הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכת השפעת הקדמיום על מצב החמצון החיזור והפרופיל המטבולי של קיפודי הים Paracentrotus lividus

762 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68300

⸱

29 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Higher Institute of Biotechnology - Sidi Thabet, Laboratory of Biotechnology and Valorization of Bio-Geo-Resources, University Manouba, 2Faculty of Sciences of Tunis, Laboratory of Ecology, Biology and Physiology of Aquatic Organisms LR, University Tunis El Manar, 3Laboratory of Mass Spectrometry, National Institute of Research and Physical-Chemical Analysis (INRAP) Biotechpole Sidi Thabet, 4Department of Chemistry, College of Sciences at Bisha, University of Bisha, 5Department of Applied Medical Sciences, Applied College at Bisha, University of Bisha

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מדגיש את שיטות המיצוי והאפיון של תרכובות ביו-אקטיביות מקיפודי הים Paracentrotus lividus (Echinoderm) וכן קביעת פרמטרים של עקה חמצונית לאחר חשיפה לקדמיום.

תקציר

קדמיום (Cd) היא אחת המתכות הכבדות המזיקות ביותר לאורגניזמים ימיים ומזהמת נפוץ בביוטה ימית. בגלל הזמינות הביולוגית הגבוהה שלו, ההתמדה והיכולת לצבור ביולוגית, קדמיום (Cd), מתכת כבדה רעילה הנפלטת על ידי כריית נגר, פריקה תעשייתית ותשומות חקלאיות, הוא אחד המזהמים המזיקים ביותר לאורגניזמים ימיים ומזהם נפוץ בביוטה ימית. המחקר הנוכחי העריך את ההשפעות הרעילות הפוטנציאליות של קדמיום על סמנים ביולוגיים של מתח חמצוני ופרופילי מטבוליטים בבלוטות המין Paracentrotuslividus שנחשפו לטווח ריכוזים (0.0183, 0.183 ו-1.83 מ"ג/ליטר) במשך 96 שעות. התוצאות הראו כי Cd גורם לעקה חמצונית על ידי עלייה ברמות מלונדיאלדהיד, מי חמצן והידרופרוקסיד שומנים בהשוואה לקבוצת הביקורת, כמו גם הגברת הפעילות נוגדת החמצון (הפחתת גלוטתיון וקטלאז). בנוסף, בהתבסס על ניתוח כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה, זוהו 74 מטבוליטים בתמציות בלוטות המין הן של קיפודי הים שטופלו והן של הביקורת. ניתוח ההבחנה בין הריבועים הפחותים החלקיים חשף הפרדה מעמדית ברורה והבחין בין תשעה מטבוליטים רלוונטיים באמצעות ציוני ה-VIP. ניתוח מפת החום שבוצע הדגיש הפרעה ברמות הסטרולים ותרכובות חומצות השומן כגון Cholest-5-en-3-ol (3.beta.)-, Desmosterol, ו-(23S)-ethylcholest-5-en-3.beta.-ol וחומצה איקוסאפנטאנואית (EPA), כמו גם ההגנות נוגדות החמצון כגון חומצה רטינואית, וויסות סטרואידים כגון Pregna-5-en-20-one, 3-hydroxy-,(3β). בסך הכל, הנתונים שלנו חשפו את הרגישות הגבוהה של בלוטות המין ל-Cd, אפילו בריכוזים נמוכים יחסית.

מבוא

הסביבה הימית יכולה להיחשב גם כיור חשוב לכמה כימיקלים רעילים, כמו למשל מתכות כבדות. בשל הליפופיליות שלהם, ליסודות אלה יש נטייה להיקשר לחלקיקים מרחפים ולהצטבר בהדרגה במשקעים ימיים, שם הם מראים ירידה בניידות ובזמינות הביולוגית. כתוצאה מכך, משקעים ימיים משמשים כשקע מתכת כבד עיקרי1. בין מזהמים אלה, קדמיום (Cd) הוכר זה מכבר כמזהם מים עולמי עיקרי המאיים על מערכות אקולוגיות ועל ביוטה2 הקשורה אליהן. שליש מה-Cd הקיים במערכות אקולוגיות מימיות מגיע מייצור ושימוש בדשני פוספט2. מקורות אחרים לשחרור Cd לסביבה כוללים את מגזר הכרייה, חברות ציפוי אלקטרוני ותהליכים טבעיים של קרום כדור הארץ3. מזהם זה נפוץ מאוד בשל יכולתו להיות מועבר בקלות דרך מדיה מימית, והניידות הגדולה יחסית שלו בניגוד למתכות כבדות אחרות2. על פי הספרות, ריכוזי Cd נעים בין 12 ל-16 x 10−3 מיקרוגרם/ליטר בים הבלטי4, ובין 13.4 x 10−3 ל-1.49 מיקרוגרם/ליטר באתר מזוהם מאוד לאורך חופי גליסיה (צפון מערב חצי האי האיברי)5. רמות גבוהות בהרבה של Cd תועדו בכמה אזורים מזוהמים בים התיכון, שם הריכוזים עשויים להגיע ל-80.4 x 10-3 מיקרוגרם/ליטר ליד האי סיציליה (איטליה)6, ו-48 מיקרוגרם/ליטר במפרץ גאבס (תוניסיה)7. מתכת מעבר מתמשכת, מצטברת ביולוגית ולא חיונית זו מוכרת ביכולתה לגרום לבעיות בריאותיות חמורות הן לאורגניזמים אנושיים והן לאורגניזמים ימיים8. Cd יכול להפעיל ישירות את רעילותו על ידי קשירה לחלבונים, עיכוב פעילויות אנזימים והפרעה להומאוסטזיס סידן9. זה יכול גם לפעול בעקיפין באמצעות יצירת מיני חמצן תגובתיים (ROS), מה שמוביל לנזק חמצוני לביו-מולקולות כגון שומנים, חלבונים ו-DNA10. מספר מחקרים מדעיים דיווחו כי זיהום Cd עלול לעורר הפרעות מבניות ותפקודיות באורגניזמים מימיים11.

