מאמר שיטה

ב Vivo הדמיה של פעילות עצבית בזבובים בוגרים של דרוזופילה לא מורדמת

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68332

⸱

20 ביוני 2025

 , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Georgetown University

במאמר זה

סיכום

מחסום משמעותי לחקר הפעילות התאית במהלך תהליכים קוגניטיביים כמו למידה וזיכרון הוא השימוש בחומרי הרדמה להכנת הדמיה in vivo . הרדמה פוגעת בזיכרון לטווח קצר ובקוגניציה במספר מודלים, כולל דרוזופילה. מחקר זה מציג שיטה ייחודית להכנת דרוזופילה בוגרת להדמיה in vivo ללא הרדמה.

תקציר

הדמיה in vivo חיונית לחקר נוירוביולוגיה בדרוזופילה מכיוון שהיא מאפשרת הדמיה בזמן אמת של פעילות עצבית, התפתחות ופלסטיות בתוך הזבוב השלם והמתנהג. טכניקה זו מספקת תובנות שלא יסולא בפז לגבי תהליכים דינמיים, כגון תפקוד סינפטי וקישוריות מעגלים, שלא ניתן ללכוד במדויק בתכשירים קבועים או ex vivo. רוב הטכניקות להכנת זבובים להדמיה in vivo כוללות הרדמה של הזבובים זמן קצר לפני הדמיה תפקודית. עם זאת, עדויות נרחבות מוכיחות כי הרדמה משפיעה על מספר תהליכים קוגניטיביים ופיזיולוגיים. מסיבה זו, הדמיה in vivo של Drosophila melanogaster בוגר ללא שימוש בחומרי הרדמה במהלך הכנת בעלי חיים היא גישה מאתגרת אך רצויה מאוד. הפרוטוקול המוצג כאן כולל שיתוק ראשם של זבובים ערים על ידי שאיבת הפרובוסקיס לתוך צינור מתכת קטן המחובר למערכת ואקום. בזמן שהראש מקובע, הזבוב מוכן להדמיה תפקודית ללא צורך בהרדמה. פרוטוקול זה מהיר וניתן לשחזור, ומבטיח שלא ייגרם נזק לזבוב. היתרון העיקרי של שיטה זו טמון בהימנעות משימוש בהרדמה, ובכך מביא בחשבון את ההשפעות המורכבות הפוטנציאליות של הרדמה על הפעילות העצבית. שיטה זו היא גם משתלמת וגם ניתנת להתאמה גבוהה, תוך שימוש בכלים זולים הניתנים להתאמה אישית. הוא מאפשר הדמיה מוצלחת של זבובים חיים, ולוכד שינויים מהירים בפעילות העצבית הקשורה לתהליכים קוגניטיביים דינמיים.

מבוא

ההתקדמות האחרונה בדיווחי פעילות מקודדת גנטית חוללה מהפכה במדעי המוח על ידי מתן תובנות ספציפיות מאוד בזמן אמת על פעילות עצבית. מדווחים אלה, כגון חיישני סידן או מתח 1,2,3,4,5,6,7,8,9, מאפשרים לחוקרים לעקוב אחר האותות החשמליים והכימיים בתוך נוירונים בדיוק זמני ורזולוציה מרחבית חסרי תקדים. על ידי מתן אפשרות לניטור של נוירונים בודדים ספציפיים לרשתות עצביות על פני אזורי מוח שונים, כלים אלה העמיקו את ההבנה שלנו כיצד דפוסי ירי עצביים קשורים לתהליכים קוגניטיביים כמו למידה, זיכרון או קבלת החלטות 10,11,12,13,14.

כדי לנצל את האינדיקטורים המקודדים גנטית הללו, החוקרים פיתחו שיטות מתקדמות להכנת אורגניזם המודל שלהם להדמיה in vivo. הדיווח הראשון על פלסטיות עצבית על ידי הדמיה תפקודית in vivo, המכונה לעתים קרובות "עקבות זיכרון", התגלה באונה האנטנה של דבורי הדבש בעקבות התניה מעוררת תיאבון של חוש הריח15. תגלית זו היוותה השראה למחקר באורגניזם המודל הרב-תכליתי מבחינה גנטית, Drosophila melanogaster, מה שהוביל לפיתוח טכניקות הדמיה חדשניות in vivo 10,16,17,18.

דרוזופילה משמשת כמודל מצוין להבנת למידה וזיכרון בשל יכולתה החזקה ליצור זיכרונות ריח באמצעות התניה קלאסית, כאשר ריח (הגירוי המותנה-CS) נקשר לגירוי מרתיע או מתגמל (הגירוי הבלתי מותנה-US)19,20,21,22. בדרוזופילה, ריחות מיוצגים בדלילות בגוף הפטרייה (MB)23, אזור מוח קריטי לזיכרון אסוציאטיבי המורכב מכ-2,000 נוירונים של תאי קניון (KCs) לכל חצי כדור24. מידע על חוש הריח מועבר מהגביע לאונות ה-MB באמצעות אקסוני KC, המתקבצים יחד ליצירת האונות. במהלך התניה של חוש הריח, ה-US, כגון שוק חשמלי או תגמול סוכר, מועבר לאונות ה-MB באמצעות נוירונים דופמינרגיים מובהקים (DANs): נוירוני PPL1 לגירויים מרתיעים ונוירוני PAM לגירויים מתגמלים 25,26,27,28,29,30 . רכישת זיכרון נחשבת כרוכה בהפעלה בו-זמנית של מסלולי CS ו-US, וכתוצאה מכך עלייה סינרגטית ב-AMP מחזורי (cAMP), המקודד את הזיכרון31,32. תהליך זה גורם לפלסטיות בסינפסות KC→MBON, ומשנה את המשקל הסינפטי שלהן 11,12,13,33,34,35,36,37. פלסטיות בתיווך DAN מניעה בסופו של דבר את נוירוני פלט גוף הפטריות (MBONs) לעורר התנהגות גישה או הימנעות כלפי הריח הנלמד34. המודל הנוכחי מציע שזרימת המידע מ-KCs ל-MBONs הופכת את ייצוג הריח מזהות ריח ב-KCs למידע מופשט יותר ב-MBONs, כגון ערכיות של ריח על סמך ניסיון קודם34,38. בניגוד ל-KC, ל-MBONs יש תגובות ריח מכוונות באופן רחב; כל ריח נתון מביא לתגובה לרוב ה-MBONs39. כוונון הריח של ה-MBONs משתנה על ידי פלסטיות סינפטית ומשתנה באופן משמעותי בין זבובים בודדים, מה שמרמז על כך ש-MBONs משנים את תגובתם לריחות על סמך ניסיון. ישנם 34 MBONs, כאשר רוב רשת ה-MBON מחולקת לכאורה לשתי מחלקות יריבות הדדיות המניעות כל אחת מהגישות של התנהגות הימנעות34. מסיבה זו, נעשה שימוש נרחב בהדמיה in vivo לחקר אחזור זיכרון על ידי הקלטה ב-MBONs שונים.

