הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

RNA-Seq חושף את מסלול ההתמיינות של תאי Th17 כמנגנון של פגיעה מוחית הנגרמת על ידי קרינה

561 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68322

⸱

20 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Institute of Radiation Medicine

במאמר זה

סיכום

מחקר זה נועד לחקור את הפעלת מסלול ההתמיינות של תאי Th17 בעכברים עם פגיעה מוחית הנגרמת על ידי קרינה.

תקציר

רדיותרפיה היא שיטה טיפולית נפוצה לממאירות ראש וצוואר; עם זאת, זה תמיד גורם לנזק הנגרם על ידי קרינה לרקמת מוח רגילה, שמגיע לשיאו בפגיעה מוחית הנגרמת על ידי קרינה (RBI). למרות מחקר מקיף על דלקת עצבית הנגרמת על ידי קרינה, הקשר בין RBI למסלול ההתמיינות של תאי Th17 נותר לא מובן מספיק. עכברי C57BL/6 עברו מתן יחיד של הקרנת גולגולת 30 Gy כדי לפתח את מודל ה-RBI. התפקוד הקוגניטיבי הוערך באמצעות מבוך המים של מוריס (MWM), מבחן שדה פתוח, מבחן זיהוי אובייקטים חדשני ומבחן רוטרוד. שינויים היסטופתולוגיים ברקמת המוח נותחו באמצעות צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E). צביעה אימונופלואורסצנטית שימשה כדי להעריך את ההפעלה של מיקרוגליה (IBA-1) ואסטרוציטים (GFAP). ריצוף RNA נערך לזיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי, בעוד ש-Simple Western ו-qPCR שימשו לבחינת מולקולות איתות מרכזיות המעורבות בהתמיינות תאי Th17. עכברי RBI הראו ליקויים קוגניטיביים ניכרים, במיוחד בלמידה מרחבית ושימור זיכרון. בדיקה היסטולוגית הצביעה על הפעלה של מיקרוגליה ואסטרוציטים בתוך קליפת המוח וההיפוקמפוס של עכברים מוקרנים. ניתוח ריצוף RNA זיהה העשרה משמעותית של מסלול התמיינות תאי Th17 בקליפת המוח של קבוצת RBI. אימות נוסף באמצעות ניתוחי Simple Western ו-qPCR אישר את הוויסות המוגבר של TGF-β, IL-6, RORγt, IL-17 ו-P-STAT3 בקליפת המוח של עכברי RBI. ממצאים אלה הצביעו על כך שמסלול ההתמיינות של תאי Th17 מילא תפקיד מרכזי בפתוגנזה של פגיעה מוחית הנגרמת על ידי קרינה. דלקת עצבית המתווכת על ידי תאי Th17 עשויה להיות מנגנון קריטי העומד בבסיס תפקוד קוגניטיבי לקוי הנגרמת על ידי קרינה.

מבוא

רדיותרפיה היא טיפול חיוני לגידולי ראש וצוואר ראשוניים וגרורתיים, אך פגיעה מוחית הנגרמת על ידי קרינה (RBI) יכולה להתרחש כסיבוך חמור, המאופיין בנזק למערכת העצבים המרכזית. שכיחות RBI משתנה בהתאם לסוג הגידול ואופן הטיפול, כאשר השיעורים המדווחים נעים בין 28%-50% לאחר רדיותרפיה סטריאוטקטית למנינגיומות1, 1.9%-5% לקרצינומה של הלוע 2,3, 1%-24% לגליומות בדרגה נמוכה 4,5 ו-8%-20% לגרורות במוח 6,7. RBI מסווג לסוגים אקוטיים, מושהים מוקדם ומאוחר, כאשר תפקוד קוגניטיבי, במיוחד פגיעה בזיכרון, וליקויי למידה בולטים בצורה מאוחרת. תפקוד קוגניטיבי לקוי הנגרמת על ידי קרינה (RICD), המשפיע על 50%-90% מהשורדים לטווח ארוך מסרטן הראש והצוואר, משפיע באופן משמעותי על איכות החיים8, אך הפתוגנזה שלו נותרה לא מובנת היטב, וחסרות אסטרטגיות מניעה וטיפול יעילות.

דלקת עצבית היא מאפיין פתולוגי מרכזי של RBI, המחמירה את הפרעת מחסום הדם-מוח ומעכבת נוירוגנזה בהיפוקמפוס. תאי Th17, תת-קבוצה של תאי CD4+ T הידועים בייצור הציטוקין הפרו-דלקתי IL-179, נקשרו למחלות ניווניות שונות, כולל טרשת נפוצה ומחלת פרקינסון10,11. תאים אלה, בתנאים דלקתיים מסוימים, יכולים לחצות את מחסום הדם-מוח ולתרום לדלקת עצבית12. מאז גילויים ב-2005, תאי Th17 זכו לתשומת לב בשל תפקידם הן בתגובות החיסוניות נגד פתוגנים והן במעורבותם במחלות דלקתיות, מה שהופך אותם למטרה פוטנציאלית לחקר המנגנונים של RBI ותפקוד קוגניטיבי לקוי הקשור13.