כמו שאר חסרי החוליות הימיים, קיפודי הים חשופים במיוחד לזיהום ימי. למרות יכולתם לצבור רמות גבוהות של מתכות כבדות, קיפודי ים יכולים להתמודד עם זיהום מתכות ולהחזיק מעמד בסביבות מזוהמות12. לפיכך, הם מוכרים בדרך כלל כאורגניזמים זקיפים ונמצאים בשימוש נרחב כמודלים למחקרים אקוטוקסיקולוגיים וסביבתיים13. מחקרים רבים חקרו את ההשפעה של חשיפה ל-Cd על כמה מיני קיפודי ים בשלבי חיים שונים, כולל אורגניזמים בוגרים, עוברים וזחלים13. נמצא כי חשיפה ל-Cd עלולה לגרום למגוון תופעות לוואי החל מהפחתת קצב הפריית הביציות, חריגות בהתפתחות העובר והזחל, מתח חמצוני ועד אפופטוזיס ואוטופגיה13. רוב הספרות הזמינה מתמקדת בהשפעת Cd על עוברים מתפתחים של קיפודי ים13,14; עם זאת, רק כמה מחקרים15בוצעו כדי להבין את ההשפעות של מתכת זו על הפרופיל המטבולי של קיפודי ים בוגרים, ואין מידע זמין על חילוף החומרים של השומנים.

חשיפה מתמשכת של עוברי Paracentrotus lividus (Lamarck, 1816) לריכוזי קדמיום תת-חריפים/תת-קטלניים גורמת להתפתחות לא תקינה עם פגמים בהתארכות ובדפוס השלד, יחד עם הפחתה כללית של סינתזת החלבון, וביטוי מטלותיונין דיפרנציאלי16.

השיטה המוצעת משפרת את הערכת רעילות קדמיום (Cd) ומתח חמצוני באורגניזמים ימיים על ידי שילוב של בדיקות ביוכימיות עם פרופיל מטבולומי ממוקד ולא ממוקד באמצעות כרומטוגרפיה גזית-ספקטרומטריית מסה (GC-MS). בהשוואה לגישות מסורתיות המסתמכות אך ורק על סמנים ביולוגיים בודדים כגון חמצון שומנים או פעילויות אנזימים נוגדי חמצון (למשל, SOD, CAT), התוספת של בדיקת מטבוליטים מבוססת GC-MS מספקת טביעת אצבע ביוכימית מקיפה של המצב הפיזיולוגי של האורגניזם17. אינטגרציה זו מאפשרת זיהוי רגיש ושיטתי יותר של השפעות תת-קטלניות, אפילו בריכוזי Cd נמוכים, ויכולה לזהות הפרעות מוקדמות בחילוף החומרים האנרגטי, תחלופת חומצות אמינו ומסלולי חמצון המתרחשים לפני נזק טוקסיקולוגי נצפה. חשוב לציין, שיטה זו משלימה את ההערכות הטוקסיקולוגיות הקיימות על ידי מתן נתונים ברזולוציה גבוהה יותר ומאפשרת זיהוי של סמנים ביולוגיים חדשים שבדיקות מסורתיות עשויות לפספס18. זה גם מקדם הבנה מכניסטית באמצעות ניתוח ברמת המסלול, המשפר מודלים אקוטוקסיקולוגיה חזויים19. שיטה זו מזהה חשיפה לקדמיום בטווח של 1-100 מיקרוגרם/ליטר, הרלוונטי למערכות חוף ושפך מזוהמות20. הגישה מתאימה ביותר לחשיפות מעבדה מבוקרות או למחקרי שדה מורכבים למדי. עם זאת, פרשנות יכולה להיות קשה במטריצות מזוהמות מאוד שבהן גורמי לחץ מרובים (למשל, מתכות כבדות, PAHs, מזהמים מתעוררים) מתקשרים ועלולים לבלבל את הספציפיות של הסמן הביולוגי. למרות זאת, כאשר הוא מתוכנן כראוי, החוסן והספציפיות של GC-MS, בשילוב עם ניתוח נתונים רב-משתנים (למשל, PCA, PLS-DA), מספקים כוח הבחנה חזק לפתרון השפעות חופפות.

