מאמר שיטה

ממשקים חשמליים ואופטו-אלקטרוניים דו-כיווניים בלבבות חולדות ex vivo בריאים ואיסכמיים

DOI:

10.3791/68305

⸱

18 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago, 2The James Franck Institute, The University of Chicago, 3Department of Chemistry, The University of Chicago, 4The Institute for Biophysical Dynamics, The University of Chicago

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר ייצור חומרים מתקדם ושיטות לב חולדות ex vivo לממשק ביולוגי דו-כיווני אופטי וחשמלי, המאפשר גירוי לבבי מדויק, הקלטה ומידול אוטם למחקר ביו-אלקטרוניקה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים אלקטרופיזיולוגיים הם מרכזיים בחקר האינטראקציות בין חומרים וממשקים ביולוגיים לבביים. ההתקדמות האחרונה הציגה חומרים מוליכים ומוליכים למחצה חדשים שונים לממשקים דו-כיווניים עם מודלים לבביים, המאפשרים קצב בעוצמה נמוכה לצד הקלטות מרחביות-זמניות גבוהות ויחס אות לרעש גבוה (SNR). מודל לב המכרסמים ex vivo משמש כפלטפורמה יעילה לאימות הפונקציונליות של חומרים ומכשירים חדשים, גישור בין ממצאים במבחנה לתובנות תרגומיות תוך מזעור חששות אתיים ומנהליים. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים את הבידוד והזלוף ex vivo של לבבות חולדות בוגרים באמצעות מנגנון לנגנדורף, תוך יצירת גירוי דו-כיווני מדויק ורישום עם מוליכים למחצה ומוליכים בעלי ביצועים גבוהים, כולל סיליקון ננו-נקבובי, פחמן ננו-נקבובי ומערכי מיקרו-אלקטרודות גמישים דמויי רשת. בנוסף, אנו מציגים מודל אוטם שריר הלב המושרה על ידי פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה (I/R), המוערך באמצעות רישום ומיפוי רב-ערוציים כמו גם צביעת אוטם, המאפשר מחקרים רלוונטיים למחלות לב וחקירות טיפוליות פוטנציאליות. מתודולוגיה זו מציעה תובנות חשובות לגבי מחקר ממשק חומרים-ביו ופיתוח הדור הבא של ביו-אלקטרוניקה לבבית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תחום הביו-אלקטרוניקה של הלב מתקדם במהירות, מונע מהצורך לפתח חומרים ומכשירים המאפשרים תקשורת דו-כיוונית מדויקת ויעילה עם הלב 1,2,3,4. מחקרים אלקטרופיזיולוגיים ממלאים תפקיד מרכזי במאמץ זה, ומספקים תובנות קריטיות לגבי האופן שבו חומרים מקיימים אינטראקציה עם ממשקים ביולוגיים לבביים באמצעות אפנון וחישה. בעוד שמודלים במבחנה, כגון קווי תאי HL-1 מתורבתים וקרדיומיוציטים ראשוניים ממכרסמים, מציעים סביבה מבוקרת להערכות ראשוניות 5,6,7,8, הפשטות שלהם לרוב לא מצליחה לשכפל את התנאים המורכבים והדינמיים של לב חי. מודלים אלה חסרים את הארכיטקטורה התלת-ממדית של הלב, החיונית להולכה חשמלית מתואמת ויצירת כוח מכני, ואינם יכולים לחקות מחזורי התכווצות-הרפיה קצביים או דינמיקת זלוף קריטית לאספקת חמצן וחומרים מזינים9. לעומת זאת, מודלים in vivo מספקים את התובנות הרלוונטיות ביותר מבחינה פיזיולוגית אך מגיעים עם אתגרים אתיים, מנהליים וטכניים משמעותיים, כולל הצורך בהכשרה נרחבת, מערכי כירורגיה מתוחכמים ועמידה במסגרות רגולטוריות מחמירות10.

כדי לגשר על הפער הזה, מודלים של לב ex vivo, כמו לב החולדה הבוגר של לנגנדורף, מציעים אלטרנטיבה משכנעת למחקר מדעי11,12. מודלים אלה משלבים את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מערכות in vivo עם יכולת השליטה והנגישות של הגדרות in vitro. על ידי בידוד הלב ושמירתו במצב תפקודי, מנגנון לנגנדורף מאפשר לחוקרים לבצע מחקרים בנאמנות גבוהה על אלקטרופיזיולוגיה של הלב בתנאים מבוקרים במדויק. היעדר משתנים מערכתיים כגון תשומות עצביות והורמונים במחזור מפשט את פירוש התוצאות תוך שמירה על היבטים מרכזיים של פיזיולוגיה של הלב. בנוסף, מודלים ex vivo מפחיתים חששות אתיים רבים ומפחיתים את נטל המשאבים, מה שהופך אותם לפלטפורמה רב-תכליתית ומעשית למחקר תרגומי13.

בנוסף לפוטנציאל התרגום שלו, פרוטוקול זה קובע אמת מידה להערכת ביצועי חומרים. על ידי שילוב אסטרטגיות חומר מייצגות, כגון פלטפורמות אופטו-אלקטרוניות לגירוי פוטו אלחוטי ומערכות אלקטרוניות לגירוי והקלטה קווית, הוא יוצר מסגרת ניתנת לשחזור למחקרים השוואתיים. סטנדרטיזציה זו לא רק מאפשרת חדשנות אלא גם משפרת את יכולת השחזור והאמינות של ממצאים בקבוצות מחקר. בעבר, פוטואלקטרודות ואלקטרודות רבות בעלות ביצועים גבוהים הראו הבטחה גדולה למחקרים ביו-חשמליים, כגון PEDOT: PSS14, MXene15, תחמוצות אירידיום16, פלטינה17, מוליבדן18, סיליקון 19,20,21, נקודות קוונטיות 22,23,24 ומוליכים למחצה אורגניים25. כאן, פרוטוקול זה מציג חומרים מייצגים ומתקדמים, כולל סיליקון ננו-נקבובי26, פחמן ננו-נקבובי27 ומערכי רב-אלקטרודות זהב גמישים דמויי רשת (MEAs)28,29, המשתלבים בפרוטוקול כדי להדגים את יכולותיהם בממשקי לב דו-כיווניים. חומרים אלה מאפשרים גירוי על-סף בעוצמה נמוכה, רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה והקלטות SNR גבוהות, המציגים את הפוטנציאל שלהם לקידום ביו-אלקטרוניקה לבבית. יתר על כן, הכללת מודל אוטם שריר הלב המושרה על ידי פגיעת I/R מספקת מסגרת חזקה למחקרים רלוונטיים למחלה ולמחקרים טיפוליים.

עבודה זו מציגה שיטות מפורטות לייצור ויישום חומרים מתקדמים עבור גירוי אור ללא עופרת וגירוי חשמלי וחישה עם לבבות חולדות ex vivo (איור 1A). ממברנות סיליקון ננו-נקבוביות יוצרו באמצעות דפוס פוטוליתוגרפיה, תחריט יונים תגובתי (RIE) ושחרור חומצה הידרופלואורית (HF) מפרוסות סיליקון על מבודד (SOI) עם שכבת מכשיר של 5 מיקרומטר, ואחריה תחריט כתמים והעברה לממברנות פולידימתילסילוקסן רכות (PDMS)26. לצורך גירוי חשמלי והקלטה, פחמן ננו-נקבובי פותח על ידי אבלציה בלייזר של מצעי תאית מודגרים במלח, ואחריו העברת פאזת מים ולמינציה בחום, מה שמציע יכולות אחסון והזרקה משופרות של מטען בהשוואה לאלקטרודות זהב מסורתיות27. בנוסף, MEAs גמישים יוצרו על פרוסות Si מצופות פולימיד באמצעות פוטוליתוגרפיה, מתכת קרן אלקטרונית, תחריט, אנקפסולציה ותהליכי שחרור כדי לאפשר רישום ומיפוי אפיקרדיאלי בפתרון מרחבי28,29.

מעבר לייצור, הפרוטוקול מספק פרוטוקול שלב אחר שלב לבידוד לב של חולדות בוגרות, זלוף, ניטור והתממשקות עם מכשירים אופטיים וחשמליים. המכשירים נבדקו על לבבות מבודדים, והדגימו תוצאות מייצגות בקצב ורישום להערכה אלקטרופיזיולוגית. פרוטוקול זה מציג גם שיטה ליצירת מודל אוטם שריר הלב באמצעות I/R, המאומת על ידי רישומים פיזיולוגיים, צביעה והערכות מורפולוגיות. מתודולוגיה מקיפה זו מבססת מסגרת הניתנת לשחזור להערכת חומרים ומכשירים בממשקים ביולוגיים לבביים. איור 1B-D מתאר את זרימות העבודה של ייצור חומרים להערכה במודל לב ex vivo זה. איור 2A-C מדגים את התוצאות הצפויות בתמונות של המכשירים כפי שנוצרו.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת שיקגו (מספר פרוטוקול 72378).

1. ייצור קרום סיליקון ננו-נקבובי (איור 1B, איור 2A, איור 3)