שיטות מוקדמות להדמיה תפקודית in vivo כוללות ביצוע ניתוחים להסרת חלק מהקוטיקולה מהחלק העליון של קפסולת הראש, שכוסה לאחר מכן בחתיכה קטנה של ניילון נצמד18. בעוד שזה סימן את תחילתה של הדמיה in vivo בדרוזופילה, מאז חלה התקדמות משמעותית בטכניקות הכנת זבובים והעברת גירויים מתחת למיקרוסקופ כדי לחקור תהליכים כמו למידה וזיכרון. עם זאת, גם כיום, רוב הטכניקות להכנת זבובים להדמיה in vivo כרוכות בהרדמת הזבובים. פרקטיקה זו מציבה אתגרים, שכן ישנן ראיות נרחבות - ותחום מחקר שלם - המדגים כיצד הרדמה משפיעה על הזיכרון, כמו גם על תהליכים קוגניטיביים ופיזיולוגיים אחרים. לדוגמה, נערך מחקר כדי להבין את ההשפעות של חומרי הרדמה שונים הנמצאים בשימוש נפוץ מאוד בסביבת המעבדה (פחמן דו חמצני, איזופלורן, סבופלורן והלם קור). הם מצאו שככל שהחשיפה להרדמה ארוכה יותר, הייתה עלייה בזמן ההחלמה, שינויים בפעילות התנועה, פוריות נמוכה יותר, ועשויה להשפיע על מאגרי המים והשומנים40. בנוסף, דווח כי מתן הרדמה בהלם קר מיד לאחר האימון יכול לשבש לחלוטין את הזיכרון לטווח קצר21. ממחקר ראשוני זה, ידוע כעת כי בדרוזופילה יש זיכרון לא מגובש (זיכרון רגיש להרדמה) שמתפרק תוך 6-8 שעות, וצורה של זיכרון מאוחד (זיכרון עמיד להרדמה) שנוצר בהדרגה לאחר הלמידה ויכול להימשך בסביבות 24 שעות41. על סמך זה, הרדמה יכולה להשפיע על העיבוד הקוגניטיבי ועל פעילות הנוירונים, מה שבסופו של דבר מאפשר ביטוי זיכרון תקין.

השפעות ההרדמה על הזיכרון אינן מוגבלות לדרוזופילה. מחקרים רבים בבני אדם ויונקים אחרים הראו ממצאים דומים. לדוגמה, מחקר חתך שנעשה בבית חולים אוניברסיטאי מצא כי הזיכרון לטווח קצר הופחת באופן משמעותי בחולים 24 שעות לאחר הרדמה כללית42. מחקר אחר שנעשה בעכברים מצא כי הרדמה כללית הפחיתה באופן משמעותי את דינמיקת הזינוק, ניתקה הרכבים תאיים ושינתה את הדינמיקה של עמוד השדרה באזור CA1 של ההיפוקמפוס, אזור חשוב במוח המעורב בלמידה וזיכרון ביונקים43. כדי להתגבר על קשיים אלה, מטרת מחקר זה היא לספק פרוטוקול חדשני המבטל את השימוש בהרדמה במהלך הכנת הזבוב להדמיה in vivo , ומשאיר את גופו של הזבוב חופשי לחלוטין. גישה זו מאפשרת הקלטות מדויקות יותר של פעילות עצבית, משפרת את בריאות הזבובים להקלטות ארוכות יותר, ומבטלת השפעות מבלבלות אפשריות של הרדמה בהשוואה לגישות אחרות. פרוטוקול זה נועד לתעד פעילות של נוירונים בדרוזופילה, ובמיוחד להסתכל על האופן שבו נוירונים מפגינים פלסטיות במהלך ואחרי חווית הלמידה. עם זאת, פרוטוקול הדיסקציה הוא רב תכליתי וניתן להתאים אותו ליישומים שונים במחקר הדמיה חיה.

פרוטוקול

פרטי הציוד והריאגנטים המשמשים למחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. זבובי פירות טרנסגניים, Drosophila melanogaster

  1. הכלאה של בתולות נקבות וזבובים זכרים (הגדלים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בלחות יחסית של 60% במחזור אור/חושך של 12 שעות) הנושאים את מבני ה-Gal4 וה-UAS הרצויים, בהתאמה, כדי לייצר זבובים שבהם נוירונים ספציפיים מעניינים מבטאים את מדווח הפעילות המקודד גנטית הרצוי.
  2. הזדקן את צאצאי הצלב הנ"ל עד שהם נמצאים בטווח של 2-5 ימים לאחר האקלוזיה. ניתן להשתמש גם בזכרים וגם בנקבות, מכיוון שתאי ההדמיה מיוצרים בהתאמה אישית כך שיתאימו לשני המינים.

2. בניית שואב (זרימת עבודה של 5 דקות)

  1. חותכים צינורות סיליקון 6 מ"מ לאורך של כ-8 סנטימטרים באמצעות סכין גילוח. קחו קצה פיפטה p200 וחתכו כמחצית ממנו באמצעות סכין גילוח עבור הפיה (איור 1A). הכנס את הקצה החתוך לצינור. חותכים קצה פיפטה p1000 מספיק כדי שזבוב יוכל לנוע דרכו.
  2. קח חתיכת כותנה קטנה וכסה את צינור הסיליקון. זאת כדי למנוע מהזבוב לשאוף לתוך פיו של הנסיין. הנח את קצה p1000 החתוך על הצינור המכוסה כותנה.
  3. כסו את קצה הפיפטה p1000 בקצה פיפטה p200 חדש. כדי לקבוע את האורך המתאים לחיתוך קצה הפיפטה p200, ראשית, הסר את קצה הפיפטה p200 ושאף זבוב לתוך קצה הפיפטה p1000. חבר מחדש את קצה p200. נשפו בעדינות והקישו על הזבוב כדי להזיז אותו הכי רחוק שהוא יכול להגיע לקצה p200.
    1. ברגע שהוא כבר לא יכול להתקדם הלאה, השתמשו במיקרוסקופ מנתח כדי לסמן את הנקודה שבה ראש הזבוב מסתיים, ובית החזה מתחיל, באמצעות סכין גילוח. שאפו את הזבוב בחזרה לקצה הפיפטה p1000 וחתכו את קצה הפיפטה p200 במיקום המסומן.

