מאמר שיטה

בידוד והערכה ציטומטרית של זרימה של אינטראקציות נוירואימוניות במודל עכברי מיני שבץ

DOI:

10.3791/68308

⸱

20 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Translational Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקוד תאי החיסון לאחר שבץ איסכמי באמצעות ניתוח זרימה ציטומטרי במודל מיני שבץ. שיטה זו מאפשרת בחינה מפורטת של אינטראקציות נוירואימוניות וניתן להתאים אותה לחקר מחלות ניווניות אחרות, מה שמשפר את ההבנה שלנו לגבי תגובות חיסוניות בפתולוגיה של שבץ מוחי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שבץ מוחי הוא גורם מוביל למוות ונכות ארוכת טווח ברחבי העולם, כאשר שבץ איסכמי מייצג את רוב המקרים. לאחר שבץ איסכמי, תאי חיסון תושבים ומסתננים מופעלים, מה שתורם לנזק עצבי נוסף. עם זאת, תפקידי מערכת החיסון בפתולוגיה של שבץ איסכמי אינם מובנים במלואם, בעיקר בשל הוויסות המורכב והדינמי של תגובות חיסוניות בתגובה לשינויים במיקרו-סביבה במהלך דלקת עצבית. לכן, חיוני לעקוב ולנתח את הפעלת תאי החיסון השוהים והחודרים לאורך זמן לאחר שבץ איסכמי. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול להערכת תפקודם של תאי חיסון אלה לאחר שבץ איסכמי באמצעות ניתוח זרימה ציטומטרי במודל מיני שבץ. אנו מנתחים את רקמת המוח האוטמת בנקודות זמן מסוימות ואז מפרקים אותה לתרחיף של תא בודד בשיטות מכניות ואנזימטיות כאחד. התאים מועברים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר ומסומנים בקוקטיילים של נוגדנים מתויגים פלואורסצנטיים לפני שהם מכומתים על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי. בעוד שבדיקה זו פותחה במיוחד כדי לחקור אינטראקציות נוירואימוניות לאחר שבץ איסכמי, ניתן להתאים אותה בקלות גם לחקר מנגנונים נוירו-אימוניים במחלות ניווניות אחרות, כגון טרשת נפוצה, מחלת פרקינסון ומחלת אלצהיימר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שבץ מוחי הוא גורם דומיננטי לתמותה ונכות ארוכת טווח ברחבי העולם, כאשר שבץ איסכמי מהווה את הרוב המכריע של המקרים 1,2,3. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לשפר את הבנתנו את האינטראקציות הנוירו-אימוניות המתרחשות לאחר שבץ איסכמי על ידי מתן גישה מעודנת להערכת ההפעלה של תאים חיסוניים תושבים ומסתננים במודל עכברי מיני שבץ 4,5. יחסי הגומלין המורכבים בין תאי חיסון אלה לבין המיקרו-סביבה העצבית חיוניים להבנת הפתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי. עם זאת, המנגנונים המדויקים העומדים בבסיס האינטראקציות הנוירו-אימוניות הללו נותרו ברורים בצורה גרועה, בעיקר בשל האופי הדינמי והרב-פנים של תגובות חיסוניות המופעלות על ידי דלקת עצבית6. טכניקה זו נועדה להבהיר את הדינמיקה המורכבת של תגובות חיסוניות בהקשר של דלקת עצבית והשפעתן לאחר מכן על נזק עצבי ותוצאות החלמה.

הרציונל מאחורי פיתוח טכניקה זו נובע מהתפקיד הקריטי שתאי החיסון ממלאים בהחמרת הנזק העצבי ובהשפעה על ההתאוששות לאחר אירוע איסכמי. שיטות מסורתיות לחקר אינטראקציות אלה חסרות לעתים קרובות את הרזולוציה הדרושה כדי ללכוד את הניואנסים הזמניים והמרחביים של הפעלת תאי החיסון. על ידי שימוש בניתוח זרימה ציטומטרי על תרחיפים של תא בודד שמקורם ברקמת מוח עם אוטם מיקרו-מנותח, פרוטוקול זה מציע הערכה מפורטת ודינמית יותר של פרופילי תאי החיסון לאורך זמן 7,8. גישה זו מאפשרת לזהות אוכלוסיות ספציפיות של תאים חיסוניים ומצבי התפקוד שלהם, שהם חיוניים להבנת הפתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי.