  1. תכנן את תבנית מסיכת הפוטו בתוכנת AutoCAD (איור 3). ודא שגודל המכשיר תואם את סולם האורך של המטרה הביולוגית. עבור לב העכברוש, השתמש במכשיר בגודל 2 - 10 מ"מ. בתכנון, הוסף מערכי חורים קטנים בקוטר 20 - 100 מיקרומטר כדי להקל על שחרור שכבת התקן Si ב- HF חוצץ. צור את שלושת החורים הגדולים בקוטר 200 - 1000 מיקרומטר, ויוצר אות כיראלית L כדי לסייע בזיהוי הצד הנכון של הממברנה.
  2. נקו את פרוסת ה-SOI עם אצטון ואלכוהול איזופרופיל (IPA) למשך 3 דקות כל אחד באמבט האולטראסוני. בצע אפיית התייבשות ב-200 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות על הפלטה החמה.
  3. ציפוי סיבוב ההתנגדות החיובית העבה AZ40XT-11D ב -3000 סל"ד למשך 45 שניות, אופה ב -115 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. היזהר לא לשפוך יותר מדי התנגדות לאור על הוופל. לאחר ציפוי הסיבוב, נקה את השאריות בצד האחורי של הוופל באמצעות ספוגיות אצטון.
    הערה: AZ40XT-11D הוא פוטו-רזיסט חיובי צמיג מאוד.
  4. השתמש בכותב הישיר של היידלברג MLA150 כדי לחשוף את דפוס ההתנגדות לאור ב-375 ננומטר ומינון של 800 mJ/cm2. בצע את האפייה לאחר החשיפה ב-110 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
  5. פתח את התבנית במפתח AZ 300MIF למשך 2 דקות. שטפו את הוופל במים נטולי יונים (DI) למשך 60 שניות ולאחר מכן יבשו עם N2 אוויר.
  6. חרטו את ה-SOI החשוף באמצעות תהליך SF6/CHF3 (20 sccm:50 sccm) RIE למשך 12 דקות באמצעות פלזמה מצומדת אינדוקטיבית ב-600 W ותדר רדיו של 60 W בתחריט פלואוריד פלזמה מצומד אינדוקטיבי עם לחץ תא של 10 mT, וכתוצאה מכך קצב תחריט של כ-660 ננומטר/דקה.
  7. הפשיטו את הפוטו-רזיסט באמצעות AZ NMP באמבט קולי של 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ונקו את הוופל באמבט קולי למשך 3 דקות באצטון, ולאחר מכן 3 דקות ב-IPA, וייבשו באמצעות חנקן דחוס.
  8. טבלו את הדגימה ב-HF חוצץ בטמפרטורת החדר כדי לחסל שכבות תחמוצת קבורות. המכשיר משתחרר תוך 4 - 8 שעות. הגדל מעט את טמפרטורת התמיסה (40 מעלות צלזיוס) כדי להקל על השחרור.
  9. העבירו בזהירות את הממברנות המשוחררות עם נייר סינון בגודל 1 ס"מ על 1 ס"מ לשתי אמבטיות מים DI נפרדות ברצף כדי להסיר שאריות HF.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן. משרים את הממברנה באמבט IPA לאחסון בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  10. מעבירים את הממברנה באמצעות נייר סינון לצלחת פטרי עם מים נטולי יונים (DI). הממברנה תצוף על פני המים עקב הידרופוביות ומתח פנים.
    הערה: ממברנות סיליקון יכולות לנוע בקפדנות מ-IPA למים עקב אפקט מרנגוני30.
  11. בצלחת פטרי נפרדת, הכינו את תמיסת תחריט הכתם המכילה יחס נפח של 100:1 של HF מרוכז וחומצה חנקתית מרוכזת (למשל, 10 מ"ל HF ו-0.1 מ"ל HNO3). מערבבים אותו היטב לפני התחריטה.
  12. העבירו את הממברנה עם נייר סינון לתמיסת תחריט הכתמים וחרטו למשך 30 שניות. שימו לב לצד של קרום ה-Si על ידי ציון כיוון האות L שנוצר על ידי שלושת החורים העיקריים. קרום ה-Si צריך לצוף על התחריט, שם חרוט רק צד אחד של הממברנה.
  13. העבירו את הממברנה עם נייר סינון לשני צלחות מים DI נפרדות כדי לשטוף את שאריות ה-HF.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן. מעבירים את הממברנה ל-IPA לאחסון ב-4 מעלות צלזיוס.
  14. הכינו מצע תומך עם PDMS דק. מערבבים את חלק A (פולימר בסיס) וחלק B (חומר ריפוי) ביחס משקל של 10:1 ומסירים גז למשך 30 דקות.
  15. מעיל ספין PMMA (495 A6) שכבת הקרבה על מגלשת זכוכית ב-2,000 סל"ד למשך 45 שניות. אופים בחום של 180 מעלות למשך 60 שניות.
  16. ציפוי ספין PDMS ב -4,500 סל"ד למשך 45 שניות על הזכוכית המצופה PMMA, מה שאמור לגרום לעובי של 10 - 20 מיקרומטר. מרפאים בתנור 80 מעלות צלזיוס או בפלטה חמה למשך שעתיים.
    הערה: כדי להפחית נזק מכני, PDMS שימש כמצע רך להכיל את ממברנות הסיליקון הננו-נקבוביות, ומספק הגנה מפני נזק פוטנציאלי מטיפול ישיר בפינצטה.
  17. העבר את קרום ה-Si החרוט בכתמים מ-IPA ל-PDMS. השתמש ברקמה נקייה כדי להסיר את עודפי ה-IPA, וממברנת ה-Si תצמד היטב ל-PDMS לאחר שה-IPA יתאדה. שימו לב לצד של קרום ה-Si על ידי זיהוי כיוון האות L שנוצר על ידי שלושת החורים העיקריים. ה-Si הנקבובי החרוט צריך לפנות החוצה, וה-Si הלא חרוט צריך להתממשק עם PDMS.
  18. חותכים את ה-PDMS בצורה היקפית באמצעות סכין גילוח המכיל את קרום ה-Si. השאירו מספיק מקום והיזהרו לא לפגוע בקרום ה-Si.
  19. משרים את המכשיר באצטון עד לשחרור ה-Si/PDMS. הימנע מהשרייה ארוכה מדי, מכיוון שהיא עלולה לגרום לנפיחות PDMS. שוטפים אותו במי DI ומייבשים אותו עם N2. בצע טיפול בפלזמה O2 ב-400 וואט למשך 10 דקות.

2. ייצור מערכי מיקרו-אלקטרודות גמישים (איור 1C, איור 2B, איור 4)

  1. תכנן את המבנה של MEAs גמישים ב- AutoCAD (איור 4). אנו מציגים שני עיצובים שונים הכוללים את אותו אזור הקרנת אלקטרודה אך מבני מצע שונים (איור 2B, איור 4).
  2. נקה את מצע פרוסת הסיליקון באצטון ו-IPA למשך 3 דקות כל אחד באמבט קולי.
    הערה: פרוטוקול זה אינו דורש טיפול משטח נוסף כדי לשפר את ההידבקות בין פולימיד (PI) לפרוסה Si כדי להקל על שחרור המכשיר. ניתן להשתמש בטיפול בפלזמת חמצן כדי לשפר את ההדבקה במידת הצורך.
  3. יוצקים 4 מ"ל מתמיסת מבשר PI של פולי (דיאנהידריד פירומליטי-קו-4,4′-אוקסידיאנילין) על הוופל. סובב את הוופל ב-1,500 סל"ד למשך 45 שניות. השתמש ב-NMP או באצטון כדי להסיר את הפרקורסור בצד האחורי של הוופל.
  4. אופים מראש בחום של 110 מעלות למשך 3 דקות, ואז בחום של 180 מעלות למשך 3 דקות. רפא את הוופל המצופה PI בתנור ההתנגדות עם פרופיל מצב. התחל מטמפרטורת החדר, מחממים עד 250 מעלות צלזיוס בקצב הרמפה של 4 מעלות צלזיוס לדקה, ומחזיקים למשך 30 דקות. לאחר מכן מחממים את הוופל ל-350 מעלות צלזיוס בקצב הרמפה של 2.5 מעלות צלזיוס לדקה, ושומרים על 350 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, ואז מצננים לאט ל-RT. התוצאה היא סרט PI בעובי של כ-5 מיקרומטר.
  5. ציפוי ספין את הוופל המצופה PI עם AZ nlof 2020 ב -2,000 סל"ד למשך 45 שניות. אופים את הוופל בחום של 110 מעלות למשך 2 דקות. השתמש בכותב הישיר של היידלברג MLA150 כדי לחשוף את דפוס ההתנגדות לאור ב-375 ננומטר ומינון של 200 mJ/cm2.
  6. בצע את האפייה לאחר החשיפה ב-110 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. פתח את התבנית במפתח AZ 300MIF למשך דקה אחת. שטפו את הוופל במי DI למשך 60 שניות ולאחר מכן יבשו עם N2 אוויר.
  7. הפקידו 10 ננומטר טיטניום ו-200 ננומטר זהב באמצעות מאייד קרן אלקטרונית. הפשיטו את הפוטו-רזיסט באמצעות AZ NMP באמבט של 80 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות ונקו את הוופל באמבט קולי למשך 3 דקות באצטון, ולאחר מכן 3 דקות ב-IPA וייבשו באמצעות חנקן דחוס.
  8. ציפוי סיבוב ההתנגדות החיובית העבה AZ40XT-11D ב-3,000 סל"ד למשך 45 שניות. נקה את הפוטו-רזיסט בצד האחורי של הוופל באמצעות אצטון. אופים את הוופל בחום של 115 מעלות למשך 3 דקות.
  9. השתמש בכותב הישיר של היידלברג MLA150 כדי לחשוף את דפוס ההתנגדות לאור ב-375 ננומטר ומינון של 800 mJ/cm2. בצע את האפייה לאחר החשיפה ב-110 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
  10. פתח את התבנית במפתח AZ 300MIF למשך 3 דקות. שטפו את הוופל במי DI למשך 60 שניות ולאחר מכן יבשו עם N2 אוויר.
  11. חרטו את ה-PI החשוף באמצעות תהליך SF6/CHF3 (20 sccm: 50 sccm) RIE למשך 20 דקות עם פלזמה מצומדת אינדוקטיבית ב-600 W ותדר רדיו של 60 W בתחריט פלואוריד פלזמה בצימוד אינדוקטיבי עם לחץ תא של 10 mT.
  12. הפשיטו את הפוטו-רזיסט באמצעות AZ NMP באמבט של 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ונקו את הוופל בסוניקציה עדינה למשך 3 דקות באצטון, ולאחר מכן 3 דקות ב-IPA וייבשו באמצעות חנקן דחוס.
    הערה: השתמש באולטרסאונד בהספק נמוך כדי למנוע את ניתוק המכשיר. הימנע מסוניקציה אם ה-PI מראה סימני ניתוק.
  13. עבד את הוופל בתנור hexamethyldisilazane (HMDS) כדי ליישם טיפול HMDS. מעיל מסתובב SU-8 2002 ב-2,000 סל"ד למשך 45 שניות. התוצאה היא עובי SU8 של כ-2.5 מיקרומטר.
  14. אופים את הוופל בחום של 95 מעלות למשך 20 דקות. השתמש בכותב הישיר של היידלברג MLA150 כדי לחשוף את דפוס ההתנגדות לאור ב-375 ננומטר ומינון של 950 mJ/cm2.
  15. פתח את התבנית במפתח SU-8 למשך דקה אחת. שוטפים אותו במי IPA ו-DI, ומייבשים עם גז N2 . אם מופיעים כתמים לבנים על הוופל במהלך שטיפת ה-IPA, יש להשרות את הוופל במפתח SU8 עד להיעלמות כתמים לבנים.
  16. מבצעים אפייה קשה בחום של 160 מעלות למשך הלילה. השתמש בזמני אפייה קצרים יותר (~30 דקות) לניסויים חריפים. אין לאפות מתחת ל-150 מעלות או מעל 200 מעלות. קלף את ה-MEA הגמיש הנתמך על ידי PI מהמצע.

