמת לקטלניות עוברית. לכן, עכברים עם צבע פרווה צהוב הם הטרוזיגוטיים עבור הגן Ay.
    2. גמילה מעכברים בגיל 21 יום. קבצו יחד עכברים שישוכנו באותו כלוב במהלך המחקר. מאכלסים שלושה או ארבעה עכברי איי בכל כלוב, בהתאם למשקל הגוף הצפוי ולהנחיות המוסדיות.
    3. האכילו צ'או ומים סטנדרטיים. עכברי בית בטמפרטורה סטנדרטית (20-23 מעלות צלזיוס) ולחות יחסית (40% עד 60%) עם מחזור אור של 12 שעות וחושך של 12 שעות.
  4. האכילו את עכברי האיי בתזונה עתירת שומן ופרוקטוז (דיאטה עתירת שומן ופרוקטוז, HFFD) החל מגיל 8 שבועות כמתואר להלן.
    1. ספקו לעכברי האי את התזונה המערבית, העשירה בשומן וסוכרוז (קלוריות מותאמות לדיאטה המערבית Inotiv TD.88137) אד ליביטום.
    2. הכינו תמיסה המכילה פרוקטוז (23 גרם/ליטר) וגלוקוז (19 גרם/ליטר) במי השתייה. עקר את התמיסה על ידי סינון דרך פילטר של 0.2 מיקרומטר ואחסן אותה בבקבוקים סטריליים. לאחר הפתיחה, שמור את התמיסה בקירור.
    3. לספק לעכברים את התמיסה המכילה פרוקטוז וגלוקוז לשתייה, בבקבוקי שתייה סטריליים. החלף את התמיסה והבקבוקים לפחות מדי שבוע, ובדוק אם יש צמיחה של מיקרואורגניזמים.
    4. השתמש במצעי כלוב ללא ערך תזונתי (למשל, שבבי עץ).
  5. עכברי בקרת הזנה תזונה דלת שומן ופרוקטוז כמתואר להלן.
    הערה: סוג עכברי הביקורת לשימוש תלוי בתכנון המחקר: אם משתמשים בעכברי Ay-HFFD כדי להעריך את השפעת התרופות, עכברי הביקורת יכולים להיות עכברי Ay-HFFD שטופלו בפלצבו. אם המודל משמש לחקר ההשפעה של שינוי גנטי על התפתחות פיברוזיס, עכברי Ay-HFFD ללא השינוי הגנטי יכולים לשמש כבקרות. אם רוצים פקדים ללא MASH, בצע את השלבים המתוארים כאן.
    1. השתמש בעכברים מסוג בר שהם חברי המלטה של עכברי האי. ניתן לזהות אותם לפי צבע הפרווה השחור שלהם.
    2. האכילו את העכברים בדיאטת בקרה (דיאטת בקרת שומן נמוכה Inotiv TD.08485; המכונה דיאטה דלת שומן ופרוקטוז, LFFD) החל מאותו גיל. ספקו לעכברים מי שתייה קבועים.
  6. עקוב אחר התפתחות השמנת יתר על ידי שקילת העכברים מדי שבוע על ידי הנחת בעלי החיים הערים במיכל זפת על מאזני מעבדה ורישום משקלם.
  7. ודא שלעכברים יש מספיק מזון ותמיסת שתייה בכל עת. עקוב ורשום את צריכת תמיסות המזון והשתייה כדי להעריך את צריכת הקלוריות, אם תרצה.
  8. אסוף רקמות כמתואר להלן.
    1. בצע איסוף רקמות לאחר 16 שבועות בדיאטת HFFD. המתת חסד של העכבר בשאיפת פחמן דו חמצני (או בשיטות אחרות שאושרו על ידי IACUC של המוסד).
      הערה: לאחר 16 שבועות, עכברי Ay שניזונו מתזונת HFFD סובלים בדרך כלל מפיברוזיס שלב 1; הארכת הזמן תוביל לפיברוזיס גדול יותר, ולהתקדם לשלב 3 לאחר 9 עד 12 חודשים.
