מאמר שיטה

טכניקה של ביופסיה של הלחמית ואימונופלואורסצנציה ישירה לאבחון פמפיגואיד קרום רירי

DOI:

10.3791/68303

⸱

17 ביוני 2025

 ,  , 
1Prof. Krothapalli Ravindranath Ophthalmic Research Biorepository, LV Prasad Eye Institute, 2Brien Holden Centre for Eye Research (BHERC), LV Prasad Eye Institute

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקציר ועיבוד ביופסיה של הלחמית לזיהוי פמפיגואיד קרום רירי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פמפיגואיד רירית העין (MMP) מופיע כדלקת לחמית כרונית שאם לא מטפלים בה, עלולה לגרום לעיוורון. אבחון בזמן וטיפול מדכא חיסון מונעים את התקדמות המחלה. צביעה אימונופלואורסצנטית ישירה (DIF) של ביופסיית הלחמית לתצהיר קומפלקס חיסוני בקרום הבסיס היא אבחנה של MMP. שיעור החיוביים לביופסיה תלוי במאפייני הביופסיה, לרוחב, לגיל מבוגר ולפעילות המחלה. מאמר השיטות הנוכחיות מתאר את הטכניקה של קצירת ביופסיית הלחמית ושימוש במחסניות במילוי בינוני בטמפרטורת חיתוך אופטימלית להעברת דגימה והכנת בלוק. ביופסיה מבוצעת מאזור לא מצולק, לא מעורב או פחות מעורב יחסית של הלחמית בשתי העיניים. גודל הביופסיה הרגיל הוא 4-5 מ"מ אורך, 2-3 מ"מ רוחב, וצריך להיות בעל רקמה תת-לחמית זעירה כדי שקרום הבסיס לא יתפספס. אנו ממליצים לבצע צביעת חומצה שיף תקופתית כדי לאשר את נוכחות קרום המרתף. באמצעות פרוטוקול מוגדר, ההקפאות מביופסיות מוכתמות בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים IgG, IgM, IgA וגורמים משלימים C3c ו-C4c. ביופסיה חיובית מראה את הקרינה החיובית הירוקה בקרום הבסיס, וגם אם אחד הנוגדנים חיובי, הוא חיובי ל-MMP. ביופסיה שלילית אינה שוללת פמפיגואיד; עם זאת, חיובי מאשר את ה-MMP ומבדיל אותו מדלקת הלחמית הנגרמת על ידי תרופות או פסאודופמפיגואיד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פמפיגואיד קרום רירי (MMP) היא מחלת לחמית כרונית של אטיולוגיה אוטואימונית ומשפיעה על הריריות בגוף 1,2. לדלקת הלחמית הכרונית יש אטיולוגיות שונות, והבידול של MMP מ-SJS, סרקואידוזיס, ניאופלזיה קשקשית עינית ופסאודופמפיגואיד הוא הכרחי מכיוון שהראשון דורש דיכוי חיסוני מערכתי 3,4. יתר על כן, MMP היא מחלה שעלולה לגרום לסמיות שבה חולים מופיעים לעתים קרובות מאוחר ומאובחנים באופן שגוי בהתחלה 1,2,5. ניתן לראות רק מעורבות עינית ללא מעורבות מערכתית ב-27.4% מחולי MMP עיניים6. אבחון MMP דורש ביופסיה של הלחמית כדי להראות נוכחות של נוגדנים עצמיים בקרום הבסיס 2,5. אימונופלואורסצנציה ישירה (DIF) היא כלי אבחון מרכזי לזיהוי מחלות אוטואימוניות המשפיעות על הלחמית, כגון MMP. DIF מסייע באיתור שקיעה במקום של אימונוגלובולינים ורכיבים משלימים באזור קרום הבסיס (BMZ), מאפיין של MMP. שיעורי החיוביים של DIF נעים בין 30% ל-80%1,5. עם זאת, חלק מהחולים יכולים לקבל ביופסיה שלילית, במיוחד אלה עם MMP עיניים בלבד, אך תיעוד קליני של התקדמות המחלה מטופל באופן דומה למקרי MMP עיניים חיוביים לביופסיה 7,8. לפיכך, דארט ועמיתיו הדגישו את הצורך בקריטריונים אבחנתיים נפרדים ל-MMP8 לעיניים בלבד.