3. בניית שואב פרובוסקיס צינורות מתכת (זרימת עבודה של 5 - 10 דקות)

  1. חותכים את צינורות המתכת ההיפודרמיים בגודל 22X לגודל הרצוי (~10 ס"מ) באמצעות כלי Dremel ולהב מסור יהלום. קצוות מבריקים של צינורות מתכת עם גלגל חיתוך Dremel 420 ליצירת פתח חלק ונקי. פתח זה יתאים לחרטום הזבוב.
  2. עטפו צינורות סביב צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל כדי לקבל את הצורה המעוקלת הרצויה (איור 1A). העקומה צריכה ליצור צורה דמוית וו שתאפשר לגוף הזבוב להיות בקו אחד עם החדר.
  3. חותכים חתיכה (באורך ~7 ס"מ) של צינורות מתכת היפודרמיים בגודל 12TW באמצעות כלי Dremel (צינור זה צריך להתאים לקצה פיפטה של 2 מיקרוליטר). קח קצה פיפטה של 2 מיקרוליטר וחתוך את הקצה בעזרת סכין גילוח כך שיתאים לצינורות המתכת בגודל 22X. הכנס את צינור המתכת הגדול יותר לקצה השני של קצה הפיפטה של 2 מיקרוליטר.
  4. מערבבים יחד כמות קטנה של שרף ומקשה של דבק אפוקסי. מרחו את התערובת במקום שבו צינור המתכת הקטן פוגש את קצה הפיפטה ובמקום שבו צינור המתכת הגדול יותר מתחבר לקצה הפיפטה. הניחו לדבק להתרפא לחלוטין למשך הלילה לפני חיבור המכלול למחזיק במיקרומניפולטור. התאם את הזווית לפי הצורך.

4. בניית פיפטה להעברת הלם וריח לניסויי למידה וזיכרון תחת המיקרוסקופ (זרימת עבודה של 10 דקות)

  1. בעזרת כלי יהלום Dremel, חותכים 1 מ"ל בפיפטת זכוכית של 1/100 בסימן של 3 מ"ל. חותכים חתיכה מלבנית קטנה של יריעת אקריליק במידות 24.5 מ"מ על 8 מ"מ ועובי של 1/8 אינץ '.
    הערה: לחלופין, ניתן להדפיס יצירה זו בתלת מימד כדי להתאים טוב יותר לרשת ההלם (ניתן למצוא את קבצי stl ו-obj בקובץ משלים 1 וקובץ משלים 2).
  2. חותכים את רשת ההלם הנחושת כך שתתאים לחתיכת האקריליק המלבנית מהשלב הקודם. הלחמו שני חוטי חשמל בקצוות מנוגדים של רשת הנחושת. הניחו את רשת הנחושת לתוך חתיכת האקריליק המלבנית ועקמו אותה כך שהבטן והרגליים של הזבוב יתאימו לרשת ההלם (איור 1I).
  3. הדביקו את רשת הנחושת לפלסטיק המלבני בעזרת פיסת סרט חשמלי. בעזרת אקדח דבק חם, חבר היטב את פיפטת הזכוכית לרשת ההלם, וודא שהיא ישרה וממורכזת כהלכה. באמצעות מולטימטר דיגיטלי, ודא שרשת הנחושת פועלת כדי לספק ביעילות זעזוע לרגלי הזבוב.

5. הרכבת נגד פלטינה להמסת דבק (חומצה מיריסטית) (זרימת עבודה של 20 דקות)

  1. בעזרת חשפניות תיל, חותכים 200 מ"מ של חוטים לאורך הרצוי ומפשיטים קצה אחד של שני החוטים. חותכים כ- 60 מ"מ מחוט הפלטינה (אורך זה אמור להספיק ליצירת לולאה שתשמש להמסת הדבק).
  2. בעזרת אקדח הלחמה, הלחמו קצה אחד של חוט הפלטינה לחוט החשמל. העבירו צינור לכווץ חום דרך חוט החשמל והשתמשו במבער בונסן כדי לכווץ את הצינור על החוט כדי לכסות את החלקים המולחמים.
  3. חותכים שתי חתיכות של 20 מ"מ מצינור הגומי ID 2.55 מ"מ ומעבירים אותן דרך חוט הפלטינה (שמור על חוט הפלטינה ישר כדי להקל על תהליך זה). השתמש באקדח ההלחמה כדי להלחם את הקצה השני של חוט הפלטינה לחוט החשמל השני. השתמש בצינור כיווץ חום חדש כדי לכסות את החלק המולחם החדש הזה.
  4. הסר את הבוכנה של מזרק BD tb 1 מ"ל והעביר את החוטים מהשלבים הקודמים דרך הקנה. הפלטינה צריכה לבלוט מקצה קנה המזרק. לא אמורים להיות חוטים חשופים, וצינורות הגומי הקטנים צריכים לכסות את חוט הפלטינה למעט עד הסוף.
  5. בעזרת חשפנית תיל, הפשיטו כמות קטנה משני הקצוות האחרים של חוטי החשמל. בעזרת אקדח הלחמה, הלחמו כל חוט לתקע בננה עד שהוא מחובר היטב.
  6. השתמש בדבק אפוקסי כדי להדביק את החלק העליון והבסיס של חבית המזרק כדי להדביק את החוטים והחבית יחד; זה ימנע מתח לחוטים בתוך המזרק ויבטיח חיים ארוכים יותר לנגד. תן לדבק להתרפא בן לילה.
  7. חבר את הנגד המוגמר לאספקת החשמל DC.

