הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח ניוון ושימור קולטני אור במודל עכברי רטיניטיס פיגמנטוזה

621 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68324

⸱

22 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Science and Biotechnology Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 2Neural Development and Regeneration Laboratory, Department of Neurobiology, Neuroscience Graduate Program, Institute of Biology, Fluminense Federal University, 3Instituto Estadual de Hematologia Arthur de Siqueira Cavalcanti (HEMORIO)

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר טכניקות אופטימליות לניתוח ניוון ושימור קולטני אור במודל עכברי של רטיניטיס פיגמנטוזה, כולל מתן תרופות תוך זגוגיות, חתך קריוסטט ואימונופלואורסצנטי. השיטה מבטיחה את שלמות הרשתית ומספקת נתונים כמותיים על יעילות ההתערבויות הטיפוליות.

תקציר

רטינופתיה משפיעה על מאות מיליוני אנשים ברחבי העולם ומהוות גורמים משמעותיים ללקות ראייה ועיוורון. בין המחלות הללו, רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) היא הפרעת עיניים תורשתית המאופיינת בניוון רשתית מתקדם, המשפיעה על כ-1.5 עד 2 מיליון אנשים ברחבי העולם. מחקרי הוכחת היתכנות במודלים של בעלי חיים של ניוון רשתית תורשתי מהווים בסיס חשוב לראיות למחקרים במנגנונים פתופיזיולוגיים של המחלה, יעילות הטיפול ובטיחותו. הזרקה תוך זגוגית בעכברים וחתך קריוסטט הן טכניקות בשימוש נרחב לחקירת השפעות תרופות במודלים של RP, מכיוון שהן מאפשרות אספקה מדויקת של חומרים להומור זגוגי והכנת דגימות היסטולוגיות באיכות גבוהה לניתוח מפורט של שינויים ברשתית. כמו כן, ספירת תאים באמצעות אימונופלואורסצנציה באמצעות נוגדנים נגד recoverin, חלבון תלוי סידן המתבטא בקולטני אור ברשתית, שימשה לאחרונה לחקר שינויים תאיים הקשורים לניוון רשתית במודלים של RP, מכיוון שגישה זו מאפשרת הערכה של אובדן קולטני אור ושימור תאים פוטנציאלי לאחר התערבויות טיפוליות. ההזרקה התוך-זגוגית עברה אופטימיזציה כדי להבטיח את שלמות העין ותוצאות אמינות, תוך שימוש במחט דקה כדי להחדיר את התמיסה לתוך תא הזגוגית. לאחר תקופה מוגדרת מראש להערכת השפעות התרופות, מבוצע עיבוד היסטולוגי, עם דגימות שנחתכות בעובי של 10 מיקרומטר באמצעות קריוסטט, ולאחר מכן תיוג אימונופלואורסצנטי עם נוגדנים להתאוששות. לבסוף, מבוצעת ספירת תאים כדי להעריך אם לטיפול בתרופות הייתה השפעה מגנה, כפי שמעיד שימור קולטני האור. למרות שטכניקות אלו יושמו באופן נרחב כדי ליצור נתונים עקביים במחקר רטינופתיה, האתגרים נמשכים בהשגת איכות מדויקת של טיפול ועיבוד רקמות. פרוטוקול זה מספק גישה סטנדרטית לאופטימיזציה של כל שלב, מהזרקה תוך זגוגית ועד הכנת חתכים היסטולוגיים, מה שמבטיח תוצאות ניתנות לשחזור ואיכותיות.

מבוא

ראייה היא אחד החושים המורכבים ביותר של מערכת החושים, החיונית ללכידת גירויים חזותיים סביבתיים ותרגומם לאותות אלקטרוכימיים, המעובדים במוח ליצירת תמונות. גורמים ביולוגיים שונים, כגון הזדקנות, פגמים גנטיים ומחלות, עלולים לפגוע בראייה, ולהשפיע באופן משמעותי על איכות החיים והפעילות היומיומית.

העין האנושית מורכבת משלושה חדרים עיקריים. השכבה החיצונית, שנוצרה על ידי הקרנית והסקלרה, מספקת תמיכה מבנית לגלגל העין. שכבת הביניים כוללת את הקשתית, הגוף הריסי והכורואיד, כאשר האחרון אחראי על אספקת דם לקולטני האור. לבסוף, השכבה הפנימית כוללת את הרשתית, מבנה האחראי על עיבוד גירויי אור והמרת אור לאותות חשמליים הנשלחים למוח ליצירת תמונה 1,2.

הרשתית העצבית מורכבת ממספר שכבות תאיות, כולל תאים מיוחדים כגון קולטני אור, תאים דו קוטביים, תאים אופקיים, תאי אמקרין ותאי גנגליון. בנוסף, הרשתית מכילה תאי גליה כגון מיקרוגליה, אסטרוציטים ותאי מולר, כמו גם תאי אפיתל פיגמנטיים. האחרון, הממוקם בחלק הלא עצבי של הרשתית, ממלא תפקיד קריטי בשמירה על שלמות מבנית, הגנה ותמיכה בקולטני אור 3,4. החלק העצבי מכיל תאים חושיים ועצביים המעורבים ישירות בלכידת אורועיבודו 5,6,7.