הסיבות המוצעות לשיעור החיוביים הנמוך במחקרים הן מחלה מתקדמת עם צלקות נרחבות על פני העין, טכניקות עיבוד רקמות או צביעה לא מספקות, ווריאנט מחלה שלילי לביופסיה 8,9,10,11. ניתוח רטרוספקטיבי של ביופסיות מ-27 חולים החשודים ב-MMP בעיניים הראה שיעור חיובי של 30% בלבד, ו-63.7% היו מעורבות עיניתבלבד. DIF דורש פרוטוקול ספציפי; לא כל מעבדת אבחון מכוונת לכך. ישנם הבדלים לגבי מקום הביופסיה, האם לבצע ביופסיה מעין אחת או משתיהן, ופתרונות העברת דגימה 13,14,15. בניתוח רטרוספקטיבי של ביופסיות הלחמית במרכז שלנו, שיעור החיוביים ל-DIF היה 54.1%, עם יותר חיוביים בביופסיה דו-צדדית (59% לעומת 45%)8. למרות שביופסיה היא קריטית, סימנים קליניים וציקטריזציה מתקדמת של פני העין עוזרים להשיג את האבחנה של MMP. קל יותר לאבחן כאשר מעורב אתר חוץ-עיני, כגון הפה או העור, המדווח ב-40% ו-18% מהחולים, בהתאמה5.

ישנן וריאציות בספרות הקיימת, והפרוטוקול המוצג כאן יכול לשמש כמדריך עזר עם שינויים שהוכנסו כדי להפחית את הצורך באמצעי העברה ייחודי14. הביופסיות מועברות במדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) ומוקפאות באותה מחסנית העברה במעבדה הפתולוגית, מה שמייתר את הצורך באמצעי העברה נוסף. המאמר הנוכחי מתאר את המתודולוגיה לצביעת DIF של רקמת הלחמית, קצירת רקמות ופרוטוקול העברת דגימות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה למחקר בבני אדם של מכון העיניים LV Prasad.

1. טכניקת ביופסיה של הלחמית

  1. תכנן ביופסיה משתי עיניו של המטופל החשוד בפמפיגואיד בהרדמה מקומית או מקומית ומיקרוסקופ ניתוח.
  2. קח הסכמה מדעת מהמטופל ורשום תופעות לוואי אפשריות של דימום, צלקות והצורך להתחיל בסטרואידים מקומיים לאחר הניתוח.
  3. יש להניח 1-2 טיפות של 0.5% פרופרקאין בשתי העיניים ולהמתין 5 דקות לפני תחילת ההליך.
  4. ודא שהמטופל אינו חש כאב בעת נגיעה בלחמית עם מלקחיים עדינים. אם המטופל עדיין מרגיש כאב לאחר מריחת פרופרקאין מקומי, יש להזריק 0.2 מ"ל של לידוקאין תת-לחמית 2% עם מזרק טוברקולין של 1 מ"ל.
  5. הניחו ספקולום בעין ימין או שמאל, המוקדם מביניהם.
  6. בדוק את פני העין לאיתור אזורים של צלקות וקרטיניזציה. בחר את אזור הביופסיה שאינו מעורב ואינו מצולק או קרטיני.
    הערה: במחקר זה, הלחמית הבולברית העליונה הרחק מהלימבוס מועדפת כאתר הביופסיה, ואחריה הלחמית הבולברית הנחותה.
  7. השתמש במלקחיים של לים כדי להרים את הסקלרה מהלחמית ובבלו ליניארי עם המספריים של ווסטקוט, באורך 4-5 מ"מ ורוחב 2-3 מ"מ.
  8. העבירו את כל הביופסיה מיד למדיום חיתוך אופטימלי (OCT).
    הערה: ניתן להעביר ביופסיות במי מלח רגילים או במדיום הובלה מישל.
  9. קח מחסנית ותבנית טישו מפלסטיק עם באר במרכז, נקה אותה במי מלח וייבש אותה באוויר.
  10. מלאו את המחסנית במדיום OCT בנפרד לעין ימין ושמאל. טבלו את רקמת הלחמית שנכרתה במדיום OCT ושלחו אותה לפתולוגיה.
  11. חזור על השלבים הדומים גם עבור הצד הנגדי.