3. ייצור פחמן ננו-נקבובי (איור 1D, איור 2C, איור 5)

  1. תכנן את תבנית סרט הפחמן בתוכנת התכנון (איור 5).
    הערה: שיטה זו מכילה את פרוטוקול הייצור עבור שני סוגים של אלקטרודות: אלקטרודת גירוי מבוססת פחמן ננו-נקבובית ואלקטרודת חישה.
  2. הספגו את נייר הסינון בתמיסות מימיות של נתרן בוראט (0.15 M, pH 9.4) למשך שעה אחת ולאחר מכן יבשו בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה (איור 1D).
    הערה: נייר סינון Whatman בדרגה 1 שימש בעיקר כמצע נקבובי מבוסס סיבים מייצג. נתרן בוראט משולב בסיבי התאית לאחר תהליך ההספגה והייבוש. מלח משמש כזרזים המאפשרים פחמן פוטוכימי תחת סינתזת לייזר27.
  3. בצע סינתזת לייזר באמצעות לייזר CO2 עם תבניות מתוכננות מראש (איור 5A). דפוס ביצוע במצב רסטר עם פרמטרים אופטימליים: הספק = 1.8 וואט; מהירות = 1.6 ס"מ לשנייה; נקודות לאינץ' = 1000.
  4. הכן סרט פוליאתילן טרפתלט (PET) בעובי של 50 מיקרומטר ונקה את הסרט עם אצטון ואלכוהול איזופרופיל (IPA) למשך 3 דקות כל אחד באמבט האולטראסוני.
  5. הפקידו 5 ננומטר של טיטניום ו-100 ננומטר של זהב באמצעות מאייד קרן אלקטרונית. החל את הליך העברת שלב המים כדי להעביר את ה-MEA על סרט ה-PET (12.5 מיקרומטר).
    הערה: העברת פאזת המים בוצעה באמצעות שני תהליכים עוקבים: הפרדת פאזת מים והעברה נימית.
  6. טבלו מצעי נייר בהדרגה במי DI לצורך דלמינציה במהלך הפרדת שלב המים.
    הערה: אנרגיית המתח הנגרמת על ידי נפיחות תאית הקלה על הפרדת קרום הפחמן מהמצע התומך תוך פחות משנייה, וגרמה לו לצוף על פני המים.
  7. השתמש במצע התומך, למשל, סרט PET, להעברת הדפוסים במדיום מים במהלך העברת נימים. טבלו את המצע במים והביאו אותו למגע עם קצה אחד של קרום הפחמן הרצוי ליצירת קו מגע (חזית ההעברה). לאחר מכן, החזק את המצע ביד ונע בכיוון מוטה או אנכי במהירות נמוכה.
    הערה: עבור מצעים תומכים הידרופוביים, ניתן להפעיל כוח חיצוני או טיפול בפלזמה O2 כדי לסייע ביצירת קו המגע.
  8. לאחר ההעברה, יש למרוח כ-20 מיקרוליטר של תמיסת פולימר חומצה פרפלואורו-סולפונית (PFSA) (בריכוז של ~5% בתערובת של אלכוהולים אליפטיים נמוכים יותר ומים) על דפוסי הפחמן ולאפשר להתייבש בתנאי טמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס) ולחץ (1 אטמוספירה) לקיבוע.
  9. אבטח את אלקטרודת הגירוי הננו-נקבובית המבוססת על פחמן על ידי חיבורה לחוט Cu באמצעות דבק כסף מוליך. עטפו את הצומת החשוף בין חוט ה-Cu לאלקטרודה בדבק סיליקון כדי להבטיח בידוד ויציבות. לאחר ריפוי של 3 שעות בטמפרטורת החדר, אלקטרודת הגירוי מוכנה לשימוש. ניתן להשהות את הניסוי כאן.
  10. תכנן את תבנית הפחמן וה-MEA ב-AutoCAD (איור 5B). בנה מערכי מיקרו-אלקטרודות בגודל 4 x 4 על סרט PI של 25 מיקרומטר באמצעות הליך הפוטוליתוגרפיה הסטנדרטי כמתואר בשלב 2.
    הערה: ניתן ליצור את סרט ה-PI באמצעות מבשר PI או על ידי למינציה של סרט PI מסחרי על פרוסת Si באמצעות AZ2020 photoresist. הפרוטוקול עבור פוטוליתוגרפיה ותצהיר מתכת זהה לשלב 2.
  11. צור ממברנת פחמן מונוליטית (2 ס"מ על 2 ס"מ) על מצע נייר לאחר הספגת מלח וכתיבה בלייזר, כמו בשלבים 3.1-3.3. העבירו את דפוס הפחמן לסרט תמיכה PET שתוכנן מראש בשיטת העברת שלב מים סטנדרטית, כמו בשלבים 3.6-3.9.
  12. מרחו תמיסת פוליאתילן-קו-ויניל אצטט (EVA) של 10% משקל בהקסאן על תבנית הפחמן והמתינו לייבוש בתנאי טמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס) ולחץ (1 אטמוספירה). תכנן וחתוך בלייזר תבנית PET בעובי 10 מיקרומטר (עם ציפוי EVA בצד התחתון) עם 16 חורים מיושרים לתבנית MEA, המשמשים כשכבת האנקפסולציה.
  13. יישר את שכבת ה-MEA, שכבת עטיפת ה-PET וממברנת הפחמן על תומך ה-PET. לחץ על המכלול באמצעות למינציה חמה מסחרית בטמפרטורת עיבוד של 120 מעלות צלזיוס להעברה ואנקפסולציה.
  14. יש לקרר את אלקטרודת החישה הננו-נקבובית המופעלת על ידי פחמן לטמפרטורת החדר, להסיר את השאריות ולשטוף אותה באתנול ומים פי 3 לפני השימוש בה.

4. בידוד לב חולדה, זלוף וניטור (איור 6)

  1. הכינו חולדות לפני שאיבת הלב (איור 6A). פרוטוקול זה השתמש בחולדות CD/SD זכרות בנות 3 עד 4 חודשים, שהתקבלו מנהר צ'ארלס.
  2. הכן N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES) תמיסת Tyrode על ידי המסת הכימיקלים לפי טבלה 1. התאם את ה-pH ל-7.2-7.4 עם 2M NaOH. חמצן מראש על ידי גז חמצן מבעבע למשך 0.5-1 שעה והמשך חמצון עד לסיום הניסויים.
  3. הניחו שלוש שפופרות של תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS, ללא סידן, ללא מגנזיום) על קרח. הכינו מכשירים כירורגיים נקיים (מספריים חדים, מספריים כפופים, שני המוסטטים, פינצטה חדה, שני זוגות פינצטה קטנה).
    הערה: ניתוח אינו מיועד להישרדות, ולכן אין צורך בסטריליות.
  4. אספו חולדות זכרות CD/SD בוגרות במשקל של בין 400 ל-500 גרם ממתקן החיות. יש לתת 0.5 מ"ל של הפרין (1000 יחב"ל/ק"ג) תוך צפקית לתוך הבטן התחתונה. השתמש בכפפות עבות כדי להחזיק את החולדה להגנה.
  5. תפוס את החולדה בגבה העליון, כך שהבטן תהיה חשופה. החזק את החולדה בחוזקה, אך ללא כוח מופרז כדי לא לפגוע בחיה. להזריק במהירות ובדייקנות את תמיסת הפרין. המתן 20-30 דקות. הכן בינתיים את מכשיר לנגנדורף.
    הערה: ניתן להרדים את החולדה מראש כדי להבטיח את שלב ההכנה הנכון להליך הכירורגי.
  6. לפני מילוי תמיסת HEPES Tyrode, שטפו את שקית הטיפול התוך-ורידי (IV) במים וייבשו אותה לחלוטין כדי להבטיח את ההרכב הסופי הנכון. מלאו את השקית בתמיסת HEPES Tyrode מחומצנת מראש.
  7. הפעל את התרמוסטט ואת זרימת המים במנגנון לנגנדורף ב-37 מעלות צלזיוס (איור 6A). מכינים את הצינורית, התפרים ומניחים את צלחת הפטרי על החבילה הקרה לחיתוך רקמות. יש להניח את הצינורית ב-HBSS קר כקרח לפני החיתוך.
  8. התכוננו לבצע כריתת בית חזה של חולדות (איור 6B). להרדים את החיה עם איזופלורן בתצורת צנצנת פעמון. שים 8 עד 10 מ"ל איזופלורן בצינור של 50 מ"ל מלא בכרית גזה. סוגרים את החיה עם הצינור הפתוח (עם איזופלורן) במיכל.
  9. התבונן בהתקדמות ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס צביטת הבוהן. בעלי חיים יוכנסו להרדמה ויאבדו את הכרתם תוך 2-3 דקות. עקוב אחר מצבה של החולדה בזהירות והעביר אותה לוועדת הניתוח מיד לאחר שהיא מאבדת את הכרתה. הרדמה ממושכת עלולה לגרום למותה של החולדה.
  10. העבירו את החיה ללוח הניתוח. הניחו אותו על הגב והניחו 5 מ"ל של איזופלורן בצינור של 50 מ"ל מלא בפד גזה מעל פיה של החולדה. אשר הרדמה כללית על ידי צביטה של אחת הכפות. המשך רק אם לא צוינה תגובה.
  11. אבטח את הזרועות העליונות והתחתונות ללוח הניתוח בעזרת מחטים. בצע חתך (~ 5 ס"מ) כדי לפתוח את כלוב הצלעות של החולדה ממש מתחת לחזה. חותכים בזהירות את הסרעפת כדי לחשוף את הלב והריאות.
  12. חותכים את הצלעות משני הצדדים כדי לפתוח את כלוב הצלעות במלואו כדי לספק גישה מלאה. אבטח את כלוב הצלעות בעצם החזה באמצעות המוסטט. החזק את הווריד הנבוב מתחת ללב באמצעות המוסטט. הסר את הלב על ידי חיתוך מתחת להמוסטט בעזרת מספריים קהות כפופות קרוב ככל האפשר לתחתית כלוב הצלעות.
  13. העבירו את הלב ל-HBSS קר כקרח. צמצם את משך הצעד כדי למנוע הפרעה ממושכת של אספקת החמצן ללב המתכווץ.
  14. התכוננו לבצע זלוף וניטור לנגנדורף. מלאו את צלחת הצינורית והפטרי לחלוטין ב-HBSS קר כקרח. ודא שאין בועות במערכת.
  15. העבירו את הלב לצלחת הפטרי הממולאת מראש ב- HBSS לחיתוך. בעזרת פינצטה ומספריים, הסירו ריאות ורקמות חיבור אחרות (איור 6C).
    הערה: דיסקציה קהה מומלצת להליך החיתוך כדי למנוע נזק פוטנציאלי ללב. לחיתוך רקמות סמוכות, השתמש בשני מספריים וקרע בזהירות את הרקמה.
  16. אתר את אבי העורקים על ידי לחיצה על הלב ומעקב אחר נתיב הדם ביציאתו. חותכים מתחת לעורק העולה הראשון ומקננים את אבי העורקים אם קשת אבי העורקים נשמרת במהלך החילוץ (איור 6D). אבטח את אבי העורקים לצינורית בעזרת קשר כפול.
    הערה: הימנע מהכנסת הצינורית עמוק מדי כדי להבטיח שהשסתום יישאר סגור. אל תמקם את התפר נמוך מדי, מכיוון שהדבר עלול לחסום את העורקים הכליליים.
  17. יש לחזק את מנגנון לנגנדורף בתמיסת עבודה מחומצנת מראש. פתח את זרימת החיץ והצמד את הצינורית למנגנון (איור 6E). ודא שלא יוכנסו בועות אוויר. הלב מתחיל להתכווץ בשלב זה.
    הערה: בתחילה, חיץ כלשהו עלול להתיז מהחדרים, אך לא צפויה דליפה מוגזמת. כוונן את התפר לפי הצורך כדי למנוע דליפת חוצץ. לא ייצפה פרפור לב בשלב זה אם הניתוח וההכנה מתבצעים כראוי.
  18. חותכים את הפרוזדורים. רוקנו את הבלון לפני הכנסתו לחדר השמאלי, ולאחר מכן מלאו אותו במים באמצעות המזרק המחובר.
  19. חבר בדיקות BP-100 לקו הזלוף ולבלונים מלאים במים כדי לנטר זלוף ולחץ חדר שמאל (LVP), בהתאמה (איור 6F).
    הערה: בדיקות BP-100 זקוקות לכיול לפני השימוש. יש להוציא בועות בבלונים כדי להבטיח את חישת הלחץ המדויקת.
  20. עקוב אחר לחץ המאגר של HEPES Tyrode וקו הבסיס של LVP. ודא שלחץ המאגר נשמר בטווח האופטימלי של 80-100 מ"מ כספית. כוונן את ה-LVP הבסיסי לכ-20 מ"מ כספית על ידי שינוי נפח המים המוזרק לתוך הבלון (איור 6F).
  21. חבר אלקטרודות א.ק.ג. הארקה של הצינורית ומקם את האלקטרודה בצדדים, בחלק העליון או בקודקוד על סמך העדפה (איור 6F).
  22. להגביר את כל האותות (זלוף, לחץ חדר שמאל ואק"ג) באמצעות מגבר IA-400D וממשק עם מחשב באמצעות דיגיטייזר עם תוכנת Clampex (איור 6F).