בהיותה חיונית לראייה, הרשתית מושפעת לעתים קרובות מפתולוגיות שעלולות להוביל לעיוורון. בין המצבים הללו, רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) בולטת כאחת הרטינופתיות התורשתיות העיקריות, עם יותר מ-80 גנים הקשורים לאטיולוגיה שלה 8,9. RP היא מחלה הטרוגנית, העוברת בתורשה בעיקר באופן אוטוזומלי דומיננטי או רצסיבי, אך היא עלולה להופיע גם כקשורה ל-X או עקב מוטציות ספונטניות10.

עם שכיחות עולמית המוערכת בין 1 ל-3,000 ל-1 ל-7,000 אנשים, תלוי באוכלוסייה ובאזור הגיאוגרפי11,12, RP מתבטא בדרך כלל במהלך גיל ההתבגרות או הבגרות המוקדמת, עם תסמינים ראשוניים כגון ירידה בראיית לילה ואובדן שדה ראייה היקפי. ככל שהמחלה מתקדמת, הראייה המרכזית נפגעת, מה שעלול להוביל לעיוורון מוחלט 9,13.

למרות שעדיין אין תרופה ל-RP, טיפולים שונים בפיתוח הראו פוטנציאל להאט או להפוך את התקדמות המחלה. בין הגישות הללו ניתן למנות טיפולים גנטיים, תאיים ותרופתיים, כמו גם מכשירים אלקטרוניים. כדי לקדם את ההבנה של RP ולהעריך התערבויות חדשות, נעשה שימוש נרחב במודלים של עכברים של ניוון רשתית. מודלים אלה, המכונים לעתים קרובות rd (ניוון רשתית), הם כלים רבי ערך לחקר הבסיס המולקולרי והטיפולים ב-RP. בין המודלים השונים המשמשים בחקר רטיניטיס פיגמנטוזה, זן העכבר Pde6βrd10/rd10 (rd10) מציג מוטציה שגויה בגן המקודד את תת-היחידה β הספציפית למוט של פוספודיאסטראז14, ומציג ניוון איטי של קולטני אור בדומה למה שקורה בבני אדם15.

מתן תרופות תוך זגוגיות נמצא בשימוש נרחב במחקרים שונים 16,17,18. פרוטוקול זה מתאים לחוקרים החוקרים את השפעות התרופות על הרשתית, במיוחד בכל הנוגע להישרדות תאי קולטני האור. באופן זה, המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לייעל את העברת התרופות באמצעות הזרקה תוך זגוגית במודל עכברי של רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) ולהעריך את הישרדות קולטני האור באמצעות אימונופלואורסצנציה להתאוששות, סמן תאים קולטני אור. הזרקה תוך זגוגית מאפשרת מתן תרופות מקומי, מזעור תופעות לוואי מערכתיות, הגדלת הזמינות הביולוגית של הרשתית והפחתת תופעות לוואי באיברים אחרים. מצד שני, אימונופלואורסצנציה עבור recoverin מאפשרת ניתוח ספציפי של הישרדות קולטני האור, ומספקת כלי יעיל להערכת היעילות של אסטרטגיה טיפולית זו. עם זאת, תחולתם תלויה בגורמים כגון בחירת מודל בעלי חיים, דיוק ההזרקה ומשך הטיפול, אותם יש לקחת בחשבון בעת התאמת שיטה זו למסגרות ניסוי אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרויקט וכל הפרוטוקולים המבוצעים במסגרתו עוקבים אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים של המועצה הלאומית לפיקוח על ניסויים בבעלי חיים ואושרו על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים (CEUA - UFF) תחת המספר 1464280219.

1. בעלי חיים

  1. השתמש בזן העכברים rd10, שעובר ניוון קולטני אור, ובזן C57 Black/6 (רקע של rd10). שמור על זנים אלה במחזור אור-חושך של 12 שעות / 12 שעות, עם גישה אד ליביטום למים ומזון.

2. הרדמה

  1. יש לבצע הזרקה תוך צפקית עם חומר הרדמה המוכן במינון של 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו-8 מ"ג/ק"ג קסילזין, מדולל במים מזוקקים. קטמין פועל כמעכב קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDA), ומספק השפעות משככות כאבים, בעוד שקסילזין מתפקד כחומר הרגעה.
  2. עבור ההזרקה התוך-צפקית, חשב את הנפח שיש להזריק כ-10 מיקרוליטר x משקל (גרם).
  3. רסנו את העכבר כדי להבטיח גישה ברורה לבטן. נקה את הרבע הימני התחתון של חלל הבטן עם 70% אלכוהול, שם יש להכניס את המחט כשהשיפוע פונה כלפי מעלה.
  4. כדי לאשר את היעדר רפלקס הכאב, צבט בעדינות את הזנב או הכפה של החיה. אם אין תגובה, זה מצביע על כך שהחיה מורדמת כראוי.