פלטפורמה ביוכימית-מטבולומית משולבת זו שימושית במיוחד לניטור מיני זקיפים והערכות סיכונים אקולוגיים במסגרות כגון הוראת מסגרת האסטרטגיה הימית (MSFD) ועולה בקנה אחד עם המאמצים הנוכחיים לקדם ניטור סביבתי מבוסס אומיקס21.

במחקר הנוכחי השתמשנו בקיפוד הים הסגול P. lividus, שהוא אחד המינים המנוצלים והמשמעותיים ביותר מבחינה כלכלית ברחבי חופי האוקיינוס האטלנטי והים התיכון22, כדי להעריך את השפעת זיהום Cd על מצב החמצון החיזור ועל הפרופיל המטבולי של בלוטות המין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. דגימות ותכנון ניסויים

  1. אספו בסך הכל 40 דגימות בוגרות של קיפודי ים P. lividus (20 זכרים ו-20 נקבות, אורך ממוצע: 45 ±-4 מ"מ, גיל ממוצע: 2.0 ±-0.5 שנים, משקל ממוצע: 22.54 ±-2.50 גרם) על ידי צוללנים בטווח עומק של 5-7 מ' במאי 2023 מחופי ביזרטה (הים התיכון, תוניסיה).
  2. להעביר את קיפודי הים שנאספו P. lividus ממין מעורב, גיל משוער כ-12-18 חודשים על סמך גודל למעבדה ולשמור במי ים טבעיים מאווררים 16 ± 1 מעלות צלזיוס עם מליחות טבעית של ~38 PSU, pH של 7.8-8.0 ותקופת אור של 12:12. עקוב אחר הפרמטרים מדי יום לאורך כל תקופת החשיפה כדי להבטיח יציבות סביבתית ולמזער את השונות החיצונית.
  3. הזרקו 1 מ"ל של KCl 0.5 M לאזור הפריסטומי כדי לגרום להטלה ולזהות חזותית גמטות. יש לשטוף אנשים במי ים מסוננים ולאקלם אותם במשך 3 ימים בתנאים מבוקרים ללא אספקת מזון.
  4. חלקו באופן אקראי את קיפודי הים לארבע קבוצות של תשעה פרטים (שלושה פרטים לכל מיכל בשלוש עותקים) והקצו אותם לאקווריומים מזכוכית של 50 ליטר. קבע את גודל המדגם על סמך מחקרים שפורסמו בעבר23,24 שהעריכו סמנים ביולוגיים של מתח חמצוני ותגובות מטבולומיות בחסרי חוליות ימיים והשתמשו בשכפולים ביולוגיים דומים או פחות.
    הערה: רמת שכפול זו מבטיחה ייצוג ביולוגי חזק ותוצאות מובהקות סטטיסטית.
  5. חשיפה לאחר התאקלמות, בעלי חיים במשך 96 שעות לטווח של ריכוזי קדמיום כלוריד (CdCl2) כדלקמן: קבוצה I (Ctrl): קיפודי ים המוחזקים במים שאינם CdCl2; קבוצה II (Tr1): קיפודי ים שנחשפו לריכוז CdCl2של 0.0183 מ"ג/ליטר; קבוצה III (Tr2): קיפודי ים שנחשפו לריכוז CdCl2של 0.183 מ"ג/ליטר; קבוצה IV (Tr3): קיפודי ים שנחשפו לריכוז CdCl2של 1.83 מ"ג/ליטר.
  6. כדי לשמור על יציבות המים במהלך הניסוי יש להחליף 50% מהמים כל 24 שעות, להסיר את המים בזהירות באמצעות סיפון ולהחליף אותם במים טריים תוך שמירה על ריכוזי CdCl2.