5. יצירת אוטם שריר הלב באמצעות תהליך IR (איור 6G, איור 7)

  1. מלאו את החדר המחומם במאגר HEPES Tyrode שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס. טבלו את הלב לתוך המאגר בתוך התא המחומם והתאימו את תא העצירה כדי לעצור את זרימת החיץ, ולגרום לאיסכמיה גלובלית. התאם את משך האיסכמיה על סמך המטרות הספציפיות של הניסוי.
  2. סובב את תא העצירה כדי להחזיר את זרימת החיץ ללב לאחר 30 דקות של איסכמיה, ולהתחיל רפרפוזיה. אפשרו עירוי חוזר של הלב במשך 45 דקות לפני סיום הניסוי לצביעה כדי להעריך את גודל האוטם (איור 6G).
    הערה: זמן האיסכמיה או הרפרפוזיה נקבע על סמך יעדי הניסוי.
  3. ודא אינדוקציה איסכמית מוצלחת על ידי התבוננות בהפחתת קצב הלב ודפוסי א.ק.ג לא סדירים (איור 7A). נצפתה הפרעות קצב או פרפור חדרים.
  4. יש לתת לאט 10 מ"ל של 4 מעלות צלזיוס HBSS דרך היציאה הצדדית של תא העצירה כדי לעצור את הלב. הסר את הלב מעמוד הזלוף, חתוך את כל רקמת הפרוזדורים שנותרה והנח את הלב במטריצת חיתוך רקמות.
  5. מכסים את המטריצה בסרט שקוף ומקפיאים את הלב בחום של -80 מעלות צלזיוס למשך כ-8 דקות או עד שהוא מגיע למרקם דמוי מרשמלו. הסר את מטריצת חיתוך הרקמות מהמקפיא והכנס סכיני גילוח כדי לפרוס את הלב לחלקים בעובי 2 מ"מ.
  6. מוציאים את פרוסות הרקמה ממטריצת החיתוך בזו אחר זו ומאחסנים אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שהן נחוצות לניסויים ביוכימיים.
  7. בצע צביעת אוטם (איור 7B). דגרו את פרוסות הלב ב-10 מ"ל של 1% w/v triphenyltetrazolium chloride (TTC) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  8. העבירו את פרוסת הרקמה לפורמלין 10% חומצה והניחו לה להתייצב בטמפרטורת החדר למשך הלילה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הסר את הלב מהפורמלין ודמה את הרקמה תוך 24 שעות. צמצם את החשיפה לאור במהלך שלב זה כדי למנוע השפלה של הכתם.
  9. צלם את הפרוסה המוכתמת והשתמש בתוכנה כגון ImageJ כדי להעריך את גודל האוטם.

6. יצירת ממשקים אופטו-אלקטריים דו-כיווניים בין מכשירים לרקמת הלב (איור 8, איור 9)

  1. הנח את הממברנה האופטו-אלקטרונית מסיליקון במיקום הרצוי לגירוי. קרום הסיליקון מתחבר בעצמו לאפיקרדיום בכוח נימי (איור 8A). אם ההצמדה קשה, השתמש בדבקי רקמות רטובות כדי לעזור בהצמדה.
    הערה: הפחתת קצב הזלוף יכולה להפחית את כמות המים על פני הלב, מה שמקל על החיבור. לאחר החיבור למשטח הלב, קרום הסיליקון מתחבר בדרך כלל למיקום שנקבע מראש במהלך הפעולה.
  2. חבר את האלקטרודות למערכות RHD או לפלטפורמות אלקטרופיזיולוגיות אחרות להקלטת נתונים. ה- MEA כוללים רפידות I/O עם 16 ערוצים עם פסיעה של 0.5 מ"מ בקצה אחד, המחוברות דרך מחבר כוח תחיבה אפס (ZIF) ללוח מתאם. לאחר מכן לוח המתאם מקושר לראש הבמה באמצעות מחבר Omnetics.
  3. הניחו את ה-MEA הגמישים על משטחי החדרים של לב החולדה המבודד (איור 8A). הנח את ה-MEA בתוך החלון אם אתה משתמש בקרום סיליקון בצורת חלון (איור 8B).
  4. תכנת את מקור הלייזר של 635 ננומטר עם התדר הרצוי (למשל, 4 הרץ) ומחזור העבודה (למשל 0.4%, משך פולס של 1 אלפיות השנייה) באמצעות אותות טרנזיסטור-טרנזיסטור לוגיקה (TTL). מקד את נקודת הלייזר על קרום הסיליקון, עם גודל נקודה סביב 1 מ"מ. הרכיבו משקפי בטיחות לייזר מגן. התחילו בעצימות נמוכה למיקוד.
  5. התחל את פרוטוקול ההקלטה והגירוי. הגדל בהדרגה את עוצמת הלייזר עד שנצפה קצב עקיפה ללא הפרעה (איור 8C).
    הערה: בתקנים של פרוטוקול זה, הוא מגדיר את עוצמת הסף שבה הלייזר מאפשר 10 שניות של קצב ללא הפרעה.
  6. תכנת את פרופיל הלייזר עם משכי פולסים שונים כדי לקבל פרופיל עוצמה לעומת משך זמן כדי להשוות את ביצועי ההתקן (איור 8D). ההגדרה מאפשרת הקלטה רב-ערוצית של ECG, TTL ו-LVP (איור 8E).
  7. שנו את המיקום של קרום הסיליקון או מיקום נקודת האור וחזרו על שלבים 6.3-6.6 כדי לחקור כיצד מיקומי קצב שונים משפיעים על צורות גל קצביות ועל הולכת לב (איור 9A).
  8. זהה את שיאי ה-QRS בקצב מכל אתר הקלטה כדי לבנות את מפת האיזוכרון או עיכוב ההפעלה. זהה את שיא ה-QRS המוקדם ביותר והגדר מיקום זה כעיכוב אפס כדי לשרטט את מפת עיכוב ההפעלה (איור 9B-C).
    הערה: בעוד שמפת עיכוב ההפעלה בקצב הסינוסים (ללא קצב) יכולה לשמש כהתייחסות, הדפוס שלה עשוי להשתנות באופן משמעותי בהתאם למצב הלב ולמיקום MEA18,30. התוצאות משמעותיות יותר כאשר קיים מקור גירוי ברור, כגון קצב חיצוני.

7. יצירת ממשקים חשמליים דו-כיווניים בין מכשירים לרקמת הלב (איור 10)

  1. חבר אלקטרודות גירוי (0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ) בתצורה של שתי אלקטרודות, הנח את האלקטרודה העובדת על דופן החדר השמאלי בזמן שהאלקטרודה הנגדית נמצאת על דופן החדר הימני.
  2. לספק צורות גל זרם ריבועי (למשל, 1 mA, משך פולס של 1 אלפיות השנייה) דרך פוטנציוסטט עד לקצב מוצלח (איור 10A-B). בצע בדיקות להשגת זרם גירוי לעומת משך הדופק ומתח גירוי לעומת משך הדופק כדי להעריך את יעילות גירוי החומר (איור 10C-D).
  3. בצע הקלטה חשמלית באמצעות מערך מיקרו-אלקטרודות 4 x 4 (מרווח של 2 מ"מ בין אלקטרודות) והוקלט באמצעות לוח ממשק RHD USB וראש הקלטת קלט RHD 16 ערוצים. הקלט את האותות במהירות של 10 kS/s ברוחב הפס של 0.1-100 הרץ.
  4. מדוד את הרעש של כל אלקטרודת הקלטה (איור 10E). חשב את ה-SNR באמצעות המשוואה הבאה (איור 10F):
    figure-protocol-1אוfigure-protocol-2
    כאשר האות הוא משרעת האותורעש std הוא סטיית התקן של רמות הרעש. בהקלטה, מסנן החריץ של 60 הרץ כבוי כדי לשקף את התוצאות הגולמיות.
  5. לבצע אנליזה נוספת ולשרטט מפות איזוכרונליות של ההתפשטות החשמלית באמצעות פייתון.
  6. קבע חותמת זמן של סטיית שיא (קומפלקס QRS בקצב) עבור כל התכווצות וחשב את הממוצע עבור אותות מרובים. השתמש באינטרפולציה גאוס לעיבוד מפה כדי לשפר את הקריאות.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן לאמת ביעילות את האלקטרופיזיולוגיה של הגירוי של מגוון רחב של חומרים אופטו-אלקטרוניים ואלקטרוניים באמצעות מערכת הלב ex vivo , המספקת מערך נוח ומבוקר (איור 1A). חומרים בהזרקת מטען גבוהה כגון סיליקון נקבובי ופחמן נקבובי מקלים על אפנון ביו-חשמלי עם עוצמה אופטית נמוכה וגירוי במתח נמוך, ומבטיחים בטיחות ופעולה קיבולית מאוזנת מטען.

סיליקון ננו-נקבובי מציג ייצור פוטו-זרם גבוה משמעותית בהשוואה למבני סיליקון קונבנציונליים, כגון צמתים p-n או p-i-n (איור 11A), בשל ההטרו-צומת20 המופעל על ידי נקבוביות, קיבולת אחסון מטען משופרת, עכבה מופחתת וספיגה אופטית משופרת. זרמי פוטו קיבוליים אלה מאפשרים גירוי מאוזן מטעןבטוח ביולוגית 31 (איור 12A-B), ומשיגים קצב אופטי של לבבות חולדות ex vivo ב-240 bpm עם עוצמת אור של 0.51 mW/mm2 ומשך פולס של 1 ms (איור 8C), או נמוך עד 0.167 mW/mm2 עם משך פולס של 10 ms (איור 11B) - ערכים דומים או נמוכים יותר משיטות אופטוגנטיות והרבה מתחת לסף בטיחות הלייזר31, 32. מתחת לעוצמות אלה, עלולה להתרחש לכידה חלקית או לא של פולסי אור. לעומת זאת, חומרים אחרים, כגון ממברנות סיליקון p-i-n או ממברנות סיליקון p-i-n מעוטרות בזהב, דורשים עוצמות אופטיות גבוהות יותר באופן משמעותי כדי לעורר קצב (איור 11B). קצב רציף עם סיליקון ננו-נקבובי מגביר את ההתכווצות המכנית, כפי שמצוין על ידי LVP מוגבר (איור 8E). יתר על כן, בצורתו המונוליטית, המכשיר מדגים הזרקת פוטו-זרם ברזולוציה מרחבית גבוהה תחת פולסי אור מקומיים, מה שמאפשר מחקרי גירוי מרובי אתרים ופוטנציאליים בגישה אקראית26.