3. הזרקה תוך זגוגית

  1. לאחר הרדמת בעלי החיים, יש לחשוף את העיניים ובאמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי דו-עיני בהגדלה של פי 10, לזהות את אזור הלימבוס, פס אפור בין הקרנית לסקלרה, בו תבוצע ההזרקה.
  2. כדי לבצע את ההזרקה יש צורך בסיוע של אדם אחר. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי דו-עיני, אדם אחד צריך להחזיק את החיה ולהכניס את המחט, בעוד העוזר לוחץ על בוכנת המזרק כדי להכניס את החומר לעין.
  3. ראשית, השתמש במזרק דק במיוחד עם מחט קבועה (31 גרם על 6 מ"מ) כדי לבצע ניקוב באזור הלימבוס, היזהר לא להכניס את המחט עמוק מדי; מספיק להכניס רק מחצית מהשיפוע.
  4. לאחר מכן, הכנס את מזרק המיקרו המעוקר מראש (מד 26 S ללא שיפוע), המכיל 1 מיקרוליטר של הנוזל/התרופה המעניינת, לנקב שנעשה על ידי מזרק האינסולין.
  5. בקש מהעוזר ללחוץ על בוכנת המזרק באיטיות, וודא שכל הנפח מנוהל על פני כ-30 שניות.
  6. חזור על התהליך עבור העין השנייה של אותה חיה ורשום את השעה.
  7. אם יש יותר מקבוצת ניסוי אחת, סמנו את אוזן החיה כדי להבטיח זיהוי נכון של כל קבוצה.
  8. השתמש בטיפה אחת של תמיסת PBS 0.01 M בכל עין של בעל החיים כדי למנוע התייבשות.
  9. לאחר הליכים אלה, הניחו את בעלי החיים על כרית חימום, כשהטמפרטורה מוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס, עד שהם מתעוררים. זה יכול לקחת 1-2 שעות. עקוב אחר בעלי החיים באופן רציף בזמן ההרדמה, ולאחר ההתעוררות, החזיר אותם לכלובים עד למועד הניתוח.
  10. בצעו אימון ראשוני באמצעות צבע גלוי, כגון כחול טריפאן, כדי לעזור למפעילים לחדד את טכניקת ההזרקה התוך-זגוגית שלהם בעכברים.
    הערה: הצבע מקל על הדמיה של נתיב המחט, מאפשר התאמות מדויקות בעומק ובזווית ההזרקה, מפחית את הסיכון לפגיעה במבנה העין ומגביר את בטיחות ההליך.

4. המתת חסד והכנת עיניים

  1. לאחר משך טיפול ספציפי לאחר ההזרקה, המתת חסד של בעלי החיים באמצעות שאיפת מנת יתר של איזופלוראן 5%. המשך בחשיפה עד דקה אחת לפחות לאחר הפסקת הנשימה. כדי להבטיח מוות, החזק את החיה בחלק האחורי של הצוואר והפעל מתיחה איתנה על הזנב עד להשגת פריקת צוואר הרחם.
  2. לפני הסרת העיניים, סמן את הקוטב הטמפורלי. מרחו בזהירות את הסמן או המחט/סיכה החמה על האזור הטמפורלי של הסקלרה, וודאו שהסימון גלוי ומדויק. שלב זה ישמש כנקודת התייחסות להתמצאות במהלך תהליך החיתוך.
  3. לאחר מכן, חשפו את העיניים ובעזרת אזמל סטרילי ומספריים לכריתת אירידקטומיה, חתכו את הרקמה שמסביב כדי להפריד בין רקמות חיבור ושרירים ולחשוף את גלגל העין. בעכברים, נתחו את שרירי העיניים בזהירות, מכיוון שזה יכול להיות מאתגר. כדי להקל על ההליך, בצע חתך רוחבי עם אזמל סטרילי בשתי פינות עור העין.
  4. בעזרת מלקחיים מעוקלים בקצה בינוני, הסר בעדינות את העיניים מארובת העין על ידי אחיזתן בעצב הראייה וקבע מיד את הרקמה למשך 5 דקות בתמיסת פרפורמלדהיד 4% (PFA) בטמפרטורת החדר (RT).
  5. לאחר קיבוע בתמיסת PFA, העבירו את העיניים לצלחת זכוכית, באמצעות מלקחיים מעוקלים בקצה בינוני. צלחת זו מתפקדת כפלטפורמת חיתוך ומבטיחה שהיא מכילה מאגר פוספט בריכוז של 0.1 M pH 7.4.
  6. לאחר מכן, הניחו את הצלחת מתחת למיקרוסקופ סטריאוסקופי דו-עיני בהגדלה של פי 10, ובצעו חתך קטן ממש מעל הלימבוס (גבול הקרנית) באמצעות אזמל. לאחר מכן, בצע חתך היקפי בעקבות הלימבוס עם מספריים מיקרו-אירידקטומיה כדי להפריד את הקרנית.
  7. הסר את הקרנית, יחד עם הקשתית והעדשה, באמצעות מלקחיים Dumont #5. לבסוף, יש לתקן את העיניים שוב בתמיסה של 4% PFA למשך 55 דקות. לאחר מכן יש לשטוף את העיניים שלוש פעמים עם מאגר פוספט 0.1 מ ', pH 7.4.

5. שימור בהקפאה והקפאה

הערה: חתך קריוסטט של רקמת הרשתית בוצע כמתואר קודם לכן עם כמה התאמות19.