במחקר זה השתמשו רק בעכברים זכרים. הדרת הנקבות נועדה למנוע השפעות מבלבלות פוטנציאליות הנובעות מתנודות נוירו-דלקתיות הקשורות למחזור האסטרוס, שכן רמות הפרוגסטרון יכולות להשתנות עד פי עשרה בשלבים שונים של מחזור14. יתר על כן, המודל הניסיוני שלנו תוכנן לשקף את ההקשר הקליני של הקרנות לסרטן ראש וצוואר, שבו כ-72% מהחולים הם גברים15. בהתאם לכך, רוב המחקרים שפורסמו החוקרים את המנגנונים של פגיעה מוחית הנגרמת על ידי קרינה (RBI) השתמשו במכרסמים זכרים כדי לבסס מאפיינים פתולוגיים בסיסיים16.

בעוד שמודלים שונים שימשו לחקר RBI, מתודולוגיות מסורתיות כמו צביעה היסטופתולוגית וכתמים מערביים פשוטים מתמודדות עם מגבלות במונחים של רגישות, תפוקה ודיוק17. התקדמות אחרונה כגון ריצוף RNA (RNA-Seq) ופרוטאומיקה בתפוקה גבוהה סיפקו תובנות חזקות יותר לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס RBI18. טכנולוגיות אלה מאפשרות הבנה מקיפה של שינויים בביטוי גנים ושינויים בחלבונים, ומספקות נתונים מדויקים יותר משיטות קודמות19. Simple Western, במיוחד, היא טכניקה חדשה ואוטומטית המשלבת את היתרונות של אלקטרופורזה נימית עם זיהוי חלבון באמצעות כימילומינסנציה, המאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה עם נפח דגימה מינימלי ויכולת שחזור מוגברת20. בהשוואה לכתמים מערביים מסורתיים, Simple Western מבטל את הצורך בהעברת ממברנה ומספק נתוני ביטוי חלבון כמותיים, המציעים מספר יתרונות מבחינת רגישות ושחזור, במיוחד בזיהוי חלבון בשפע נמוך21,22.

הנחיות מעשיות למיצוי והכנת RNA הן חיוניות להצלחת ריצוף וכימות באיכות גבוהה. למיצוי RNA אופטימלי, אנו ממליצים להשתמש בערכות בידוד RNA איכותיות ולוודא שהריכוז נמצא בטווח של 100-1000 ננוגרם/מיקרוליטר, עם מספר תקינות RNA (RIN) מעל 7.0 כדי למנוע פירוק. בעת ביצוע ניתוח חלבון באמצעות Simple Western, חשוב לוודא שדגימות החלבון עוברות דנטורציה נכונה ונטענות בריכוז של כ-1-5 מיקרוגרם לנימים. לאימות qPCR, השתמש ב-cDNA איכותי המסונתז מ-1 מיקרוגרם לפחות של RNA, מה שמבטיח תנאי שעתוק הפוך עקביים. יש להימנע ממלכודות נפוצות בהכנת RNA, כגון זיהום ב-DNA גנומי או פירוק RNA, על ידי שימוש בציוד נטול RNAse וביצוע הפרדת פאזה באופן מיידי כדי למנוע פירוק RNA.

על ידי שילוב שיטות אלה, מחקר זה נועד לחקור האם מסלול ההתמיינות של תאי Th17 מופעל במודלים של עכברים של RBI וכיצד הוא תורם לפתוגנזה של תפקוד קוגניטיבי לקוי הנגרמת על ידי קרינה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הליכי הניסוי שנערכו כאן הם בהתאם להנחיות ARRIVE (מחקר בבעלי חיים: דיווח על ניסויים In Vivo). האישור התקבל מהוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המכון לרפואת קרינה בבייג'ינג (אישור מס. AF/SC-08/02; תאריך: 25 בפברואר 2024).