במחקרי קרום סיליקון דו-כיווניים בצורת חלון (איור 3D, איור 8B), גירוי רב-אתרים מייצר פרופילי הקלטה מרובי אלקטרודות ודפוסי הולכת לב מובחנים, המאמתים את מקוריות התפשטות הגל מכל נקודת גירוי (איור 9). תכונה זו מדגישה את יכולתה של המערכת לנתח מסלולי הולכה לבביים מורכבים בדיוק גבוה ואת היכולת לאבחן מצבי לב חריגים כגון אוטם שריר הלב.

עובי ה-MEA המיוצר הוא כ-10 מיקרומטר, המשלב מבנים מקרו-נקבוביים או חיבורי סרפנטין כדי למזער את קשיחות הכיפוף ולשפר את הגמישות או יכולת המתיחה (איור 4)33,34. המערכים מורכבים מ-16 אתרי הקלטה עצמאיים המסודרים בתצורת 4 x 4, המכסים שטח של 6 מ"מ על 6 מ"מ. מערכים אלה מאפשרים הקלטה ישירה של אותות אפיקרדיאליים במספר אתרים על פני הלב. הקלטה מייצגת של 16 ערוצים מודגמת באיור 13. מפות איזוכרון שנבנו מההקלטות מדמות הולכה חשמלית על פני הלב, עם או בלי גירוי מקומי. גירוי מקומי גורם לעתים קרובות לעיכובים בהולכה שעוקפים את קצב הסינוס הפנימי ומסלולי ההולכה של הלב ex vivo (איור 9B).

חומרי פחמן ננו-מובנים מהווים פתרון יעיל לשיפור ביצועי התקנים ביו-אלקטרוניים בשל יכולת אחסון המטען הגבוהה והעכבה הנמוכה שלהם (איור 14). שיטת העברת הלייזר בסיוע מלח שלנו מאפשרת דפוס קל והעברה מיידית של התקני פחמן ננו-נקבוביים על מצעים גמישים או אלקטרודות Au מסורתיות לשיפור ביצועי הביו-אלקטרוניקה. אפיון העכבה אישר עוד כי ציפוי הפחמן הפחית באופן משמעותי את העכבה של אלקטרודת ה-Au בכ-2 סדרי גודל, מ-7244.4 Ω ל-63.1 Ω בתדר של 100 הרץ הרלוונטי לאותות א.ק.ג (איור 14A-B). קיבול הלמהולץ של אלקטרודת Au גדל באופן משמעותי לאחר ציפוי פחמן, מ-0.025 mF/cm2 ל-1.98 mF/cm2 (איור 14C). הגידול בקיבוליות באמצעות אסטרטגיית ציפוי מיקרו-קבלים זו יכול להוריד ביעילות את מתח הקיטוב בהשוואה לאלקטרודה Au המסורתית (איור 14D).

פרוטוקול זה מקים פלטפורמה מבוססת פחמן ננו-נקבובית עבור ממשקים ביולוגיים יעילים לקראת אפנון חשמלי או חישה של מערכות לב (איור 10). להערכת הביצועים של אלקטרוניקת פחמן ננו-נקבובית לגירוי לבבי, האלקטרודה Au או Au-C הונחה על דופן החדר השמאלי (LV) להזרקת מטען בצורות גל של זרם ריבועי דו-פאזי35 (איור 10A). בגירוי של 4 הרץ (1 mA), גם אלקטרודות Au וגם Au-C השיגו קצב אוברדרייב יעיל (איור 10B). עם זאת, משרעת א.ק.ג גבוהה במיוחד, המעידה על חוזק ההתכווצות, נצפתה בקבוצת Au-C. שתי האלקטרודות הדגימו ירידה אקספוננציאלית בזרם הסף לגירוי עם משך הדופק. ספי גירוי, המציינים את המתחים הנמוכים ביותר עבור אפנון תדרים יעיל, נמדדו גם על פני רוחבי פולסים שונים (איור 10C-D). עקומת החוזק-משך עוצבה באמצעות המשוואה:

figure-results-1

כאשר I(t) מתייחס לזרם הגירוי במשך הדופק (t), Irheobase הוא זרם הסף במשך דופק ארוך לאין שיעור (rheobase), ו-τ הוא קבוע זמן הממברנה36. החישוב משתמש במטען המינימלי הדרוש לגירוי מוצלח בכרונקסיהfigure-results-2. שדקה. הערכים נקבעו כ-0.79 ו-0.71 μC עבור אלקטרודות Au ו-Au-C, בהתאמה (איור 10C). בזרם גירוי של 4 mA/cm2, מתחי סף לגירוי יעיל נצפו ב-1.32 V ו-0.90 V עבור אלקטרודות Au ו-Au-C, בהתאמה (איור 10D). ההפחתה של 30.3% במתח הסף מצביעה על ירידה פוטנציאלית במתח החמצוני במהלך גירוי ממושך31, ובכך מקלה על יישומי ביו-אלקטרוניקה בטוחים יותר עם נזק מינימלי לרקמות. בנוסף, פותחה אלקטרודת Au מושתלת פחמן עם 16 ערוצים לזיהוי אותות א.ק.ג אפיקרדיאלי משופר (איור 10E-F). העברת הפחמן הננו-מובנית שיפרה באופן משמעותי את יחס האות לרעש פי 8.0 בהשוואה לאלקטרודות Au מסורתיות, והדגימה את היעילות של ציפויים ננו-נקבוביים מבוססי פחמן עבור ביו-אלקטרוניקה בנאמנות גבוהה.

האינדוקציה המוצלחת של מודלים של אוטם I/R אומתה באתר במהלך הניסוי או לאחר הניסוי באמצעות ניטור אותות פיזיולוגיים או צביעת TTC, בהתאמה. לאחר החיתוך והצביעה, הלב האוטם יציג אזור בצבע לבן, המייצג נזק לשריר הלב ומתאים לגודל האוטם (איור 7B). לעומת זאת, לב בריא יחסר אזורים לבנים לאחר הצביעה. במהלך ניטור בזמן אמת, מודל איסכמיה מוצלח יציג קצב לב מופחת משמעותית, הניכר בקריאות LVP ו-ECG. בנוסף, מיפוי MEA של הלב האיסכמי יגלה ירידה במהירות ההולכה החשמלית על פני האפיקרדיום, וכתוצאה מכך זמן עיכוב מוגבר37 (איור 7A).