    2. שקלו את העכבר ורשמו את המשקל19.
    3. אסוף דם במידת הצורך. לשם כך יש לשאוב דם מהווריד הנבוב התחתון עם מזרק של 1 מ"ל ומחט 27G לאחר פתיחת הבטן ולפני ניתוח הכבד (או להשתמש בכל שיטה אחרת שאושרה על ידי ה-IACUC).
    4. נתח את הכבד על ידי פתיחת הבטן עם חתך בקו האמצע, החזקת הכבד בהילום שלו בעזרת מלקחיים וחיתוך הרצועות הקושרות את הכבד לסרעפת ולרטרופריטונאום בעזרת מספריים. שקלו את הכבד ורשמו את המשקל.
    5. יש לשטוף את הכבד בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט קר כקרח (PBS). צלם את הכבד וכלול סרגל או אובייקט אחר כהתייחסות לגודל בתמונה. מניחים את הכבד בצלחת פטרי שמונחת על קרח.
    6. לנתח דגימות (כ-100 עד 150 מ"ג לדגימה) של מספר אונות, כולל האונה החציונית, האונה השמאלית והאונה הימנית. ודא שהדגימות בעובי של לא יותר מ-4 מ"מ כדי להקל על הקיבוע. מניחים אותם בתמיסה מקבעת (פורמלין 10% או פורמלדהיד 4%) למשך 24 שעות ומעבדים אותם לניתוח היסטופתולוגי (ראה להלן).
    7. נתח דגימות נוספות של מספר אונות. מניחים אותם בצינורות (1.5 או 2 מ"ל), מקפיאים אותם על ידי טבילתם בחנקן נוזלי ומאחסנים אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. דגימות אלו ישמשו למדידת תכולת הידרוקסיפרולין.
    8. אסוף דגימות של איברים אחרים במידת הצורך (רקמת שומן, שריר וכו')

2. צביעה היסטוכימית של קולגן וכימות מורפומטרי

הערה: השלבים הדורשים שימוש בכימיקלים מסוכנים ו/או נדיפים צריכים להיעשות במכסה אדים. יש לעבד את כל השקופיות במקביל באמצעות כלים מכתימים ומחזיקי שקופיות.

  1. הכן חלקי כבד כמתואר להלן.
    1. תקן את רקמת הכבד על ידי שמירתה בפורמלין (או פורמלדהיד) למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. השתמש בנפח של קיבוע גדול פי 20 מנפח הרקמה. לאחר מכן, העבירו רקמות ל-70% אתנול. ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה.
      הערה: ניתן להניח רקמות בקלטות היסטולוגיות שמונחות לאחר מכן במיכל עם קיבוע או, לחילופין, במיכלים או צינורות בודדים.
    2. הטמיעו רקמות בפרפין. זה נעשה בדרך כלל על ידי מתקן או שירות ליבה של היסטופתולוגיה.
    3. השג קטעים בעובי של 0.5 מיקרומטר המותקנים על שקופיות (שקופיות לא טעונות מספיקות). אפשר לחלקים להתייבש על ידי חשיפתם לאוויר בטמפרטורת החדר. מתקן או שירות ליבה של היסטופתולוגיה בדרך כלל עושה זאת. ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה.
  2. יש להפחית ולחות חלקים כמתואר להלן.
    1. הפחיתו את החלקים על ידי טבילתם בשני שינויים של תמיסת דה-פרפיניזציה/ניקוי (קסילן או ציטריזולב), למשך 5-15 דקות בכל אחד.
    2. החזר לחות על ידי טבילה רצופה של שקופיות ב-100% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול ומים, למשך 5 דקות בכל אחת.
  3. קטעי כתמים באדום פיקרו-סיריוס כמתואר להלן.