1. הקרנת גולגולת עכברים

  1. השתמש בסך הכל ב-10 עכברי C57BL/6 זכרים בגילאי 6-8 שבועות במחקר, והקצה חמישה בעלי חיים לקבוצת ה-RBI וחמישה לקבוצת הביקורת, כאשר קבוצת הביקורת מורכבת מעכברי ביקורת ריקים שלא קיבלו RBI. שמור על העכברים בתנאי סביבה מבוקרים, כולל טמפרטורה מווסתת, לחות ומחזור אור/חושך של 12 שעות. אקלום את העכברים במשך שבוע לפני תחילת הניסוי.
  2. להרדים בעלי חיים באמצעות הזרקה תוך-צפקית של 1% נתרן פנטוברביטל במשקל גוף של 50 מ"ג/ק"ג. אשר הרדמה נכונה על ידי בדיקת היעדר תגובה רפלקסיבית לצביטה יציבה בכף. יש למרוח משחה עיניים וטרינרית על שתי העיניים מיד לאחר תחילת ההרדמה כדי למנוע ייבוש בקרנית.
  3. מקם בעלי חיים בכיוון שכיבה באמצעות התקן ריסון ייעודי מעץ וכסה את האזורים הלא ממוקדים בגוף בלוחית מיגון עופרת (Pb) בעובי 3 מ"מ (טוהר של 99.9%) כדי להבטיח קרינה מקומית.
  4. קולימציה של שדה הקרנה של 2 x2 ס"מ 2 עם סינון מובנה (1.5 מ"מ Al + 0.25 מ"מ Cu). יישר את השדה לקו האמצע של הגולגולת עם כוונת לייזר משולבת (λ = 635 ננומטר ± דיוק של 0.5 מ"מ) וודא מיקום בזמן אמת עם מערכת מצלמות CMOS משולבת ותאורת IR אחורית. הקרין את אזור הגולגולת במינון רנטגן יחיד של 30 Gy ב-1.325 Gy/min באמצעות מערכת X-RAD 320 תחת הפרמטרים הבאים: 320 kVp/12.5 mA, SSD = 50 ס"מ.
  5. בצע כיול מינון שבועי באמצעות תא יינון הניתן למעקב הממוקם באיזוסנטר. שמור על פרמטרי אלומה ב-320 kVp/12.5 mA עם סינון 3.2 מ"מ Cu HVL כדי להשיג קצב מינון של 1.325 Gy/min (± 3% שונות). ודא את אחידות האלומה מדי יום (> 95% בתוך השדה) באמצעות סרט EBT3 Gafchromic.
  6. יש לתת מלוקסיקם (1-2 מ"ג/ק"ג, תת עורי) פעם ביום למשך 3 ימים כדי לטפל בכאבים לאחר הניתוח. הניחו בעלי חיים בתא התאוששות שחומם מראש ועקבו אחריהם באופן רציף עד שהם חוזרים להכרה מלאה ויכולים לשמור על שכיבה על עצם החזה. אל תשאיר בעלי חיים ללא השגחה במהלך תקופת ההחלמה.
  7. רשום את משקל הגוף של כל העכברים מדי שבוע לאורך כל המחקר. התבוננו בעכברים במשך 4 שבועות בסך הכל, כולל שבוע אחד של התאקלמות ו-3 שבועות לאחר ההקרנה.

2. ניתוח התנהגות בעלי חיים

  1. בצע ניסויים התנהגותיים 3 שבועות לאחר RBI.
  2. מבוך המים של מוריס
    1. ממלאים בריכה עגולה (קוטר: 120 ס"מ, גובה: 50 ס"מ) במים אטומים (20-22 מעלות צלזיוס) בעזרת אבקת חלב כדי לטשטש את המשטח השקוע. הניחו פלטפורמה נסתרת (קוטר: 10 ס"מ) 1 ס"מ מתחת לפני המים ברבע קבוע.
    2. אקלום עכברים לחדר הבדיקה לפחות 30 דקות לפני הניסויים. התחל את שלב האימון על ידי הכנסת כל עכבר למים מאחת מארבע נקודות התחלה שנבחרו באופן פסאודו-אקראי (N, S, E, W).
    3. אפשר לעכבר לשחות עד 60 שניות כדי לאתר את הפלטפורמה הנסתרת. אם העכבר לא מצליח למצוא את הפלטפורמה תוך 60 שניות, הנח אותו לפלטפורמה ואפשר לו להישאר שם במשך 15 שניות.
    4. ערכו ארבעה ניסויים ביום לכל עכבר במרווח של 15 דקות בין הניסויים. יבש כל עכבר ביסודיות עם מגבת חמה בין הניסיונות כדי למנוע היפותרמיה. המשיכו להתאמן במשך 5 ימים רצופים כדי להעריך את רכישת הלמידה.
    5. ביום הניסיון של הבדיקה, הסר את הפלטפורמה ואפשר לעכבר לשחות בחופשיות במשך 60 שניות. רשום פרמטרים כגון זמן שהושקע ברביע היעד, מעברי פלטפורמה ושבילי שחייה.
    6. עקוב ונתח את כל הניסויים באמצעות מערכת מעקב וידאו אוטומטית עם נסיינים עיוורים להקצאה קבוצתית.
  3. בדיקת שדה פתוח
    1. אקלום עכברים לחדר הבדיקה לפחות 30 דקות לפני הניסוי. השתמש במנגנון שדה פתוח (50 ס"מ על 50 ס"מ על 40 ס"מ) העשוי מפלסטיק אטום. האירו את הזירה בצורה אחידה (בדרך כלל 25-30 לוקס) כדי למנוע צללים חזקים ולמזער לחץ.
    2. נקו את הזירה עם 70% אתנול לפני שתבדקו כל בעל חיים כדי למנוע רמזי ריח. הנח את העכבר בעדינות במרכז השדה הפתוח כדי להתחיל את הבדיקה. אפשר לעכבר לחקור את הזירה בחופשיות במשך 10 דקות.
    3. רשום פעילות תנועה ומיקום באמצעות מערכת מעקב אוטומטית. הגדר את האזור המרכזי כ-20%-25% הפנימיים של השטח הכולל. מדוד את הזמן שהושקע באזור המרכזי ואת המרחק הכולל שעברת.
    4. לאחר הפגישה, החזר את העכבר לכלוב הביתי שלו ונקה את המכשיר ביסודיות.
  4. מבחן זיהוי אובייקטים חדשני
    1. אקלום עכברים לחדר הבדיקה לפחות 30 דקות לפני הניסוי. השתמש בזירת שדה פתוח (50 ס"מ x 50 ס"מ x 40 ס"מ) עם תאורה אחידה (20-30 לוקס). נקו את הזירה ביסודיות עם 70% אתנול בין בעלי חיים כדי למנוע סימני ריח.
    2. הנח כל עכבר בזירה הריקה ואפשר לו לחקור בחופשיות במשך 10 דקות. אל תניח חפצים במהלך שלב זה.
    3. לאחר 24 שעות, הניחו שני חפצים זהים (A ו- A′) בפינות מנוגדות של הזירה (לפחות 8 ס"מ מהקירות). הנח בעדינות את העכבר במרכז הזירה ואפשר לו לחקור במשך 10 דקות.
    4. הקלט אינטראקציה עם אובייקט באמצעות מערכת וידאו אוטומטית. הגדירו חקר אובייקט כחוטם העכבר שנמצא בטווח של 2 ס"מ מהאובייקט כשהוא מכוון אליו.
    5. החזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו לאחר המשפט ונקו את הזירה והחפצים.
    6. לאחר מרווח שמירה של שעה, מקם אובייקט מוכר אחד (A) ואובייקט חדש אחד (B) באותם מיקומים. החזר את העכבר לזירה ואפשר לו לחקור במשך 5 דקות.
    7. רשום את הזמן שהוקדש לחקר כל אובייקט באמצעות אותם קריטריונים כמו קודם. חשב את מדד הזיהוי כ:
      אינדקס זיהוי (%) = [זמן על אובייקט חדש / (זמן על אובייקט חדש + אובייקט מוכר)] x 100
  5. מבחן רוטרוד
    1. אקלום עכברים לחדר הבדיקה לפחות 30 דקות לפני הבדיקה. השתמש במנגנון רוטרוד ממונע בקוטר מוט של ~3 ס"מ וגובה של ~30 ס"מ מעל הבסיס.
    2. הגדר את מצב הסיבוב למהירות האצה (מ-4 סל"ד ל-40 סל"ד במשך 5 דקות). נקה את משטח המוט עם 70% אתנול לפני הנחת כל עכבר.
    3. הנח את העכבר בעדינות על מרכז המוט המסתובב, עם הפנים קדימה. התחל את הסיבוב והתחל מיד בתזמון.
    4. רשום את ההשהיה כך שתיפול אוטומטית על ידי המערכת. תפוס את העכבר בבטחה בעת נפילה כדי למנוע פציעה. אפשר תקופת מנוחה של לפחות 15 דקות בין הניסויים כדי למנוע עייפות.
    5. ערכו 3 ניסויים רצופים לעכבר ליום וממוצע ההשהיה כתוצאה הסופית. ודא שכל הבדיקות מבוצעות על ידי נסיינים עיוורים בתנאים עקביים. החזר את העכבר לכלוב הביתי שלו לאחר הבדיקה וחטא את המכשיר ביסודיות.