  1. שימור הקפאה של העיניים עם שיפוע סוכרוז של 10%, 20% ו-30%, מדולל במאגר פוספט של 0.1 M, pH 7.4. טבלו את העיניים ברצף בתמיסות הסוכרוז, החל מהריכוז הנמוך ביותר (10%) ועד לעלייה הדרגתית לגבוה ביותר (30%). כל שלב נמשך למשך הזמן הדרוש עד שהעיניים מתיישבות בתחתית המיכל, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בריכוז הבא. בריכוז הסופי, יש לאחסן את העיניים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך כ-12 שעות.
  2. למחרת, הסירו את עודפי הסוכרוז 30% והניחו את העיניים במיכל אלומיניום עגול בקוטר 2 ס"מ, מסודר לפי קבוצות הניסוי.
    הערה: הכינו מיכל נייר אלומיניום בגודל המתאים בהתאם למספר קבוצות הניסוי.
  3. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי דו-עיני בהגדלה של פי 10, הסר את עודפי הסוכרוז מתוך ומסביב לגלגל העין באמצעות פיפטה או נייר פילטר, תוך הקפדה על כך שלא לפגוע במבנה הרקמה.
  4. הטמיעו את העיניים בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), הקפידו למנוע היווצרות בועות בתוך העיניים או סביבן, והשאירו אותן למשך שעה אחת ב-RT.
  5. לאחר שעה אחת ב-OCT, מקם את העיניים כשנקודת הייחוס שסומנה קודם לכן פונה כלפי מעלה. הניחו את מיכל נייר האלומיניום על צלחת אלומיניום מתאימה בתוך קופסת קלקר קטנה להקפאה.
  6. שופכים בזהירות חנקן נוזלי על צלחת האלומיניום, סביב מיכל נייר הכסף. ודא שהחנקן מתפזר באופן שווה על פני השטח. זה מקדם הקפאת רקמות אחידה. ודא שהחנקן הנוזלי אינו בא במגע ישיר עם העיניים בתוך מיכל נייר הכסף. לאחר מכן, המשך בחיתוך העיניים באמצעות קריוסטט.

6. הכנת שקופיות

  1. מורחים פולי-L-ליזין (200 מיקרוגרם/מ"ל) על שקופיות הזכוכית החלביות.
  2. המתן 12 שעות עד שהמגלשות יתייבשו ויהיו מוכנות לשימוש.

7. חתך קריוסטט

  1. על קריוסטט, מקם את הבלוק הקפוא על הרציף.
  2. סובב את גלגל היד כדי ליצור קטעים בעובי של 10 מיקרומטר.
  3. התאם את מיקום הבלוק כדי להבטיח שכל העיניים יהיו נוכחות באותה מידה בחיתוך.
  4. המשיכו לחתוך עד לזיהוי עצב הראייה, באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.
  5. אסוף את החלקים על שקופיות הפולי-L-ליזין שטופלו מראש.
  6. אחסן את השקופיות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לניתוח.

8. אימונופלואורסצנציה

הערה: אימונופלואורסצנציה בוצעה כמתואר קודם לכן עם כמה התאמות19,20.

  1. דגרו את השקופיות המתקבלות מהחתך בקריוסטט עם 100 מיקרוליטר של 0.5% טריטון X-100 ב-0.01 M PBS למשך 15 דקות ב-RT כדי לחלחל את קרום הפלזמה של התא.
  2. שטפו את השקופיות פעמיים עם 0.01 M PBS למשך 5 דקות כל אחת ב-RT כדי להסיר עודפי Triton X-100.
  3. דגירה עם 100 מיקרוליטר 1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-0.01 M PBS למשך 30 דקות ב-RT כדי לחסום אתרי קשירת נוגדנים לא ספציפיים.
  4. לאחר החסימה, יש לדגור על החלקים עם 100 מיקרוליטר של אנטי-ריברברין בריכוז של 1:1500 מדולל ב-BSA 1% כדי לסמן תאים קולטני אור, למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס (מקרר).
  5. למחרת, דגרו את החלקים עם 100 מיקרוליטר של נוגדן משני פוליקלונלי נגד ארנב 488 או נוגדן משני פוליקלונלי נגד ארנב 568 1:500 מדולל ב-BSA 1% למשך שעתיים ב-RT.
  6. שטפו את המגלשות פעמיים עם 0.01 M PBS למשך 5 דקות כל אחת ב-RT.
  7. דגרו את החלקים עם 100 מיקרוליטר של DAPI 1 מ"ג/מ"ל (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול) למשך 2-3 דקות ב-RT.
  8. שטפו את השקופית פעם אחת עם 0.01 M PBS למשך 5 דקות ב-RT.
  9. לבסוף, טפל בקטעים עם מדיום הרכבה המכיל 2.5 גרם n-פרופיל גלאט ב -40 מ"ל גליצרול במאגר פוספט 0.1 M pH 7.4. הם ישמשו כמגיב נגד דהייה וכמדיום הרכבה, תוך שמירה על הדגימות. הנח כיסוי (24 מ"מ 50 מ"מ) על גבי השקופיות, ולאחר מכן אטום את החלקים עם לק. לאחר מכן, המשך בצפייה בדגימות תחת המיקרוסקופ.