figure-results-3
איור 1: איור סכמטי של זרימת העבודה של הפרוטוקול והייצור. (A) איור סכמטי של מערך לב החולדה ex vivo וממשק המכשיר. (B) תהליך ייצור של קרום סיליקון נקבובי (שלב 1). הייצור של קרום ה-Si הנקבובי מתחיל בפרוסת SOI, שבה שכבת פוטו-רזיסט מעוצבת באמצעות פוטוליתוגרפיה כדי להגדיר תכונות משושה. RIE מסיר באופן סלקטיבי סיליקון חשוף, ואחריו תהליך הרמה ב-HF חוצץ כדי לשחרר ממברנות Si. הממברנה עוברת תחריט כתמים בתמיסה מבוססת HF, ויוצרת מבנה Si ננו-נקבובי. קרום ה-Si הנקבובי שנוצר מנותק בזהירות ומועבר על מצע PDMS לתמיכה מכנית. לבסוף, טיפול בפלזמה משנה את תכונות פני השטח עבור פוטו-זרמים משופרים. (C) תהליך ייצור של מערכי רב-אלקטרודות מקרו-נקבוביים גמישים (שלב 2). ייצור MEAs גמישים מתחיל בציפוי PI על פרוסת סיליקון כדי לשמש כשכבת המצע הגמישה. Photopatterning מבוצע באמצעות AZ 2020 photoresist להגדרת אזורי אלקטרודות. שקיעת מתכת (Au/Ti) מתבצעת באמצעות אידוי קרן אלקטרונית ליצירת עקבות מוליכים, ואחריו שלב פוטו-דפוס נוסף באמצעות AZ 40XT-11D כדי להגן על אזורים נבחרים מפני RIE ליצירת מצע מקרו-נקבובי. שלב צילום ואפייה קשה של SU-8 מוסיף אנקפסולציה לפני שתהליך ההרמה הסופי משחרר את ה-MEA הגמיש מפרוסת ה-Si. (ד) זרימת עבודה של דפוס והעברת קרום פחמן (שלב 3), הכולל עיבוד סיבים באמצעות הספגת מלח, מיקרו-ייצור באמצעות סינתזת לייזר והעברת דפוסים בעזרת מים ממצע נייר לתומכים אחרים. איור 1D שונהמ-27. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 2: תמונות אופטיות ו-SEM של ההתקנים כפי שנוצרו. (A) SEM חתך (למעלה) ותמונה מיקרוסקופית אופטית (למטה) של Si ננו-נקבובי. (B) תמונות אופטיות של מערכי רב-אלקטרודות מקרו-נקבוביים עם עיצובים חלולים (למעלה) וסרפנטין (למטה). (C) תמונה מיקרוסקופית אופטית חתך (למעלה) ותמונה (למטה) של מצעים מוגזים. איור 2A שונהמ-26. איור 2C שונהמ-27. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 3: תכני CAD של התקן ממברנת Si. האיור מפרט את הפרמטרים עבור (A) התקני ממברנת סיליקון קטנים, (B) בינוניים, (C) גדולים ו-(D) התקני ממברנת סיליקון בצורת חלון פתוח. יחידה: מ"מ. נתון זה שונהמ-26. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 4: תכנון CAD של ה-MEA המקרו-נקבובי. (A) שרטוטי העיצוב וההערות עבור ה-MEA בצורת חלול. (B) שרטוטי העיצוב וההערות עבור ה-MEA בצורת הנחש. יחידה: מ"מ. איור 4A שונהמ-26. איור 4B שונהמ-28. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 5: סכמות ותכנים של מערכי אלקטרודות מבוססי-פחמן עבור ממשק לב. (A) תכנון עבור ממשקי האלקטרודות המגרים (שלב 3). במהלך גירוי טיפוסי, אלקטרודות גירוי חוברו בתצורה של שתי אלקטרודות. האלקטרודה העובדת (תבנית פחמן ננו-נקבובי סרפנטין) הונחה על דופן החדר השמאלי, ואילו האלקטרודה הנגדית הונחה על דופן החדר הימני וחוברה לקרקע. צורות גל זרם מרובעות הועברו דרך פוטנציוסטט. (B) ה-MEAs של 16 הערוצים למיסוך והעברה של אלקטרודות פחמן (שלב 3). שכבה 1 מציינת את תבנית ה-Au של MEA בן 16 ערוצים על מצע PI. שכבה 2 מציינת את סרט האנקפסולציה של PET. נתון זה שונהמ-27. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 6: תיאור סכמטי וצילומי של מערך ex vivo ותהליך הניסוי. (א) מכשירים וכלים המשמשים להתקנה ex vivo , כולל מיכלי צלוחיות חרוטיות, מכשירים כירורגיים, מערכות זלוף ומערכות בקרת טמפרטורה (שלב 4). (B) תהליך מיצוי לב חולדה: להרדים את החיה עם איזופלורן; אבטח את זרועות החולדה; פתח את כלוב הצלעות של החולדה; קציר את לב העכברוש. (C) הסרת רקמת השומן שמסביב מהלב שנשאב כדי להכין אותו למערך הניסוי. (D) הצמדת הלב שנשאב למערכת הזלוף ex vivo . (E) מערך זלוף שמראה את הלב מחובר למערכת כדי לדמות מצבים פיזיולוגיים. (ו) הגדרת הקלטת א.ק.ג לב. (G) תהליכי איסכמיה-רפרפוזיה (I/R) מודגמים באמצעות ההגדרה (שלב 5). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 7: השוואה בין לב מבודד בריא ללב I/R. (A) עיכובים בהתפשטות LVP, א.ק.ג ו-ECG תועדו מלבבות בריאים מזויפים, ולבבות איסכמיה/רפרפוזיה (I/R). (B) תצלומים מייצגים של מקטעי לב בריאים מוכתמים בטריפנילטרזוליום כלוריד (TTC). האזור הלבן מציין את גודל האזור האוטם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10
איור 8: קוצב אופטו-אלקטרוני דו-כיווני ורישום חשמלי של לב חולדה ex vivo באמצעות ממברנת סיליקון נקבובית ו-MEAs גמישים. (A) תצלום המראה את החיבור של ממברנת הסיליקון ומיקום של MEAs בצורת סרפנטין ליד קרום הסיליקון על הלב. (B) תצלום שמראה חיבור של קרום סיליקון פתוח בצורת חלון ו-MEA בצורת חלול שמותקנים בתוך חלון Si. (C) קצב אופטי על לב החולדה ex vivo המראה אי-לכידה, לכידה חלקית ולכידה מלאה בשלוש עוצמות שונות ב-240 פעימות לדקה, ומשך פעימה של אלפית שנייה. (ד) תרשים של עוצמה לעומת משך זמן כדי להעריך את סף הקצב של המכשיר. (E) פרופילי קוצב אופטיים בעוצמה של 0.24 mW/mm2 ומשך פולס של 10 אלפיות השנייה. איור 8B-D שונו מ-26. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-11
איור 9: ריווח ומיפוי מרובי אתרים בממשקים דו-כיווניים. (א) מיקומים של אתרי קצב ורישום. (B) מפת איזוכרון מראה עיכוב בהפעלת אותות חשמליים לאחר גירוי פוטו של שמונה מיקומים שונים במכשיר Si מונוליטי בעל מבנה חלון פתוח. (ג) הבקרה המופתית ועקבות א.ק.ג בקצב של 16 ערוצים במיקומי קצב שונים. על ידי גירוי מיקומים שונים, הפעלה מרחבית גרמה לעיכובים זמניים באבולוציה של QRS שזוהו ברקמות באתרי רישום שונים. ניתן לתאר אותם כמפת עיכוב הפעלה, המאפשרת בחינה של מסלולי הולכה על פני הלב. נתון זה שונהמ-26. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-12
איור 10. ביו-אלקטרוניקה ננו-נקבובית מבוססת פחמן לגירוי והקלטת לב. (A) תמונה אופטית של אלקטרודת Au (Au-C) מושתלת בקרום פחמן נקבובי לגירוי הלב. התמונה הפנימית מציגה את התצוגה המוגדלת של מיקרו-קבלים מובנים סרפנטין על אלקטרודת ה-Au. (B) תגובת א.ק.ג של לב חולדה מבודד לגירוי צורת גל דו-פאזית של זרם ריבועי בתדר של 4 הרץ. תחת אותה צפיפות זרם של 4.0 mA/cm2, הלב הראה תגובות א.ק.ג שונות תחת גירוי מאלקטרודות Au או Au-C. (C) עקומות משך הזמן-חוזק של אלקטרודות גירוי Au ו-Au-C והתאמת העקומה שלהן קיימות בתדר גירוי של 4 הרץ. (D) מתח הסף שמופעל על האלקטרודות לגירוי יעיל במשכי זמן שונים עבור אלקטרודות Au ו-Au-C. (E) עקומות בסיס של אותות א.ק.ג שנרשמו עם התקני האלקטרודה Au והאלקטרודה Au-C. (F) יחס האות לרעש (S/N) מחושב מעקומות ה-ECG המוקלטות. האיורים המוכנסים מציגים את התמונות האופטיות של מערך האלקטרודות Au ו-Au-C המשמש להקלטת א.ק.ג (גודל אלקטרודה: 1 מ"מ; שלב 7.5). נתון זה שונהמ-27. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-13
איור 11: השוואת פוטו-זרמים עבור התקני Si שונים והערכת סף קצב. (A) השוואה של גדלי פוטו-זרם על פני ארבעה מכשירים מבוססי Si. עקבות כחולות מייצגות את הפוטו-זרמים הממוצעים מהתקנים בלתי תלויים N = 8, והעקבות האפורים המונחים על גבי ממחישים מדידות של התקנים בודדים. גרף העמודות המצורף מציג ערכי פוטו-זרם שיא (בכחול) והזרקות מטען משולבות (בכתום). גרפי עמודות מבוטאים כממוצע ± s.d. סרגל קנה מידה, 10 אלפיות השנייה. (B) קוצב הלב Ex vivo בוצע באמצעות שלושת המכשירים השונים. הקצב נערך בקצב של 240 פעימות לדקה ורוחב פעימה של 10 אלפיות השנייה. נתון זה שונהמ-26. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-14
איור 12: אפיון מאזן המטען על ידי שילוב המטען המוזרק והחוזר. (A) איור של תהליך הטעינה והפריקה בעקבות הפוטו-זרם האופייני. (ב) חישוב סך המטענים הכרוכים בהזרקת מטען והחזרת מטען. התוצאות הראו בסך הכל איזון מטען טוב במשכי גירוי שונים. נתון זה שונהמ-26. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-15
איור 13: האותות החשמליים המייצגים שנאספו על ידי כל אלקטרודה ב-MEA עם 16 ערוצים. האותות החשמליים ב-16 ערוצים (Ch) מראים את מידע האלקטרוקרדיוגרמה (ECG) של הלב הפועם ex vivo. הנתון שונהמ-28. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-16
איור 14. תכונות אלקטרוכימיות של ביו-אלקטרוניקה ננו-נקבובית מבוססת פחמן. (A) הממשק האלקטרוכימי בין רקמות מעוררות וממשקי פחמן מעוצבים. (ב) ספקטרום עכבה ופאזה של אלקטרודות Au ו-Au-C עם עקומות מותאמות בהתאם למעגל המוצג ב-A. (C) מדידת CV של דפוסי Au ו-C עם אותה גיאומטריה, עם טווח מתח בין -0.2 ל-0.4 V לעומת אלקטרודה Ag/AgCl סטנדרטית. (D) שינויי מתח של אלקטרודות Au ו-Au-C במהלך מחזור גירוי גלוונוסטטי דו-פאזי. נתון זה שונהמ-27. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תרכובתמגוון מומלץקונק. [מ"מ]מגה-וואטלליטר 1ל-2 ליטר
NaClסיגמא (S9625)12658.47.3614.7
KClסיגמא (P4504)5.474.60.40.8
גלוקוזסיגמא (G7021)101801.83.6
הפססיגמא (H4034)102382.3834.766
MgCl2.7 שעות2סיגמא (M9272)12031 מ"ל2 מ"ל
מלאי 1 מ 'מלאי 1 מ '
CaCl2.2H2Oסיגמא (C3881)21471 מ"ל2 מ"ל
מלאי 2 מטרמלאי 2 מטר
נאח2פוס4סיגמא (S0751)0.391201 מ"ל2 מ"ל
מלאי 0.39 מטרמלאי 0.39 מטר

טבלה 1: רכיבי הפתרון של HEPES Tyrode.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה הציג את פלטפורמת לב החולדה ex vivo (איור 1A) ואת מודל I/R כדי להציע מחקרי אלקטרופיזיולוגיה מהירים ונוחים ברמת האיבר כדי ללוות את מאמצי המחקר והדרישות הגדלים במהירות בביו-אלקטרוניקה38. הוא פירט את הייצור והאימות של שלוש מערכות התקנים, כלומר סיליקון ננו-נקבובי, מערכי רב-אלקטרודות גמישים ופחמן ננו-נקבובי (איורים 1B-D), כאמת מידה לחקירות אלקטרופיזיולוגיות דו-כיווניות. סיליקון ננו-נקבובי מאפשר קצב מרחבי-זמני בעוצמה נמוכה, קיבולי וגבוה, מערכי רב-אלקטרודות גמישים מאפשרים הקלטה ומיפוי רב-ערוציים של פעילויות אפיקרדיאליות, ופחמן ננו-נקבובי מוביל לגירוי במתח נמוך ורישום SNR גבוה בשילוב עם MEAs27.

קוצב אופטי הוכח בעבר באמצעות אופטוגנטיקה, שיטה הדורשת שינוי גנטי כדי לבטא תעלות יונים רגישות לאור ברקמות מטרה33. בעוד שהיא יעילה, אופטוגנטיקה מציגה מורכבות משמעותית בשל הצורך בווקטורים ויראליים או גישות טרנסגניות, מה שמעלה חששות בטיחותיים, אתיים ורגולטוריים, במיוחד עבור יישומים קליניים. לעומת זאת, גירוי ביולוגי מבוסס מוליכים למחצה ולא גנטי מציע חלופה פשוטה יותר ובת קיימא יותר לתרגום 39,40,40,42. חומרים כמו סיליקון ומוליכים למחצה אורגניים אחרים מאפשרים אפנון אופטו-אלקטרוני ישיר של רקמות ללא שינוי גנטי, תוך מינוף זרמי פוטו קיבוליים לגירוי בטוח ביולוגית ומאוזן מטען. גישה זו משיגה ביצועים דומים או אפילו טובים יותר לאופטוגנטיקה במונחים של עוצמת קצב, ופועלת הרבה מתחת לסף בטיחות הלייזר כדי למזער נזק לרקמות31,32 (איור 8). האופי הלא גנטי של גירוי ביולוגי מבוסס מוליכים למחצה מבטל את החסמים הקשורים לשינוי גנטי, וסולל את הדרך לאימוץ רחב יותר במסגרות קליניות ויישומים מגוונים בהנדסת רקמות ורפואה ביו-אלקטרונית. עם זאת, המכשירים צריכים להיות מתוכננים בקפידה כדי להשתלב עם הרקמה, שם יש לשקול בקפידה תאימות ביולוגית, כמו גם את מקום הממשק לגירוי והקלטה יעילים (איור 8A-B). בנוסף, נוכחות של חומר על פני הרקמה עלולה לעכב את האפשרות של הדמיה בזמן אמת, אלא אם כן ניתן להנדס מכשיר כך שיהיה שקוף לחלון העירור-פליטה של חומרי הדמיה מסוימים.