3. המתת חסד של בעלי חיים והכנת דגימות

  1. אסוף דגימות רקמה 5 שבועות לאחר RBI.
  2. הכינו נתרן פנטוברביטל (100 מ"ג/ק"ג) ומזרק סטרילי. יש להזריק נתרן פנטוברביטל תוך צפק. המתן עד שהעכבר יפסיק לנשום ושפעימות הלב ייפסקו, ויאשרו את המוות.
  3. ערפו במהירות את הראש בצומת העורף וחתכו את תפרי הגולגולת בעזרת מספריים עדינים, ולאחר מכן הרימו בזהירות את דשי הגולגולת הדו-צדדיים בעזרת מלקחיים מעוקלים תוך שמירה על שלמות קרום המוח לפני ניתוק קשרים עצביים.
  4. העבירו את המוח השלם למטריצה מקוררת מראש תוך 60 שניות לחצייה אמצעית באמצעות סכיני גילוח סטריליים. רשום מיד מידות אנטרופוסטריוריות (8.2 ± 0.3 מ"מ), רוחב מדיולטרלי (4.5 ± 0.2 מ"מ) ומסת רקמה (112 ± 8 מ"ג) עם מכשור מדויק.
  5. נתח את רקמות קליפת המוח וההיפוקמפוס על קרח. הקפאת הבזק של חצי הכדור השמאלי בחנקן נוזלי לריצוף RNA, qPCR ו-Simple Western.
  6. תקן את ההמיספרה הימנית ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) להיסטולוגיה. ייבשו את המוח הקבוע באתנול מדורג מ-70% ל-100%, כאשר כל שלב נמשך 30 דקות.
  7. נקה את המוח בקסילן למשך שעתיים. הסתנן לרקמות עם פרפין מותך בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. הטמיעו את המוחות המנוקים בקוביות פרפין ותנו להם להתמצק בטמפרטורת החדר. חותכים חתכים עטרתיים בעובי של 5 מיקרומטר בעזרת מיקרוטום.