    1. טבלו חלקים בתמיסה של סיריוס אדום (אדום ישיר 80) 1 גרם/ליטר בחומצה פיקרית 1.3% למשך שעה. אין להכתים זמן רב יותר, מכיוון שאדום ישיר עלול להכתים מבנים אחרים מלבד קולגן (למשל, גרעינים). הוסף ירוק מהיר (1 גרם/ליטר) לתמיסת הצביעה אם רוצים צביעה נגדית26. לחלופין, צבעו גרעינים עם המטוקסילין27 של וייגרט.
    2. החזר תמיסה אדומה של picro-sirius למיכל זכוכית כהה או פלסטיק סגור לאחסון. ניתן לעשות שימוש חוזר בתמיסה מספר פעמים (למשך 20 שנה לפחות27).
  4. טבלו דגימות באתנול (100%) למשך 5 דקות להתייבשות. חזור על הפעולה עם החלפה שנייה של אתנול.
  5. טבלו בתמיסת פינוי (קסילן או ציטריזולב) עד שהם מוסרים בנפרד לצורך הרכבה.
  6. הסר שקופית אחת בכל פעם מתמיסת הניקוי והסר עודפי נוזלים על ידי ספיגה על מגבות נייר. הוסף אמצעי הרכבה (כ-50 עד 100 מיקרוליטר). כסו את החלק בכיסוי ולחצו בעדינות על הכיסויהחלקה כלפי מטה כדי להסיר בועות אוויר. תן לאוויר להתייבש.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה.
  7. התבונן בקטעים באמצעות מיקרוסקופ אור עם תאורת שדה בהיר ומטרות פי 4 עד 20x - קולגן מופיע אדום על רקע צהוב-כתום בהיר. אזורי עניין של תמונה עם מצלמה צבעונית, בהתאם להוראות המצלמה.
  8. בצע הדמיה עם מיקרוסקופ אור מקוטב כמתואר להלן.
    1. הפעל והתאם את מסנני המקטב והמנתח בצורה אורתוגונלית כדי להבטיח שהקולגן נראה ושאות הרקע מינימלי. קולגן נראה בלבן, צהוב או כתום על רקע כהה. בקטעים עם מעט פיברוזיס או ללא פיברוזיס, קולגן בדפנות כלי הדם יהיה גלוי. שמור על הגדרות, כולל עוצמת תאורה, זהות עבור כל הדוגמאות שיש להשוואה.
    2. תמונה באמצעות מצלמה בשחור-לבן או במצב מונוכרום במצלמה צבעונית. השתמש במטרת הגדלה פי 4. צלם מספר תמונות בכל קטע. הימנע מאזורים הסמוכים להילום אם יש להם כלי דם גדולים. השתמשו באותן קביעות לכל התמונות להשוואה.
  9. בצע כימות מורפומטרי באמצעות Photoshop (חלופה א') כמתואר להלן.
    1. כמת את האזור הלבן בתמונות, המתאים לקולגן. ב- Photoshop, לחצו על Select > Color range, ולאחר מכן בחרו Highlights, והתאימו את הפרמטרים Fuzziness ו- Range לבחירת פיקסלים לבנים המתאימים לקולגן. לאחר מכן, בחר Window > Histogram > Expanded View ורשום את מספר הפיקסלים שנבחרו, המוצג לצד הפרמטר Pixels. השתמשו באותם פרמטרים לכל התמונות להשוואה.
    2. כימות השטח הכולל של התמונה. ב- Photoshop, לחצו על Select > All ולאחר מכן רשמו את מספר הפיקסלים הכולל כפי שנעשה קודם לכן.
    3. חשב את אחוז שטח התמונה המתאים לקולגן על-ידי חלוקת מספר הפיקסלים הלבנים במספר הפיקסלים הכולל. ערכים מבוטאים בדרך כלל כאחוזי שטח.
  10. בצע כימות מורפומטרי באמצעות ImageJ (חלופה ב') כמתואר להלן.