6. בניית תא הקלטה - (זרימת עבודה של יומיים)

  1. בעקבות קובץ משלים 3, חתך בלייזר יריעת שיים שחורה (עובי 0.0125 אינץ'). ניתן לשנות את גודל הפתח באמצע החדר כך שיתאים לגודל הזבובים (הגודל בקובץ מתאים בדרך כלל לנקבות ולזכרים).
  2. קח שקופית מיקרוסקופ זכוכית שתשמש כבסיס החדר. מערבבים שרף ואפוקסי יחד. קח את תא האקריליק השחור ובעזרת דבק אפוקסי, חבר מגנטים של ניאודימיום 3 מ"מ על 2 מ"מ על כל ארבע הפינות. מומלץ להדביק מגנט אחד בכל פעם ולהחזיק אותו בזמן שהדבק מתרפא בעזרת מהדק נייר.
  3. הנח שני מגנטים חדשים על כל אחד מהמגנטים שהודבקו על החדר בעבר. בעזרת אפוקסי, הדביקו את המגנט האחרון המחובר למגלשת זכוכית והשתמשו במהדק נייר כדי להחזיק אותו במקומו בזמן האוצרות.
    הערה: לאחר אוצר הדבק, החדר הושלם, וניתן להוסיף מגנטים נוספים כדי להתאים את גובה החדר לניסויים. תיק משלים 4, תיק משלים 5 וקובץ משלים 6 מציגים את תא ההקלטה המורכב.

7. פרוטוקול דיסקציה in vivo ללא הרדמה - (זרימת עבודה של 5 - 7 דקות)

  1. הסר את קצה הפיפטה p200 מהשואב. הכנס את השואב לבקבוקון ושאף זבוב בודד לקצה הפיפטה p1000. החזר את קצה הפיפטה p200 בחזרה לשואב. נשפו בעדינות והעבירו את השואב כך שהזבוב ישותק בחלק העליון של קצה הפיפטה p200, בראש.
  2. הנח את תא החיתוך על מחזיק המניפולטור. חבר את הוואקום לצינור המחזיק זבוב והתאם את רמת הזרימה לפי הצורך (~500 מ"ל/דקה). השתמש במחבר מהיר כדי לחבר-לנתק את השואב בקלות ובמהירות (איור 1A).
  3. הזז את צינור המתכת הוואקום כדי למרכז אותו בשדה הראייה כאשר מסתכלים דרך המיקרוסקופ. ודא שהתא ממוקם נכון כך שהוא יעבור ישירות על גבי צינור המתכת כשהוא מוכן להדביק את הזבוב. בעדינות, שאפו את החוטם של הזבוב לתוך מחזיק הוואקום (איור 1A).
  4. ברגע שהזבוב נמצא במיקום הנכון, הזז את המניפולטור כך שראש הזבוב מיושר עם פתח החדר.
  5. הפעל את ספק הכוח DC. יש להגדיר את הזרם לטווח שבין 0.40-0.50 אמפר. זרמים גבוהים יותר עלולים לגרום לחומצה המיריסטית להימס עד לנקודה שבה הצמיגות שלה הופכת נמוכה מדי, מה שמגביר את הסיכון להתפשטות הדבק על ראשו של הזבוב.
  6. באמצעות התנגדות הפלטינה, הדביקו את צידי העיניים ובית החזה לתא באמצעות חומצה מיריסטית מותכת (איור 1B). כדי למנוע דבק על ציפורן הראש, השתמש בכמה שפחות דבק, במיוחד בעת הדבקת צידי העיניים.
  7. לאחר הדבקת העיניים ובית החזה, נתק את צינור הוואקום והשתמש במניפולטור כדי להסיר את תא ההקלטה מצינור הוואקום. הפוך את החדר והשתמש בהתנגדות הפלטינה כדי להדביק את הפרובוסקיס מלמטה (איור 1C). הדבקת העיניים מלמטה היא אופציונלית ויכולה לעזור לשמור על הזבוב במקומו במהלך הדיסקציה, אך אין בכך צורך.
  8. לאחר שהכל מודבק, כבה את ספק הכוח DC, סובב את החדר זקוף והצמד אותו לבסיס צד הזכוכית. חתכו פיסת סרט קטנה באמצעות מספריים והניחו אותה ממש לפני ומאחור של ראש הזבוב (איור 1D).
  9. סובב את החדר כך שהראש פונה לנסיין ב 90. בעזרת מחט ניתוח, עשו חתך אנכי לאורך צידי העיניים (איור 1E). סובב את החדר כך שהוא ממוקם אופקית. בעזרת מחט הניתוח, חתכו את הציפורן (איור 1E).
    הערה: ודא שניתן להרים את "חלון" הציפורן שזה עתה נוצר באמצעות מחט הניתוח. אם הוא מתרומם ללא כל התנגדות, החזר את מחט החיתוך למכסה שלה. לא נעשה שימוש במי מלח בשלבים 13 ו-14 כדי למנוע שבירת אור, שעלולה לחסום ראייה ברורה במהלך החיתוכים.
  10. הוסיפו 100 מיקרוליטר של מי מלח לראש הזבוב (איור 1F). בעזרת מלקחיים חדים, הסר בזהירות את החלון (איור 1G). בעזרת המלקחיים החדים, הסר בזהירות את כל השומן או קנה הנשימה שנותרו. המוח אמור להיות מוכן להדמיה עכשיו (איור 1H-1J).

8. ויזואליזציה של פלסטיות הנגרמת על ידי למידה באמצעות מיזוג ריח מרתיע (זרימת עבודה של 20 דקות)