2. העברת הרקמה

  1. הטמע את דגימות הביופסיה של הלחמית במדיום OCT כדי לשמר את ארכיטקטורת הרקמה והאנטיגניות אם התקבלו במדיום ההובלה של מישל או במי מלח רגילים.
  2. הקפיאו את הדגימות המוטבעות באמצעות חנקן נוזלי או קרח יבש ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

3. הכנה וחיתוך רקמות

  1. חתכו את הרקמה הקפואה לפרוסות של 4-6 מיקרומטר (7 במספר) באמצעות קריוסטט בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד -25 מעלות צלזיוס.
  2. התקן את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ מצופות פוליליזין טעונות חיובית כדי להבטיח הידבקות ואחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד להכתמה בנייר אלומיניום.

4. צביעה אימונופלואורסצנטית

  1. הפשירו מגלשות בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות וקבעו באצטון קר (100%) למשך 10 דקות כדי לשמר אנטיגנים ולמנוע נזק לרקמות.
  2. יש לשטוף עם PBS 1x שלוש פעמים, בכל פעם למשך 5 דקות כדי להסיר עודפי מדיום OCT ואצטון.
  3. יש למרוח נוגדנים מצומדים נגד IgG, אנטי-IgA, אנטי-IgM ואנטי-C3 מדולל (פיברינוגן-1:10 [בקרה חיובית], IgG-1:10, IgA-1:10, IgM-1:10, C3-1:5, C4-1:10) על שקופיות.
    הערה: נוגדנים מדוללים ב-1x PBS.
  4. עבור בקרות שליליות, דלג על היישום של נוגדנים מצומדים ובצע את השלבים הנותרים המוזכרים להלן.
  5. עקוב אחר הנחיות היצרן לדילול הנוגדנים ותקן עם בקרות חיוביות ושליליות ידועות.
  6. דגרו את המגלשות בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45-60 דקות.
  7. שטפו את השקופיות עם PBS (3× למשך 5 דקות כל אחת) כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.
  8. כתם נגד עם מדיום הרכבה המכיל DAPI (4',6 -diamidino-2-phenylidole) להדמיה גרעינית.
  9. הניחו כיסוי מעל המגלשות והניחו להן להתרפא במשך 20 דקות.
  10. בחן שקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסננים מתאימים לפלואורופורים המשמשים (מסנן ירוק עירור ל-488 ננומטר).
  11. תעד את הממצאים במיקרוגרפיה דיגיטלית.

