הדמיית רנטגן של עירוי אבלטיבי מבוסס אתנול תוך-צינורי למניעת סרטן השד במודלים של ארנבים

סרטן השד (BC) הוא מקרה המוות השכיח ביותר והשני בגובהו הקשור לסרטן בקרב נשים בארצות הברית. התחזיות לשנת 2025 מעריכות שיהיו 316,950 סרטן שד חדש, ו-42,170 נשים ימותו מ-BC¹. נכון לעכשיו, כריתת שד מונעת דו-צדדית היא ההליך היעיל ביותר למניעת BC. עם זאת, מדובר בהליך פולשני ביותר הכולל הסרה מוחלטת של תאי האפיתל, מהם נוצר קרצינומה של השד, והרקמה שמסביב. בשל הפולשניות שלו כמו גם ההשפעה הפסיכולוגית והחברתית של הליך זה, פחות מ-50% מהנשים בסיכון גבוה עוברות כריתת שד מפחיתה סיכון². אנחנו, ואחרים, פיתחנו נהלי אספקה תוך-צינוריים (ID) למניעה ראשונית ו/או טיפול מקומי בסרטן השד במודלים של מכרסמים ^2,3 כחלופה למניעה ולטיפולים הנוכחיים. לאתנול (EtOH) יש פרופיל רעילות ובטיחות נמוך המבוסס היטב ומשמש ביישומים קליניים מרובים, כגון חומרים טרשתיים לטיפול במומים ורידיים וכחומר אבלטיבי לטיפול מקומי בכמה סוגי סרטן³. בדרך כלל, מספר מיליליטר של EtOH מוזרקים או מועברים בריכוז של 90-100% בהליכים קליניים אלה. בעבודתנו הקודמת, אספקה של 70% EtOH ישירות למערכת עץ הצינור של מודלים של עכברים וחולדות הייתה יעילה בהסרה כימית של תאי אפיתל חלב עם נזק מוגבל לרקמה תקינה סמוכה, ובמניעת היווצרות גידול שד 4,5,6,7. מכיוון שהליך זה מורחב למערכת עצי הצינור הגדולה יותר של ארנב עם נפח לומינלי גדול יותר ליחס שטח הפנים של תא אפיתל לומינלי, אנו חוקרים את התכונות האבלטיביות של תמיסה עם אחוז נמוך יותר של EtOH (10% עד 70%). בחיפוש אחר תרגום קליני, אנו מסיקים כי האחוז הנמוך ביותר של אתנול היעיל בהסרת תאי אפיתל יהיה הנסבל ביותר ובעל פרופיל הבטיחות הטוב ביותר.

יש צורך באישור של מילוי עץ צינור מלא כדי להבטיח שהתמיסה האבלטיבית באה במגע ישיר עם תאי אפיתל חלב. במחקרים הקודמים שלנו במודלים של מכרסמים, נעשה שימוש בהדמיית רנטגן של עצי צינור מוזרקים על ידי הדמיית מיקרו-CT לאחר ההליך. בשל חלוף הזמן הנדרש להרדמה, העברה, הגדרה ומיקום של בעל החיים להדמיה, Omnipaque (iohexol) שאושר על ידי ה-FDA או חומרי ניגוד דומים המכילים יוד לא התאימו להדמיית עץ צינורית במכרסמים ^6,8. מצאנו שחומרי ניגוד מבוססי ננו-חלקיקים, במיוחד אלה המכילים ננו-גביש תחמוצת טנטלום, היו מפוזרים לאט יותר ומתאימים יותר להדמיית עץ צינורית במכרסמים 6,7,8,9. עם זאת, אישור מאוחר זה על ידי הדמיית מיקרו-CT אינו מאפשר לנו לנטר או לשלוט בכמות הנפח המוחדר וחורג מהליכי אבחון שנקבעו קלינית, כגון דוקטוגרפיה^10,11, להדמיית עץ צינור. לפיכך, צעד מרכזי לביסוס ההיתכנות הטכנית של תרגום הליך זיהוי זה לבני אדם הוא הדגמת הדמיה פלואורוסקופית בזמן אמת של עץ הצינור המוזרק במודל של בעלי חיים בגודל ומורכבות הולכים וגדלים של בלוטות החלב שלו. פרוטוקול זה מגדיל את ההליך האבלטיבי הזה ממכרסמים ^4,5 למודלים של ארנבות. מבחינה אבולוציונית, אנטומית ופיזיולוגית, בלוטות החלב של ארנב דומות יותר לשדיים אנושיים מאשר לאלו של מכרסמים או מודלים אחרים של בעלי חיים גדולים, כגון פרות וכבשים 12,13,14. לארנבות נקבות יש ארבעה זוגות של בלוטות חלב, כל אחת מכילה ארבעה עצי צינור, ואילו למכרסמים יש רק עץ צינור אחד לכל בלוטת חלב. פטמות ארנב יכולות להיות משומרות^15,16 באמצעות הליך דומה למתן ID של חומר ניגוד בדוקטוגרפיה קלינית במחקר קליני ראשון בבני אדם. לכן, ארנבים מספקים מודל ביניים מעשי ורלוונטי של בעלי חיים גדולים ליישום תרגומי של הליך אבלטיבי זה לבני אדם. פרוטוקול זה נותן מענה לאתגרים טכניים של מסירת תעודות זהות והדמיה in vivo של מערכת עצים רב-צינורית שלא ניתן היה לטפל בהם במודלים של מכרסמים. פרוטוקול זה משתמש במכשירים, ריאגנטים וחומרים התואמים לפרקטיקה הקלינית הנוכחית להדמיה של עצי צינור. לפיכך, ההליך המתואר לעירוי מונחה פלואורוסקופיה של תמיסה אבלטיבית מבוססת אתנול המכילה יוהקסול יכול להיות מיושם ולהעריך בקלות בניסויים קליניים ראשונים בבני אדם.