2. הכנת רקמות

  1. לבצע, באמצעות הפרוטוקול המתואר על ידי Telahigue et al.23, את הכנת רקמת קיפודי הים הומוגנטים.
  2. נתחו על קיפודי ים קרח מכל קבוצה בסוף הניסוי. השתמש במספריים סטריליים כדי לבצע חתך עגול סביב הפה כדי לפתוח את הבדיקה.
  3. הסר בזהירות את חמשת בלוטות המין בעזרת מרית ושמור להמשך ניתוח. שוטפים במים מזוקקים קרים כדי להסיר פסולת ומזהמי שטח
  4. הומוגניזציה באמצעות סוניקטור בדיקה המוגדר ל-40% משרעת, ב-3 התפרצויות של 10 שניות כל אחת עם מנוחה של 20 שניות בין התפרצויות, 300 מ"ג של שברי בלוטת המין עם מאגר Tris-HCl (20 מ"מ, pH 7.4) בתנאים קרים.
  5. חלקו כל דגימת בלוטת המין לשני חלקים: אחד לניתוח ביוכימי (טרי) ואחד לניתוח מטבולומי (ליופיליזציה).
  6. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם למשך 20 דקות. אחסן את הסופרנטנטים בטמפרטורה של - 80 מעלות צלזיוס לניתוח פרמטרים ביוכימיים.
  7. ליופיליזציה של שברי בלוטת המין האחרים באמצעות מייבש הקפאה לפני ניתוח GC-MS. שמור במשך 48 שעות בטמפרטורה של -50 מעלות צלזיוס עם ואקום של פחות מ-0.1 מבר עד להשלמת ייבוש מלא.
  8. השתמש בשיטת Lowry כדי לקבוע את תכולת החלבון הכוללת של כל דגימה באמצעות BSA כסטנדרט. קבע את רמת ה-LOOH ב-560 ננומטר והתבטא כ-mmol/mg של חלבון.
    הערה: כימות זה בוצע לפני כל הבדיקות הביוכימיות כדי לנרמל את רמות הסמנים הביולוגיים.

3. בדיקת גלוטתיון מופחתת

  1. הערכת תכולת גלוטתיון מופחתת (GSH) על פי השיטה של אלמן25, בהתבסס על הספיגה של חומצה 2-ניטרו-5-מרקפטורית כתוצאה מהפחתת 5-50-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) על ידי קבוצת התיול (SH) של הגלוטתיון.
  2. צנטריפוגה ב-1600 x גרם למשך 15 דקות תערובת של הומוגנטים רקמות במאגר פוספט וחומצה סולפוסליצילית (4%).
  3. קח נפח של 500 מיקרוליטר של הסופרנטנט המתקבל והוסף אותו למגיב של אלמן (DNTB) עם 0.025 מ"ל. קרא ב -412 ננומטר את ספיגת התערובת המתקבלת.
  4. מעריך את תכולת ה-GSH כמ"ג לגרם רקמה. מבטאים את תכולת ה-GSH הכוללת כמיקרוגרם/מ"ג של רקמה. חשב את רמות ה-GSH באמצעות עקומת כיול סטנדרטית המבוססת על ריכוזים ידועים של גלוטתיון מופחת.
    הערה: המטרה היא לכמת גלוטתיון מופחת (GSH) בהומוגנטים בלוטות המין כסמן עקה חמצונית לאחר חשיפה לקדמיום.

4. פעילות קטלאז

  1. בצע הגדרת תגובה לפי השיטה של Aebi26. הכן את מדיום התגובה המורכב מ-2.9 מ"ל של מאגר פוספט של 100 מ"מ (pH 7.4) ו-20 מיקרוליטר של רקמת בלוטת המין. אזנו מראש את מדיום התגובה לטמפרטורת החדר.
  2. התחל את התגובה על ידי הוספת 80 מיקרוליטר של תמיסת מי חמצן (H2O2) שהוכנה לאחרונה לקובטה. מערבבים מיד את התכולה היטב ורשמו את הירידה בספיגה ב-240 ננומטר למשך 1 מייל במרווחים של 10 שניות באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis.
  3. חשב את פעילות ה-CAT על סמך קצב הפירוק של H2O2, שנקבע על ידי ניטור הירידה בספיגה ב-240 ננומטר לאורך זמן. השתמש בנוסחה הבאה: פעילות CAT = (ΔA/min x V) / (ε x l x C)
    כאשר: ΔA/min = שינוי בספיגה לדקה ב-240 ננומטר, V = הנפח הכולל של הבדיקה (ב-L), ε = מקדם הכחדה מולרית של H2O2 (43.6 M-1/cm), l = אורך הנתיב של הקובט (בדרך כלל 1 ס"מ), C = ריכוז החלבון במ"ג/מ"ל.
  4. השתמש במקדם ההכחדה המולרי של 43.6 מ'/ס"מ. ביטוי פעילות CAT כ-nmol H2O2 מתפרק לדקה לכל מ"ג חלבון (nmol H2O2/min/mg חלבון).
    הערה: המטרה היא לכמת את פעילות הקטלאז בהומוגנטים של בלוטות המין של P. lividus כמדד לתגובת אנזים נוגד חמצון לחשיפה לקדמיום.

5. מדידת ייצור מי חמצן

  1. מדוד את רמות מי החמצן (H2O2) בבלוטות המין של P. lividus באמצעות בדיקת חמצון ברזל-תפוז קסילנול על פי השיטה שתוארה על ידי Ou ו-Wolff27.
  2. קבע את ריכוז H2O2בסופרנטנט באמצעות ספקטרופוטומטר ב-560 ננומטר. מבטאים את התוצאות כ-nmol/mg של חלבון.