    1. בחרו אזורים לבנים בתמונות המתאימים לקולגן. פתחו את הכלי Threshold בלחיצה על Image > Adjust > Threshold (או הקישו Shift + T). הגדר את טווח הסף כדי להבטיח שרק אזורים מוכתמים בקולגן (אזורים לבנים) יודגשו באדום (לדוגמה, סף מינימלי 64; סף מקסימלי: 255) ולחץ על החל. זה יהפוך את התמונה לבינארית, ימיר את אזור הקולגן לשחור ואת הרקע ללבן.
    2. מדדו את שטח התמונה הכולל בלחיצה על 'נתח' > קבעו מדידות. בדוק את האזור ואת תווית התצוגה. לחץ על OK. לחץ על נתח > מדידה (או הקש M בלוח המקשים). חלון התוצאות יציג את שטח התמונה הכולל.
    3. כדי למדוד את שטח הקולגן ואחוזי הקולגן, ראשית, הפעל את Limit to Threshold על-ידי לחיצה על Analyze > Set Measurements. בדוק אזור, שבר שטח (ImageJ יחשב את % הקולגן באופן אוטומטי), הגבל לסף ותווית תצוגה. לחץ על OK. לאחר מכן, לחץ על נתח > מדידה (או הקש M). חלון התוצאות יציג: אזור קולגן (ספירת פיקסלים מוחלטת) ושבר שטח (אחוז קולגן מסך התמונה).
    4. שמור את התוצאות על-ידי בחירה בשמירה בשם או העתק אותן ללוח והדבק אותן בגיליון אלקטרוני.

3. כימות הידרוקסיפרולין בכבד

הערה: השלבים הדורשים שימוש בבסיסים וחומצות חזקים צריכים להתבצע עם ציוד מגן אישי מתאים.

  1. שקלו דגימות כבד שהוכנו בשלב 1.8.7 ורשמו משקל. יש להניח את הרקמות בשפופרת המתאימה להומוגניזציה. הוסף מים נטולי יונים באמצעות יחס מים לרקמה של 900 מיקרוליטר מים לכל 100 מ"ג רקמה.
  2. הומוגניזציה על ידי הכאת חרוזים או שיטה אחרת על פי הוראות היצרן עד שהרקמה הומוגנית לחלוטין, כפי שהוערך על ידי תצפית חזותית. ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, וניתן לאחסן הומוגנטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
  3. בצע משקעי חלבון כמתואר להלן. השלבים הבאים נעשים בטמפרטורת החדר, למעט כאשר צוינה טמפרטורה שונה.
    1. העבירו כ-500 מיקרוליטר ל-1000 מיקרוליטר של הומוגנט לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. העבר את אותו אמצעי אחסון עבור כל הדגימות.
    2. הוסף חומצה טריכלורואצטית לריכוז סופי של 12% (למשל, הוסף 120 מיקרוליטר של חומצה טריכלורואצטית ל-880 מיקרוליטר הומוגנט)28. מערבולת קצרה לערבב.
    3. דגירה של דגימות באמבט קרח/מים למשך 30 דקות. צנטריפוגה ב-6,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. נוצר משקע המכיל את החלבון. הסר סופרנטנט על ידי שאיפה. שמור את הצינורות על קרח.
    4. הוסף 1 מ"ל אתנול קר כקרח (100%) כדי לשטוף את הגלולה. השעו מחדש את הגלולה באמצעות סוניקציה (או שיטה אחרת) וודאו חזותית שהחומר מושעה מחדש. צנטריפוגה ב-6,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולהסיר סופרנטנט על ידי שאיפה. השתמש בהגדרות סוניקציה בהתאם להוראות הציוד (למשל, שימוש בסוניפייר Branson SFX 150 עם מיקרו-טיפ בקוטר 3.2 מ"מ, משרעת של 70% למשך 10 שניות יעילה עבור רוב הדגימות). חזור על הכביסה פעמיים.
    5. הניחו לגלולה להתייבש באוויר למשך 10 דקות, או יותר במידת הצורך.
  4. בצע הידרוליזה של חלבון כמתואר להלן.