9. מיקרוסקופ פלואורסצנטי, פוטומיקרוגרפיה

  1. כדי לרכוש תמונות של התאים המסומנים בטכניקת האימונוהיסטוכימיה, השתמש במיקרוסקופ אופטי פלואורסצנטי המצויד במסננים כחולים, ירוקים ואדומים. בנוסף, צרף מצלמה לצילום שקופיות. כדי להשיג את הפוטומיקרוגרפים, השתמש במחשב עם תוכנת LAS V3.7 (Leica) (תוכנת הדמיה), שחייב להיות פתוח להדמיה בו זמנית עם המיקרוסקופ.
  2. הנח את השקופית על המיקרוסקופ במה. בתחילה, השתמש במטרת ההגדלה הנמוכה ביותר ובמסנן הכחול.
  3. כוונן את המיקוד באמצעות כפתורי המיקוד הגסים והעדינים עד שהרשתית עם התאים המסומנים בכחול (גרעיני התא) תוצג בבירור.
  4. בחר את האזור הרצוי ברשתית להדמיה. הגדל בהדרגה את ההגדלה עד למטרה של פי 40, והתאם את המיקוד לפי הצורך.
  5. לאחר התאמת המיקוד, משוך את סיכת המעקף כדי להעביר את תמונת המיקרוסקופ לתוכנת ההדמיה. בחר את המסננים הרצויים (A4 (כחול), L5 (ירוק) ו-TX2 (אדום)). התאם את הפרמטרים הבאים: חשיפה, רווח וגמא, כדי להבטיח שהתמונה ברורה וקרובה ככל האפשר למה שנצפה במיקרוסקופ.
  6. בהגדלה של 400×, לכוד ארבעה שדות בשטח של 113 × 113 מיקרומטר, בעקבות כיוון מהפריפריה למרכז הרשתית. ודא ששניים מהשדות הללו מייצגים את האזור ההיקפי, ושניים מייצגים את האזור המרכזי של הרשתית.
  7. כדי להשיג פוטומיקרוגרפים בשדה היקפי, צלם תמונות במרחק של כ-50 מיקרומטר מקצוות העין. עבור פוטומיקרוגרפים בשדה מרכזי, בחר אזורים סמוכים הממוקמים 50 מיקרומטר מהעצב האופטי ורכוש את התמונות. השתמש בעין ימין ושמאל לכימות וכתוצאה מכך בסך הכל שמונה שדות מנותחים לכל טיפול.
  8. לאחר השלמת כל הפוטומיקרוגרפים, המשך בכימות הידני של התאים בעלי התווית החיסונית.

10. כימות תאים

  1. פתח את התוכנית ImageJ v.1.54g. בתוך התוכנית, לחץ על קובץ ולאחר מכן פתח ובחר את התמונה שנשמרה במחשב.
  2. כשהתמונה כבר פתוחה, לחץ על ריבוי נקודות. השתמש בכלי זה כדי לכמת את התאים על ידי לחיצה שמאלית על כל תא שיש לספור.
  3. כמת את התאים המקומיים, כלומר חיוביים ל-recoverin ו-DAPI, בשכבה הגרעינית החיצונית (ONL).
  4. לאחר השלמת הספירה, לחץ פעמיים עם לחצן העכבר השמאלי כדי לראות את המספר הכולל של התאים שסומנו.
  5. לאחר קביעת מספר התאים החיוביים לשחזור, הזן את מספר התאים בטבלת הכימות של Excel ועבור לפוטומיקרוגרף הבא.
  6. חזור על כל השלבים עבור 8 השדות המתאימים לכל חיה.
  7. חשב את הממוצע של שמונת השדות הללו, המתאים לנקודת ניסוי אחת עבור כל הרשתית (n=1). עבור גרף הרשתית ההיקפית, השתמש בממוצע השדות ההיקפיים, בסך הכל ארבעה שדות: שניים מהעין השמאלית ושניים מהעין הימנית. ממוצע זה מתאים לנקודת ניסוי אחת עבור הרשתית ההיקפית (n=1). צור את מרכז גרף הרשתית באותו אופן כמו הגרף ההיקפי, ושנה רק את האזור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