בהשוואה לטכניקות חלופיות כגון צביעה היסטולוגית או ריצוף RNA בתפזורת, שעשויות לספק תובנות מוגבלות לגבי התרומות האישיות של סוגי תאים חיסוניים, שיטת זרימה ציטומטרית זו מציגה מספר יתרונות. לדוגמה, מחקרים קודמים הראו כי זרימה ציטומטרית מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של מספר סמנים בו זמנית, מה שמקל על אפיון מקיף יותר של פנוטיפים ותפקודים של תאי חיסון 9,10,11,12,13. בנוסף, יכולתה של שיטה זו להסתגל למגוון מצבים ניווניים - כגון טרשת נפוצה, מחלת פרקינסון ומחלת אלצהיימר - מדגימה את הרבגוניות והרלוונטיות שלה בגוף הרחב יותר של ספרות העוסקת באינטראקציות נוירו-אימוניות.

עבור חוקרים השוקלים את יישום שיטה זו, הערכת המטרות הספציפיות של המחקר שלהם היא חיונית. טכניקה זו מתאימה במיוחד לחקירות הדורשות ניתוח זמני מפורט של תגובות חיסוניות בהקשר של שבץ איסכמי או מחלות ניווניות קשורות. מומלץ למשתמשים להיות בעלי הבנה בסיסית של ציטומטריית זרימה וניסיון במודלים של עכברים כדי ליישם ביעילות פרוטוקול זה ולפרש את הנתונים המתקבלים. על ידי מתן מסגרת חזקה לחקר אינטראקציות נוירו-אימוניות, שיטה זו תורמת באופן משמעותי למאמצים המתמשכים לתאר את המורכבות של מעורבות חיסונית בפתולוגיה של שבץ מוחי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית החולים לידידות בייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל. אנו ממליצים שכל הפתרונות יהיו נתונים לסינון סטרילי ושכל הצינורות המשמשים יהיו סטריליים.

1. הכנת ריאגנטים ומאגר

  1. תערובת אנזימי עיכול: ממיסים קולגנאז IV לקבלת ריכוז של 0.25% ומדללים DNase I כדי להגיע לריכוז סופי של 2 U/mL.
  2. מאגר מיון תאים מופעלים מגנטיים (MACS): ממיסים אלבומין בסרום בקר (BSA) וחומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) כדי להגיע לריכוזים של 0.5% ו-2 מ"מ ב-1x PBS, בהתאמה.

2. מודל שבץ איסכמי מוקדי

הערה: עכברי C57BL/6 J (בני 8-10 שבועות) הועסקו כדי ליצור מודל שבץ איסכמי מוקדי, כפי שתואר קודם לכן14. ניתן להרדים עכברים לחלופין באמצעות תמיסה של 1.25% אברטין במינון של 0.2 מ"ל לכל 10 גרם משקל גוף.