4. צביעת המטוקסילין ואאוזין

  1. הפזר חלקי רקמה על ידי טבילת שקופיות בקסילן למשך 5 דקות, פי 3. לחות את החלקים באמצעות סדרת אתנול מדורגת: 100%, 95%, 70% ומים מזוקקים, למשך 5 דקות כל אחד.
  2. מכתימים את החלקים בהמטוקסילין למשך 5 דקות, תלוי בעוצמת הצביעה הרצויה. שטפו את החלקים במי ברז זורמים למשך 5 דקות כדי להסיר עודפי המטוקסילין.
  3. הבדיל בין החלקים בחומצה הידרוכלורית 1% באתנול למשך מספר שניות כדי להשיג את הניגודיות הרצויה. שוטפים שוב במי ברז זורמים למשך 5 דקות. מכתימים את החלקים ב- Eosin למשך דקה.
  4. שוטפים את החלקים לזמן קצר במים מזוקקים. יבש את החלקים באמצעות סדרת אתנול מדורגת: 70%, 95% ו-100%, למשך 5 דקות כל אחד.
  5. נקה את החלקים בקסילן למשך 5 דקות, 3x. הרכיב את החלקים עם כיסוי באמצעות מדיום הרכבה. קבל תמונות באמצעות מיקרוסקופ Nikon Eclipse Ni-U עם מטרה של פי 20.

5. אימונופלואורסצנציה

  1. תקן את הטישו על ידי טבילת שקופיות ב-4% PFA למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות במי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) למשך 5 דקות, 3x, כדי להסיר עודפי PFA.
  2. לחדור את הרקמה על ידי דגירה של שקופיות עם 0.3% טריטון X-100 ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חסום קשירה לא ספציפית על ידי דגירה של השקופיות עם 5% סרום רגיל למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  3. דגירה עם נוגדנים ראשוניים IBA-1 ו-GFAP, מדוללים במאגר חוסם בדילול של 1:2000, לילה ב-4 מעלות צלזיוס, בהתאם למפרט הנוגדנים. שטפו את השקופיות ב-PBS למשך 5 דקות, 3x, כדי להסיר נוגדן ראשוני לא קשור.
  4. דגירה עם נוגדן IgG משני נגד ארנב עז מצומד ל-Alexa Fluor 488, מדולל ב-1:1000 למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. שטפו את השקופיות ב-PBS למשך 5 דקות, 3x, כדי להסיר עודפי נוגדנים משניים.
  5. הרכיבו את השקופיות עם אמצעי הרכבה נגד דהייה המכיל DAPI. אטום את הכיסוי עם לק שקוף.
  6. צלם תמונות פלואורסצנטיות באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של פי 20.
  7. כמת את עוצמת הקרינה באמצעות ImageJ. בצע ניתוח כמותי באמצעות כלי ניתוח החלקיקים של ImageJ עם ספי גודל של 50-200 מיקרומטר2 (מיקרוגליה) ו-100-500 מיקרומטר2 (אסטרוציטים). הפחיתו את הרקע באמצעות האלגוריתם Rolling Ball (רדיוס = 50 פיקסלים).

6. ניתוח qPCR

  1. חלץ את סך ה-RNA מרקמה באמצעות ערכת מיצוי RNA. עקוב אחר פרוטוקול היצרן להומוגניזציה, ליזה וטיהור RNA.
  2. כמת את ה-RNA המופק באמצעות ספקטרופוטומטר כדי למדוד את הריכוז ולהעריך את הטוהר (יחס A260/A280). ודא שריכוז ה-RNA מתאים לסינתזת cDNA (100-500 ננוגרם/מיקרוליטר).
  3. העריכו את איכות ה-RNA באמצעות ביו-אנלייזר. ודא שה-RNA אינו מראה השפלה (רצועות חדות עבור 18S ו-28S rRNA) ויש לו מספר שלמות RNA (RIN) מעל 7.
  4. הכן תערובת תגובה של 20 מיקרוליטר עם 1 מיקרוגרם RNA, מאגר שעתוק הפוך, oligo-dT, dNTPs, מעכב RNase וטרנסקריפטאז הפוך.
  5. יש לדגור בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות כדי לסנתז cDNA. יש לחמם בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לנטרל את הטרנסקריפטאז ההפוך.
  6. שלב cDNA, תערובת מאסטר, פריימר קדימה, פריימר הפוך (טבלה 1) ומים נטולי נוקלאז בצלחת PCR של 96 בארות. השתמש ב-2 מיקרוליטר של cDNA לכל תגובה של 20 מיקרוליטר והבטיח ריכוז פריימר סופי של 200 ננומטר. אטום את הצלחת עם סרט דבק אופטי כדי למנוע אידוי.
גןרצף פריימר (5'-3', קדימה/אחורה)
TGF-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
TGF-β3GGACTTCGGCCACATCAAGAA
TAGGGGACGTGTCATCAC
IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
RORγtTCCACTACGGGGTTATCACCT
AGTAGGCCACATTACACTGCT
IL-17ATCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT
IL-17FTGCTACTGTTGATTGTTGGGAC
CAGAAATGCCCTGGTTTTGGT
GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTG
GGGGTCGTTGATGGCAACA

טבלה 1: פריימרים לרצף qPCR.

  1. הנח את לוחית התגובה במכשיר PCR בזמן אמת ותכנת את המחזור התרמי. השתמש בתנאי הרכיבה הבאים: דנטורציה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ואחריה 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
  2. לנרמל את ביטוי גני המטרה ל-GAPDH. חשב את רמות הביטוי היחסיות בשיטת ΔΔCt והצג את הנתונים כשינויי קיפול בהשוואה לקבוצת הביקורת.