  1. בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזר ומטרת טבילה במים, הניחו את הזבוב המוכן על במת המיקרוסקופ. לחלופין, השתמש במצלמה עם עדשת מאקרו כדי להתמקד בתנועה, ולוודא שהזבוב בריא ונעים.
  2. התאם את המיקום של רשת ההלם/פיפטת הריח באמצעות מיקרומניפולטור כך שהזבוב יושב על רשת ההלם.
    הערה: הזבוב עדיין אמור להיות מסוגל לנוע בחופשיות מכיוון שרשת ההלם רק נוגעת ברגליים ומעט בבטן (הזבוב אמור להיות מסוגל להסיר את רגליו ובטנו מהרשת אם הוא נסוג). יש לכוון את פיפטת העברת הריח לעבר האנטנות של הזבוב.
  3. באמצעות כפתור כוונון Z הגס, סרקו דרך ציר ה-Z של המוח ואתרו את אזור העניין במוח. התאם את גודל המסגרת ל-512 x 512 פיקסלים. יש להתאים את תדר הסריקה למהירות הרצויה - עם מינימום של 2 הרץ. לבסוף, הגדר את משך ההקלטה.
  4. התחילו להקליט את תא העצב המעניין באמצעות מערכת העברת ריחות מותאמת אישית או מסחרית, והתחילו אספקת ריח "טרום-אימון" בו-זמנית (איור 2C). הגדר את ההקלטה ל-2 דקות. מצגת הריח לפני האימון מתחילה בהקלטת תגובות לדופק ריח ראשון של 5 שניות (CS-) ואחריו דופק ריח של 5 שניות (CS+) עם מרווח בין גירויים של 30 שניות.
  5. לאחר איסוף תגובות לפני האימון, המתן 5 דקות לפני התחלת פרוטוקול אימון במערכת העברת הריחות. בדוגמה זו, רק ה-CS+ הוצג במהלך ההדרכה. ריח CS+ מוצג למשך דקה אחת החל מ-30 שניות לאחר הפעלת מערכת אספקת הריחות. ממריץ הזעזועים מתוכנת לספק בו זמנית 12, 90 וולט זעזועים בזמן הצגת הריח.
  6. לאחר האימון, יש להמתין 5 דקות או 15 דקות לפני קבלת תגובות לאחר האימון. רשום תגובות לאחר האימון באותו אופן שבו נרשמו תגובות לפני האימון בשלב 6. שמור את כל הקבצים בתבנית המתאימה לניתוח תמונות לאחר מכן.

9. ניתוח תמונות

  1. כדי לנתח הקלטות, צייר אזור עניין (ROI) סביב אזור הנוירון. זה צריך להיות מדויק ככל האפשר כדי להגביל את השפעת הקרינה ברקע.
  2. השתמש בכלי המדידה כדי לחלץ נתוני עוצמת הקרינה הממוצעת בתוך ההחזר על ההשקעה עבור כל פריים של ההקלטה. ייצא נתונים אלה כקובץ CSV.
  3. פתח את הנתונים ב-MATLAB, או בכל תוכנית ניתוח נתונים כדי לחשב ערכי ΔF/Fo עבור כל עקבות ריח. שלבו את הנתונים כדי לקבל את ממוצע ההקלטות הכוללות של זבובים בודדים של ΔF/Fo וצרו גרף של עקבות תגובת הריח הממוצעת לפני ואחרי האימון (איור 2E,F).

תוצאות

כאן, הדמיה in vivo של דרוזופילה בוגרת ללא הרדמה משמשת לחקירת התניה של חוש הריח המעורר פלסטיות בנוירון פלט גוף פטריות מאופיין היטב (MBON γ2α'1)12. אינדיקטור הסידן GCaMP6f2, יחד עם החלבון הפלואורסצנטי האדום TdTom, מתבטאים בתא עצב פלט MB, שהדנדריטים שלו מעצבבים את התא של אונות MB γ ו-α' והוא ממוקד גנטית ל-MBON γ2α'1 באמצעות קו ה-Gal4 המפוצל MB077C34 (איור 2A,B).

כדי לצפות בפלסטיות לאחר מיזוג ריח מרתיע, הזבוב מונח מתחת למיקרוסקופ קונפוקלי, כאשר בטנו ורגליו מיושרות לאמצע רשת ההלם ופיפטת העברת הריח מכוונת לעבר האנטנה של הזבוב. ראשית, תגובות ריח סידן נרשמו לפולס של 5 שניות של 4-מתיל ציקלוהקסנול (MCH) ואחריו דופק של 5 שניות של 3-אוקטנול (OCT), מופרד על ידי מרווח בין גירוי של 30 שניות. חמש דקות לאחר מכן, הזבובים אומנו על ידי הצגה בו-זמנית של דופק OCT (CS+) של דקה אחת יחד עם זעזועים של 12, 90 וולט. לוח זמנים אסוציאטיבי זה מייצר זיכרון התנהגותי מרתיע חזק. לבסוף, 5 דקות ו-15 דקות לאחר ההתניה תועדו תגובות סידן ל-MCH ו-OCT כמו לפני האימון. MBON γ2α'1 מגיב בעוצמה על ידי מעברי סידן הן ל-MCH והן ל-OCT לפני ההתניה (איור 2D-F). עם זאת, בהתאם לממצאים קודמים12, 5 דקות לאחר התניה תגובות סידן ל-CS+ (OCT) מדוכאות לחלוטין (איור 2D-F). בנוסף, התגובות ל-CS- (MCH), היו מוגברות באופן משמעותי. רבע שעה לאחר האימון הדגימה תוצאות דומות, שכן תגובת הסידן ל-CS+ הייתה מדוכאת באופן משמעותי ו-CS הוגבר. התוצאות האלה מצביעות על כך שעקבות הזיכרון שנצפו בשני הריחות נמשכים לפחות 15 דקות (איור 2D-F). תגובות אלה כומתו באמצעות תגובת הריח הממוצעת במהלך פעימת 5 שניות והושוו בתוך הזבוב. ניתן להמחיש את השינויים האלה בתגובות הריח גם על ידי ייצוג פסאודו-צבעוני של השינוי באימון הקרינה של GCaMP6 לפני ואחרי האימון המרתיע (איור 2E). לעומת זאת, הרדמת הזבוב במהלך ההכנה מראה פלסטיות מופחתת הן ל-CS+ והן ל-CS-. רק דיכאון חלקי ל-CS+ נצפה בבעלי חיים מורדמים, מכיוון שתגובות לאחר האימון עדיין קיימות. בנוסף, תגובות CS אינן שונות באופן משמעותי לאחר אימון (איור 2G,H). כדי להתבונן בזה טוב יותר, חישבנו את הפלסטיות המושרית כיחס של CS+/CS- והראינו שזבובים שאינם מורדמים מראים פלסטיות מוגברת באופן משמעותי בהשוואה לחיות מורדמות (איור 2I). תוצאות מייצגות אלו מצביעות על כך שפרוטוקול זה מתאים לחקר למידה וזיכרון תחת מיקרוסקופ ומבטיח את בריאות הזבוב במהלך הדמיה מנוירונים לאורך זמן. פרוטוקול זה הוא רב תכליתי מספיק וניתן ליישם אותו על סוגים אחרים של הדמיה in vivo ונוירונים אחרים מעניינים.