טכניקת האימונופלואורסצנציה לתיוג קולטני אור, תאים חיוביים להתאוששות, אפשרה לנו לצפות בדפוס הניוון של קולטני אור בחיות rd10 ו-C57Bl6, כאשר האחרונים נחשבים בריאים (איור 1). כפי שניתן לראות, תיוג לתאים חיוביים להתאוששות הוא בלעדי לשכבה הגרעינית החיצונית (ONL) שבה נמצאים קולטני אור, כולל תיוג של מקטעים פנימיים לתאים אלה, הן ב-rd10 והן בבעלי חיים מסוג בר. ככל שהפיתוח מתקדם, אנו יכולים לראות שימור של צביעה חיסונית פלואורסצנטית בשני בעלי החיים, אך עם ירידה בעובי ONL...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הרשתית היא רקמה עדינה שקשה לגשת אליה; לכן, יש לקחת בחשבון את הטכניקה שבה יש להשתמש לביצוע טיפול תרופתי המכוון לרקמה זו. הזרקה תוך זגוגית היא טכניקה מבוססת ונמצאת בשימוש נרחב להעברת תרופות ישירות לרשתית, במיוחד בטיפול במחלות עיניים כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל21, רטינופתיה סוכרתית22 ורטיניטיס פיגמנטוזה23. בהתאם לפרוטוקול שלנו, מחקרים רבים השתמשו גם בהזרקות תוך זגוגיות בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה כדי לבחון את...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נערכה במהלך מלגת מחקר שנתמכה על ידי המועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq), קרן קרלוס צ'אגס פיליו לתמיכה במחקר של מדינת ריו דה ז'ניירו (FAPERJ), ומומנה גם בחלקה על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - ברזיל (CAPES) - קוד פיננסי 001.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.3% Triton-X-100Sigma-AldrichT8787פתרון לחסימת מאגר
1% BSASigma-AldrichA4503פתרון לחסימת מאגר
1% אנושי BD Fc Block BDBiosciences564220Fc בלוק נדרש לחסימת מאגר
150 W מנורת LEDאמזוןB07VH3CVSFמקור אור LED להקרנת רקמות
1x PBS Gibco10010-023פתרון לחסימת שלבי חיץ וכביסה
מיכל אחסון 20 ליטר מיכלB001B1C4G0 אמזוןלתהליך הקרנת אור
40 W RGBW מנורת LED הצפה  אמזוןB08QFPJSMDמקור אור RGB להקרנת רקמות
Ag85BAbcamab43019/NAנוגדן להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
אקטין שריר חלק אלפא DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NAנוגדן להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
ערכת חסימת אבידין/ביוטיןAbcamab64212תמיסת חסימת אבידין וביוטין
BD ציטופיקס/ציטופרםBD Biosciences554714תמיסת קיבוע
BOND תמיסת הסרת שעווהLeica BiosystemsNC0221076תמיסת דפרפיניזציה
BOND Epitope Retrieval Solution 1Leica BiosystemsNC0235529תמיסת אחזור pH 6 אפיטופ מבוססת ציטראט ( ER1)
BOND Epitope Retrieval Solution 2Leica BiosystemsNC0235530תמיסת אחזור אפיטופים pH 9 מבוססת EDTA (ER2)
BOND מערכת גילוי מחקרLeica BiosystemsNC0396648ריאגנט מחקר אוטומטי
BOND RX Research StainerLeica BiosystemsNAפלטפורמת צביעת מחקר אוטומטית
BOND Wash SolutionLeica BiosystemsNC0221077מאגר כביסה
CD15BD Biosciences347420/AB_400298נוגדן להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82/AB_11150959נוגדן להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
CD4 אלקסה פלואור 488R& D SystemsFAB8165G/AB_2728839נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE/NAנוגדן להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135/AB_2892745נוגדן להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
חמור נגד עזים IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_2762838נוגדן להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
חמור נגד עכבר IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher ScientificA32787/ AB_2762830נוגדן להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
חמור נגד עכבר IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_2340844נוגדן להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
חמור נגד ארנב IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher ScientificA32794/AB_2762834נוגדן להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
מערכת צביעה EasyDipאספקת מצטרף חדשה5300KITמערכת צביעת שקופיות
Fluoromount-GThermo Fisher Scientific00-4958-02אמצעי הרכבה
HoechstBiotium40046כתם גרעיני להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
ממיר קבצים Imaris x64 10.2.0Imaris Oxford Instrumentsממיר קבצים חינם
תוכנת ImarisViewer x64 10.2.0Imaris Oxford Instrumentsתוכנה חינמית לעיבוד תמונה
ImmEdge PenVector LaboratoriesH-4000עט מחסום הידרופובי
ליתיום בורוהידריד (1 גרם)STREM Chemicals93-0397כימיקל להשבתת צבע, קנו כמויות קטנות של כימיקל זה (1 גרם)
Lumican BiotinR& D SystemsBAF2846נוגדנים להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
משקפי מיקרו כיסויVWR48393-241כיסויי שקופיות זכוכית