6. בדיקת מלונדיאלדהיד

  1. הכן דגימות כמתואר בשיטת דרייפר והדלי28. מערבבים 500 מיקרוליטר של בלוטת המין עם 1 מ"ל של 10% חומצה טריכלורואצטית (TCA). צנטריפוגה ב-2500 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  2. העבירו 1 מ"ל מהסופרנטנט שנוצר לצינור חדש והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת TBA של 0.67%. דגרו את התערובת באמבט מים בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  3. מצננים את הדגימות לטמפרטורת החדר. מדוד ספיגה ב-532 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
  4. הפחיתו את ספיגת הרקע באמצעות ריאגנט ריק (TBA + TCA ללא תמצית רקמה). הכן עקומה סטנדרטית באמצעות 1,1,3,3-tetraethoxypropane (TEP) ובטא את ריכוז ה-MDA כחלבון nmol/mg.

7. מדידת הידרופרוקסיד ליפידים

  1. מדוד את הידרופרוקסיד השומני (LOOH) ברקמות בלוטת המין באמצעות חמצון ברזל בבדיקת תפוז קסילנול, כמתואר בשיטה של ג'יאנג ואחרים.29.
    הערה: המטרה היא להעריך את רמות חמצון השומנים ברקמות בלוטת המין על ידי כימות מלונדיאלדהיד (MDA), תוצר לוואי של נזק לממברנה החמצונית.

8. מיצוי תרכובות ביו-אקטיביות מבלוטות המין וסינון אנליטי

  1. בצע מיצוי מתנולי של תרכובות ליפופיליות בטריפליקט מרקמת בלוטת המין המיובשת של כל קבוצה בטריפליקט על ידי השריית החומר במתנול בדרגה אנליטית (≥99.8%; 1:25 w/v) על שייקר סיבובי במהירות של 150 סל"ד לדקה בטמפרטורת הסביבה.
  2. צנטריפוגה כל התמציות למשך 15 דקות ב-700 x גרם, 4 מעלות צלזיוס, לאחר אידוי של שברי MeOH על ידי אידוי סיבובי בטמפרטורת אמבט מים של 40 מעלות צלזיוס ומהירות סיבוב מוגדרת ל-100 סל"ד. השעו מחדש את התמצית הגולמית ב-1 מ"ל של MeOH, ולאחר מכן אחסנו בבקבוקונים אטומים ב-4 מעלות צלזיוס.

9. כרומטוגרפיה גזית-ניתוח ספקטרומטריית מסה של תמציות בלוטות המין

  1. הכינו מנה של 500 מיקרוליטר בבקבוקון באמצעות התמצית המתנולית שאוחסנה.
  2. בצע ניתוח על ידי כרומטוגרפיית גז-ספקטרומטריית מסה (GC-MS) על כרומטוגרף גז המחובר לספקטרומטר מסה. עמודת ה-GC הייתה 5%-פניל-מתילסילוקסן: 30 מ' x 0.25 מ"מ x 0.25 מיקרומטר עובי סרט.
  3. השתמש בהליום כגז נשא בקצב זרימה קבוע של 1 מ"ל לדקה. הגדר את נפח ההזרקה ל-1 μL במצב פיצול ביחס של 100:1. תכנת את טמפרטורת התנור בין 4-280 מעלות צלזיוס ב-5 מעלות צלזיוס לדקה.
  4. הפעל את הספקטרומטר במצב פגיעת אלקטרונים (EI), אנרגיית היינון הייתה 72 eV, טמפרטורת מקור היונים הייתה 250 מעלות צלזיוס, זמן הסריקה 1 שניות וטווח המסה 45-550 אמו.
  5. לבצע זיהוי של תרכובות על ידי השוואה של ספקטרום המסה שלהן עם אלה מספריית NIST98MS ומסד הנתונים של ספריית ווילי275.

10. ניתוח סטטיסטי

  1. העריכו תחילה את מערך הנתונים לנורמליות באמצעות מבחן שפירו-וילק ולהומוגניות של שונות באמצעות מבחן לוין.
  2. עבד מראש את הנתונים עם MetaboAnalyst 6.030, תוך שימוש בהליכי נורמליזציה סטנדרטיים, טרנספורמציה של יומן וקנה מידה של פארטו כדי לעמוד בהנחות ANOVA כגון התפלגות נורמלית והומוגניות שונות.
  3. בצע ניתוח סטטיסטי רב-משתני באמצעות Metaboanalyst, השתמש בשיטת Benjamini-Hochberg False Discovery Rate (FDR) לתיקון בדיקות מרובות כדי להסביר שגיאות מסוג I הקשורות להשוואות ביוכימיות רבות, ולהבטיח חוסן סטטיסטי.
  4. השתמש בניתוח השונות החד-כיווני (ANOVA) כדי להשוות תוצאות בין קבוצות. ההבדלים בין הממוצעים נחשבו משמעותיים כאשר p <0.05.
  5. השתמש בניתוח מבחין של ריבועים מינימליים חלקיים (PLS-DA) כדי להבחין בין קבוצות דומות. קבע את חשיבות המשתנה בהקרנה (VIP) עבור כל התרכובות.
  6. חשב ערכי p באמצעות מבחן ה-t הזוגי של הסטודנט לניתוח סטטיסטי חד-ממדי של משתנים מתוקננים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוקף והיעילות של השיטות שלנו הובטחו על ידי שימוש בשכפולים ביולוגיים וטכניים, שאפשרו מדידות עקביות ואמינות. הבדיקות הראו שונות נמוכה, עם סטיות תקן בדרך כלל פחות מ-10%, מה שמעיד על יכולת חזרה גבוהה. כדי להבטיח כימות מטבוליט מדויק, ניתוחי GC-MS כללו עקומות כיול ותקנים פנימיים. כל הטכניקות בהן נעשה שימוש מבוססות על פרוטוקולים מקובלים שאומתו בעבר באקוטוקסיקולוגיה ימית ובמטבולומיקה סביבתית, כפי שמצוין בכתב היד.