7. ניתוח ריצוף RNA

  1. הרדמה והמתת חסד של העכבר בהתאם לפרוטוקולים מוסדיים לטיפול בבעלי חיים. יש להחדיר מיד PBS קר כדי להסיר דם במחזור.
  2. נתח את המוח על קרח. בודד את קליפת המוח באמצעות כלי דיסקציה סטריליים. צמצם את זמן הדיסקציה כדי לשמור על שלמות ה-RNA.
  3. הקפאת הבזק של רקמת קליפת המוח בחנקן נוזלי. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס אם מיצוי RNA לא מתבצע באופן מיידי.
  4. הומוגניזציה של קליפת המוח הקפואה (30-50 מ"ג) ב-1 מ"ל של מגיב מיצוי RNA באמצעות הומוגנייזר ממונע עד שלא יישארו שברים גלויים.
  5. בצע הפרדת שלב כלורופורם. מוסיפים 200 מיקרוליטר כלורופורם, מנערים במרץ במשך 15 שניות, דוגרים במשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר, ואז צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. מעבירים את השכבה העליונה לצינור חדש, מוסיפים נפח שווה של 70% אתנול וממשיכים בטיהור RNA באמצעות ערכה מבוססת עמוד סיליקה.
  7. השתמש בעיכול DNase על העמודה כדי להסיר DNA גנומי במהלך טיהור RNA. אסוף את סך ה-RNA ב-30-50 מיקרוליטר ושמור על קרח לשימוש מיידי.
  8. השתמש בספקטרופוטומטר כדי לכמת את ריכוז ה-RNA והטוהר. אשר יחס A260/A280 של ~2.0. נתח 1 מיקרוליטר של RNA בביואנלייזר. ודא ש-RIN גדול מ-8.0 לרצף.
  9. השתמש בפרוטוקול בחירה poly(A) ובערכת הכנה לספרייה תקועה. עקוב אחר פרוטוקול היצרן כדי ליצור ספריות של 300-400 bp. טהר ספריות עם ערכה מסחרית.
  10. השתמש בביואנלייזר כדי לאשר את גודל השבר ולכמת עם ספריות מאגר באופן שווה. בצע ריצוף קצה מזווג (2x, 150 bp) באמצעות פלטפורמת Illumina.
  11. חתוך מתאמים באמצעות Trim Galore, העריך איכות עם FastQC, יישר קריאות לגנום העכבר (GRCm39) באמצעות STAR וכימת ביטוי גנים עם featureCounts. זיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי באמצעות DESeq2.
  12. השתמש בפלט מ-DESeq2, וסנן גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי משמעותי DEGs (ערך p מותאם < 0.05 ו-|log2FC| > 1). בצע ניתוח העשרה במסלולי GO ו-KEGG באמצעות Phyper על סמך המבחן ההיפר-גיאומטרי. זהה מסלולים עם ערך P מתוקן ≤ 0.05 כמובהקים סטטיסטית.

8. ניתוח מערבי פשוט

  1. הומוגניזציה של קליפת המוח של העכבר במאגר RIPA עם מעכבי פרוטאז ופוספטאז, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת. קבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA.
  2. דנטורציה של דגימות החלבון על ידי ערבוב שלהן עם מאגר דגימה ודגירה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להבטיח דנטורציה מלאה.
  3. טען 3 מיקרוליטר דגימות חלבון מפוגל לתוך הנימים של Simple Western. ודא שהדגימות נטענות כראוי כדי למנוע הצפת יתר. הנח את הנימים בכלי המערבי הפשוט.
  4. דגרו את החלבונים המופרדים עם נוגדנים ראשוניים מדוללים ביחס של 1:50, כולל p-STAT3, STAT3, RORγt, TGF-β, IL-6 ו-IL-17, למשך 30 דקות.
  5. שטפו את מערכת הנימים עם מאגר כביסה למשך שלוש שטיפות של 5 דקות כל אחת כדי להסיר נוגדנים ראשוניים לא קשורים. הוסיפו את הנוגדן המשני המצומד ל-HRP מדולל במאגר חוסם ודגרו למשך 30 דקות.
  6. בצע 3 שטיפות של 5 דקות כל אחת עם מאגר כביסה כדי להסיר עודפי נוגדנים משניים. הפעל את תוכנית הזיהוי במערכת Simple Western כדי לזהות אוטומטית את החלבונים באמצעות כימילומינסנציה.
  7. נתח את הנתונים באמצעות תוכנת Compass for Simple Western. כמת את ביטוי החלבון על ידי השוואת אזורי השיא היחסיים באלקטרופרוגרמה. נרמל את הנתונים לחלבון GAPDH.