5. חומצה תקופתית מהירה - צביעת שיף

  1. הכנת חומצה תקופתית שיף (PAS)
    1. ממיסים 1 גרם פושין בסיסי ב -100 מ"ל מים מזוקקים חמים.
    2. הוסף 10 מ"ל חומצה הידרוכלורית ו -2 גרם אשלגן דיסולפיט כדי להסיר את צבע הצבע.
    3. לאחר הקירור מוסיפים 0.5 גרם פחם פעיל, מערבבים ומסננים את התמיסה לקבלת חומצה תקופתית ברורה המגיב של שיף. יש לאחסן בבקבוק כהה.
      הערה: כדי לבדוק את המגיב של שיף, שפכו 10 מ"ל של 37% פורמלין לתוך שעון והוסיפו כמה טיפות של שיף לבדיקה. מגיב טוב של שיף יהפוך במהירות לצבע אדום-סגול. מגיב שיף מתדרדר יגרום לתגובה מאוחרת, והתוצר יהיה כחול-סגול עמוק.
  2. טכניקת צביעת PAS
    1. הרטיבו את המגלשות במים.
    2. מחמצנים בתמיסת חומצה תקופתית של 0.5% למשך 5 דקות.
    3. שוטפים במים מזוקקים.
    4. מניחים במגיב של שיף למשך 15 דקות (החלקים נראים ורודים בהירים בשלב זה)
    5. יש לשטוף במי ברז פושרים למשך 5 דקות (החלקים הופכים לוורודים כהים).
    6. כתם נגד בהמטוקסילין של מאייר למשך דקה אחת.
    7. שוטפים במי ברז למשך 5 דקות.
    8. יבש את השקופיות בתמיסות הבאות: פעם אחת ב 80% אלכוהול אתילי למשך דקה, פעמיים ב 90% אלכוהול אתילי למשך דקה, פעמיים ב 100% אלכוהול אתילי למשך דקה.
    9. יבש את השקופיות שלוש פעמים בקסילן למשך דקה אחת כל אחת.
    10. הנח כיסוי מעל המגלשות באמצעות אמצעי הרכבה סינטטי (למשל, תושבת DPX)
    11. צפו בתוצאות ה-PAS תחת מיקרוסקופ השדה הבהיר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרשנות של DIF דורשת אישור על נוכחות קרום הבסיס בקטעי הרקמה (איור 1). בשקופיות המוכתמות ב-PAS, קרום הבסיס יופיע כממברנה ורודה בהירה הממוקמת באזור הבסיסי של אפיתל הלחמית (איור 1C). יש להעיר גם על ההמשכיות והארכיטקטורה של קרום המרתף. חיוביות DIF תיראה כ-BM ירוק בוהק (איור 1B), מה שמצביע על שקיעה של IgM (איור 2A), IgA (איור 2B), IgG (איור 1B), C3 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה של ביופסיית הלחמית המתוארת כאן משתמשת במדיום OCT כמדיום העברה, מייתרת את הצורך באמצעי העברה נוסף ומונעת את הטיפול בביופסיה להעברתו למדיום OCT להקפאה. תבנית מחסנית פלסטיק מלאה במדיום וביופסיה מוקפאת ישירות ליצירת גושי רקמות ואז נחתכת. היתרונות של OCT הם שהוא קופא במהירות עם נזק מינימלי מהיווצרות גבישים ועוטף את דגימות הרקמה. השלב הקריטי ביותר באימונופלואורסצנציה ישירה הוא העברת דגימות. אין לשלוח ביופסיה של הלחמית בפורמלין. עם זאת, מחקר אחד העריך את שיעור הביופסיה החיובית בדגימות ק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לקרן לחקר העיניים בהיידראבאד, הודו על תמיכתה במחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 N חומצה הידרוכלורית פינאר  כימיקלים בע"מ 7647-01-0
אצטון קוואליגניםשאלה 33517
אלבומיןדקוF0117
פוקסין בסיסיקוואליגניםשאלה 39402
ג3גדיאגנוסטיקה ביו-סיסטם פ003
C4cדיאגנוסטיקה ביו-סיסטם F005
מחסניתמדעי העולם25376-500
פחם פעיל סיגמאג-5260
קריוסטט לייקה CM1860UV 
להבי קריוטום לייקה 818
DAPIאבקאם אביב104139
פיברינוגן דיאגנוסטיקה ביו-סיסטם F006
מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוסCX43
מלקחיים ג'וג'ה כירורגיJS1528A
תא לחות דיאגנוסטיקה ביו-סיסטם SM365
IgAדיאגנוסטיקה ביו-סיסטם פ007
IgGדיאגנוסטיקה ביו-סיסטם פ008
IgMדיאגנוסטיקה ביו-סיסטם F009
שקופיות זכוכית דביקות IHC טומו 33140455
המלקחיים של ליםספידוויי S-7223
מדיום הטנספורט של מישלפישר סיניטיקס NC0253304
זכוכית כיסוי מיקרוסקופיתכוכב כחולhttps://www.bluestarslides.com
OCT בינוני קריומטריקס 6769006
PBS דקודמ831
חומצה תקופתית סיגמאברקוד 375810-25G
אשלגן דיסולפיטסיגמאP2522-500G
פרופרקאין 0.5%סאנוויי פרייבט ז/1118א
המספריים של ווסטקוטפיליג גורגיאל אינטרמנטס 423480