    1. הוסף 800 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית 6 N לצינורות המכילים את משקעי החלבון. השעו מחדש את הגלולה באמצעות סוניקציה (או שיטה אחרת), תוך שימוש באותן הגדרות כמו בשלב 3.3.4.
    2. העברת תרחיף חלבון לצינורות זכוכית או בקבוקונים עם מכסי בורג; סגור בחוזקה. דוגרים צינורות בתנור בחום של 110 מעלות צלזיוס למשך 22 ± 2 שעות29.
    3. צינורות צנטריפוגה ב 16,000 x גרם למשך 10 דקות; חלקיקים יהוו גלולה. זה בדרך כלל דורש העברת ההידרוליזט מבקבוקוני הזכוכית לצינורות צנטריפוגה לפני הצנטריפוגה.
    4. העבירו את הסופרנטנט, המכיל הידרוקסיפרולין, לצינורות של 1.5 מ"ל. ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה. ניתן לאחסן הידרוליזטים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  5. הכן עקומה סטנדרטית לריכוז הידרוקסיפרולין. עבור דגימות כבד עם פיברוזיס שלב 1 עד 3, תוך שימוש בכמויות הרקמה המצוינות בפרוטוקול זה, ריכוזים סטנדרטיים של עד 125 מיקרוגרם/מ"ל מספיקים (למשל, דילולים סדרתיים של 125, 62.5, 31.3, 15.6, 7.81, 3.91, 1.95 ו-0 מיקרוגרם/מ"ל). הכן את התקנים על ידי דילול הידרוקסיפרולין בחומצה הידרוכלורית 6 N.
  6. מעבירים 40 מיקרוליטר מכל דגימה וסטנדרטית לצינורות צנטריפוגה מסומנים של 1.5 מ"ל. הוסף 10 מיקרוליטר של 10 N נתרן הידרוקסיד לכל אחד ומערבולת קצרה לערבוב.
  7. בצע חמצון של הידרוקסיפרולין כמתואר להלן.
    1. הכן מאגר אצטט-ציטראט המכיל חומצה אצטית 1.2% v/v, חומצת לימון 46 גרם/ליטר, נתרן אצטט טריהידרט 120 גרם/ליטר ונתרן הידרוקסיד 34 גרם/ליטר במים נטולי יונים, והתאם את pH החיץ ל-6.5.
    2. הכינו תמיסה של 12.7 גרם/ליטר של כלורמין T במים:n-פרופנול:מאגר אצטט-ציטראט (1:1:8 v:v:v). ראשית, ממיסים כלורמין T במים על ידי ערבוב, לאחר מכן מוסיפים n-פרופנול, מערבבים ולאחר מכן מוסיפים מאגר אצטט-ציטראט ומערבבים.
    3. הוסף 450 מיקרוליטר של תמיסת כלורמין לצינורות עם דגימות ותקנים. מערבבים על ידי מערבולת. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות30.
  8. הכן את המגיב של ארליך עם 1 M 4-(Dimethylamino) benzaldehyde בחומצה פרכלורית: פרופנול 1:2 (v/v). הוסף 500 מיקרוליטר של המגיב של ארליך לדגימות ולתקנים. מערבבים על ידי מערבולת.
  9. דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בבלוק חימום, אמבט מים או חממה. כאשר הדגירה מסתיימת, הניחו לדגימות ולתקנים להתקרר לטמפרטורת החדר.
  10. מדוד את הספיגה של דגימות ותקנים באורך גל של 550 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
  11. התווה ספיגה לעומת כמויות סטנדרטיות והשתמש ברגרסיה ליניארית כדי ליצור עקומה סטנדרטית. השתמש בפרמטרים מהעקומה הסטנדרטית כדי לחשב את ריכוז ההידרוקסיפרולין בדגימות.