תגובות סמנים ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה תוכנן להעריך את ההשפעה הרעילה של Cd על בלוטות המין של קיפודי הים P. lividus על ידי ניתוח סמנים ביוכימיים ומטבוליטים פעילים. החשיפה של P. lividus לריכוזים שונים של Cd יצרה תגובת עקה חמצונית. ממצאים אלה דומים לדיווחים קודמים המצביעים על מתאם הדוק בין רמות נוגדי החמצון המוגברות בשטחי קיפודי הים לבין רמות המזהמים13.

התוצאות שלנו חשפו עלייה משמעותית ברמת ה-GSH לאחר חשיפה לריכוזים שונים של Tr1, Tr2 ו-Tr3 (איו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים מודים לדיקן ללימודים מתקדמים ומחקר מדעי באוניברסיטת בישה על תמיכתם בעבודה זו באמצעות תוכנית התמיכה במחקר המסלול המהיר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מייבש הקפאהBiobaseBK-FD12PT מייבש הקפאהליופיליזציה
כרומטוגרף גזAgilent TechnologiesHP 6890 כרומטוגרף גזגלאי יינון להבה (FID)
עמודת GCAgilent TechnologiesHP-5 (5%-פניל)-מתילסילוקסן עמודהלא קוטבית  טור  המספק ביצועים מעולים במגוון רחב של יישומים
ספקטרומטר מסהAgilent Technologiesספקטרומטר מסה HP 5973Quadrupole MS