שיטה זו יושמה במעבדה שלנו כדי להחדיר בהצלחה את כל ארבעת עצי הצינור של בלוטת חלב אחת או יותר בארנב, בפגישה אחת, עם תמיסה אבלטיבית מבוססת אתנול המכילה חומר ניגוד (איור 1, איור 2, איור 3). שיטה זו כוללת החדרת התמיסה האבלטיבית ישירות לתוך פתח הפטמה עם מחט קהה של 27 גרם של ארנב (בתול 4 חודשים) על שולחן פלואורוסקופיה. הליך זה מבוצע על בעל חיים בהרדמה כללית (איזופלורן) עם טיפול אנטי דלקתי לפני ואחרי ההליך (קטופרופן, תרופה אנטי דלקתית לא סטרואידית). הדמיית פלואורוסקופיה מאפשרת לנו לנטר את מילוי עץ הצינור בזמן אמת, לשלוט בקצב ובכמות הנפח המופץ, ו/או לקבוע עד כמה מוצלחת אספקת הזיהוי בכל מערכת עצים בודדת (איורים 1, איור 2, איור 3). טכניקת פלואורוסקופיה זו מתקרבת יותר ליישום הקליני המיועד להנחיית תמונה של הטיפול האבלטיבי ויכולה לעזור להגביל את מינון הקרינה הכולל המוטל על המטופל. פרוטוקול זה מדגים כי Omnipaque (iohexol) שאושר על ידי ה-FDA הוא חומר ניגוד מתאים להמחשת המילוי הראשוני של עץ צינור הארנב (איור 3). תצפיות בבדיקה גסה וניתוח היסטולוגי מראות כי ריכוז אתנול של 70% גורם לנזק מהיר לרקמות בתוך עץ הצינור ומחוצה לו ומעבר למבנה בלוטת החלב (איור 3). ריכוז אתנול בטווח של 10-40% מספק אבלציה נאותה של תאי אפיתל עם נזק נמוך יותר לרקמות אגביות מאשר אתנול 70% (איור 4). יידרשו מחקרי אורך המשתמשים בהליך זה עם גודל קבוצה בעל עוצמה מתאימה לכל תמיסה אבלטיבית ואוספי רקמות מתוזמנים כדי לקבוע פרמטרים אופטימליים של הפתרון האבלטיבי להערכה הקלינית שלו בחולים אנושיים.

כל הניסויים המתוארים נערכו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן. ארנבים (Oryctolagus cuniculus) טופלו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה וחוק רווחת בעלי חיים של USDA במתקן מוסמך AAALAC.