figure-results-1
איור 1: הכנת הדמיה in vivo של דרוזופילה ללא שימוש בהרדמה. (A) פאנל עליון: תרשים הממחיש את השלבים הכרוכים בהכנת אספירטור. פנל תחתון: תרשים המציג את התא המוחזק במיקרומניפולטור במהלך מיקום הזבוב. הפרובוסקיס של הזבוב ממוקם בפתח צינורות מתכת המחוברים לוואקום במהירות של 500 מ"ל לדקה באמצעות שואב. לאחר מכן החדר ממוקם מעל הזבוב. (B) צידי העיניים ובית החזה מודבקים בחומצה מיריסטית באמצעות נגד פלטינה מותאם אישית. (C) חוטם הזבוב מוסר מצינור המתכת, והתא הפוך כדי לאפשר להדביק את הפרובוסקיס למקומו, ובכך למזער את התנועה במהלך ההקלטות. (ד) התא מחובר לבסיס מגלשה מזכוכית. סרט מוחל על החלק העליון של החדר, מכסה את האנטנות, ועל הצד האחורי כדי למנוע דליפת מי מלח. (E) שני חתכים אנכיים נעשים לאורך הקוטיקולה ליד העיניים המורכבות, ואחריהם חתך שלישי לאורך הקוטיקולה ליד בית החזה, מה שיוצר "חלון" למוח. (F) בין 100 ל-200 מיקרוליטר של מי מלח מתווספים לראש הזבוב באתר החתכים. (G) חלון הקוטיקולה מורם, נמשך ומנותק באמצעות מלקחיים חדים ועדינים כדי לחשוף את המוח. (H) רקמות שומן וקנה הנשימה מוסרות כדי לאפשר ויזואליה ברורה של תאי מוח תחת המיקרוסקופ. (I) הזבוב המוכן ממוקם מתחת למיקרוסקופ וממוקם כשגופו מיושר על גבי רשת ההלם. (J) תמונה פסאודו-צבעונית המציגה את דפוס הביטוי של MBON γ2α′1. אזור העניין מתואר בקו מקווקו המקיף את הסוכה הדנדריטית. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: פלסטיות הנגרמת על ידי למידה ב-MBON γ2α′1 לאחר התניה של חוש הריח המרתיע. (A) דפוס ביטוי של מנהל ההתקן MB077C-splitGal4 המבטא GCaMP. המוחות נותחו והוכתמו באנטי-GFP והוכתמו באנטי-NC82. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (B) תמונה פסאודו-צבעונית של MBON γ2α′1 המדגישה את גוף התא, תהליך הרחבה וסוכת דנדריטית. האזור הדנדריטי מייצג את האזור שממנו נאספו תגובות הסידן. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (C) סכמטי של פרוטוקול האימון המרתיע. הזבובים נחשפו לפולסים של 5 שניות של MCH ו-OCT עם 30 שניות של אוויר נקי ביניהם. לאחר מרווח של 5 דקות, זבובים אומנו לשייך OCT ל-12 מכות חשמל של 90 וולט. הקלטות של תגובות סידן ל-MCH ו-OCT בוצעו 5 דקות ו-15 דקות לאחר האימון. (D) עקבות תגובת ריח ל-MCH (פאנל עליון) ו-OCT (פאנל תחתון) מוצגים לפני האימון, וב-5 דקות ו-15 דקות לאחר האימון. פסים שחורים עבים מציינים את עיתוי הצגת הריח. (E) תמונות פסאודו-צבעוניות של הסוכה הדנדריטית של MBON γ2α′1 לפני האימון, ו-5 דקות ו-15 דקות לאחר האימון, בתגובה הן ל-MCH והן ל-OCT. חיזוק הקרינה נצפה עבור CS- (MCH), בעוד שהפלואורסצנציה מבוטלת עבור CS+ (OCT). סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (F) תגובת הריח הממוצעת ל-MCH מוגברת באופן משמעותי לאחר 5 דקות ו-15 דקות לאחר האימון, בעוד שהתגובות ל-OCT (CS+) מדוכאות באופן משמעותי. מבחן זוגי Wilcoxon לא פרמטרי, N = 12. (G) עקבות תגובת ריח ל-MCH (פאנל עליון) ו-OCT (פאנל תחתון) מוצגים עבור זבובים מורדמים לפני ו-5 דקות לאחר האימון. פסים שחורים עבים מעידים על העברת ריח. (H) בחיות מורדמות, תגובות הריח הממוצעות ל-MCH אינן מראות חיזוק משמעותי לאחר האימון, והתגובות ל-OCT מציגות דיכוי חלקי בלבד בהשוואה לחיות שלא עברו הרדמה. (I) הפלסטיות הנגרמת על ידי אימון, המחושבת כיחס CS+/CS-, נמוכה משמעותית בזבובים מורדמים בהשוואה לאלה שהוכנו ללא הרדמה. מבחן זוגי Wilcoxon לא פרמטרי, N = 8-12. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תיק משלים 1: Grid_holder (STL). STL של הרכיב המעוצב בהתאמה אישית המשמש להחזקת רשת החשמל. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: Grid_holder (OBJ). קובץ OBJ של הרכיב המעוצב בהתאמה אישית המשמש להחזקת רשת החשמל. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

תיק משלים 3: Chamber_LaserCut. קובץ Adobe Illustrator המשמש לחיתוך לייזר של הרכיב העליון של תאי ההקלטה עבור זבובים זכרים ונקבות כאחד. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

תיק משלים 4: Recording_chamber (STL). STL של תא ההקלטה המעוצב בהתאמה אישית. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

תיק משלים 5: Recording_chamber (OBJ). קובץ OBJ של תא ההקלטה המעוצב בהתאמה אישית. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

תיק משלים 6: Recording_chamber_animation. סרטון MP4 המציג אנימציה של תא ההקלטה המורכב. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

הבנת המעגלים העצביים מאחורי למידה וזיכרון היא מטרה מרכזית בתחום מדעי המוח. ערכת הכלים הגנטית הזמינה בדרוזופילה, בשילוב עם הפשטות והרבגוניות של בדיקות התנהגותיות, הופכים אותה לאורגניזם מודל אידיאלי לחקר תהליכים אלה. מחקרים שפורסמו ממעבדות שונות תיארו פרוטוקולים שונים להכנת זבובים להדמיה תפקודית ללא שימוש בהרדמה44,45. עם זאת, פרוטוקולים אלה משתנים מאוד ולעתים קרובות מסתמכים על כלים מיוחדים ומותאמים אישית עם הדרכה מוגבלת כיצד לבנות או להשתמש בהם. בפרוטוקול זה מוצגת שיטה לביצוע הדמיה תפקודית in vivo בזבובים המונעת את ההשפעות המבלבלות של הרדמה כללית. יתר על כן, גישה זו מאפשרת ללכוד פעילות עצבית בזמן אמת בתוך אותו זבוב, ומאפשרת השוואה ישירה של תגובות עצביות לפני ואחרי חשיפה לגירויים שונים.