Pan-cytokeratin Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750/AB_2868569נוגדן להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
מערכת מיקרוגל PELCO BioWave ProTed Pella Inc36500-230מיקרוגל מדעי ללא חימום
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062בקרת טמפרטורה אוטומטית לחלוטין למיקרוגל מדעי
SimpleITKתוכנתרישום ועיבוד ערוצים
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227מגיב תיוג להדמיית IBEX. ראה טבלה 1.
מיקרוסקופ WidefieldLeica MicrosystemsNALeica Microsystems מצלמת THUNDER עם מקור אור LED8 ותוכנת LAS X (3.7.1.21655). להדמיית פלואורסצנטיות, נעשה שימוש במסנן מרובע פס מותאם אישית עם גלגל מסנן חיצוני (PN: 11536075) עם שני מסננים נוספים בעלי פס יחיד (PN: 8118215) להדמיית שבעה ערוצי צבע בכל מעבר. קווי עירור המסנן, הדיכרואי והפליטה הם (1) קוביית Quad-Band: דיכרואי ב-391/32, 479/33, 554/24, 638/31, ללא מסנני עירור או פליטה; (2) גלגל מסנן חיצוני מיקום 1: 434/32, מיקום 2: 520/40, מיקום 3: 585/20, מיקום 4: 720/60, מיקום 5: מעבר; (3) פס יחיד 1— עירור 585/22, 594 דיכרואיק, פליטת 625/30; (4) פס יחיד 2— עירור 635/20, 647 דיכרואיק, פליטת 667/30.
Zeiss מנקה עדשות אופטיאמזוןB00GPVQVCOמיקרוסקופ אובייקטיבי מנקה עדשות
<חזק>נוגדנים>
Ag85BAbcamab43019ארנב פוליקלונלי IgG, מחזור 1
אקטין שריר חלק אלפא DyLight 755Novus BiologicalsNBP2-345221R1A4/asm-1, מחזור 1
CD4 Alexa Fluor 488R&;D מערכותFAB8165GPolyclonal Goat IgG, מחזור 1
CD8 Alexa Fluor 647BioLegend372906C8/144B, מחזור 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotechnologies1064135KP1, מחזור 1
חמור נגד עזים IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814חמור פוליקלונלי, מחזור 1
חמור נגד עכבר IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo פישר סיינטיפיקA32787חמור פוליקלונלי, מחזור 1
חמור נגד ארנב IgG Alexa Fluor Plus AF555תרמו פישר סיינטיפיקA32794חמור פוליקלונלי, מחזור 1
HoechstBiotium40046תווית גרעינית, מחזור 1
CD15BD Biosciences347420MMA, מחזור 2
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-82L26, מחזור 2
CD45 Phycoerythrin (PE)Novus BiologicalsNBP2-34528PE2B11 + PD7/26, מחזור 2
חמור נגד עכבר IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020חמור רב-שבטי, מחזור 2
Lumican BiotinR& D SystemsBAF2846Polyclonal Goat IgG, מחזור 2
Pan-cytokeratin Alexa Fluor 750Novus BiologicalsNBP2-33200AF750AE-1/AE-3, מחזור 2
Streptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificS11227N/A, מחזור 2
HoechstBiotium40046מחזור 2
<חזק>פתרונות
Blocking Buffer (מחזור 1)
Triton-X-100Sigma-AldrichT87870.3% בנפח
BSASigma-AldrichA45031% בנפח
Human BD Fc BlockBD Biosciences5642201% בנפח
1x PBS Gibco10010-02397.7% לפי נפח
<חזק>תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית #1 (מחזור 1)
(מחזור 1)ראה לעילהגדל לנפח לאחר הוספת נוגדנים
HoechstBiotium400461:5000
CD8 AF647BioLegend3729061:10
<תמיסת צביעת נוגדנים חזקה>עיקרית #2 (מחזור 1)
מאגר חוסם (מחזור 1)ראה לעילהגדל את הנפח לאחר הוספת נוגדנים
CD4  AF488מו"פ D SystemsFAB8165G1:10
Ag85BAbcamab43019/NA1:100
<חזק>תמיסת צביעת נוגדנים משנית #1 (מחזור 1)
חוסם מאגר (מחזור 1)ראה לעילטען עד לנפח לאחר הוספת נוגדנים
חמור נגד עזים AF Plus 488Thermo Fisher ScientificA32814/AB_27628381:100
חמור נגד ארנב AF פלוס 555תרמו פישר סיינטיפיקA32794/AB_27628341:100
חמור נגד עכבר AF פלוס 647תרמו פישר סיינטיפיקA32787/AB_27628301:50
<חזק>תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית #3 (מחזור 1)
חוסם מאגר (מחזור 1)ראה לעילהגדל לנפח לאחר הוספה נוגדנים
CD68 iF594Caprico Biotechnologies10641351:10
a-SMA DL755Novus BiologicalsNBP2-345221R/NA1:30
מאגר חוסם ללא BSA (מחזור 2) 
Triton-X-100Sigma-AldrichT87870.3% לפי נפח
Human BD Fc BlockBD Biosciences5642201% לפי נפח
1x PBS Gibco10010-02398.7% לפי נפח
<חזק>תמיסת צביעת נוגדנים ראשונית #4 (מחזור 2)
מאגר חוסם ללא BSA (מחזור 2)ראה לעילהגדל לנפח לאחר הוספת נוגדנים
CD15BD Biosciences3474201:30
Lumican BiotinR& D SystemsBAF28461:100
CD45 PENovus BiologicalsNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Scientific50-0202-821:10
Pan-Cytokeratin AF750Novus BiologicalsNBP2-33200AF7501:10
<חזק>תמיסת צביעת נוגדנים משנית #2 (מחזור 2)
מאגר חוסם ללא BSA (מחזור 2)ראה לעילהגדל לנפח לאחר הוספת נוגדנים
חמור נגד עכבר IgM AF488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_23408441:100
Strepavidin AF594Thermo Fisher ScientificS112271:200
קוד פתוח תוכנת חוסם חזק