  12. חשב את כמות ההידרוקסיפרולין בדגימות הכבד על סמך הנפח הכולל של ההידרוליזט (שלב 3.4) ונרמל לפי מסת הרקמה המתאימה לנפח ההומוגנאט המשמש למשקעי החלבון (שלב 3.3.1). בטא את התוצאות כ-ng של הידרוקסיפרולין למ"ג רקמה. לחלופין, ניתן למדוד את ריכוז החלבון בהומוגנטים ולבטא את התוצאות כמסה של הידרוקסיפרולין למסה של חלבון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עכברים שניזונו מ-HFFD עלו במשקל יותר מעכברים מסוג בר שאכלו את ה-LFFD ופיתחו השמנת יתר (איור 1A). הם עולים במשקל מהר יותר במהלך 4 השבועות הראשונים של האכלת HFFD, ועולים בערך 3-4 גרם בשבוע. לאחר 8 שבועות, הם עולים במשקל בקצב דומה לעכברי ביקורת (כ-0.6 גרם לשבוע)19. אחרי 16 שבועות, עכברי Ay שהוזנו ב-HFFD שוקלים כ-45 גרם עד 50 גרם (ממוצע של שלושה ניסויים נפרדים) ושוקלים כ-40% עד 80% יותר מעכברי ביקורת מסוג בר שהזינו את ה-LFFD (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר של MASLD עם פיברוזיס בכבד המשחזר את המחלה בבני אדם 5,6. העכברים מפתחים סטיאטוזיס בכבד, כפי שמוצג על ידי סטיאטוזיס מעורב מיקרו ומקרו-שלפוחית בהיסטולוגיה ותכולת טריאציל גליצרול מוגברת בכבד19. העכברים מפתחים גם השמנת יתר, היפרטריגליצרידמיה, אי סבילות לגלוקוז, ודווח על יתר לחץ דם, אשר בשילוב עם סטיאטוזיס בכבד, תואמים את קריטריוני האבחון של MASLD בבני אדם19,32<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות K22CA178098, R03DK101863 ו-R15DK131627 וקרנות סטארט-אפ מברוקלין קולג' (ל-JMC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4-(דימתילמינו)בנזאלדהידסיגמא-אלדריץ'D2004
חומצה אצטיתמגווןNA
דיאטת קלוריות מותאמות דיאטה מערביתאינוטיבTD.88137הדיאטה מכילה שומן (42% קלוריות) וסוכרוז (34% בשבוע). ספקים אחרים מספקים דיאטות עם הרכב דומה
B6. Cg-Ay/Jמעבדת ג'קסון000021לזן יש את המוטציה הצהובה הקטלנית של אגוטי ורקע C57BL6/J. כיום, מעבדת ג'קסון שומרת על הזן בכי.
C57BL/6Jמעבדת ג'קסון000664
צנטריפוגהמגווןNAעם רוטור לצינורות של 1.5 מ"ל, מקוררים, שיכולים להגיע ל-16,000 XG.
צנטריפוגהמגווןNA
כלוראמין-T הידראטסיגמא-אלדריץ'857319
חומצה ציטריתמגווןNA
דיירקט רד 80סיגמא365548-5G
אתנולמעבדות דקון2701
תמיסת פורמלין, נייטרלית עם בופרסיגמאHT501128
פרוקטוזסיגמא-אלדריץ'F0127
גלוקוזסיגמא-אלדריץ'G8270
ציוד עיבוד היסטולוגיהNANAהטמעה וחתך יכולים להתבצע במעבדת החוקרים או במתקן חיצוני
הומוגנייזרמגווןNAמכות חרוזים יעילות לעיבוד דגימות מרובות. ניתן להשתמש בשיטות הומוגניזציה נוספות
חומצה הידרוכלוריתמגווןNA
הידרוקסיפרוליןסיגמאH5534
דיאטת שליטה דלת שומןאינוטיבTD.08485דיאטת בקרה, דלת שומן (13% קלוריות) וסוכרוז (12% עם שבוע)
מיקרוסקופ המצויד למיקרוסקופ אור מקוטבמגווןNA
N-פרופנולמגווןNA
חומצה פרכלוריתמגווןNA
מדיום הרכבה פרמאונטפישר סיינטיפיקSP15-100
חומצה פיקריק, תמיסה מימית רוויה, ספקטרוםפישר18612375
נתרן אצטט טריהידרטמגווןNA
נתרן הידרוקסידמגווןNA
סוניקטורמגווןNASonicator שימושי להחזיר כדורים בשלב 2.5, אבל לא הכרחי לחלוטין
חומצה טריכלורואצטיתמגווןNA
משקפי VWR Micro Cover, מלבנייםVWR 48393-081
VWR Premium Superfrost Plus Microscope Slides | VWRVWR 48311-703
מים, דה-יוניזציהמגווןNAמים דה-יוניים ממערכת טיהור מים או נרכשים מספק.