מקורות

  1. Patchaiyappan, A., et al. Bioaccumulation of heavy metals in commercially important marine species from Puducherry coast, Southeast India. Region Studies Marine Sci. 65, 103080(2023).
  2. Satarug, S., Garrett, S. H., Sens, M. A., Sens, D. A. Cadmium, Environmental Exposure, and Health Outcomes. Environ Health Persp. 118 (2), 182-190 (2010).
  3. Le Croizier, G., et al. Significance of metallothioneins in differential cadmium accumulation kinetics between two marine fish species. Environ Poll. 236, 462-476 (2018).
  4. Pohl, C., Hennings, U. The coupling of long-term trace metal trends to internal trace metal fluxes at the oxic-anoxic interface in the Gotland Basin (57°19,20′N; 20°03,00′E) Baltic Sea. J Marine Syst. 56 (1-2), 207-225 (2005).
  5. Beiras, R., Bellas, J., Fernández, N., Lorenzo, J. I., Cobelo-Garcıa, A. Assessment of coastal marine pollution in Galicia (NW Iberian Peninsula); metal concentrations in seawater, sediments and mussels (Mytilus galloprovincialis) versus embryo-larval bioassays using Paracentrotus lividus and Ciona intestinalis. Marine Enviro Res. 56 (4), 531-553 (2003).
  6. Censi, P., et al. Trace element distributions in the Strait of Sicily (Central Mediterranean Sea). I. Evidence of rock-water interactions. Period Miner. 71 (3), 255-272 (2002).
  7. Annabi-Trabelsi, N., et al. Concentrations of trace metals in phytoplankton and zooplankton in the Gulf of Gabès, Tunisia. Marine Poll Bull. 168, 112392(2021).
  8. Kumar, P., Singh, A. Cadmium toxicity in fish: An overview. GERF Bull Biosci. , (2010).
  9. Klein, R. D., et al. Effects of sublethal Cd, Zn, and mixture exposures on antioxidant defense and oxidative stress parameters in early life stages of the purple sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Aquatic Toxicol. 217, 105338(2019).
  10. Rani, A., Kumar, A., Lal, A., Pant, M. Cellular mechanisms of cadmium-induced toxicity: a review. Int J Environ Health Res. 24 (4), 378-399 (2014).
  11. Wang, W. X., Rainbow, P. S. Subcellular Partitioning and the Prediction of Cadmium Toxicity to Aquatic Organisms. Environ Chem. 3 (6), 395(2006).
  12. Sarly, M. S., et al. Use of the gonadal tissue of the sea urchin Paracentrotus lividus as a target for environmental contamination by trace metals. Environ Sci Poll Res. 30 (38), 89559-89580 (2023).
  13. Chiarelli, R., Martino, C., Roccheri, M. C. Cadmium stress effects indicating marine pollution in different species of sea urchin employed as environmental bioindicators. Cell Stress Chaperones. 24 (4), 675-687 (2019).
  14. Gharred, T., Jebali, J., Belgacem, M., Mannai, R., Achour, S. Assessment of the individual and mixture toxicity of cadmium, copper and oxytetracycline, on the embryo-larval development of the sea urchin Paracentrotus lividus. Environmen Sci Poll Res. 23 (18), 18064-18072 (2016).
  15. Migliaccio, O., Castellano, I., Cirino, P., Romano, G., Palumbo, A. Maternal Exposure to Cadmium and Manganese Impairs Reproduction and Progeny Fitness in the Sea Urchin Paracentrotus lividus. PLoS ONE. 10 (6), e0131815(2015).
  16. Ragusa, M., Nicosia, A., Costa, S., Cuttitta, A., Gianguzza, F. Metallothionein Gene Family in the Sea Urchin Paracentrotus lividus: Gene Structure, Differential Expression and Phylogenetic Analysis. Int J Mol Sci. 18 (4), 812(2017).
  17. Cappello, T., et al. Neurotoxicological effects of trace metals in fish: molecular and biochemical biomarkers. Environ Toxicol Pharmacol. 41, 94-105 (2016).
  18. Viant, M. R., Rosenblum, E. S., Tjeerdema, R. S. NMR-based metabolomics: a powerful approach for characterizing the effects of environmental stressors on organism health. Environ Sci Technol. 37 (21), 4982-4989 (2003).
  19. Nicholson, J. K., Lindon, J. C., Holmes, E. Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR data. Xenobiotica. 29 (11), 1181-1189 (2002).
  20. Chen, Q., et al. Environmental levels of cadmium exposure induce developmental toxicity and oxidative stress in zebrafish embryos. Sci Rep. 9, 15085(2019).
  21. Taylor, N. S., Gavin, A., Viant, M. R. Metabolomics Discovers Early-Response Metabolic Biomarkers That Can Predict Chronic Reproductive Fitness in Daphnia magna. Environ Sci Technol. 54 (16), 10186-10195 (2020).
  22. Gibson, R. N., Atkinson, R. J. A., Gordon, J. D. M. Oceanography and marine biology: an annual review. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2009).
  23. Telahigue, K., et al. Effects of acute mercury exposure on fatty acid composition and oxidative stress biomarkers in Holothuria forskali body wall. Ecotoxicol Environ Safety. 169, 516-522 (2019).
  24. Mhadhbi, L., et al. Exposure to tebufenpyrad interrupts histo-architecture and fatty acid compositions of carpet shell clam Ruditapes decussatus. Int J Environ Health Res. , 1-12 (2025).
  25. Ellman, G. L. Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem Biophys. (82), 70-77 (1959).
  26. Aebi, H. Catalase in vitro. Method Enzymol. 105, 121-126 (1984).
  27. Ou, P., Wolff, S. P. A discontinuous method for catalase determination at 'near physiological' concentrations of H2O2and its application to the study of H2O2fluxes within cells. J Biochem Biophys Methods. 31 (1-2), 59-67 (1996).
  28. Draper, H. H., Hadley, M. Malondialdehyde determination as index of lipid Peroxidation. Method Enzymol. 186, 421-431 (1990).
  29. Jiang, Z. Y., Hunt, J. V., Wolff, S. P. Ferrous ion oxidation in the presence of xylenol orange for detection of lipid hydroperoxide in low density lipoprotein. Anal Biochem. 202 (2), 384-389 (1992).