  1. להרדים את העכברים באמצעות איזופלורן 3%, תוך שמירה על מינון של 1.5% בעזרת מכשיר הרדמה בגז. שמרו על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך באמצעות כרית חימום.
    הערה: מחקר זה מדגיש את החשיבות של אימות השגת המישור הניתוחי לפני תחילת ההליך. שלב זה חיוני כדי להבטיח גישה אופטימלית לאזור הממוקד ולמזער סיבוכים פוטנציאליים במהלך הניתוח.
  2. חתוך את הפרווה באזור שבין עין ימין לאוזן ימין באמצעות סכין גילוח חשמלי. צור חתך אנכי באזור המיועד הסמוך לעיניים תחת מיקרוסקופ דיסקציה.
  3. הפרד בעדינות את כל הרקמות כדי לחשוף את הגולגולת ולזהות את הענף הדיסטלי של עורק המוח האמצעי הימני (MCA), המאופיין במבנה כלי דם אנכי בצורת "Y". השתמש במקדחה חשמלית כדי לחדור לגולגולת, הקפד להסיר אותה בזהירות.
  4. כריתה עדינה את קרומי המוח בעזרת מיקרו מלקחיים.
  5. חשוף את הענף הדיסטלי של עורק המוח האמצעי הימני (MCA), ולאחר מכן בצע קשירה קבועה של הענף הדיסטלי של ה-MCA הימני באמצעות תפר 10-0.
  6. מקם מחדש את הרקמה למצבה המקורי וסגור את חתך עור הפנים עם דבק רקמות.
  7. מקם את העכבר בכיוון שכיבה וחתוך את הפרווה באזור הצוואר בעזרת סכין גילוח חשמלי.
  8. צור חתך אופקי באזור הצוואר ומשוך בעדינות את הבלוטות התת-לסתיות.
  9. נתח בזהירות את מעטפת הצוואר בעזרת מיקרו-מלקחיים, מזהה את עורק הצוואר המשותף ומפריד אותו מהעצב התועה.
  10. השחילו תפר 4-0 דרך עורק הצוואר המשותף ואבטחו אותו בעזרת קשר.
  11. חזור על שלב 10 בעורק הצוואר המשותף הנגדי. חסום באופן זמני את עורקי הצוואר המשותפים הדו-צדדיים (CCAs) למשך 7 דקות.
  12. החזר את רקמת הבלוטה התת-לסתית למקומה המקורי וסגור את חתך הצוואר עם דבק רקמות.
    הערה: קבוצת ניתוח הדמה עברה הליכים זהים לאלה של קבוצת השבץ, למעט היוצא מן הכלל היחיד שה-MCA וה-CCA הדיסטליים נותרו לא קשורים.
  13. עקוב אחר העכבר לאורך כל ההליך הכירורגי ואחריו, כולל הנשימה וטמפרטורת הגוף שלו. השאר את העכבר על משטח חימום עד שהוא ער לחלוטין.

3. זלוף מוח ודיסקציה

  1. הכן מזרק של 50 מ"ל והצמד מחט של 26 גרם לקצהו. מלאו את המזרק בתמיסת מלח.
  2. יש לתת מינון כפול של 1.25% אברטין כדי להשיג הרדמה עמוקה בעכבר.
    הערה: יש לאשר היטב שהעכבר מורדם לחלוטין לפני שתמשיך לשלב הבא.
  3. מקם את העכבר בכיוון שכיבה על לוח קצף, האריך את הגפיים הקדמיות והגפיים האחוריות, אבטח אותם במקומם עם מחטי 26 גרם.
  4. לאחר שהעכבר מורדם ביסודיות, אחוז בעור הבטן בעזרת מלקחיים עיניים ובצע חתך רוחבי כדי לחשוף את הכבד. המשך לחתוך לאורך שני צידי הצלעות כדי לחשוף את הלב.
  5. הכנס את מחט ה-26 גרם לחדר השמאלי וחתך את האפרכסת, ולאחר מכן לחץ על המזרק כדי לאפשר לדם לזרום החוצה.
  6. המשך בתהליך הזלוף עד שהדם המתנקז מהאפרכסת נראה צלול.
  7. ערפו את ראשו של העכבר ממש מעל חוט השדרה באמצעות מספריים כירורגיים ישרים.
  8. צור חתך אחורי-קדמי בעור הראש כדי לחשוף את הגולגולת. בצע שני חתכים רוחביים בצומת הקירות הצדדיים ובסיס הגולגולת.
  9. חותכים את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי ומבצעים חתך בין המסלולים.
  10. השתמש במלקחיים כדי להסיר את הגולגולת המכסה כל חצי כדור, ובכך לחשוף את המוח, ולהעביר אותו למטריצת מוח מפלדת עכבר. לאחר מכן, חתכו את המוח לפרוסות עטרה עוקבות בעובי 2 מ"מ.