הערה: שיטה זו נערכה בבעלי חיים לבנים ניו זילנדיים בתולים (nulliparous) ומגדלים בדימוס (multiparous) בגילאים (4 חודשים עד > שנה) ובמשקל (2.6 עד 4.2 ק"ג) שנרכשו ממקורות מסחריים. מניסיוננו, גודל החיה שנקבע על ידי משקל אמין יותר מגיל החיה כדי לחזות את גודל הפטמות. בדרך כלל, בעלי חיים ששוקלים יותר מ-3.3 ק"ג מציגים פטמות מתאימות לקנולציה. הפרוטוקול המתואר להלן מתמקד בבעלי חיים בתולים בגילאי 4-5 חודשים ובמשקל של יותר מ-3.3 ק"ג, מכיוון שהם מתאימים יותר למחקרי יעילות ארוכי טווח, ריפוי פצעים, רעילות ובטיחות.

1. הכנה טרום ניתוחית

1. התאקלמו בעלי חיים במתקן החדש לפחות שבוע עם הגעתם, במיוחד עבור בעלי חיים המיועדים להליכי החלמה ומחקרים ארוכי טווח. במהלך השבוע הראשון הזה, יש לנטר/לבדוק את הארנבים מדי יום ולספק פינוקים, העשרה תזונתית לפי המלצות ההנחיות המוסדיות, כדי לסייע בתהליך ההתאקלמות.
2. רכשו את הארנב (~ לבן ניו זילנדי בן 4 חודשים) ממתקן הדיור המאושר. רשום את משקל הגוף לפני ההליך.
   הערה: ניתן לרשום את משקל הגוף יום לפני ההליך כדי להכין את החישובים הנדרשים להרדמה. מגדלים שיצאו לגמלאות (> גיל שנה, > 3.5 ק"ג) יכולים לשמש גם מכיוון שיש להם פטמות גדולות יותר ומאפשרים קנולציה קלה יותר של צינורות בודדים (איור 3). מסיבות אלה, ניתן להשתמש במגדלים בדימוס בניסויים ראשוניים כדי להכיר ולייעל את ההליך התוך-צינורי
3. יש להזריק 35 מ"ג/ק"ג קטמין ו-5 מ"ג/ק"ג קסילזין תוך שרירי 20 דקות לפני מתן איזופלורן כדי להרגיע את בעל החיים.
   הערה: ההרדמה ניתנת על סמך משקל הארנב והטווחים עבור כל תרופה הם כדלקמן: 15-35 מ"ג/ק"ג לקטמין, ו-2-5 מ"ג/ק"ג לקסילזין. ודא שהחיה מורדמת לפני שעוברים להסרת שיער ואינטובציה. זה למען רווחתם ובטיחותם של בעלי החיים והצוות. לאחר אישור ההרגעה, ניתן להניח את הארנב בגב על שולחן ההדמיה/ניתוח.
4. יש להזריק 5 מ"ג/ק"ג קטופרופן תת עורי לשיכוך כאבים לאחר הופעת סימנים קליניים של טשטוש (כלומר, התנהגות שקטה ועיניים עצומות חלקית ועיניים בצבע ורוד).
   הערה: משככי כאבים ניתנים על סמך משקל הארנב והטווח של קטופרופן הוא 2-5 מ"ג/ק"ג.
5. החדירו את הארנב עם הציוד המתאים (למשל, צינור אנדוטרכיאלי או מכשיר דרכי נשימה סופרגלוטיות) וחברו למכונת איזופלורן (1-2% איזופלורן, 1.0 ליטר לדקה חמצן) שנבדקה כראוי ואושרה להרדמת הארנב. עקוב בקפידה אחר הנשימה של בעל החיים כדי להבטיח שההרדמה נשמרת ב-1-2% מהאיזופלורן. עקוב אחר הארנב לאיתור ריווי חמצן באמצעות SpO₂, דופק, קצב נשימה וטמפרטורה לאורך כל ההליך.
   הערה: גודל צינור האינטובציה מבוסס על משקל וגודל הארנב. עם זאת, טווח המידות לא תמיד מדויק, ולכן כדאי שיהיה מגוון גדלים כדי לראות איזה מהם מתאים ביותר לארנב הספציפי הזה. ניתן להשתמש במסכת אף גם במקום צינור אנדוטרכיאלי למטרות הרדמה¹⁷, מתוך מודעות לכך שמסכה זו אינה מספקת הגנה על דרכי הנשימה של החיה הניתנת על ידי אינטובציה. שמיכות במחזור מים חמים (שמיכות מחממות) המוגדרות ל-37 מעלות צלזיוס מונחות מתחת למגבות כדי לשמור על טמפרטורת גופו של הארנב.
6. הנח ואבטח קטטר ורידי של 25 גרם לווריד האוזן השולי כדי לאפשר מתן תרופות חירום.
   הערה: ניתן להשתמש בטווח מד של 24 עד 26 בהתאם לגודל וריד הארנב.
7. יש למרוח חומר סיכה לעיניים על שתי העיניים כדי למנוע גירוי בעיניים והתייבשות בקרנית.
8. גלחו את הפרווה סביב זוג הפטמות השני והשלישי בעזרת סכין גילוח חשמלי. השתמשו באפליקטור עם קצה כותנה כדי למרוח קרם להסרת שיער על אזור הפטמה. הניחו לקרם ליצור קשר עם האזור למשך 15 שניות.
   הערה: יש לנקוט משנה זהירות כדי לא לפגוע בפטמות עם סכין הגילוח. שואב אבק אלחוטי יכול לשמש גם כדי לסייע בשמירה על אזור נוהל נקי.
9. הרטיבו כרית גזה במי מלח סטריליים והשתמשו בה כדי לשטוף את הקרם ולשחרר פרווה מהחיה לאחר 15 שניות של מריחת קרם להסרת שיער. ודא ראות טובה וגישה לאזור הפטמה ממנו הוסרה הפרווה. חזור על הפעולה במידת הצורך.
   הערה: הקרם צריך להישאר על הארנב למשך הזמן הקצר ביותר האפשרי, בין 10 - 30 שניות ולהסיר אותו לחלוטין כדי למנוע כוויות כימיות בעור.