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jain, N., Jakati, S., Shanbhag, S. S., Basu, S. Direct immunofluorescence findings and factors affecting conjunctival biopsy positivity in ocular mucous membrane pemphigoid. Cornea. 43 (2), 159-165 (2024).
  2. Vazirani, J., et al. Chronic cicatrizing conjunctivitis: a review of the differential diagnosis and an algorithmic approach to management. Indian J Ophthalmol. 68 (11), 2349-2355 (2020).
  3. Singh, S., et al. Drug-induced cicatrizing conjunctivitis: a case series with review of etiopathogenesis, diagnosis and management. Ocul Surf. 24, 83-92 (2022).
  4. Bocanegra-Oyola, N., et al. Clinical characteristics of ocular mucous membrane pemphigoid: a systematic review and meta-analysis. Ocul Immunol Inflamm. 32 (10), 2388-2404 (2024).
  5. Coco, G., et al. Conjunctival biopsy site in mucous membrane pemphigoid. Am J Ophthalmol. 216, 1-6 (2020).
  6. Ong, H. S., et al. Mucous membrane pemphigoid with ocular involvement: the clinical phenotype and its relationship to direct immunofluorescence findings. Ophthalmology. 125 (4), 496-504 (2018).
  7. Anesi, S. D., et al. Reliability of conjunctival biopsy for diagnosis of ocular mucous membrane pemphigoid: redetermination of the standard for diagnosis and outcomes of previously biopsy-negative patients. Ocul Immunol Inflamm. 29 (6), 1106-1113 (2021).
  8. Dart, J., et al. Autoantibody detection for diagnosis in direct immunofluorescence-negative mucous membrane pemphigoid: ocular and other sites compared. Ophthalmology. 128 (3), 372-382 (2021).
  9. Leonard, J. N., et al. Immunofluorescent studies in ocular cicatricial pemphigoid. Br J Dermatol. 118 (2), 209-217 (1988).
  10. Mehra, T., et al. Diagnostic relevance of direct immunofluorescence in ocular mucous membrane pemphigoid. JDDG. 13 (12), 1268-1274 (2015).
  11. Shimanovich, I., Nitz, J. M., Zillikens, D. Multiple and repeated sampling increases the sensitivity of direct immunofluorescence testing for the diagnosis of mucous membrane pemphigoid. J Am Acad Dermatol. 77 (4), 700-705 (2017).
  12. Goldich, Y., et al. Characteristics of patients with ocular cicatricial pemphigoid referred to major tertiary hospital. Can J Ophthalmol. 50 (2), 137-142 (2015).
  13. Mudhar, H. S. Biopsies of cicatricial conjunctivitis cases reveal highly variable sampling practice among ophthalmologists: time for national and international standardisation. Br J Ophthalmol. 100 (6), 736-744 (2016).
  14. Vodegel, R. M., et al. Enhanced diagnostic immunofluorescence using biopsies transported in saline. BMC Dermatol. 4, 1-7 (2004).
  15. Jonkman, M. F., De Groot, A. C., Slegers, T. P., De Jong, M. C., Pas, H. H. Immune diagnosis of pure ocular mucous membrane pemphigoid: indirect immunofluorescence versus immunoblot. Eur J Dermatol. 19 (5), 456-460 (2009).
  16. Shimanovich, I., Nitz, J. M., Witte, M., Zillikens, D., Rose, C. Immunohistochemical diagnosis of mucous membrane pemphigoid. J Oral Pathol Med. 47 (6), 613-619 (2018).
  17. Philip, A. M., Stephenson, A., Al-Dabbagh, A., Ramezani, K., Fernandez-Santos, C. C., Foster, C. S. Ocular cicatricial pemphigoid with IgM-positive biopsy. Cornea. 42 (12), 1503-1505 (2023).
  18. Williams, G. P., et al. Conjunctival neutrophils predict progressive scarring in ocular mucous membrane pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
  19. Levian, B., Hussaini, S. S., Woodley, D. T., Kasperkiewicz, M. Pseudopemphigoid: a systematic review. JAAD Int. 17, 170-171 (2024).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PAS

מאמרים קשורים