סיליקון ננו-נקבובי בולט בקרב פוטו-סטימולטורים של מוליכים למחצה מכיוון שהוא אינו דורש אלקטרודת החזרה מלאכותית, בניגוד לחומרים שדווחו בעבר26. מאפיין ייחודי זה נובע מיכולתו ליצור אזורי קתודה ואנודה שנפתרו מרחבית על סמך גודל ומיקום נקודת האור. המשטח המואר משמש כאתר ההזרקה הקתודית, בעוד שהאזורים ההיקפיים שמסביב מאפשרים החזרת זרם אנודי. מנגנון זה מאפשר גירוי מרובה אתרים על ממברנות מונוליטיות ללא פיקסלים, ומאפשר גירוי מדויק ומקומי. יש לציין כי גירוי אור מקומי, ולא תאורה גלובלית, הוא קריטי ליצירת פרופילי גירוי דו קוטבי יעילים. בנוסף, גודל המכשיר משפיע באופן משמעותי על הביצועים; מכשירים גדולים יותר מייצרים זרמים גבוהים יותר באותם תנאי גירוי, מה שמשפר עוד יותר את הרבגוניות התפקודית שלהם.

כשל בקוצב אופטי יכול לנבוע מגורמים שונים, אפילו במודלים ביולוגיים בריאים, הקשורים בעיקר לשלמות המכשיר וצימוד ממשק ביולוגי. ראשית, אפיון פוטו-זרם יסודי הוא קריטי לפני גירוי הלב. פוטו-זרמים נמוכים מהצפוי עלולים לנבוע מפירוק חומר43 פסיבציה של תחמוצת לאחר אחסון ממושך, תחריט יתר במהלך תהליך תחריט הכתמים, שברים במכשיר במהלך הטיפול או ההעברה, או כיוון שגוי של המכשיר במהלך הממשק. כדי להפחית נזק מכני, PDMS שימש כמצע רך להתאמה של ממברנות הסיליקון הננו-נקבוביות, ומספק הגנה מפני נזק פוטנציאלי מטיפול ישיר בפינצטה. שנית, יצירת ממשק חלק עם האפיקרדיום, המלא בנוזלים ביולוגיים במערך זה, היא חיונית. שכבת נוזל ביולוגי עבה עלולה לעכב את ההתקשרות התקינה ולפגוע ביעילות הקצב. כדי לשפר את צימוד הממשק הביולוגי, ניתן להשתמש בדבקים ביולוגיים42,43 או תפירה כדי לייצב את החיבור ולהבטיח גירוי אמין. יש לציין כי הסיליקון הננו-נקבובי ששימש במחקר שלנו הוא מתכלה, תומך ביישומי קוצב זמניים אך משפיל את הביצועים תוך 1-2 ימים בתנאים פיזיולוגיים. ליציבות לטווח ארוך יותר, יש לשקול פסיבציה של פני השטח44 או שימוש בחומרים מוליכים למחצה עמידים יותר.

במהלך קוצב ex vivo, העלייה ההדרגתית ב-LVP (איור 8E) בתדרים גבוהים יותר (למשל, 4 הרץ) נובעת ככל הנראה מהתכווצות שריר הלב משופרת, הצטברות סידן ומנגנון פרנק-סטארלינג45. קצב קצב גבוה משפר את מחזור הסידן התוך תאי ואת דינמיקת מילוי החדרים, ומגביר את חוזק העומס וההתכווצות46. בעוד שזה עשוי להעלות את הדרישה לחמצן בשריר הלב ואת הסיכון להפרעות קצב, ניתן להפחית את ההשפעות הללו על ידי חמצון מקדים מספיק, ניטור א.ק.ג צמוד ופרמטרים של קצב מבוקר. בניסויים שלנו לא נצפו תופעות לוואי משמעותיות.

בהקלטה מרובת אלקטרודות, ציון מיקומי האלקטרודות על הלב ומיקומן היחסי לאלקטרודה הקוצבת הוא חיוני לניתוח משמעותי. חיוני לבטל דיבור צולב בין אלקטרודות כדי להבטיח לכידת צורות גל שונות ודפוסים שנפתרו זמנית. מערכי אלקטרודות גמישים יוצרים בדרך כלל ממשק טוב עם האפיקרדיום; עם זאת, ניתן לשפר עוד יותר את ההדבקה באמצעות ציפויי דבק מוליכים יונית, כגון שכבות הידרוג'ל דקות28,43 כדי לשפר את היציבות ואיכות האות.

חומרי גרפן/פחמן ננו-מבניים, עם שטחי פנים גדולים לאחסון והזרקת מטען, יכולים לשפר את ביצועי המכשירים הביו-אלקטרוניים על ידי הפחתת העכבה בצמתים של אלקטרודה ומלח והגדלת יכולות הזרקת המטען35. השיטות הנוכחיות לדפוס חומרי גרפן על אלקטרודות גמישות (למשל, Au) כוללות אלקטרודפוזיציה, ציפוי ספין והדפסת מסך47. עם זאת, שיטות אלו קשורות בדרך כלל לתהליכי ייצור מורכבים, יכולות דפוס מוגבלות וביצועים מופחתים עקב הנפח המת של קלסרים. נעשה שימוש בשיטת סינתזת לייזר כדי ליצור דפוסי פחמן ננו-מובנים על מצע תאית ולאחר מכן להעביר אותם לסרטים רכים אחרים כדי ליצור ממשק ביולוגי תואם, המציג דרך קלה ויעילה לייצור ביו-אלקטרוניקה. השילוב של ציפויי פחמן מעוצבים עם גדלים גיאומטריים קטנים עד לרמת התא הבודד, אשר יגדיל את השדה החשמלי המקומי, ומבנים נקבוביים מאוד של קרום פחמן כדי להפחית את ההתנגדות בממשק האלקטרודה-רקמה, ישיג באופן סינרגטי גירוי ביולוגי יעיל ורישום בעתיד48.

למרות שזהו מודל מחלה נוח, מודל Langendorff ex vivo I/R חסר אינטראקציות מערכתיות, מבודד את הלב מתגובות נוירו-הורמונליות וחיסוניות, ומסתמך על זלוף מלאכותי עם חוצצים, שיכולים לשנות מצבים פיזיולוגיים כגון אספקת חמצן ותפקוד אנדותל. הכדאיות המוגבלת שלו מגבילה את המחקרים לאירועים אקוטיים. עם זאת, המודל מציע סביבה מבוקרת ביותר עם התאמות פרמטרים מדויקות ושחזור טוב. זה גם מאפשר מדידת תפקוד לב בזמן אמת, מה שהופך אותו לכלי רב ערך לחקר אסטרטגיות טיפוליות חדשות למחלת לב איסכמית. לדוגמה, ניתן לדמיין מכשירים אלקטרו-צבטיים לחימום מוקדם של הלב, לאמן אותו לסבול סביבות חמורות של מיני חמצן תגובתיים (ROS), או להפחית את רמות ה-ROS להתאוששות משופרת. ניתן להעריך את יעילותם של טיפולים כאלה באמצעות מדדים כמו דפוסי פעימות לב, צורות גל של א.ק.ג ומהירות הולכה. יתר על כן, פלטפורמת גירוי מרובת אתרים יכולה לספק מידע מרחבי על אוטם שריר הלב, ולאפשר הערכה מפורטת יותר של האזורים הפגועים. גישה זו יכולה גם להדגים ספי גירוי משופרים, בקורלציה עם חומרת האוטם, ולהציע מסגרת מקיפה להערכה טיפולית ואופטימיזציה.

בעוד שהפרוטוקול הדגיש את השימוש בשלושת המכשירים במודלים דו-כיווניים של לב ex vivo , הישימות שלהם משתרעת הרבה מעבר לרקמות הלב. מכשירים אלה ניתנים להתאמה בקלות לשימוש עם רקמות או איברים אחרים המעוררים חשמלית, כגון רקמות עצביות, שרירי שלד ומערכות עיכול, שבהן אפנון חשמלי מדויק הוא קריטי, מה שהופך אותם לכלים רב-תכליתיים הן למחקר והן ליישומים תרגומיים ברפואה ביו-אלקטרונית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.L. ו-B.T. הגישו פטנט על ייצור ויישום מכשיר הסיליקון הננו-נקבובי. P.L., C.Y. ו-B.T. הגישו פטנט על ייצור ויישום התקן הפחמן הננו-נקבובי. P.L. ו-B.T. הגישו פטנט על ייצור ויישום מערך המיקרו-אלקטרונים הגמישים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך כספית על ידי המכון הלאומי לבריאות באמצעות מענק 1R56EB034289-01 ו-1R01EB036091-01, ומשרד המחקר של צבא ארה"ב באמצעות מענק W911NF-24-1-0053. P.L. אסירת תודה על התמיכה שהעניק פרס גריר בחדשנות במדעי הביופיזיקה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
16 ערוצים Headstageאינטן טכנולוגיותC3334
2,3,5-טריפנילטטרזוליום כלורידסיגמא אולדריץ'T8877-5Gטריפנילטטרזוליום כלוריד
2-פרופנול (IPA) פישר סיינטיפיקA451-4
לייזר 635 ננומטר, 500 mWזוהר לייזרנה
אצטוןפישר סיינטיפיקא18-4
מאייד קרן אלקטרונית Angstrom Evovacאנגסטרוםנה
מפתח AZ 300MIFמיקרוכימיקלים18441123163מפתח
AZ nlof 2020 מיקרוכימיקלים1א002020
AZ NMP מיקרוכימיקליםנהמסיר פוטו-רזיסט
AZ40XT-11D מיקרוכימיקלים1000300פוטו-רזיסט
HF חוצץתרמו סיינטיפיקAA44627K2
CaCl2.2H2Oסיגמא אולדריץ'(ג3881)
לייזר CO2 מערכות לייזר אוניברסליותVLS 4.60
צבע כסף מוליךפלקו16062הידבקות מוליכה בין האלקטרודה לחיבור חוט Cu
חוט נחושת עטוף 0.1 מ"מאמזוןhttps://www.amazon.com/Enameled-Temperature-Resistance-Transformers-Inductors/dp/<> B09TNM51S5/ref=asc_df_B09
TNM51S5?mcid=155de761ea4
c389ea86d45ba61a83e8d& תגית
=hyprod-20& linkCode=df0& hvadid
=693675076770& hvpos=& hvnetw
= g& hvrand=664358781094905
4431& hvpone=& hvptwo=& hvqmt
=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint
=& hvlocphy=9021716& hvtargid=
PLA-1878323158943& psc=1
דיגיטייזר Digidata 1550התקנים מולקולרייםנה
גלוקוזסיגמא אולדריץ'G7021
HBSS, ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדוםתרמו סיינטיפיק14175095
היידלברג MLA150 כותב ישירהיידלברגנה
הפרין (1,000 יחב"ל/ק"ג)סג'נט פרמצבטיקה1009655
הפססיגמא אולדריץ'(H4034)
הקסאן סיגמא אולדריץ'52750-10 מ"להממס
HFפישר סיינטיפיקA513-500דרגת מתכת
תנור HMDS Vapor Primeמערכות הנדסיות תשואהנה
HNO3פישר סיינטיפיקA509P500דרגת מתכת
למינציה חמהאופיס דיפוL410-Aאנקפסולציה רב שכבתית
מערכות Intan RHDאינטן טכנולוגיותC3100
א.ק.ג iWorxאייוורקס IA-400D
בדיקה iWorx LVDאייוורקסBP-100
מגבר מקדים iWorxאייוורקסתקן C-ISO-256
KClסיגמא אולדריץ'(עמ' 4504)
בלון לטקס (מידה 4)רדנוטי170404
MgCl2.7H2Oסיגמא אולדריץ'(M9272)
NaClסיגמא אולדריץ'(S9625)
תמיסה המכילה Nafion 117סיגמא אולדריץ'31175-20-9מגיב קיבוע לדפוס פחמן ננו-נקבובי
NaH2PO4סיגמא אולדריץ'(S0751)
נאוהסיגמא אולדריץ'221465
PDMSפישר סיינטיפיקNC9285739
תחריט פלזמה פלואוריד בצימוד אינדוקטיבי של פלזמה-תרמיתפלזמה-תרםנה
PMMA (495 A6) מיקרוכימיקליםM130006
פולי (דיאנהידריד-קו-4,4'-אוקסידיאנילין פירומליטי)סיגמא אולדריץ'575801קודמן PI
פולי (אתילן-קו-ויניל אצטט)סיגמא אולדריץ'ברקוד 437247-250 גרםפולימר לחדירה
פולי (אלכוהול ויניל)סיגמא אולדריץ'ברקוד 341584-25G
פוליאתילן טרפתלט (PET)אמזוןKS-6304-21-11סוג D גיליון PET שקוף .0005 אינץ' עובי x 27 אינץ' רוחב x 10 רגל אורך 1 pc
פוטנציוסטטביולוג'יקSP-200גירוי חשמלי
התנגדות לתנור משלוחLCC1-15-5
מיקרוסקופ אלקטרונים סורקקרל זייסמרליןמכשיר לאפיון מורפולוגיה
פרוסת סיליקון חומרים אלקטרוניים של NOVAHS39626
דבק סיליקוןWPIקוויק-סיל-סאנקפסולציה
נתרן בוראטסיגמא אולדריץ'SX0355
פרוסת SOIאולטראסיל3-10541סוג-אוריינטציה: P / B (100) DT: 7 +/- 1um DR: <. 005 אוהם ס"מ HT: 300 +/- 10um HR: 1-30 אוהם ס"מ קופסה: 1um +/- 5% UD-13998 / UH-13962
SU-8 2002מיקרוכימיקליםסדרת SU-8 2000
מפתח SU-8מיקרוכימיקליםסדרת SU-8 2000
דבק רקמות רטוב3 דקות1469 ס"ב
נייר סינון איכותי של Whatman, כיתה 1סיגמא אולדריץ'WHA1001150מצע לדפוס פחמן