2. עירוי תוך-צינורי

1. הכן תמיסה אבלטיבית על ידי ערבוב נפחים מתאימים מתמיסות מלאי בתנאים סטריליים במכסה מנוע תרבית רקמות BSL2.
   הערה: יש לאחסן יוהקסול (350 מ"ג יוד/מ"ל) באזור חשוך עקב רגישות לאור. נעשה שימוש במגוון ריכוזי EtOH במהלך ניסוי זה. לבדיקת אחוזים אחרים של EtOH, יש לדלל את תמיסות המלאי לריכוז הדרוש של תמיסת אבלטיבית. כדי לשמור על אותו ריכוז של יוד בתמיסה אבלטיבית עם אחוזים שונים של EtOH, PBS או מים סטריליים יכולים לשמש כדי למלא את הפרש הנפח.
2. לדוגמא זו, הכינו תמיסה אבלטיבית טרייה של 10% EtOH, 280 מ"ג יוד/מ"ל יוהקסול, 1% צבע מאכל בשפופרת של 5 מ"ל. לנפח סופי של 5 מ"ל, הוסף 4 מ"ל של ציר iohexol (350 מ"ג יוד/מ"ל), 500 מיקרוליטר של 100% EtOH (200 הוכחה), 450 מיקרוליטר של PBS, 50 מיקרוליטר של צבע מאכל כחול.
   הערה: ניתן למלא כל עץ צינור עד 400 מיקרוליטר, אך בדרך כלל 250-350 מיקרוליטר עבור בעלי חיים מתחת ל-3.5 ק"ג. ניתן להשתמש באוונס בלו עד 0.2% במקום צבע מאכל. אוונס בלו עשויה להיות אפשרות מועדפת אם מיועדים לניתוחי רקמות שלמים או רקמות אחרות מיד לאחר העירוי.
3. הסר כל עור מת המכסה את פתחי הצינורות בעזרת מלקחיים מחודדים עדינים.
   הערה: לארנבים יכול להיות פקק קרטיני הבולט מהפטמה שיכול למנוע קנולציה מוצלחת אם לא יוסר. ניתן גם למרוח לידוקאין מקומי סביב הפטמה כדי לסייע במזעור הגירוי סביב מקום ההזרקה (טבלה 1).
4. נגב את מקום העירוי עם רפידות גזה כלורהקסידין.
   הערה: כלורהקסידין משמש כחומר ניקוי לחיטוי מקום ההזרקה לפני הקנולציה (טבלה 1).
5. הכנס את השיפוע של מחט 28 גרם (אורך: 12.7 מ"מ) לצד הפטמה והזריק לאט 200 מיקרוליטר של 0.9% מלח בקצב של 200 מיקרוליטר לדקה. זה מאפשר הדמיה טובה יותר של פתחי הצינורות.
   הערה: לא ייתכן שיהיה צורך להזריק את כל 200 מיקרוליטר מי מלח לפטמה; הפסק את ההזרקה ברגע שאתה רואה את מי המלח יוצאים מפתח צינור אחד או יותר.
6. שאפו 1 מ"ל של תמיסה אבלטיבית מוכנה באמצעות מזרק נעילה של 1 מ"ל Luer. חבר את המזרק לקצה הנקבי וה"מכונף" של קו ההארכה של זכר-נקבה בגודל 12 אינץ'. חבר בזהירות מחט קצה קהה 27 גרם (אורך: 12.7 מ"מ) לקצה הזכרי של קו ההארכה. ראשית את הקו עם הפתרון. נגב את המחט עם כרית גזה אלכוהולית. כמו כן, שימו לב לא להטות את המזרק עם התמיסה האבלטיבית מכיוון שהדבר עלול לגרום להיווצרות בועות אוויר.