9. ניתוח סטטיסטי

  1. פתח את GraphPad Prism 9.0.0. תוכנה. לחץ על קובץ > ייבוא נתונים לטעינת נתונים. הצג נתונים כאמצעים ± SD. השתמש במבחן t הלא מזווג להשוואה בין שתי קבוצות.
  2. העריכו את הנורמליות באמצעות מבחן שפירו-וילק. אם הנורמליות מופרת (p < 0.05), יש ליישם את מבחן Mann-Whitney U להשוואה בין קבוצות. אם הנורמליות מסופקת (p ≥ 0.05), בצע מבחן t של דגימות עצמאיות כדי להעריך את ההבדלים בין הקבוצות.
  3. דווח על תוצאות עם ערכי p. קחו בחשבון את p < 0.05 כמובהקות סטטיסטית. השתמש בסימון הבא: n.s. עבור לא משמעותי, * עבור p < 0.05, ** עבור p < 0.005, *** עבור p < 0.0005 ו-**** עבור p < 0.0001.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ליקוי קוגניטיבי בעכברי RBI
לאחר חשיפה להקרנת מוח שלם של 30 Gy, משקל הגוף של העכברים נוטר על בסיס שבועי. התפקוד הקוגניטיבי הוערך במהלך השבועהרביעי (איור 1A). מדידות ראשוניות הצביעו על כך שמשקל הגוף של קבוצת הביקורת וקבוצת ה-RBI היה דומה. עם זאת, בין שבוע אחד לשלושה שבועות לאחר ההקרנה, קבוצת ה-RBI הדגימה ירידה משמעותית במשקל הגוף (איור 1B), מה שמצביע על כך שהקרנה של כל המוח משפיעה לרעה על גדילה והתפתח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלבים קריטיים בפרוטוקול
פרוטוקול זה כולל אינדוקציה של RBI בעכברים, ואחריו הערכות מקיפות של דלקת עצבית ומסלול התמיינות תאי Th17 (איור 6). שלב קריטי הוא הקרנה גולגולתית של עכברי C57BL/6 במינון של 30 Gy, מודל מבוסס היטב עבור RBI1. כיול מינון מדויק באמצעות תאי יינון מבטיח שחזור28. מבחנים התנהגותיים, כולל MWM, מעריכים ליקויים קוגניטיביים29, בעוד שריצוף RNA מספק תובנות לגבי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

תמיכה בעבודה זו ניתנה על ידי המכון לרפואת קרינה בבייג'ינג

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מודול הפרדה 12-230 kDa, 8 x 25 מחסניות נימיותProteinSimpleSM-W004
לנוגדנים SimpleWestern anti-GAPDHProteintechHRP-600041:500 דילול/נוגדן ל-SimpleWestern
נוגדן נגד GFAPAbcamab72601:2000 דילול/נוגדן לאימונופלואורסצנציה
נגד IBA-1Abcamab1788461:2000 דילול/נוגדן לאימונופלואורסצנציה
אנטי-IL-17 נוגדן A/FThermoMA5-237481:10 דילול/נוגדן ל-SimpleWestern
אנטי-IL-1β נוגדןCST122421:50 דילול/נוגדן ל-SimpleWestern
נוגדן נגד IL-6ThermoMA5-238001:5 דילול/נוגדן
למודולזיהוי נגד עכבר SimpleWesternProteinSimpleDM-002נוגדן משני לנוגדנים SimpleWestern
anti-P-STAT3(Try705)ThermoMA5-151931:2 דילול/נוגדן
למודול זיהוי ארנבחלבוןנוגדן משני Simple DM-001עבור SimpleWestern
anti-ROR & gamma; t נוגדןThermo14-6988-821:5 דילול/נוגדן ל-SimpleWestern
נוגדן נגד STAT3Thermo7100771:20 דילול/נוגדן ל-SimpleWestern
anti-TGF β-1,2,3 נוגדןThermoMA5-237951:10 דילול/נוגדן לבדיקת SimpleWestern
BACThermoA55860מבחני חלבון
EZ Standard Pack 1 12-230 kDaProteinSimplePS-ST01EZ-8עבור SimpleWestern
Goat Anti-Rabbit IgG H& LAbcamab1500771:1000 דילול/נוגדן לאימונופלואורסצנציה
ערכת RNeasyQiagen74134מיצוי RNA
SuperScript IV מערכת סינתזה של גדיל ראשוןThermo Fisher Scientific18091050שעתוק הפוך
SYBR Green Master MixTakara Bio RR820AQ-PCR
TRIzol ReagentInvitrogen15596026מיצוי RNA
SimpleWestern