4. עיכול רקמת קליפת המוח לתרחיף חד-תאי וצביעה של נוגדנים לזרימה ציטומטרית

  1. הכניסו 500 מיקרוליטר של תערובת אנזימי עיכול לכל באר של צלחת של 12 בארות.
  2. להפריד בעדינות את רקמת האוטם ולהעביר אותה לתערובת אנזימי העיכול באמצעות מיקרו-מלקחיים (איור 1).
  3. מפרקים את הרקמה לחתיכות הקטנות ביותר האפשריות בעזרת מספריים עיניים ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  4. השתמש בפיפטה P1000, שאב בעדינות והוציא את התמיסה 10 פעמים כדי לפרק את הרקמה לתאים בודדים, ולאחר מכן העביר את התמיסה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר. שטפו ברציפות גם את צלחת 12 הבארות וגם את מסננת התאים עם HBSS קר כקרח המכיל סידן ומגנזיום.
  5. צנטריפוגה בטמפרטורה של 500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואז השליכו בזהירות את הסופרנטנט.
    הערה: בהתחשב בכך שהכדורים המיוצרים רופפים למדי ונעקרים בקלות, אנא הימנע מהפרעה להם כדי למנוע אובדן תאים.
  6. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של 1x PBS וחזרו על שלב 5. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה ב-150 מיקרוליטר של 1x PBS והעבירו את המתלה לצלחת של 96 בארות עם תחתית עגולה. ואז שוב צנטריפוגה ב-500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  7. אחזו בחוזקה בצלחת 96 הבארות והפכו אותה במהירות כדי להשליך את הסופרנטנט.
  8. לדלל צבע פלואורסצנטי של כדאיות התא ביחס של 1:100 ב-1x PBS, ולאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב-150 מיקרוליטר ציטוט. דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT), מוגנת מפני אור.
  9. צנטריפוגה ב-500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט. לדלל את קוקטייל הנוגדנים על פני התא במאגר MACS. מבלי לשטוף את התאים, הוסיפו את קוקטייל הנוגדנים על פני התא ודגרו למשך 15-20 דקות נוספות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  10. צנטריפוגה ב-500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות והשליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה ב-150 מיקרוליטר של מאגר MACS.
  11. חזור על שלב 4.10 והעביר את המתלה לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל או מבחנות פוליסטירן תחתונות עגולות של 5 מ"ל.

5. ניתוח ומיון ציטומטריית זרימה

  1. תכנן פאנל ציטומטריית זרימה רב צבעוני לפי תצורת המכשיר, תוך שימוש בטכניקות ידניות או בכלי עיצוב מקוון, כדי לייעל את בחירת הפלואורופורים המצומדים לנוגדנים ולמזער חפיפה ספקטרלית.
    הערה: יש לקחת בחשבון מספר שיקולים מרכזיים בעת תכנון פאנל ציטומטריית זרימה רב צבעוני. ראשית, חיוני להכיר את תצורת המכשיר הנמצא בשימוש, כולל הלייזרים והמסננים, לפני ההתחלה. שנית, השתמש בתוויות פלואורופור בהירות על נוגדנים לאנטיגנים בשפע נמוך, תוך בחירה בתוויות פלואורופור עמומות על נוגדנים המכוונים לאנטיגנים בעלי ביטוי גבוה. לבסוף, הכרחי לכלול צבע כדאיות תא בפאנל כדי להוציא ביעילות תאים ופסולת שאינם ברי קיימא מהנתונים. יש לציין כי כדי להבטיח שער מתאים של שפע נמוך או אנטיגנים בעלי אופי גרוע, יש להשתמש בבקרות פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO)15. בקרות FMO מקיפות את כל סמני השושלת למעט זה המעניין, מה שמקל על תיחום מדויק בין תאים מוכתמים חיובית ושלילית16.
  2. התאם את ההגדרות של גלאי הפיזור קדימה (FSC) ופיזור הצד (SSC) כדי להבטיח שהתאים המעניינים מוצגים כראוי בסולם וניתן לסגור אותם לפי הצורך.
  3. כוונן בקפידה את FSC ו-SSC כדי למנוע פסולת או רעשים זרים. הבדיל בין כפולות מתאים בודדים בתוך תרשים נקודות הממחיש הן את השטח והן את הגובה של FSC. לבודד תאים ברי קיימא על סמך כדאיות התא אות פלואורסצנטי שלילי לצבע.
    הערה: ההגדרות עבור מכשירים שונים עשויות להראות שינויים קלים. לדוגמה, חלק מממייני התאים משתמשים ברוחב ובגובה של FSC כדי להבחין בין כפולים לתאים בודדים, בעוד שאחרים משתמשים בשטח ובגובה של FSC לאותה מטרה.
  4. התאם את הפיצוי עבור כל ערוץ.
    הערה: ניתן להשתמש גם בדגימות סלולריות וגם בחרוזי פיצוי זמינים מסחרית לצורך פיצוי גלישה פלואורסצנטי.
    1. השווה את בקרת הקרינה העצמית (תאים לא מוכתמים) עם בקרות חיוביות של תאים מוכתמים כדי להבטיח שהתאים המוכתמים מותאמים כראוי לכל פרמטר. בנוסף, כוונן את הפיצוי על ידי ניתוח דגימות תאים מרובות צבעים, ניטור עלילות נקודות דו-צבעוניות והתאמת הגדרות הפיצוי כלפי מעלה או כלפי מטה כדי להבטיח שאוכלוסיות התאים מיושרות אנכית או אופקית זו עם זו.
    2. השתמש באותות CD45 ו-CD11b כדי להבחין בין לימפוציטים (CD11b-CD45גבוה), מיקרוגליה (CD11b+CD45int), תאים מיאלואידים (CD11b+CD45גבוה) ואסטרוציטים (CD11b-CD45- GLAST+)17,18.
    3. השתמש ברקמת מוח דמה כבקרת פלואורסצנציה עצמית והתייחסות ללימפוציטים מבחינים. אם מטרה ספציפית נבדקת, השתמש בבקרת FMO עם רקמת מוח לאחר שבץ מוחי.
  5. התחל באיסוף נתוני הבקרה והדגימה וודא שהם נשמרים.
    הערה: בהתחשב בכך שמודל המיני-שבץ המתואר כאן מביא לאוהט קטן, בדרך כלל נאספים פחות תאים מאשר מודל חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO). בדרך כלל, איסוף של 5 × 105 תאים מניב כ-5 × 103 מיקרוגליה ו-1 × 105 אסטרוציטים, בהתאמה.
  6. בחר ומיין את אוכלוסיות התאים הרצויות למבחנות פוליסטירן עגולות של 5 מ"ל או צינורות צנטריפוגה חרוטיים של 15 מ"ל.
    הערה: הוסף 500 מיקרוליטר PBS ושטוף בקפידה את הצינור כדי להבטיח את כדאיות התאים ולסייע ביצירת גלולת התא.