  30. Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 6.0: towards a unified platform for metabolomics data processing, analysis and interpretation. Nucl Acids Res. 52 (W1), W398-W406 (2024).
  31. Das, D., Moniruzzaman, M., Sarbajna, A., Chakraborty, S. B. Effect of heavy metals on tissue-specific antioxidant response in Indian major carps. Environ Sci Poll Res. 24 (22), 18010-18024 (2017).
  32. El Idrissi, O., et al. Assessment of trace element contamination and effects on Paracentrotus lividus using several approaches: Pollution indices, accumulation factors and biochemical tools. Sci Tot Environ. 869, 161686(2023).
  33. Howcroft, C. F., Amorim, M. J. B., Gravato, C., Guilhermino, L., Soares, A. M. V. M. Effects of natural and chemical stressors on Enchytraeus albidus: Can oxidative stress parameters be used as fast screening tools for the assessment of different stress impacts in soils. Environ Int. 35 (2), 318-324 (2009).
  34. Fouzai, C., et al. Dual oxidative stress and fatty acid profile impacts in Paracentrotus lividus exposed to lambda-cyhalothrin: biochemical and histopathological responses. Toxicol Res. 39 (3), 429-441 (2023).
  35. Mansoor, S., et al. Heavy Metal Induced Oxidative Stress Mitigation and ROS Scavenging in Plants. Plants. 12 (16), 3003(2023).
  36. Allen, T., Singhal, R., Rana, S. V. S. Resistance to Oxidative Stress in a Freshwater Fish Channa punctatus After Exposure to Inorganic Arsenic. Biol Trace Element Res. 98 (1), 63-72 (2004).
  37. Pagano, G., et al. Comparative toxicities of selected rare earth elements: Sea urchin embryogenesis and fertilization damage with redox and cytogenetic effects. Environ Res. 147, 453-460 (2016).
  38. Chaâbane, M., et al. The potential toxic effects of hexavalent chromium on oxidative stress biomarkers and fatty acids profile in soft tissues of Venus verrucosa. Ecotoxicol Environ Safety. 196, 110562(2020).
  39. Balakrishnan, M., Kenworthy, A. K. Lipid Peroxidation Drives Liquid-Liquid Phase Separation and Disrupts Raft Protein Partitioning in Biological Membranes. J Am Chem Soc. 146 (2), 1374-1387 (2024).
  40. Cano-Rocabayera, O., Monroy, M., Moncaleano-Niño, ÁM., Gómez-Cubillos, M. C., Ahrens, M. J. An integrated biomarker approach: Non-monotonic responses to cadmium exposure in the suckermouth catfish Hypostomus plecostomus. Aquatic Toxicol. 248, 106193(2022).
  41. Zhan, J., Sun, T., Wang, X., Wu, H., Yu, J. Meta-analysis reveals the species-, dose- and duration-dependent effects of cadmium toxicities in marine bivalves. Sci Tot Environ. 859, 160164(2023).
  42. Wu, H., Wang, W. Tissue-specific toxicological effects of cadmium in green mussels ( Perna viridis ): Nuclear magnetic resonance-based metabolomics study. Environ Toxicol Chem. 30 (4), 806-812 (2011).
  43. Warnau, M., Ledent, G., Temara, A., Jangoux, M., Dubois, P. Experimental cadmium contamination of the echinoid Paracentrotus lividus: influence of exposure mode and distribution of the metal in the organism. Marine Ecol Prog Series. 116, 117-124 (1995).
  44. Capitão, A., et al. The Echinodermata PPAR: Functional characterization and exploitation by the model lipid homeostasis regulator tributyltin. Environ Poll. 263, 114467(2020).
  45. Zhou, L., et al. Biochemical and metabolic responses of the deep-sea mussel Bathymodiolus platifrons to cadmium and copper exposure. Aquatic Toxicol. 236, 105845(2021).
  46. Geret, F., Serafim, A., Barreira, L., João Bebianno, M. Response of antioxidant systems to copper in the gills of the clam Ruditapes decussatus. Marine Environ Res. 54 (3-5), 413-417 (2002).
  47. Fokina, N., Vasil'eva, O., Ruokolainen, T., Nemova, N. Changes in lipid composition and lipid peroxidation products content in the freshwater mussel Anodonta cygnea L. under cadmium effect. Limnol Freshw. Biol. (5), 286-296 (2019).
  48. Kim, S. K., Van Ta, Q. Potential Beneficial Effects of Marine Algal Sterols on Human Health. Adv Food Nutri Res. 64, 191-198 (2011).
  49. Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of Steroidogenic Enzymes in the Pathway from Cholesterol to Active Steroid Hormones. Endocrine Rev. 25 (6), 947-970 (2004).
  50. Voogt, P. A., Den Besten, P. J., Kusters, G. C. M., Messing, M. W. J. Effects of cadmium and zinc on steroid metabolism and steroid level in the sea star Asterias rubens L. Comparat Biochem Physiol C Comparat Pharmacol. 86 (1), 83-89 (1987).
  51. Pino-Lagos, K., Benson, M. J., Noelle, R. J. Retinoic Acid in the Immune System. Ann New York Acad Sci. 1143 (1), 170-187 (2008).
  52. Lu, L., et al. Integrative proteomics and metabolomics reveal the stress response of semicarbazide in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Front Marine Sci. 9, 992753(2022).
  53. Cuypers, A., et al. Cadmium stress: an oxidative challenge. BioMetals. 23 (5), 927-940 (2010).
  54. Wang, X., et al. Sex-Specific Differences in the Toxic Effects of Heavy Fuel Oil on Sea Urchin (Strongylocentrotus intermedius). Int J Environ Res Public Health. 18 (2), 499(2021).
  55. McCarty, L. S. Ecotoxicology dilemmas: issues with dose, causality, response, mixtures, andmodifying factors. Environ Toxicol Chem. 44 (1), 45-58 (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

חשיפה לקדמיוםעקה חמצוניתפעילות נוגדת חמצוןכרומטוגרפיה של גזיםספקטרומטריית מסותרעילות של מתכות כבדות

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.