   הערה: אלו הם נפחים מומלצים שמטרתם למלא את עצי הצינורית במלואם: עד 300 מיקרוליטר בכל עץ ועד 1.2 מ"ל לכל בלוטת חלב צווארית ו/או מפשעתית^{(זוג 1 ו-4}), עד 400 מיקרוליטר בכל עץ ועד 1.6 מ"ל לכל בלוטת חזה ו/או בטן (זוגות^{2 ו-3}). עבור יישומים אחרים, ייתכן שיהיה מתאים להשתמש בנפחים קטנים או גדולים יותר על סמך דרישות ניסיוניות ו/או הנחיות פלואורוסקופיה כדי למנוע מילוי יתר של עץ הצינור. קו ההארכה מאפשר שליטה רבה יותר בקצב הזרימה ולעירוי בו זמנית והדמיית פלואורוסקופיה חיה. לשם השוואה, הנפחים המומלצים של עירוי תוך-צינורי בדגמי עכברים בגיל 9-12 שבועות⁴ הם: עד 30 מיקרוליטר בבלוטות צוואר הרחם והמפשעה ועד 50 מיקרוליטר בבלוטות החלב של בית החזה והבטן, ודגמי חולדות⁵: עד 100 מיקרוליטר בצוואר הרחם ובמפשעה ועד 300 מיקרוליטר בבלוטות החלב של בית החזה והבטן.
7. השתמש במנורת הגדלה פי 10 כדי לסייע באיתור פתחי הצינורות. החזק בעדינות את הפטמה בעזרת האצבעות והחדיר את המחט לתוך פתח הצינור. המשך בעדינות להחדיר את מחט הקצה הקהה 27 גרם עד שהקצה נמצא במלואו בתוך הפטמה. כדי להכיל את המחט בפטמה, הביאו את הפטמה לכיוון המחט במקום לדחוף את המחט כלפי מטה לתוך הפטמה. הקפד לעקוב אחר נתיב פתח הצינור.
   הערה: אצל ארנבים מסוימים, אתה עלול להרגיש התנגדות כאשר אתה מנסה להכניס את המחט לפתח/ים של הפטמה. הפעל בזהירות לחץ קל כדי לפרוץ את שכבת תאי האפיתל העליונה. מניסיוננו, נדרש מכשיר הגדלה כדי לזהות בבירור את פתח הצינור לקנולציה. זה יכול להיות מנורת מגדיל, עדשה, זכוכית מגדלת או מכשיר דומה.
8. להחדיר לאט 300 מיקרוליטר מהתמיסה בקצב קבוע של כ-200 מיקרוליטר לדקה לאחר החדרת המחט לחלוטין. המתן 30 שניות לאחר העירוי כדי להסיר את המחט מהעץ הקנולטי; זה מבטיח שנפח המוזרק נשאר בתוך עץ הצינור ומפחית את הסבירות לדליפה.
   הערה: בדרך כלל, יש חוקר אחד שמקנול ומחזיק את המחט, בעוד שחוקר שני מחזיק את המזרק ודוחף את הבוכנה בקצב הרצוי. ניתן להשתמש במשאבת מזרק כדי לקבל קצב זרימה מבוקר יותר, מכיוון ששינויים פתאומיים בקצב העירוי עלולים להתפוצץ או לפגוע בעצי הצינור.
9. נקה כל תמיסה שנשפכה עם גזה לחה או מגבון EtOH כדי למנוע תמיסת ניגודיות זרה בתמונות.