6. ניתוח ביטוי גנים באוכלוסיות תאים נבחרות

הערה: מיצוי RNA כולל עשוי להתבצע לחלופין באמצעות ערכות מסחריות בהתאם להנחיות היצרן.

  1. צנטריפוגה את התאים משלב 5.6 ב-500 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואז השליכו את הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מגיב TRIzol.
    הערה: מספר התאים הממוינים נמוך משמעותית בהשוואה לתאים או רקמות מתורבתות. כתוצאה מכך, מהירות צנטריפוגה גבוהה יותר עשויה לסייע ביצירת כדור תא קומפקטי יותר. התאים המתקבלים משלב זה עשויים לשמש ליישומים הבאים, כגון תרבית תאים או צינורות ריצוף RNA של תא בודד.
  2. אפשר לדגימה לעמוד ב-RT למשך 5 דקות כדי להקל על דיסוציאציה של קומפלקסים של נוקלאופרוטאין.
  3. הוסף 0.2 מ"ל כלורופורם לדגימה ואבטח את הצינור. לנער את הצינורות במרץ במשך 15 שניות, ואז לדגור למשך 2 דקות ב-RT.
  4. צנטריפוגה את הדגימות ב-10,000 גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. ה-RNA יישאר אך ורק בשלב המימי העליון.
  5. העבירו בזהירות את השלב המימי העליון לצינור נקי, תוך הקפדה לא להפריע לממשק.
    הערה: נפח השלב המימי צריך להיות כ-500 מיקרוליטר.
  6. זרז את ה-RNA מהשלב המימי על ידי החדרת 0.5 מ"ל איזופרופנול וערבוב עדין על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. דגרו את הדגימות ב-RT למשך 10 דקות.
  7. צנטריפוגה את הדגימות ב-10,000 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לאסוף את ה-RNA.
  8. רוקנים את הסופרנטנט ומסירים היטב כל נוזל שנותר על ידי שאיפה.
  9. שטפו את כדור ה-RNA פעם אחת עם 75% אתנול, והוסיפו מינימום של 1 מ"ל של 75% אתנול. מערבבים היטב את הדגימה, ולאחר מכן צנטריפוגה בחום של 7500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  10. הסר את כל עקבות האתנול. יבש באוויר את כדור ה-RNA למשך 5 דקות.
  11. ממיסים את ה-RNA ב-10 מיקרוליטר של מים נטולי RNase על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
  12. המשך לבצע PCR בזמן אמת בהתאם להוראות היצרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול מעודן להערכת הפונקציונליות של תאי חיסון לאחר שבץ איסכמי, תוך שימוש בניתוח זרימה ציטומטרי במודל מיני שבץ. המיני שבץ נגרם על ידי קשירה קבועה של הענף הדיסטלי של עורק המוח האמצעי הימני (MCA), ואחריו חסימה של 7 דקות של עורקי הצוואר המשותפים הדו-צדדיים (CCAs). מתודולוגיה זו מניבה שבץ מוחי קל המאופיין בנפחי נגעים קטנים ועקביים ושיעור תמותה נמוך להפליא. יתר על כן, יכולתו של המודל לחקור אינטראקציות נוירואימוניות ארוכות טווח הופכת אותו למתאים במיוחד לבחינת תפקיד הדלקת בתהליך ההחלמה לאחר שבץ מוחי.