מקורות

  1. Milano, M. T., et al. Radiation-induced edema after single-fraction or multifraction stereotactic radiosurgery formeningioma: a critical review. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 101 (2), 344-357 (2018).
  2. Tian, Y., et al. Radiation encephalopathy in nasopharyngeal carcinoma patients in mainland China: a systematic evaluation. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 24 (5), 471-473 (2002).
  3. Na, A., et al. Cerebral radiation necrosis. Asia Pac J Clin Oncol. 10 (1), 11-21 (2014).
  4. Deangelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344 (2), 114-123 (2001).
  5. Kumar, A. J., et al. Malignant gliomas: MR imaging spectrum of radiation therapy-and chemotherapy-induced necrosis of the brain after treatment. Radiology. 217 (2), 377-384 (2000).
  6. Minniti, G., et al. Single-fraction versus multifraction (3 x 9 Gy) stereotactic radiosurgery for large (>2 cm) brain metastases: acomparative analysis of local control and risk of radiation-induced brain necrosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 95 (4), 1142-1148 (2016).
  7. Minniti, G., et al. Repeated stereotactic radiosurgery for patients with progressive brain metastases. J Neurooncol. 126 (1), 91-97 (2016).
  8. Turnquist, C., Harris, B. T., Harris, C. C. Radiation-induced brain injury: current concepts and therapeutic strategies targeting neuroinflammation. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa057(2020).
  9. Raphael, I., et al. T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases. Cytokine. 74 (1), 5-17 (2015).
  10. Moser, T., et al. The role of TH17 cells in multiple sclerosis: Therapeutic implications. Autoimmun Rev. 19 (10), 102647(2020).
  11. MacMahon, C. A., et al. The Pathogenesis of Parkinson's Disease: A Complex Interplay Between Astrocytes, Microglia, and T Lymphocytes. Front Neurol. 12, 666737(2021).
  12. Kebir, H., et al. Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation. Nat Med. 13 (10), 1173-1175 (2007).
  13. Omenetti, S., et al. The Intestine Harbors Functionally Distinct Homeostatic Tissue-Resident and Inflammatory Th17 Cells. Immunity. 51 (1), 77-89.e6 (2019).
  14. Mangold, C. A., et al. Sexually divergent induction of microglial-associated neuroinflammation with hippocampal aging. J Neuroinflammation. 14 (1), 141(2017).
  15. SEER Cancer Stat Facts: Head and Neck Cancer. , National Cancer Institute. https://seer.cancer.gov/statfacts/html/headneck.html (2025).
  16. Holmes-Hampton, G. P., et al. Time- and sex-dependent delayed effects of acute radiation exposure manifest via miRNA dysregulation. iScience. 27 (2), 108867(2024).
  17. Kempf, S. J., et al. The cognitive defects of neonatally irradiated mice are accompanied by changed synaptic plasticity, adult neurogenesis and neuroinflammation. Mol Neurodegener. 9, 57(2014).
  18. Zhao, J., et al. RNA-seq reveals Nup62 as a potential regulator for cell division after traumatic brain injury in mice hippocampus. PeerJ. 11, e14913(2023).
  19. Zhang, P., et al. Quantitative proteomics analysis to identify diffuse axonal injury biomarkers in rats using iTRAQ coupled LC-MS/MS. J Proteomics. 133, 93-99 (2016).
  20. Sormunen, A., et al. Comparison of Automated and Traditional Western Blotting Methods. Methods Protoc. 6 (2), 43(2023).
  21. Mishra, M., et al. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Rev Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  22. Edouard, S., et al. Automated Western immunoblotting detection of anti-SARS-CoV-2 serum antibodies. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 40 (6), 1309-1317 (2021).
  23. Galland, F., et al. Astrocyte culture models: Molecular and function characterization of primary culture, immortalized astrocytes and C6 glioma cells. Neurochem Int. 131, 104538(2019).
  24. Wu, B., et al. The TGF-β superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation. Immunity. 54 (2), 308-323.e6 (2021).
  25. Korn, T., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  26. Kumar, R., et al. RORγt protein modifications and IL-17-mediated inflammation. Trends Immunol. 42 (11), 1037-1050 (2021).
  27. Qin, Z., et al. TCR signaling induces STAT3 phosphorylation to promote TH17 cell differentiation. J Exp Med. 221 (3), e20230683(2024).
  28. Lampert, P. W., et al. Delayed effect of radiation on the human central nervous system, 'early' and 'late' delayed reactions. Neurology. 14, 912-917 (1964).
  29. Martin, A., et al. Neurological imaging of brain damages after radiotherapy and/or chemotherapy. J Neuroradiol. 41 (1), 52-70 (2014).
  30. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17, 13(2016).
  31. Allen, B. D., et al. Mitigation of helium irradiation-induced brain injury by microglia depletion. J Neuroinflammation. 17 (1), 159(2020).
  32. Singh, R. P., et al. Th17 cells in inflammation and autoimmunity. Autoimmun Rev. 13 (12), 1174-1181 (2014).
  33. Monje, M. L., Toda, H., Palmer, T. D. Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis. Science. 302 (5651), 1760-1765 (2003).
  34. Pazzaglia, S., et al. Neurocognitive Decline Following Radiotherapy: Mechanisms and Therapeutic Implications. Cancers. 12 (1), 146(2020).
  35. Zhang, X., et al. DNA methylation changes and their role in radiation-induced brain injury,". Neurobiol Dis. 129, 96-104 (2019).
  36. Lee, H. J., et al. Profiling of gene expression in the brain associated with anxiety-related behaviors in the chronic phase following cranial irradiation. Sci Rep. 12 (1), 13162(2022).
  37. Cañada-García, D., Arévalo, J. C. A Simple, Reproducible Procedure for Chemiluminescent Western Blot Quantification. Bio Protoc. 13 (9), e4667(2023).
  38. Raber, J., et al. Radiation-induced cognitive impairments are associated with changes in indicators of hippocampal neurogenesis. Radiat Res. 162 (1), 39-47 (2004).
  39. Zhang, J., et al. Th17 cell-mediated neuroinflammation is involved in neurodegeneration of aβ1-42-induced Alzheimer's disease model rats. PLoS One. 8 (10), e75786(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNASimple WesternqPCR
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.