3. הדמיית פלואורוסקופיה

1. צלם תמונות פלואורוסקופיה לאחר החדרת כל עץ צינור. הפרמטרים של הפלואורוסקופיה הם: 30 fps, 67 kV ו-17.3 mA במכשיר רנטגן פלואורוסקופיה. עם זאת, התאם אותם על סמך צרכי הניסוי וההדמיה.
2. השתמש בתמונות הפלואורוסקופיה כדי לקבוע אם נדרש נפח נוסף כדי למלא את עץ הצינור במלואו.
   הערה: הדמיית פלואורוסקופיה יכולה להתרחש בשידור חי במקביל לעירוי של תמיסת האבלציה. ניתן להשתמש במלקחיים ממתכת או פלסטיק כדי להחזיק את הפטמה בזמן ההדמיה כדי להגן על הצוות מפני קרני רנטגן מזיקות. זה מאפשר ניטור של מילוי עצי הצינורות. פלואורוסקופיה חיה יכולה להנחות מתי להפסיק עירוי על סמך הנפח המוגבר בקצוות הנאדיות. פלואורוסקופיה לאחר עירוי יכולה לאשר אם עץ הצינור היה מלא במלואו או אם הייתה דליפה כלשהי. פלואורוסקופיה מאשרת מבוצעת בדרך כלל לאחר עירוי של כל צינור בתוך אותה בלוטת חלב.

4. טיפול והחלמה לאחר הניתוח

1. הפסק את זרימת האיזופלורן לאחר העירוי התוך-צינורי האחרון.
2. יש להזריק 0.5 מ"ג/ק"ג של אטיפמזול תוך שרירי.
   הערה: זמן ההחלמה משתנה בין בעלי חיים, אך הארנב אמור להתחיל להראות סימני התאוששות 5-20 דקות לאחר ההזרקה.
3. ספק תמיכה מתמשכת בחום לבעל החיים על שמיכה מחממת עד להתאוששות מלאה מההרדמה. שמור על זרימת החמצן עד 5 דקות לפני הוצאתו מההרדמה.
   הערה: סימני ההחלמה כוללים תנועות פה כגון לעיסה, שיעול, עוויתות באף ו/או תנועת עיניים. לארנבים צריך להיות רפלקס יישור ולהיות מסוגלים לשמור על עצמם במיקום חזה לפני החזרתם למנשא התאוששות. חומר התאוששות ניתן על סמך משקל הארנב בטווח של 0.1-1 מ"ג/ק"ג אטיפמזול.
4. יש להזריק 5 מ"ג/ק"ג קטופרופן תת עורית.
5. הסר את הקטטר התוך ורידי ברגע שהארנב יכול לשמור על עצמו במצב עצם החזה. החזק פד גזה למקום שבו הוסר הקטטר כדי לעצור דימום עודף.
   הערה: הוצאת הקטטר יכולה להתבצע כאשר הארנב נמצא במנשא ההובלה.
6. העבר את הארנב בחזרה למתקן הדיור המתאים.
7. המשך בזריקות של 5 מ"ג/ק"ג קטופרופן תת עורי למשך 3 ימים לפחות לאחר ההליך.
8. עקוב אחר הארנב לאיתור סימני אי נוחות, מצוקה, כאב ופגיעה עצמית פעם ביום למשך 3 ימים לפחות לאחר ההליך. אם הארנב מציג אחד מהסימנים הקליניים הללו, ניתן להאריך את הטיפול בקטופרופן. רשום ועקוב אחר משקל הגוף כדי להעריך אם יש סימני אנורקסיה.
   הערה: קטופרופן ניתן על סמך משקל הארנב בטווח של 2-5 מ"ג/ק"ג. ניתן לתת אותו כל 24 שעות עד 5 ימים לאחר עירוי תוך-צינורי כדי להפחית את הדלקת ולמזער צלקות. כדי למזער תופעות לוואי של כיב בעור או בעיות אחרות הקשורות לריפוי פצעים, יש למרוח לידוקאין באופן מקומי על מקום ההזרקה. יש להמית כל בעל חיים המראה סימנים מתמשכים של אי נוחות, מצוקה, כאב או פציעה לאחר טיפול בקטופרופן.