קסילניםפישר סיינטיפיקX3FCitrisolv Clearing Agent  (פישר 22-143-975) נמכר כאלטרנטיבה ידידותית לסביבה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ciardullo, S., Carbone, M., Invernizzi, P., Perseghin, G. Exploring the landscape of steatotic liver disease in the general US population. Liver Int. 43 (11), 2425-2433 (2023).
  2. Lee, B. P., Dodge, J. L., Terrault, N. A. National prevalence estimates for steatotic liver disease and subclassifications using consensus nomenclature. Hepatology. 79 (3), 666-673 (2024).
  3. Kalligeros, M., et al. Prevalence of Steatotic Liver Disease (MASLD, MetALD, and ALD) in the United States: NHANES 2017-2020. Clin Gastroenterol Hepatol. 22 (6), 1330-1332.e4 (2024).
  4. Younossi, Z. M., Kalligeros, M., Henry, L. Epidemiology of Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease. Clin Mol Hepatol. 31 ((Suppl)), S32-S50 (2024).
  5. Rinella, M. E., et al. A multisociety Delphi consensus statement on new fatty liver disease nomenclature. Hepatology. 78 (6), 1966-1986 (2023).
  6. Rinella, M. E., et al. AASLD Practice Guidance on the clinical assessment and management of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 77 (5), 1797-1835 (2023).
  7. Friedman, S. L. Hepatic Fibrosis and Cancer: The Silent Threats of Metabolic Syndrome. Diabetes Metab J. 48 (2), 161-169 (2024).
  8. Phoolchund, A. G. S., Khakoo, S. I. MASLD and the Development of HCC: Pathogenesis and Therapeutic Challenges. Cancers. 16 (2), 259(2024).
  9. Taylor, R. S., et al. Association Between Fibrosis Stage and Outcomes of Patients With Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Gastroenterology. 158 (6), 1611-1625.e12 (2020).
  10. Younossi, Z. M., et al. Liver histology is associated with long-term clinical outcomes in patients with metabolic dysfunction-associated steatohepatitis. Hepatol Commun. 8 (6), e0423(2024).
  11. Dulai, P. S., et al. Increased risk of mortality by fibrosis stage in nonalcoholic fatty liver disease: Systematic review and meta-analysis. Hepatology. 65 (5), 1557-1565 (2017).
  12. Noncirrhotic Nonalcoholic Steatohepatitis With Liver Fibrosis: Developing Drugs for Treatment; Draft Guidance for Industry. The Federal Register / FIND. , Food and Drug Administration. (2018).
  13. Im, Y. R., et al. A Systematic Review of Animal Models of NAFLD Finds High-Fat, High-Fructose Diets Most Closely Resemble Human NAFLD. Hepatology. 74 (4), 1884-1901 (2021).
  14. Vacca, M., et al. An unbiased ranking of murine dietary models based on their proximity to human metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD). Nat Metab. 6 (6), 1178-1196 (2024).
  15. Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Animal Models of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis: Do They Reflect Human Disease. Adv Nutr. 11 (6), 1696-1711 (2020).