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sunwoo, S. H., et al. Soft bioelectronics for the management of cardiovascular diseases. Nat Rev Bioeng. 2 (1), 8-24 (2024).
  2. Choi, H., et al. Adhesive bioelectronics for sutureless epicardial interfacing. Nat Elect. 6 (10), 779-789 (2023).
  3. Choi, Y. S., et al. Fully implantable and bioresorbable cardiac pacemakers without leads or batteries. Nat Biotech. 39 (10), 1228-1238 (2021).
  4. Cingolani, E., Goldhaber, J. I., Marbán, E. Next-generation pacemakers: from small devices to biological pacemakers. Nat Rev Cardiol. 15 (3), 139-150 (2018).
  5. Sala, L., Ward-van Oostwaard, D., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L., Bellin, M. Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs). J Vis Exp. (123), e55587(2017).
  6. Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J Vis Exp. (159), e61167(2020).
  7. Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M. J., Jones, S. M., Kanisicak, O. Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes. J Vis Exp. (164), e61073(2020).
  8. Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. J Vis Exp. (128), e56634(2017).
  9. Trayanova, N. A. Whole-Heart Modeling: Applications to Cardiac Electrophysiology and Electromechanics. Circ Res. 108 (1), 113-128 (2011).
  10. Yin, R. T., et al. Open thoracic surgical implantation of cardiac pacemakers in rats. Nat Protoc. 18 (2), 374-395 (2023).
  11. Wu, K., et al. Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice. J Vis Exp. (171), e62514(2021).
  12. Pendexter, C. A., et al. Modified Langendorff Perfusion for Extended Perfusion Times of Rodent Cardiac Grafts. J Vis Exp. (208), e66815(2024).
  13. Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. Modeling the human heart ex vivo-current possibilities and strive for future applications. J Tissue Eng Regenerat Med. 16 (10), 853-874 (2022).
  14. Jiang, Y. W., et al. Topological supramolecular network enabled high-conductivity, stretchable organic bioelectronics. Science. 375 (6587), 1411-1417 (2022).
  15. Driscoll, N., et al. MXene-infused bioelectronic interfaces for multiscale electrophysiology and stimulation. Sci Transl Med. 13 (612), eabf8629(2021).
  16. Gablech, I., Głowacki, E. D. State-of-the-Art Electronic Materials for Thin Films in Bioelectronics. Adv Elect Mater. 9 (8), 2300258(2023).
  17. Cho, Y. H., Park, Y., Kim, S., Park, J. 3D Electrodes for Bioelectronics. Adv Mater. 33 (47), 2005805(2021).
  18. Chen, Z., et al. bioresorbable, transparent microelectrode arrays for multimodal spatiotemporal mapping and modulation of cardiac physiology. Sci Adv. 9 (27), eadi0757(2023).
  19. Jiang, Y. W., et al. Rational design of silicon structures for optically controlled multiscale biointerfaces. Nat Biomed Eng. 2 (7), 508-521 (2018).
  20. Prominski, A., et al. Porosity-based heterojunctions enable leadless optoelectronic modulation of tissues. Nat Mater. 21 (6), 647-655 (2022).
  21. Huang, Y. X., et al. Bioresorbable thin-film silicon diodes for the optoelectronic excitation and inhibition of neural activities. Nat Biomed Eng. 7 (4), 486-498 (2023).
  22. Balamur, R., et al. Capacitive and Efficient Near-Infrared Stimulation of Neurons via an Ultrathin AgBiS2 Nanocrystal Layer. ACS Appl Mater Inter. 16 (23), 29610-29620 (2024).
  23. Karatum, O., Kaleli, H. N., Eren, G. O., Sahin, A., Nizamoglu, S. Electrical Stimulation of Neurons with Quantum Dots via Near-Infrared Light. ACS Nano. 16 (5), 8233-8243 (2022).
  24. Han, M., et al. Photovoltaic neurointerface based on aluminum antimonide nanocrystals. Comm Mater. 2 (1), (2021).
  25. Ejneby, M. S., et al. Chronic electrical stimulation of peripheral nerves via deep-red light transduced by an implanted organic photocapacitor. Nat Biomed Eng. 6 (6), 741-753 (2022).
  26. Li, P., et al. Monolithic silicon for high spatiotemporal translational photostimulation. Nature. 626 (8001), 990-998 (2024).
  27. Yang, C., et al. A bioinspired permeable junction approach for sustainable device microfabrication. Nat Sustain. 7 (9), 1190-1203 (2024).
  28. Shi, J., et al. Monolithic-to-focal evolving biointerfaces in tissue regeneration and bioelectronics. Nat Chem Eng. 1 (1), 73-86 (2024).
  29. Shi, J., et al. Active biointegrated living electronics for managing inflammation. Science. 384 (6699), 1023-1030 (2024).
  30. Zhang, L., et al. Marangoni Effect-Driven Motion of Miniature Robots and Generation of Electricity on Water. Langmuir. 33 (44), 12609-12615 (2017).
  31. Cogan, S. F. Neural Stimulation and Recording Electrodes. Ann Rev Biomed Eng. 10 (1), 275-309 (2008).
  32. Nussinovitch, U., Gepstein, L. Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies. Nat Biotechnol. 33 (7), 750-754 (2015).
  33. Hsueh, B., et al. Cardiogenic control of affective behavioural state. Nature. 615 (7951), 292-299 (2023).
  34. Tian, B. Z., et al. Macroporous nanowire nanoelectronic scaffolds for synthetic tissues. Nat Mater. 11 (11), 986-994 (2012).
  35. Fang, Y., et al. Micelle-enabled self-assembly of porous and monolithic carbon membranes for bioelectronic interfaces. Nat Nanotechnol. 16 (2), 206-213 (2021).
  36. Kay, G. N., Shepard, R. B. Stimulation and Excitation of Cardiac Tissues. Clin Cardiac Pacing Defibrillat Resynchronizat Ther. , 61-113 (2017).
  37. Zhang, J., et al. Gold-modified nanoporous silicon for photoelectrochemical regulation of intracellular condensates. Nat Nanotechnol. , (2025).
  38. Li, P., Kim, S., Tian, B. Beyond 25 years of biomedical innovation in nano-bioelectronics. Device. 2 (7), 100401(2024).
  39. Yang, C., Cheng, Z., Li, P., Tian, B. Exploring Present and Future Directions in Nano-Enhanced Optoelectronic Neuromodulation. Acc Chem Res. 57 (9), 1398-1410 (2024).
  40. Prominski, A., Li, P., Miao, B. A., Tian, B. Nanoenabled Bioelectrical Modulation. Acc Mater Res. 2 (10), 895-906 (2021).
  41. Li, P., Kim, S., Tian, B. Nanoenabled Trainable Systems: From Biointerfaces to Biomimetics. ACS Nano. 16 (12), 19651-19664 (2022).
  42. Majmudar, A., Kim, S., Li, P., Tian, B. Perspectives on non-genetic optoelectronic modulation biointerfaces for advancing healthcare. Med-X. 2 (1), 18(2024).
  43. Hwang, S. W., et al. A Physically Transient Form of Silicon Electronics. Science. 337 (6102), 1640-1644 (2012).
  44. Yu, Y., et al. Enhanced photoelectrochemical efficiency and stability using a conformal TiO2 film on a black silicon photoanode. Nat Ener. 2 (6), 17045(2017).
  45. Kosta, S., Dauby, P. C. Frank-Starling mechanism, fluid responsiveness, and length-dependent activation: Unravelling the multiscale behaviors with an in silico analysis. PLoS Computat Bio. 17 (10), e1009469(2021).
  46. Silverman, D. N., et al. Heart Rate-Induced Myocardial Ca2+ Retention and Left Ventricular Volume Loss in Patients With Heart Failure With Preserved Ejection Fraction. J Am Heart Assoc. 9 (17), e017215(2020).
  47. Zeng, M., et al. Printing thermoelectric inks toward next-generation energy and thermal devices. Chem Soc Rev. 51 (2), 485-512 (2022).
  48. Rastogi, S. K., et al. Remote nongenetic optical modulation of neuronal activity using fuzzy graphene. Proc Natl Acad Sci. 117 (24), 13339-13349 (2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ex VivoLangendorffreperfusion

מאמרים קשורים