5. ניתוח רקמות

1. יש לתת תמיסת המתת חסד (נתרן פנטוברביטל ונתרן פניטואין) תוך ורידי במינון של 100 מ"ג/ק"ג. לאחר 60 שניות בדוק אם יש סימני חיים על ידי צביטה בבוהן/אוזניים, סימני נשימה או פעימות לב, רפלקס קרנית ו/או גירוי אישונים.
2. בצע נתיחה להשגת רקמת בלוטות החלב ותהליך להליך הטמעת הפרפין השגרתי לאחר 24-36 שעות בפורמלין ניטרלי^{10% 18}. לאחר מכן, בצע צביעה סטנדרטית של המטוקסילין ואאוזין (H&E) ו/או צביעה אימונוהיסטוכימית עם סמן ספציפי לסוג התא כדי לסייע בקריאות הניתוח הרצויות¹⁸. השלך את הפגר באמצעות פרוטוקול סילוק מתאים (למשל, שריפה).
3. לנתח רקמות בלוטת החלב בהתייעצות עם פתולוג. השתמש בתוכנת מחשב כדי לסייע בכימות קצב האבלציה ונזק לרקמות נלוות.
   הערה: ניתוח רקמות בוצע על ארנבים לבנים ניו זילנדיים בני 4 חודשים תוך שעה לאחר העירוי (איור 4) עם תוכנה פתוחה של QuPath לניתוח תמונות ביולוגיות (https://qupath.github.io/). ניתוח זה מבוסס רק על רקמות מוכתמות ב-H&E. QuPath או תוכנת מחשב דומה, דורשת קלט וכיול על ידי פתולוג. חלק מהתאים עשויים להיות מסווגים באופן שגוי באמצעות מאפיינים מורפולוגיים בלבד (איור 4). ניתן להשתמש בסמנים ספציפיים לסוג התא כגון ציטוקרטינים ואקטין שריר חלק α כדי לשפר את הסיווג בעזרת מחשב⁶. בסופו של דבר, ניתוח סיווג התאים חייב להיאסף ולאמת על ידי פתולוג.

כל אחת מ-8 בלוטות החלב של נקבת ארנב מכילה 4 עצי צינור שנפתחים בפתחי פטמה עצמאיים (איור 2). בשל ההבדל בגודל ובמספר עצי הצינור לבלוטת החלב בין מכרסמים (רק צינור אחד לבלוטת חלב), ארנבים הם מודל ביניים טוב לתרגום אנושי. אנו יכולים להחדיר עד 400 מיקרוליטר של תמיסת EtOH של 10-70% כדי למלא את כל עץ הצינור של כל בלוטת חלב של ארנבים לבנים ניו זילנדיים בני 4 חודשים (איור 1, איור 2, איור 3, איור 4 4,8,9). אנו יכולים להחדיר עד 4 עצי צינור בעד 8 בלוטות חלב עם תמיסת האבלציה בפגישה אחת. תכנון ניסיוני טיפוסי מורכב מהחדרת 2-3 עצי צינור בתוך בלוטת חלב בודדת בעד 4 בלוטות חלב עם תמיסה אבלטיבית מסוימת המכילה חומר ניגוד רנטגן מבוסס יוד (איור 2,  איור 3). עבור תמיסה אבלטיבית המכילה יוהקסול (90-300 מ"ג יוד/מ"ל), פלואורוסקופיה מבוצעת במהלך ו/או אחרי כל עירוי כדי לקבוע את ההצלחה האישית של החדרת כל עץ צינור בכמות חלקית או מלאה של תמיסה מוזרקת (איור 2, איור 3). איסוף רקמת בלוטת החלב מאפשר להעריך כיצד שינויים בפורמולציה משפיעים על הרס תאי אפיתל החלב (איור 4). ניתוחי הדמיה אלה מספקים מידע להבנת הפתרון המתאים ביותר להשגת אבלציה מקסימלית תוך מזעור נזק לרקמות שמסביב. קבענו כי תמיסת EtOH של 10% מספקת שיעור אבלטיבי דומה לתמיסות אבלטיביות המכילות אחוז גבוה יותר של EtOH (איור 4).