מקורות

  1. Kels, J., et al. Anatomy and physiology of the retina: a comprehensive review. Retinal J. 21, 75-92 (2015).
  2. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  3. Tsang, S. H., Sharma, T. Retinal degeneration and gene therapy: present and future approaches. Prog Retin Eye Res. 67, 93-120 (2018).
  4. Gasparini, S. J., Favretto, F., La Greca, C. Biology of the retina: structure, function, and dysfunction. J Biomed Sci. 19 (3), 289-300 (2019).
  5. Masland, R. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  6. Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
  7. Hoon, M., et al. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  8. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
  9. Liu, W., et al. Retinitis pigmentosa: progress in molecular pathology and biotherapeutical strategies. Int J Mol Sci. 23 (9), 4883(2022).
  10. Hamel, C. Retinitis pigmentosa. Orphanet J Rare Dis. 1, 40(2006).
  11. Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Prog Retin Eye Res. 66, 157-186 (2018).
  12. O'Neal, T. B., Tripathy, K., Luther, E. E. Retinitis Pigmentosa. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
  13. Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), e112142(2014).
  14. Chang, B., et al. Two mouse retinal degenerations caused by missense mutations in the beta-subunit of rod cGMP phosphodiesterase gene. Vision Res. 47 (5), 624-633 (2007).
  15. Jae, S. A., et al. Electrophysiological and histologic evaluation of the time course of retinal degeneration in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Korean J Physiol Pharmacol. 17 (3), (2013).
  16. Strettoi, E., et al. Inhibition of ceramide biosynthesis preserves photoreceptor structure and function in a mouse model of retinitis pigmentosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18706-18711 (2010).
  17. Rösch, S., Johnen, S., Mataruga, A., Müller, F., Pfarrer, C., Walter, P. Selective photoreceptor degeneration by intravitreal injection of N-methyl-N-nitrosourea. Investig Ophthalmol Vis Sci. 55 (3), 1711-1723 (2014).
  18. Kellish, P. C., et al. Intravitreal injection of a rationally designed AAV capsid library in non-human primate identifies variants with enhanced retinal transduction and neutralizing antibody evasion. Mol Ther. 31 (12), 3441-3456 (2023).
  19. Molday, L. L., Cheng, C. L., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells and Subcellular Organelles by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. New York. (2019).
  20. Cheng, C. L., Djajadi, H., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  21. Girgis, S., Lee, L. R. Treatment of dry age-related macular degeneration: a review. Clin Exp Ophthalmol. 51 (8), 835-852 (2023).
  22. Lee, J. Y., et al. Superoxide dismutase 3 prevents early stage diabetic retinopathy in streptozotocin-induced diabetic rat model. PLoS One. 17 (1), e0262396(2022).
  23. Isiegas, C., et al. Intravitreal injection of proinsulin-loaded microspheres delays photoreceptor cell death and vision loss in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Investig Ophthalmol Vis Sci. 57 (8), 3610-3618 (2016).
  24. Doshi, R. R., Bakri, S. J., Fung, A. E. Intravitreal injection technique. Semin Ophthalmol. 26 (3), 104-113 (2011).
  25. Kim, H. M., Woo, S. J. Ocular drug delivery to the retina: current innovations and future perspectives. Pharmaceutics. 13 (1), 108(2021).
  26. Jones, B. W., Marc, R. E., Pfeiffer, R. L. Retinal Degeneration, Remodeling and Plasticity. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , University of Utah Health Sciences Center, Salt Lake City. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482309/"K482309 (2016).
  27. Roche, S. L., Wyse-Jackson, A. C., Byrne, A. M., Ruiz-Lopez, A. M., Cotter, T. G. Alterations to retinal architecture prior to photoreceptor loss in a mouse model of retinitis pigmentosa. Int J Dev Biol. 60, 127-139 (2016).
  28. Ladha, R., Caspers, L. E., Willermain, F., de Smet, M. D. Subretinal therapy: technological solutions to surgical and immunological challenges. Front Med. 9, 846782(2022).
  29. Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the eye: biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 269(2020).
  30. Bussing, D., et al. Pharmacokinetics of monoclonal antibody and antibody fragments in the mouse eye following intravitreal administration. J Pharm Sci. 112 (8), 2276-2284 (2023).
  31. Roberge, F. G., de Kozak, Y., Utsumi, T., Faure, J. P., Nussenblatt, R. B. Immune response to intraocular injection of retinal S-antigen in adjuvant. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 227 (1), 67-71 (1989).
  32. Ishikawa, T., Hokama, H., Katagiri, Y., Goto, H., Usui, M. Effects of intravitreal injection of tacrolimus (FK506) in experimental uveitis. Curr Eye Res. 30 (2), 93-101 (2005).
  33. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry: the red, brown, and blue technique. Vet Pathol. 51 (1), 42-87 (2014).
  34. Gargini, C., Terzibasi, E., Mazzoni, F., Strettoi, E. Retinal organization in the retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse: a morphological and ERG study. J Comp Neurol. 500 (2), 222-238 (2007).
  35. Haverkamp, S., Wässle, H. Immunocytochemical analysis of the mouse retina. J Comp Neurol. 424, 1-23 (2000).
  36. Haverkamp, S., Ghosh, K. K., Hirano, A. A., Wässle, H. Immunocytochemical description of five bipolar cell types of the mouse retina. J Comp Neurol. 455, 463-476 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Recoverin
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.