  16. Wang, S., Friedman, S. L. Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).
  17. Farrell, G., et al. Mouse Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Toward Optimization of Their Relevance to Human Nonalcoholic Steatohepatitis. Hepatology. 69 (5), 2241-2257 (2019).
  18. Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease. J. Hepatol. 68 (2), 230-237 (2018).
  19. St Rose, K., et al. Mouse model of NASH that replicates key features of the human disease and progresses to fibrosis stage 3. Hepatol Commun. 6 (10), 2676-2688 (2022).
  20. Hintze, K. J., Benninghoff, A. D., Cho, C. E., Ward, R. E. Modeling the Western Diet for Preclinical Investigations. Adv Nutr. 9 (3), 263-271 (2018).
  21. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L. J., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Dis Model Mech. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  22. Okumura, K., et al. Exacerbation of dietary steatohepatitis and fibrosis in obese, diabetic KK-A(y) mice. Hepatol Res. 36 (3), 217-228 (2006).
  23. Lin, X., Li, H. Obesity: Epidemiology, Pathophysiology, and Therapeutics. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 706978(2021).
  24. Brunt, E. M. Pathology of fatty liver disease. Mod Pathol. 20 Suppl 1, 40(2007).
  25. Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Dig Dis Sci. 61 (5), 1325-1336 (2016).
  26. Caviglia, J. M., et al. MicroRNA-21 and Dicer are dispensable for hepatic stellate cell activation and the development of liver fibrosis. Hepatology. 67 (6), 2414-2429 (2018).
  27. Kiernan, J. Histological and histochemical methods. , Scion Publishing Ltd. (2015).
  28. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. S. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Sci. 18 (5), 980-993 (2009).
  29. Davidson, I. Hydrolysis of samples for amino acid analysis. Methods Mol Biol. 211, 111-122 (2003).
  30. Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clin Biochem. 29 (3), 225-229 (1996).
  31. Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
  32. Mark, A. L., et al. Contrasting blood pressure effects of obesity in leptin-deficient ob/ob mice and agouti yellow obese mice. J Hypertens. 17 (12 Pt 2), 1949-1953 (1999).
  33. Luo, Y., et al. Metabolic phenotype and adipose and liver features in a high-fat Western diet-induced mouse model of obesity-linked NAFLD. Am J Physiol Endocrinol Metab. 310 (6), 418(2016).
  34. Lonardo, A., Suzuki, A. Sexual Dimorphism of NAFLD in Adults. Focus on Clinical Aspects and Implications for Practice and Translational Research. J Clin Med. 9 (5), 1278(2020).
  35. Lonardo, A., Ballestri, S., Mantovani, A., Targher, G., Bril, F. Endpoints in NASH Clinical Trials: Are We Blind in One Eye. Metabolites. 14 (1), 40(2024).
  36. Giles, D. A., et al. Thermoneutral housing exacerbates nonalcoholic fatty liver disease in mice and allows for sex-independent disease modeling. Nat Med. 23 (7), 829-838 (2017).
  37. Hao, L., Khan, M. S. H., Zu, Y., Liu, J., Wang, S. Thermoneutrality Inhibits Thermogenic Markers and Exacerbates Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Mice. Int J Mol Sci. 25 (15), 8482(2024).
  38. Horakova, O., et al. Thermoneutral housing promotes hepatic steatosis in standard diet-fed C57BL/6N mice, with a less pronounced effect on NAFLD progression upon high-fat feeding. Front Endocrinol. 14, 1205703(2023).
  39. Suzuki, A., Diehl, A. M. Nonalcoholic Steatohepatitis. Annu Rev Med. 68, 85-98 (2017).
  40. Arrese, M., et al. Insights into Nonalcoholic Fatty-Liver Disease Heterogeneity. Semin Liver Dis. 41 (4), 421-434 (2021).
  41. Wentworth, B. J., Caldwell, S. H. Pearls and pitfalls in nonalcoholic fatty liver disease: tricky results are common. Metab Target Organ Damage. 1 (1), 2(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Sirius Red

מאמרים קשורים