...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להערכת תפקוד תאי החיסון לאחר שבץ איסכמי, תוך שימוש בניתוח זרימה ציטומטרי במודל מיני שבץ. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים הקמת שבץ איסכמי מוקדי באמצעות קשירה קבועה של הענף הדיסטלי של עורק המוח האמצעי הימני (MCA) לצד חסימה של שבע דקות של עורקי הצוואר המשותפים הדו-צדדיים (CCAs). גישה כירורגית זו מניבה שבץ מוחי קל המאופיין בנפח נגעים עקבי ושיעורי תמותה נמוכים, מה שהופך אותה למתאימה לחקירות ארוכות טווח של אינטראקציות נוירואימוניות14<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 82201622) והקרן למדעי הטבע של מונגוליה הפנימית (מס' 2020MS03017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"לקן 615601חומר מעבדה
1 ופעמים; PBSקורנינג21-040-ס"ממגיב
96 בארות שקוף תחתון עגול מטופל TC מיקרופלייטקורנינג3799חומר מעבדה
APC נגד עכבר CD19ביולג'נד152410נוגדן
APC/Cyanine7 נגד עכבר CD45ביולג'נד103116נוגדן
אברטין (1.25%)נאנג'ינג אייביי ביוטכנולוגיה M2920מגיב
BD FACSAria IIב.ד.642510ציוד
סגול מבריק 421 נגד עכבר CD4ביולג'נד100437נוגדן
סגול מבריק 605 נגד עכבר / CD11b אנושיביולג'נד101237נוגדן
BSAסיגמא-אולדריץ'A1933-1Gכימי
קולגנאז IVסיגמא-אולדריץ'C4-28-100 מ"גאנזים
דנאס אמעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדM0303Lאנזים
EDTAסיגמא-אולדריץ'EDS-100Gכימי
Falcon 5 מ"ל מבחנות פוליסטירן תחתון עגולקורנינג352052חומר מעבדה
בז  צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"לקורנינג352095חומר מעבדה
פלוג'ו V10ב.ד.תוכנה
GLAST (ACSA-1) נוגדן, PEמילטני ביוטק130-118-344נוגדן
איזופלורןRWD מדעי החייםR510-22-10מגיב
PE / Cyanine7 נגד עכבר CD3ביולג'נד100220נוגדן
PE/Dazzle 594 נגד עכבר NK-1.1ביולג'נד156518נוגדן
מגיב טריזולתרמו פישר סיינטיפיק בע"מ15596026מגיב
מים מזוקקים ללא DNase/RNase UltraPureתרמו פישר סיינטיפיק בע"מ10977015מגיב
דבקי רקמות Vetbond3 דקות1469 ס"בחומר מעבדה
ערכת כדאיות ניתנת לתיקון של Zombie Aquaביולג'נד423102צבע פלואורסצנטי מגיב אמין