איור 1: זרימת עבודה של הליך תוך-צינורי. השלבים העיקריים של הליך הזיהוי מודגשים. אנא ראה את הסרטון לפרטים נוספים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: שלבים עיקריים של קנולציה ועירוי תוך-צינוריים. (A) הזרקת מי מלח בניצב לפטמה כדי להרחיב את פתחי הצינורות לקנולציה (תצוגת מישור חציונית). (B) ניתן לעקוב אחר קנולציה ומילוי של עץ צינורי (D1) עם צבע כחול בתמיסה האבלטיבית (תצוגת מישור חציונית). (C) הדמיית פלואורוסקופיה בזמן אמת מציעה ניטור מדויק וברזולוציה גבוהה של מילוי עץ צינור (D1) עם iohexol בתמיסה האבלטיבית (מבט במישור הגב). פתחי עץ הצינור ממוספרים משמאל לימין, החל ברביע העליון (D1, הרביע העליון השמאלי) ומסתיימים ברביע התחתון (D4, הרביע התחתון הימני). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: גודל פטמה ואספקה מוצלחת של תמיסה אבלטיבית למספר צינורות. הצגה אופיינית של גדלי פטמה בארנבים לבנים בניו זילנד. גודל הפטמה משתנה בהתאם למשקל וגיל הארנב. בלוטות החלב ממוספרות משמאל למעלה (L1, צוואר הרחם השמאלי) לימין התחתון (R8, מפשעתי ימין). כל התמונות מוצגות במישור הגבי. (A) ארנב בתולי במשקל 2.8 ק"ג (למעלה) עם פטמות קטנות יותר, קשה לקנולציה, ארנב בתולי במשקל 3.5 ק"ג (באמצע) עם פטמות מתאימות לקנולציה, וארנב רב-צדדי במשקל 4.1 ק"ג (למטה) עם פטמות גדולות יותר, הרבה יותר קל לקנולציה. (B) צבע מאכל כחול בתמיסה המוחדרת עשוי לשמש כעדות in vivo לאספקה תוך-צינורית ומילוי עץ צינור. עירוי לא מוצלח מסומן במתאר אדום (אספקת כרית שומן, למעלה), ועירוי מוצלח עם מתאר כחול (אספקה תוך-צינורית, אמצע ותחתון). תמיסת 70% EtOH גורמת לנזק רב יותר לעור (אריתמה) דקות לאחר העירוי (כחול כהה, פאנל אמצעי) בהשוואה לתמיסה של 10% (תכלת, פאנל תחתון). (ג) פלואורוסקופיה מספקת ראיות in vivo לאספקה תוך-צינורית. עירוי לא מוצלח (אספקת כרית שומן, פאנל עליון). עירוי רציף מוצלח של צינור D1 ראשון ועץ צינור D2 שני (פאנל שמאלי תחתון). פלואורוסקופיה חיה מספקת הנחיית תמונה למילוי (חצים לבנים) של עץ צינור D3 (הפאנל הימני התחתון); ניתן לראות גם את קו ההארכה המלא בתמיסת אבלציה המכילה יוהקסול ומלקחיים להחזקת הפטמה. פסי קנה המידה מתאימים ל-1 ס"מ בתמונות בהגדלות שונות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניתוח רקמות של בלוטות החלב בארנבים לבנים בניו זילנד לאחר הליך תוך-צינורי עם תמיסה אבלטיבית מבוססת אתנול. (A-B) צביעת H&E מייצגת של בלוטת חלב מפשעתית ימנית של בעל חיים בן 4 חודשים ללא טיפול אבלטיבי בהשוואה לבלוטת חלב מפשעתית ימנית של חיה אחרת עם טיפול אבלטיבי של 10% EtOH. פרוסות רקמה נחתכות לאורך המישור החציוני, כך ש-D1 ו-D3 (עצי צינור שמאל) מיוצגים באותם מקטעי רקמה. תצוגת רקמה שלמה (A) ותצוגה בהגדלה גבוהה (B) מציגות השפעות מורפולוגיות וכרומטיות של אבלציה של EtOH על כתם H&E (לוחות עליונים) והסיקו מחלקות תאי אפיתל וסטרומה על סמך מסווג מאומן בעזרת מחשב (לוחות תחתונים). סרגל קנה המידה השחור מתאים ל-1 מ"מ ב-A וסרגל קנה המידה הלבן ל-100 מיקרומטר ב-B. (C) עמודת הגרף מציגה את התפלגות מחלקות התאים בעצים דוקטליים (n > 4 לקבוצה) שטופלו בריכוזים שונים של EtOH או שנותרו ללא טיפול. כוכביות מצביעות על ערך p של מבחן ה-t של וולש הלא מזווג של כל סוג תאים לקבוצה בהשוואה למחלקת התאים התואמת שלו בקבוצה שטופלה ב-10% EtOH (* <0.05, ** < 0.01, **** <0.0001). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין מה לחשוף.