בעת השלמת פרוטוקול זה, שלבים קריטיים כוללים לוודא שהחוטם של הזבוב ממוקם כראוי בצינורות הוואקום. שלב זה מבטיח שההדבקה הבאה תתרחש במקומות הנכונים, והוא מוודא שהראש נמצא בזווית הנכונה כדי לדמיין את הנוירונים המעניינים. יישום דבק מינימלי חיוני לשמירה על בריאות הזבובים; שימוש בכמות הקטנה ביותר הדרושה כדי לאבטח את הזבוב במקומו הוא אידיאלי. פרוטוקול זה גם מאפשר שינויים מסוימים שיתאימו לצרכים ספציפיים, כגון הדבקת צידי העיניים בלבד כך שכל הגוף יהיה חופשי. באופן דומה, ניתן לחבר תא זלוף לחלק העליון של תא ההקלטה כדי להקל על זלוף צלצול או מתן תרופות. לבסוף, ניתן למקם הליכון צף מסתובב מתחת לזבוב כפי שדווח בעבר, מה שמאפשר ניתוח של כיווניות התנועה46,47.

לפרוטוקול זה יש כמה מגבלות, כולל הלחץ שהזבובים נתונים אליו במהלך המיקרו-כירורגיה כדי להכין את הזבובים להדמיה חיה. הטיפול בזבובים הקטנים, מריחת דבק במשורה ופתיחה זהירה של קפסולת הראש מבלי לפגוע ברקמת המוח או בגוף דורשים מומחיות רבה, אותה ניתן לרכוש רק באמצעות תרגול קפדני וחזרה. בעוד ששיטה זו מועילה במיוחד לחקר תהליכים קוגניטיביים ברמה התאית, להדמיה in vivo עדיין יש כמה מגבלות בהשוואה לרישומים אלקטרופיזיולוגיים. בנוסף, בעוד שהפרוטוקול שלנו נמנע משימוש בהרדמה לפני ההדמיה, הזבוב עדיין מוגבל לחדר פיזי, שתמיד יכול לשנות את התגובות התאיות. עם זאת, המתודולוגיה שלנו מספקת את הדרך הקרובה ביותר לשמור על בריאות הזבוב להדמיה אופטימלית in vivo . בהשוואה לשיטות הקיימות המשתמשות בהרדמה ומגבילות את הזבוב, השיטה שלנו שואפת לשמור על הזבוב בתנועה חופשית ככל האפשר תוך יכולת לצלם מתאים בתנועה מינימלית.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית עבור 1R01GM147917-01A1 והקרן לחקר המוח וההתנהגות עבור 30442.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.102 מ"מ חוט פלטינהSurepure Chemetals2690
0.25 OD, 0.125 ID, צינורות סיליקון מרפאים פלטינהVWR89068-474
0.3 מ"מ ID צינורות סיליקון פישר סיינטיפיק11-189-14
תקעי בננהאמזון
גיליון אקריליק שחור לתא 0.0125 במותגדיוק44250
סידן כלורידסיגמא-אולדריץ'746495
רשת הלם נחושתDC בהתאמה אישית
עבור נגד פלטינהפישר סיינטיפיקS35740
כלי Dremel 3000-1Dremel3000-N/18
Drosophila melanogaster / ;; uas-tdtomBDSC36328
Drosophila melanogaster / ; uas-gcamp6f;BDSC42747קו uas זה שולב עם ;; uas-td-tom כדי ליצור מלאי המכיל את שתי ההחדרות
Drosophila melanogaster/ ;; MB077C-gal4BDSC68287
דבק אפוקסי גורילה4200102
מד זרימת גז 1.5 LPMאמזוןB01N0UWZ2T
זכוכית 1 מ"ל פיפטה סרולוגית פישר סיינטיפיק50-232-9516
מגלשות זכוכיתפישר סיינטיפיק 12-550-A3
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G7528
HEPESסיגמא-אולדריץ'H4034
צינורות מד היפודרמי 12TWמיקרו-קבוצה316H12TW
היפודרמי 22X מד צינורותמיקרו-קבוצה304H22X
מגנזיום כלוריד הקסהידרטסיגמא-אולדריץ'M9272
חומצה מיריסטיתאקרוס אורגני156961000
מגנטים ניאודימיום 3X2 מ"מאמזוןB0CXSQ387M
P1000 טיפיםGenesee Scientific 23-165RL
P200 טיפיםGenesee Scientific 23-150RL
מחבר דחיפה פנאומטי 6 מ"מ ODאמזוןB07ZHG8Y1Y
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ'P3911
צינורות PTFE 6 מ"מ ODאמזון
 אמזוןB08LYD6645
נתרן ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'S5761
נתרן כלוריפישר סיינטיפיקS271-500
נתרן פוספט דו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'S0876
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S9378
טרהלוזסיגמא-אולדריץT0167
ספק כוח סכיני גילוח '

מקורות

  1. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  2. Chen, T. W., Wardill, T. J., Sun, Y., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  3. Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  4. Akerboom, J., Chen, T. W., Wardill, T. J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  5. Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
  6. Sun, F., Zeng, J., Jing, M., et al. A genetically encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
  7. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  8. Wang, L., Wu, C., Peng, W., et al. A high-performance genetically encoded fluorescent indicator for in vivo cAMP imaging. Nat Commun. 13 (1), 5363(2022).
  9. Jing, M., Zhang, P., Wang, G., et al. A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies. Nat Biotechnol. 36 (8), 723-737 (2018).
  10. Yu, D., Akalal, D. B. G. B., Davis, R. L. Drosophila alpha/beta mushroom body neurons form a branch-specific, long-term cellular memory trace after spaced olfactory conditioning. Neuron. 52 (5), 845-855 (2006).
  11. Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic plasticity underlies aversive olfactory learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
  12. Berry, J. A., Phan, A., Davis, R. L. Dopamine neurons mediate learning and forgetting through bidirectional modulation of a memory trace. Cell Rep. 25 (3), 651-662 (2018).
  13. Cervantes-Sandoval, I., Davis, R. L., Berry, J. A. Rac1 impairs forgetting-induced cellular plasticity in mushroom body output neurons. Front Cell Neurosci. 14, 258(2020).
  14. Martinez-Cervantes, J., Shah, P., Phan, A., Cervantes-Sandoval, I. High order unimodal olfactory sensory preconditioning in Drosophila. Elife. 11, 79107(2022).
  15. Faber, T., Joerges, J., Menzel, R. Associative learning modifies neural representations of odors in the insect brain. Nat Neurosci. 2 (1), 74-78 (1999).
  16. Yu, D., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Davis, R. L. Detection of calcium transients in Drosophila mushroom body neurons with camgaroo reporters. J Neurosci. 23 (1), 64-72 (2003).
  17. Yu, D., Keene, A. C., Srivatsan, A., Waddell, S., Davis, R. L. Drosophila DPM neurons form a delayed and branch-specific memory trace after olfactory classical conditioning. Cell. 123 (5), 945-957 (2005).
  18. Yu, D., Ponomarev, A., Davis, R. L. Altered representation of the spatial code for odors after olfactory classical conditioning: Memory trace formation by synaptic recruitment. Neuron. 42 (3), 437-449 (2004).
  19. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophilamelanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  20. Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophilamelanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (3), 708-712 (1974).
  21. Quinn, W. G., Dudai, Y. Memory phases in Drosophila. Nature. 262 (5569), 576-577 (1976).
  22. Tempel, B. L., Bonini, N., Dawson, D. R., Quinn, W. G. Reward learning in normal and mutant Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (5), 1482-1486 (1983).
  23. Turner, G. C., Bazhenov, M., Laurent, G. Olfactory representations by Drosophila mushroom body neurons. J Neurophysiol. 99 (2), 734-746 (2008).
  24. de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1979).
  25. Schwaerzel, M., Monastirioti, M., Scholz, H., Friggi-Grelin, F., Birman, S., Heisenberg, M. Dopamine and octopamine differentiate between aversive and appetitive olfactory memories in Drosophila. J Neurosci. 23 (33), 10495-10502 (2003).
  26. Kim, Y. C., Lee, H. G., Han, K. A. D1 dopamine receptor dDA1 is required in the mushroom body neurons for aversive and appetitive learning in Drosophila. J Neurosci. 27 (29), 7640-7647 (2007).
  27. Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Curr Biol. 15 (21), 1953-1960 (2005).
  28. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: Anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3 (5), 1-17 (2009).
  29. Liu, C., Plaçais, P. Y., Yamagata, N., et al. A subset of dopamine neurons signals reward for odour memory in Drosophila. Nature. 488 (7412), 512-516 (2012).
  30. Burke, C. J., Huetteroth, W., Owald, D., et al. Layered reward signaling through octopamine and dopamine in Drosophila. Nature. 492 (7429), 433-437 (2012).
  31. Tomchik, S. M., Davis, R. L. Dynamics of learning-related cAMP signaling and stimulus integration in the Drosophila olfactory pathway. Neuron. 64 (4), 510-521 (2009).
  32. Gervasi, N., Tchenio, P., Preat, T. PKA dynamics in a Drosophila learning center: Coincidence detection by rutabaga adenylyl cyclase and spatial regulation by dunce phosphodiesterase. Neuron. 65 (4), 516-529 (2010).
  33. Séjourné, J., Plaçais, P. Y., Aso, Y., et al. Mushroom body efferent neurons responsible for aversive olfactory memory retrieval in Drosophila. Nat Neurosci. 14 (7), 903-910 (2011).
  34. Aso, Y., Sitaraman, D., Ichinose, T., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, 04580(2014).
  35. Pai, T. P., Chen, C. C., Lin, H. H., et al. Drosophila ORB protein in two mushroom body output neurons is necessary for long-term memory formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (19), 7898-7903 (2013).
  36. Owald, D., Felsenberg, J., Talbot, C. B., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).
  37. Perisse, E., Owald, D., Barnstedt, O., Talbot, C. B., Huetteroth, W., Waddell, S. Aversive learning and appetitive motivation toggle feed-forward inhibition in the Drosophila mushroom body. Neuron. 90 (5), 1086-1099 (2016).
  38. Aso, Y., Rubin, G. M. Dopaminergic neurons write and update memories with cell-type-specific rules. Elife. 5, 16135(2016).
  39. Hige, T., Aso, Y., Rubin, G. M., Turner, G. C. Plasticity-driven individualization of olfactory coding in mushroom body output neurons. Nature. 526 (7572), 258-262 (2015).
  40. MacMillan, H. A., Nørgård, M., MacLean, H. J., Overgaard, J., Williams, C. J. A critical test of Drosophila anaesthetics: Isoflurane and sevoflurane are benign alternatives to cold and CO2. J Insect Physiol. 101, 97-106 (2017).
  41. Margulies, C., Tully, T., Dubnau, J. Deconstructing memory in Drosophila. Curr Biol. 15 (17), R700-R713 (2005).
  42. Amiri, A., Karvandian, K., Ramezani, N., Amiri, A. Short-term memory impairment in patients undergoing general anesthesia and its contributing factors. Saudi J Anaesth. 14 (4), 454-458 (2020).
  43. Wang, R., Zhang, L., Wang, X., et al. Electrophysiological activity pattern of mouse hippocampal CA1 and dentate gyrus under isoflurane anesthesia. Front Cell Neurosci. , 18(2024).
  44. Berry, J. A., Cervantes-Sandoval, I., Chakraborty, M., Davis, R. L. Sleep facilitates memory by blocking dopamine neuron-mediated forgetting. Cell. 161, 1656-1667 (2015).
  45. Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Sci Rep. 10, 1-15 (2020).
  46. Moore, R. J. D., et al. FicTrac: A visual method for tracking spherical motion and generating fictive animal paths. J Neurosci Methods. 225, 106-119 (2014).
  47. Seelig, J. D., Chiappe, M. E., Lott, G. K., et al. Two-photon calcium imaging from head-fixed Drosophila during optomotor walking behavior. Nat Methods. 7 (7), 535-540 (2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

דימיון תפקודישכחת זיכרוןמיקרוסקופיית קונפוקליתדימיון סידןגוף הפטריההכנת זבוב ערפלסטיות סינפטית
ב Vivo הדמיה של פעילות עצבית בזבובים בוגרים של דרוזופילה לא מורדמת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.