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kleindorfer, D. O., et al. 2021 Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American heart association/American Stroke Association. Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).
  2. Pu, L., et al. Projected global trends in ischemic stroke incidence, deaths and disability-adjusted life years from 2020 to 2030. Stroke. 54 (5), 1330-1339 (2023).
  3. Cheng, Y., et al. Projections of the stroke burden at the global, regional, and national levels up to 2050 based on the global burden of disease study 2021. J Am Heart Assoc. 13 (23), e036142(2024).
  4. Ma, Y., Yang, S., He, Q., Zhang, D., Chang, J. The role of immune cells in post-stroke angiogenesis and neuronal remodeling: The known and the unknown. Front Immunol. 12, 784098(2021).
  5. Duan, M., Xu, Y., Li, Y., Feng, H., Chen, Y. Targeting brain-peripheral immune responses for secondary brain injury after ischemic and hemorrhagic stroke. J Neuroinflammation. 21 (1), 102(2024).
  6. Chen, B. R., Wu, T., Chen, T. H., Wang, Y. Neuroimmune interactions and their roles in neurodegenerative diseases. Fundam Res. 4 (2), 251-261 (2024).
  7. Zhang, Z., Lv, M., Zhou, X., Cui, Y. Roles of peripheral immune cells in the recovery of neurological function after ischemic stroke. Front Cell Neurosci. 16, 1013905(2022).
  8. Garcia-Bonilla, L., et al. Analysis of brain and blood single-cell transcriptomics in acute and subacute phases after experimental stroke. Nat Immunol. 25 (2), 357-370 (2024).
  9. Stevens, S. L., et al. The use of flow cytometry to evaluate temporal changes in inflammatory cells following focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. 932 (1-2), 110-119 (2002).
  10. Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells. Glia. 22 (1), 72-85 (1998).
  11. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  12. De Haas, A. H., Boddeke, H. W., Biber, K. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
  13. Mcdonough, A., Weinstein, J. R. Neuroimmune response in ischemic preconditioning. Neurotherapeutics. 13 (4), 748-761 (2016).
  14. Wang, S., et al. Transcriptome analysis reveals dynamic microglial-induced a1 astrocyte reactivity via c3/c3ar/NF-kappab signaling after ischemic stroke. Mol Neurobiol. 61 (12), 10246-10270 (2024).
  15. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. 69A, 1037-1042 (2006).
  16. Siddiqui, S., Livak, F. Principles of advanced flow cytometry: A practical guide. Methods Mol Biol. 2580, 89-114 (2023).
  17. Sousa, C., et al. Single-cell transcriptomics reveals distinct inflammation-induced microglia signatures. EMBO Rep. 19 (11), e46171(2018).
  18. Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. 124, e55781(2017).
  19. Zhang, W., et al. Microglia-associated neuroinflammation is a potential therapeutic target for ischemic stroke. Neural Regen Res. 16 (1), 6-11 (2021).
  20. Mao, J. H., et al. Microglia polarization in ischemic stroke: Complex mechanisms and therapeutic interventions. Chin Med J (Engl). 134 (20), 2415-2417 (2021).
  21. Shui, X., et al. Microglia in ischemic stroke: Pathogenesis insights and therapeutic challenges. J Inflamm Res. 17, 3335-3352 (2024).
  22. Feng, Y., et al. Infiltration and persistence of lymphocytes during late-stage cerebral ischemia in middle cerebral artery occlusion and photothrombotic stroke models. J Neuroinflammation. 14 (1), 248(2017).
  23. Schulze, J., Gellrich, J., Kirsch, M., Dressel, A., Vogelgesang, A. Central nervous system-infiltrating t lymphocytes in stroke are activated via their TCR (T-cell receptor) but lack CD25 expression. Stroke. 52 (9), 2939-2947 (2021).
  24. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  25. Leelatian, N., et al. Single-cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry B Clin Cytom. 92 (1), 68-78 (2017).
  26. Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. J Allergy Clin Immunol. 143 (2), 528-537 (2019).
  27. Schmit, T., Klomp, M., Khan, M. N. The application of flow cytometry for simultaneous and multi-parametric analysis of heterogenous cell populations in basic and clinical research. Methods Mol Biol. 2223, 183-200 (2021).
  28. Dukhinova, M., Kopeikina, E., Ponomarev, E. D. Usage of multiparameter flow cytometry to study microglia and macrophage heterogeneity in the central nervous system during neuroinflammation and neurodegeneration. Methods Mol Biol. 1745, 167-177 (2018).
  29. Rui, W., et al. Myeloid gasdermin d drives early-stage T-cell immunity and peripheral inflammation in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 21 (1), 266(2024).
  30. Rauber, S., et al. Flow cytometry identifies changes in peripheral and intrathecal lymphocyte patterns in CNS autoimmune disorders and primary CNS malignancies. J Neuroinflammation. 21 (1), 286(2024).
  31. Rayaprolu, S., et al. Flow-cytometric microglial sorting coupled with quantitative proteomics identifies moesin as a highly-abundant microglial protein with relevance to Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 15 (1), 28(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים