מאמר שיטה

כלי הדמיה כבדית רב-פעמי: כלי רב-פעמי מודפס בתלת-ממד למיקרוסקופיה תוך-חיונית בכבד

DOI:

10.3791/68337

⸱

17 במרץ 2026

 ,  ,  , 
1Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge, 2Thoracic and GI Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências de Materiais, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal de Pernambuco

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג כלי הדמיה כבדי רב-פעמי מתקדם (RHIT) למיקרוסקופיה תוך-חיונית (IVM) של עכברים חיים, המשפר את יציבות הרקמות בניסויים מהירים וחריפים. העיצוב המודפס בתלת-ממד של ה-RHIT מציע ייצור, יכולת הרחבה ורב-שימושיות חסכונית, ומאפשר תצפית ממושכת על תהליכים מטבוליים בעכברים בגדלים שונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן להעריך את תפקוד הכבד והפרעה על ידי חזון ישיר של התהליכים הדינמיים של הכבד באמצעות מיקרוסקופיה תוך-חיונית מבוססת קונפוקלית (IVM). במיוחד, ניתן להשיג דיוק מרחבי וזמני מצוין בהפקת מידע איכותי וכמותי כאחד. בשלב המיקרוסקופ, שמירה על מצב הרקמה הפיזיולוגי תוך השגת יציבות וחזרתיות נשארת מאתגרת. עלייה במשקל ובתכולת השומנים בכבד משפיעות לרעה על תהליך זה במודלים בעלי חיים של סוכרת סוג II (T2D) ומחלת כבד שומני לא אלכוהולית (MAFLD). כדי להתגבר על מגבלות אלו, יצרנו את RHIT, עיצוב מהפכני של מכשיר הדמיה המשפר את הגישה והיציבות של הרקמות. RHIT הוא מכשיר הדמיה כבדית רב-פעמי וניתן להרחבה, המיוצר באמצעות הדפסת תלת-ממד בשיטה יעילה של שלב אחד. ניתן לשנות את מידותיו כדי להתאים לעכברים בגדלים שונים. בקצרה, RHIT הוא מכשיר מודפס בתלת-ממד למיקום וייצוב בעלי חיים במעבדה במהלך מיקרוסקופיה תוך-חיונית של כבד, המשמש לאחר הכנה ניתוחית קצרה למזעור טיפול, לחץ ושונות. העיצוב הרב-פעמי והסטנדרטי שלו ניתן לייצור והתאמה אישית בקלות, ותומך במגוון גדלים ועיצובים ניסיוניים פוטנציאליים. התוצאות הראשוניות מראות שיפור ניכר ביציבות ובאמינות של הדמיה תוך-חיונית כבדית, ומאפשרת הדמיה מפורטת של מבנים תת-תאיים, כגון טיפות שומן. דיוק משופר זה מקל על מחקרים מטבוליים ופיזיולוגיים עם בהירות, שחזוריות ופוטנציאל משופרים לעיצובים אורכיים. הפרוטוקול מציע גישה סטנדרטית ונגישה המתמודדת עם אתגרים טכניים ארוכי טווח ב-IVM בכבד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה תוך-חיונית היא כלי עוצמתי להמחשת תהליכים ביולוגיים ב-vivo באופן דינמי 1,2,3, בניגוד להיסטולוגיה אימונופלואורסצנציה מסורתית עם הדמיית רקמה קבועה או תאים חיים וניתוח ציטומטריית זרימה של תאים מבודדים. לבדיקת כבד, IVM שימש לבחינת הפרשה וזרימת מרה 4,5, מוביליזציה של גלוקוז 6,7, תאים לא-פרנכימליים 8,9,10 ומחלות כבד11,12. יתרה מזאת, בנוגע לחקירת הצטברות שומן, IVM מאפשר מידע בזמן אמת על הדינמיקה של היווצרות, גדילה ופירוק טיפות ליפידים ברקמות חיות, כגון הדמיה וכימות של טיפות ליפידים ברזולוציה מרחבית גבוהה, וכן לקשר ישיר בין הצטברות טיפות ליפידים לתהליכים תאיים ופיזיולוגיים אחרים13. למרות היתרונות הללו, IVM עדיין מאתגר מבחינה טכנית: הוא דורש ציוד מיוחד ומומחיות14, עלול לגרום לנזק לרקמות, לשנות התנהגות תאית ולדרוש הליכים פולשניים. מחקרים מסורתיים ב-in vivoהמבוססים על תצפית התנהגותית, ניטור פיזיולוגי וניתוח גנטי מספקים מידע חשוב אך חסרים את הרזולוציה המרחבית והזמנית שמציעה מיקרוסקופיה תוך-חיונית.

האתגר המרכזי הראשון ב-IVM הוא שליטה באי-היציבות של הממצאים הנגרמים מדופק הלב והנשימה של בעל החיים שנבדק, מה שעלול לפגוע באיכות התמונה, ולגרום לתמונות מעוותות או טשטוש של התהליכים הביולוגייםהנצפים. ניסיונות לתקן זאת באמצעות עיבוד תמונה לעיתים קרובות מובילים לאובדן מידע מרחבי וזמני חשוב או לדרישה לציוד ניתוחי מתקדם ותחזוקה16,17. שנית, מודלים של עכברים למחקרי מחלות כבד, כגון MAFLD ו-T2D, לעיתים קרובות שמנים ולכן קשה יותר לייצוב בשל גודלם המוגבר ותכולת השומנים ברקמה16,18. במודלים של עכברים שמנים, NAFLD ו-T2D, עלייה במסת הגוף מציבה אתגרים מכניים בהדמיה תוך-חיונית בכך שהיא חורגת מקיבולת העומס של שלבי מיקרוסקופ סטנדרטיים ומסבכת את ייצוב בעלי החיים19. משקל נוסף זה מעלה את הסיכון לתופעות תנועה ודחיסת רקמות, ששניהם פוגעים בדיוק התמונה20.

במקביל, תכולת שומנים כבדית גבוהה מגבירה את האטימות של הרקמות ואת פיזור האור, מה שמפחית את רזולוציית התמונה והניגודיות. השפעות אלו מחמרות לעיתים קרובות על ידי מחלות משולבות מטבוליות כמו שינוי בפרפוזיה ודלקת, מה שמפחית עוד יותר את התפלגות הצבע ואתבהירות האות. לבסוף, זה יכול להיות קשה ולפגוע בחזרתיות לשמור על טמפרטורת גוף יציבה לאורך כל ההדמיה כדי לשמור על פיזיולוגיית רקמות ופעילות ביולוגית. בנוסף, מיקום יציב של הכבד בשלב המיקרוסקופ במהלך IVM הוא קריטי למניעת לחץ מכני או נזק לרקמה7. חשיפת רקמת הכבד היא הליך עדין שדורש דיוק טכני למניעת דימום חמור ונזק לפרנכימת הכבד7. כדי להפחית את ארטיפקטי התנועה, כלוב הצלעות של העכבר הורם בעבר משלב המיקרוסקופ באמצעות קרטון, מה שאפשר לכוח הכבידה לגרור את הכבד הרחק משאר הגוף. למרות שהגישה הזו הוכחה כמוצלחת בהפקת נתונים כמותיים, חומר הקרטון אינו בר קיימא כיוון שהוא מאבד צורה וקשה לניקוי. בנוסף, קשה לשנות את מידות התוספת מקרטון כדי להתאים למודלים של עכברים שמנים.

בשנים האחרונות הופיעו מספר טכניקות מיקרוסקופיה כבדית תוך-חיונית מתקדמות, כולל מיקרוסקופיית שדה אור סורקת ומערכות אופטיות משודרגות חישובית, שהראו שיפורים ברזולוציה מרחבית-זמנית23, הפחתת פוטוטוקסיות24, עומק הדמיה גדוליותר 25,26, ודיכוי ארטיפקטים בתנועה27. התפתחויות אלו, כפי שמודגם במחקרים עדכניים 28,29,30, מייצגות התקדמות טכנולוגית חשובה בתחום. מאמר זה מציג את כלי הדמיית כבד רב-פעמי (RHIT), כלי חדשני ל-IVM של כבד עכברו. RHIT תורמת לנוף המתפתח הזה בכך שהיא מציעה כלי ניתן להרחבה ולשימוש חוזר המשפר את היציבות המכאנית והנגישות לרקמות במודלים מגוונים של בעלי חיים, כולל כאלה עם מחלות מטבוליות. העיצוב שלו מתמודד עם האתגרים המתמשכים של תנועה, שונות ומורכבות ההתקנה על ידי שילוב התאמה אנטומית, שחזור במה ונוחות שימוש. התאימות של RHIT לשיטות הדמיה קונבנציונליות ומתקדמות מרחיבה את השימושיות של הטכניקות המתפתחות הללו, ומקדמת דימות כבד תוך-חיוני אמין ויציב פיזיולוגית.

בעוד שהוצעו גישות שונות לייצוב הרקמה במהלך IVM, כגון חלון ניתוח 9,31,32,33,34,35,36 ושלב אקרילי מותאם אישית 6,37, שיטות אלו מציגות גם מגבלות ומורכבויות רבות בכל הנוגע להרחבה, שחזוריות וכישורי ניתוח. בהשוואה, RHIT שונה מבחינה תפקודית במטרתו ובעיצובה. הוא אינו מסתמך על דחיסה ישירה או הטמעה מבוססת ג'ל38. במקום זאת, RHIT משמש ככלי ניתן להרחבה, רב-פעמי, ומעוצב אנטומית, התומך בבידוד הכבד באמצעות מיקום כבידה, תוך שמירה על כיוון פיזיולוגי מבלי להגביל או לעוות את הרקמה. באופן קריטי, RHIT משפר את שחזור הנתונים, דיוק התמונה ועקביות פרוצדורלית במגוון רחב של גדלי עכברים. הוא מבטל את הצורך בג'לים, דבקים או ממשקים ניתוחיים מורכבים, תוך פישוט יישור הרקמות ובקרת הטמפרטורה. יתרה מזאת, RHIT הוא כלי מיוחד שמגשר על הממשק בין בעל החיים למיקרוסקופ, ומתוכנן לסייע הן בתמיכה פיזיולוגית והן בדיוק דימות.

RHIT מתמודדת ישירות עם האתגרים המכניים והאופטיים של דגמים עם פגיעה מטבולית באמצעות הגיאומטריה הניתנת להרחבה, שמאפשרת לגדלים גדולים יותר של בעלי חיים תוך חלוקת משקל באופן שווה כדי למזער את חוסר היציבות של הפלטפורמה. פתח הכבד השקוע מייצב את הרקמה באמצעות כוח הכבידה ללא כוח לחץ, מה שמאפשר גישה עקבית ומפחית תנועה במהלך ההדמיה. העיצוב הרב-פעמי והכימי האינרטי שלו מבטיח תאימות לרקמות ביולוגיות תוך תמיכה בשימוש חוזר היגייני. על ידי מתן מיקום עקבי, מזעור ארטיפקטים של תנועה ושמירה על שלמות הרקמות, RHIT מספקת התקדמות יסודית בתהליכי עבודה במיקרוסקופיה תוך-חיונית. הגמישות והזמינות בקוד פתוח מקדמים שימושיות רחבה במעבדות ובמודלים של בעלי חיים, ומציבים סטנדרט חדש לכלי הדמיה התומכים הן בדגימה והן במערכת ההדמיה.

יתרה מזאת, שלבי מיקרוסקופ מחוממים מסחריים עשויים לדרוש מערכות מיקרוסקופ מתקדמות וטיפול39. הם אינם ניתנים להרחבה לדגימה ובדרך כלל יקרים יותר, מה שהופך אותם לפחות נגישים עבור חוקרים רבים. לכן, הוספה רב-פעמית וניתנת להרחבה חשובה לסטנדרטיזציה של IVM למודלים שונים של בעלי חיים. טכנולוגיית ההדפסה התלת-ממדית, המכונה גם ייצור תוספתי, הפכה לפופולרית יותר ויותר במעבדותמדעיות, ומשנה פרוטוקולי מעבדות ביוכימיה, פיזיקה וביולוגיה. עבור IVM, טכנולוגיית תלת-ממד שימשה לייצור חלונות אופטיים קלים להדמיה41,42, שיפור נגישות הרקמות43, והקלה על תיקון ושחזור רקמות44. לכן, כלי מותאם אישית לייצוב רקמות, שלמיטב ידיעתנו לא תואר, מהווה הזדמנות מצוינת להשתמש בהדפסת תלת-ממד כדי להתגבר על חלק מהאתגרים של IVM בכבד.

RHIT נוצר באמצעות שיטת הדפסה תלת-ממדית חד-שלבית ומשפר משמעותית את ייצוב הרקמות לתקופה ממושכת. RHIT נגיש מאוד ומתאימה לניסויים ב-IVM חריפים שדורשים מומחיות כירורגית מינימלית. בנוסף, RHIT ניתנת להרחבה בקלות לגודל של בעלי חיים ועלות הייצור נמוכה. לבסוף, אנו מראים ש-RHIT מאפשר הדמיית פלואורסצנציה טיים-לאפס יציבה ומשפר את יציבות הרקמה בהשוואה לתוספת קרטון ששימשה בעבר. RHIT מפשט את ה-IVM של ההומאוסטזיס של שומן הכבד ללא מגע ישיר או השפעה מדידה על מצבים פיזיולוגיים. כתוצאה מכך, RHIT מציגה יתרון תחרותי כתרומה מואצת, רב-פעמית וגמישה ל-IVM 34,36,45.

figure-introduction-1
איור 1: עיצוב RHIT. (א) עיצוב ומידות של RHIT בקוטר 3.0 מ"מ מותאמים לעכבר שמן. תצוגת הפנים (משמאל) מציגה את המימדים, המיקום וגודל פתח הרקמה, וכן את כיוון העכבר במהלך ההדמיה. התצוגה הצדדית (מימין) כוללת מידות ומציינת את מיקום כרית החימום והכנסת גלאי הטמפרטורה. פרמטרי קנה מידה לגדלים שונים של עכברים מוצגים בטבלה 1. (B) תצוגת פנים תלת-ממדית של RHIT שנוצרה מקובץ הקוד הפתוח STL, המראה היכן חוט הגשוש הרקטלי מוכנס דרך היציאה המותאמת אישית (מימדי הכנסת הגלאי הרקטלי מסומנים בתמונה למעלה מימין). (ג) הרכבה טכנית של RHIT המדגימה את שילוב מכשיר החימום והתוספות המבניות המותאמות לגדלים שונים של RHIT, החוט מותקן בכניסת הגשוש הרקטלי לצורך גישה לגלאי טמפרטורה. קיצור: RHIT = כלי דימות כבד רב-פעמי. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

RHIT תוכנן במקור כאוסף חד-חלקי המשתמש ב-ABS (אקרילוניטריל בוטאדיין סטירן), פולימר תרמופלסטי נפוץ במודל הדפסת תלת-ממד45. ל-ABS יש מספר יתרונות ליישום זה: הוא קל משקל, עמיד לחום (נקודת התכה ~200 מעלות צלזיוס), ובעל עמידות טובה בפני פגיעות 46,47,48. העיצוב של RHIT מנצל את הצפיפות הניתנת לכיוון של ABS, ומאפשר לו לספוג תנועה פיזיולוגית כמו דופק ונשימה. צפיפות מילוי מוגברת משפרת את דיכוי התנועה, מה שמוביל ליציבות תמונה גבוהה יותר ולאיכות תמונה משופרת.

RHIT מתוכנן לספוג תנועה באמצעות התאמות לצפיפות של חומר כימי אינרטי כמו ABS. בהקשר זה, צפיפות מתייחסת ספציפית לאחוז המילוי הפנימי המשמש בהדפסת תלת-ממד, המשפיעה על קשיחות הפלטפורמה ויכולתה לדכא את הרעידות 49,50,51. הגדלת צפיפות ABS נצפתה כמפחית את העברת התנועה הנגרמת על ידי דופק ונשימה, מה שמוביל לפלטפורמה יציבה להדמיה ולשיפור איכות התמונה. בדקנו מבני RHIT עם צפיפויות מילוי פנימיות משתנות (20-100%) ושמנו לב באופן איכותני שקונפיגורציות בצפיפות גבוהה יותר הובילו להפחתת ארטיפקטים בתנועה נראית לעין במהלך הדמיה תוך-חיונית של הכבד בעכברים. לא בוצעה כימות פורמלי, שכן תצורת הצפיפות הגבוהה הוכיחה עמידה ויעילה מספיק בכל גדלי RHIT שנבדקו, וסיפקה ביצועים אמינים בעקביות בתנאי הדמיה שגרתיים. עבור רוב המשתמשים, צפיפות ברירת מחדל זו תהיה מתאימה ללא התאמות נוספות. עם זאת, בניסויים הדורשים מאפיינים מכניים ספציפיים, ניתן לשנות את צפיפות המילוי ופרמטרי התכנון, וסופקו הוראות הדפסה תלת-ממדיות מלאות לתמיכה בהתאמה אישית.

חומרים חלופיים יכולים לשמש להדפסה; עם זאת, ABS הוא החומר המועדף לייצור RHIT שכן הוא מציע מספר יתרונות מרכזיים. הוא אינרטי כימית, ומפחית את הסיכון לאינטראקציה עם רקמות או נוזלי גוף, ואינו מסיס במים, מה שמאפשר ניקוי, אחסון ושימוש חוזר יעילים. תכונות אלו הופכות את ABS לבחירה אמינה ועמידה לשימוש ניסיוני. כאשר הגישה למדפסת מודל השקיעה מותכת מוגבלת, ניתן להשתמש בטכניקות וחומרים נוספים להדפסת תלת-ממד. סטריאוליתוגרפיה, סינטר לייזר סלקטיבי והיתוך רב-סילוני הם אפשרויות מתאימות לחומרים כמו ניילון, שרפי פוטופולימר או אבקות מרוכבות. ניילון מספק עמידות וגמישות, בעוד שרפי סטריאוליתוגרפיה מספקים רזולוציה גבוהה ליישומים הדורשים פרטים מבניים דקים. עיצוב RHIT ניתן להתאמה בקלות לסובלנות ולמגבלות של חומרים שונים, מה שהופך אותו לתואם למגוון פלטפורמות הדפסה. המשתמשים צריכים לבחור חומרים בהתבסס על יציבות מכנית, תאימות ביולוגית, תאימות לתהליכי דימות ומשאבי הדפסה זמינים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחקרים בבעלי חיים נערכו במתקני בעלי חיים של המכון הלאומי לבריאות בהתאם להנחיות ופרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים (פרוטוקול מס' LCMB-037). כל הצוות נדרש לעבור הכשרה מתאימה לפני המשך הפרוטוקולים הבאים. טיפול בבעלי חיים בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות.

פרוטוקול RHIT מפרט את הכנת כלי הדמיה כבדיים רב-פעמיים (RHITs) לשימוש בניסויים במיקרוסקופיה תוך-חיונית (IVM). הפרוצדורות הניסיוניות מתבצעות בחדר מיקרוסקופ סטרילי, או במכסה המטוס, וכוללות סדרה של שלבים: תחילה הדפסת RHIT, הרדמה ותיוג פלואורסצנטי של העכבר, לאחר מכן הגדרת המיקרוסקופ, לאחר מכן ניתוח, ולבסוף יישום IVM בסיוע RHIT. איור 1 ואיור 2 ממחישים את הרכיבים הנדרשים להדמיית דגימות חיות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, הכוללים תוספת מתכתית 5,6,7 (מתאם מיקרוסקופ להדמיית דגימות חיות) למיקום RHIT, וכן RHITs לשימוש בסטאטוזיס מתקדם או מבוקר. לצורך בדיקת המערכת, הוגשו זכרים מסוג C57BL/6J Musculus Musculus בגיל 6-10 שבועות והוזנו בדיאטה סטנדרטית או מערבית במשך 8-10 שבועות לפני הניסוי.

1. עיצוב RHIT עם שינויים

  1. כדי לשחזר את RHIT, השתמשו בתוכנת עיצוב מוצר תלת-ממדי (ראו טבלת החומרים). פתח את תוכנת העיצוב וצור חלק סטנדרטי חדש. שמור את הקובץ עם תיאור מתאים.
  2. צור את הסקיצה של RHIT במישור הקדמי באמצעות תכונת יצירת סקיצה דו-ממדית .
    1. לחצו על סמל המלבן והניחו את הפינה השמאלית התחתונה שלו במקור מישור הסקיצה.
    2. צייר מלבן שני בתוך הראשון כדי לייצג את חלון ההדמיה של RHIT.
    3. הוסף ממדים לשני המלבנים באמצעות תכונת הממד , כדי להבטיח שכל האורכים והרוחבים יוזכרו למקור וביחס זה לזה.
    4. כוון את מידות ה-RHIT לפי גודל העכבר.
    5. הוסף עובי ל-RHIT על ידי בחירת המלבן החיצוני בלבד ולחיצה על אקסטרוד. כאשר מופיע חלון קופץ, בחר את הסקיצה באמצעות כלי Extrude כדי להשאיר פתח במרכז.
    6. בחר את הפנים התחתונות של ה-RHIT המוחלט והתחל סקיצה דו-ממדית חדשה באמצעות תכונת Start 2D Sketch .
  3. צייר מלבן כדי להגדיר את הכיס של כרית החימום. יישם את המידות שנרכשו באמצעות תכונת הממד .
    1. צא מהסקיצה הדו-ממדית ובצע הסרת חומר באמצעות כלי Cut Extrude ליצירת חלל עמוק למשטח החום.
  4. התחל סקיצה חדשה לגלאי הטמפרטורה באותו פנים כמו החלל. לחץ על 'התחל סקיצה דו-ממדית ' ובחר את סמל העיגול . הנח את המעגל על פני השטח של המישור וקבע את המידות שלו בהתאם. צא ממצב הסקיצה .
    1. לחץ על אקסטרוד ובחר את הסקיצה של המעגל. במצבe xtrusion , לחץ על חיתוך אקסטרוד, והמתין להופעת חלון קופץ עם אפשרות להסרת חומר. לחץ אוקיי. יציאה ממצב האקסטרוזיה .
    2. הוסף פילטים בקצוות החלון על ידי לחיצה על סמל הפילה ובחירת כל שמונת הקצוות החדים. הוסף את גודל הפילה וצא ממצב הפילה .
      הערה: אם רוצים ספיגת תנועה נוספת, המשתמשים עשויים להגדיל את צפיפות המילוי הפנימית במהלך ההכנה להדפסת תלת-ממד.
  5. הכינו את המודל להדפסת תלת-ממד על ידי ניווט ללשונית הסביבה ובחירת לשונית הדפסה תלת-ממדית.
    1. השתמש בפונקציית הגדרת כיוון כדי לוודא שהמודל שוכב שטוח על משטח ההדפסה ולא מכוון אנכית.
    2. לחצו על אפשרויות הדפסה כדי להגדיר הגדרות יחידה ולהתאים את הקנה מידה במידת הצורך.
    3. שמור את המודל הסופי. פורמט STL המשתמש בפונקציית הייצוא של STL .
    4. צא מלשונית הסביבה ולחץ על שמירה כדי לשמור את RHIT כחלק יציב.
  6. סגור את תוכנית העיצוב.
    הערה: ודא שהמדפסת תואמת ל-. פורמט קובץ STL או המרה לפורמט המתאים לפי דרישת תוכנת המדפסת התלת-ממדית.

2. העלאה והדפסה של RHIT מקבצי STL

  1. ייבא את קובץ .stl מאיור 1A או קובץ משלים 1, לתוכנת עיצוב ממוחשבת תלת-ממדית (CAD) על ידי לחיצה על ייבוא ובחירת קובץ .stl. לחצו על כפתור ההכנה כדי לחתוך את המודל לשכבות דקות להדפסת תלת-ממד.
  2. בחר את המדפסת התלת-ממדית המסחרית המתאימה ולחץ על הדפסה. לאחר מכן, עוקב אחרי התקדמות ההדפסה, וכשההדפסה מסתיימת, הסר ונקה את האובייקט המודפס בתלת-ממד לפי הצורך.
גודל העכברמשקל גוף העכבר (g)עובי RHIT (מ"מ)גודל חלון הדמיה L X W (מ"מ)
Small (S)17-201.517 x 17
בינוני (זכר)22-252.521 x 21
גדול (L)35-40326 x 26

טבלה 1: הגדלת גודל העכבר ל-RHIT. משקל העכבר מותאם לעובי של RHIT, כאשר משקל מעל 30 גרם (ראש חץ) מתאים לעובי הגדול ביותר של RHIT (3.0 מ"מ). העכבר הקל ביותר מתאים ל-RHIT הדק ביותר, והעכברים השמנים מיוצגים על ידי ה-RHIT העבה ביותר. מידות אלו ניתנות להתאמה בתוכנת CAD. אורך ה-RHIT וצמצם ההדמיה יכולים להשתנות בהתאם למיקום האיבר של הדגימה שבה משתמשים; אורך קבוע וצמצם דימות לכל שלושת ה-RHIT היו מתאימים למחקר זה. קיצורים: RHIT = כלי דימות כבד רב-פעמי; CAD = עיצוב בעזרת מחשב.

3. הכנת מיקרוסקופ ושימוש ב-RHIT

figure-protocol-1
איור 2: IVM של כבד באמצעות טכניקת RHIT. (א) סכמטיקה של מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם עכבר מונדם. (ב) מתאם מיקרוסקופ מתכתי (הכנסה) שימש למיקום העכבר על שלב המיקרוסקופ להדמיה חיה. (ג) ה-RHIT המודפס בתלת-ממד שימש עם רצועת גזה כדי לשלוט בקלות בפרנכימת הכבד. (ד) תמונה של הכבד החיצוני מראש לפני מיקום RHIT. קונוס האף שימש להרדמה לפני ובמהלך הניתוח. (ה) תמונה של הכבד החיצוני לפני מיקום RHIT במהלך הליך אקוטי. לא היה צורך בגילוח. (F) תמונה של העכבר ההפוך במצב הפוך סופי על ה-RHIT להדמיה. (G) RHIT מחובר היטב לשלב המיקרוסקופ. (ח) עכבר הממוקם על RHIT ומתאם מתכת. (I) עכברים רזים (חץ כחול) ועכברים שמנים (חץ ירוק) המוצגים עם הכנסות RHIT בקנה מידה בהתאמה ב-J-L מציגים תמונות אנטומיות גסות של כבד שמן וכבד רזה (בהתאמה). תמונות ה-IVM ברזולוציה גבוהה מציגות את M,N של כבד מעכברים שמנים ורזה המסומנים ב-BODIPY (ירוק, מוצג בחץ ורוד) כדי לסמן טיפות שומן ו-Hoechst 33342 (לבן, מתואר בחץ תכלת) לסימון גרעינים, בהתאמה. קיצורים: RHIT = כלי דימות כבד רב-פעמי; IVM = מיקרוסקופיה תוך-חיונית. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

  1. הכינו מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך קונבנציונלי ל-IVM בכבד כפי שמוצג באיור 2.
    1. הכנס מתאם במה כדי להתאים לדגימה. כדי לעקוב אחרי פרוטוקול זה, יש להשתמש בתוספת מתכת מותאמת אישית עם פתח עגול בקוטר 35 מ"מ וזכוכית כיסוי בקוטר 40 מ"מ.
    2. נקה היטב את שני צידי זכוכית הכיסוי לפני ואחרי כל הדמיה, תוך שימוש ב-70% אתנול לפי הצורך.
  2. אבטח את ה-RHIT המתאים לפי גודל העכבר (טבלה 1) עם סרט (אופציונלי) על ידי יישור צמצם RHIT עם עדשת האובייקטיב ובמקביל מעל כיסוי ההדמיה (איור 2G) על התוספת המתכתית עם סרט דבק מעל זכוכית הכיסוי.
  3. בחר אובייקטיב להדמיה בהתבסס על גודל השטח, הרזולוציה המרחבית וזמן ההדמיה, כמו מטרה של 25x/0.95 מים.
    הערה: בעוד שהגדלה גבוהה משפרת את הרזולוציה, היא גם מגבירה את הסיכוי ליצירת ארטיפקטים בתנועה.
    1. יישר את המטרה קרוב לזכוכית המכסה.
  4. אבטח רצועת גזה (בערך 1 על 8 ס"מ, איור 2C,D) על חלון RHIT עם סרט דבק כדי לסייע במיקום הרקמה ולהפרידה מאיברי בטן אחרים (איור 2C).
  5. חימום מוקדם של RHIT באמצעות כרית חימום שהוכנסה לחריץ ומאובטח את גלאי החום הסמוך ל-RHIT (איור 2G,H) כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר במהלך ההדמיה.

4. תיוג פלואורסצנטי והרדמה בעכברים

  1. הפחת את הלחץ של העכבר על ידי חיטוי תא ההרדמה כדי להיפטר מכל שאריות ריח חיות.
  2. הפעל את מעבה החמצן, מערכת הגנה על הסביבה (EPS), ואת מאדה האיזופלורן.
  3. מניחים את העכבר בתא ההשראה והרדימו באמצעות איזופלורן של 2-3% למשך כ-3-5 דקות, או עד שהחיה תראה נשימה יציבה ואובדן רפלקסים של יישור ופדלים.
    1. לאחר ההרדמה, העבר את העכבר לכרית החימום ושמור על ההרדמה באמצעות איזופלורן של 1-2% המועבר דרך קונוס האף (איור 2D), תוך התאמה לפי הצורך כדי להבטיח מישור ניתוחי יציב של הרדמה לאורך כל ההליך.
    2. הערכו את עומק ההרדמה על ידי בדיקת צביטת אצבע כדי לצפות בכל תנועה רצונית.
  4. כדי לתייג מבנים עשירים בשומן, הזריק 200 ננומול של BODIPY 665/676 מדולל ב-PBS (נפח כולל 200 מיקרוליטר) דרך וריד הזנב באמצעות מזרק אינסולין של 31G.
    1. לאות אופטימלי, ניתן BODIPY פעם ביום במשך יומיים רצופים לפני ההדמיה. יש להמתין לפחות 3-4 שעות לאחר ההזרקה השנייה כדי להבטיח ניקוי מערכתי של הרקע וייצוב אות הרקמה.
  5. כדי לספק ניגודיות גרעינית, הזרקו את Hoechst 33342 (2 מיקרוגרם/גרם משקל גוף) מדולל בתמיסת הפארין 1x (שהוכנה על ידי ערבוב של 120 מיקרוליטר הפארין עם 180 מיקרוליטר של מלח ליצירת 400 U/mL) דרך הסינוס הרטרו-אורביטלי באמצעות מזרק אינסולין של 31 G.
    הערה: הוכסט ניתנת בנפרד כדי למנוע הצפה כאשר היא מעורבבת עם צבעים אחרים.
  6. כדי להמחיש את כלי הדם, הזרקו 18 מיקרוגרם/גרם משקל גוף של דקסטרן פלואורסצנטי (70 קילו-דלטון) מדולל באותו תמיסת הפארין של 1x המתוארת בשלב 4.5, דרך הסינוס הרטרו-אורביטלי הנגדי באמצעות מזרק אינסולין של 31 גרם (טבלה 2).
    הערה: הפארין כלול להפחתת היווצרות קרישי דם ולקידום זרימת דם עקבית במהלך ההדמיה.
  7. המתינו 10-15 דקות אחרי הזרקות הוכסט והדקסטרן לפני תחילת הניתוח וההדמיה.
כתב פלואורסצנטימטרהמינון למשקל (או ריכוז)
Hoechst 33342גרעיני כתמים2 מיקרוגרם/גרם: הוסף נפח ההזרקה ל-50 מיקרוליטר עם תמיסת הפארין
בודיבי 665/676טיפות שומן מוכתמות0.8 מיקרוגרם/גרם: הגדל את נפח ההזרקה ל-200 מיקרוליטר בתמיסת מלח
2M טטרמתיל רודמין-דקסטרן (דקסטרן)כלי דם של כתמים18 מיקרוגרם/גרם: השלמת נפח ההזרקה ל-50 מיקרוליטר עם תמיסת הפארין

טבלה 2: אפשרויות לדיווח פלואורסצנטי. טבלה זו מספקת תיאור מפורט של השיטות המשמשות לתיוג רקמות עכברים להדמיה בחיים. תמיסת הפארין מוכנה תחילה ואז משמשת ליצירת פתרונות DAPI-הפארין ודקסטרן-הפארין7. Hoechst 33342 מוזרק רטרו-אורביטלית לעין אחת, בעוד ש-BODIPY מוזרק ישירות לווריד הזנב 2-3 ימים קודם לכן, בריכוז גבוה יותר לעכברים שמנים. דקסטרן מוזרק רטרו-אורביטלית לעין השנייה. חשוב לבצע הזרקות רטרו-אורביטליות בנפרד בכל עין. קיצור: DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול.

5. ניתוח עכברים

  1. לגלח את פרוות הבטן עם מכונת תספורת שיער ו/או קרם להסרת שיער. הסר שאריות שיער והשתמש ב-70% אתנול לניקוי העור החשוף.
    הערה: בהתאם לדרישות ה-IACUC המוסדיות, ניתן להשתמש בניקוי מתחלף של בטדין ואתנול כדי להבטיח הכנה מתאימה לאתר הניתוח.
  2. הערך מחדש את עומק ההרדמה לפני הניתוח.
  3. חשיפת הכבד על ידי חתך אופקי בצורת סהר בגודל 2-3 ס"מ מתחת לצלעות, באמצעות מספריים כירורגיים מהזיפואיד, שמסתיים בצד השמאלי של הבטן העליונה.
  4. לאחר החתך הראשוני, יש לבצע בזהירות חתך משני קטן יותר בשכבת השריר כדי לחשוף את האונה השמאלית של הכבד, לצרוב (אופציונלי) לפי הצורך כדי למנוע דימום (איור 2E).
    1. מנעו נזק חום לכבד בזמן השימוש בצריף על ידי הנחת גזה ספוגה במי מלח בין הכבד לשכבת השריר כדי לספוג את החום הנפלט משכבת השריר.
    2. הימנע מדימום מופרז, טראומה כירורגית או מכנית, או דחיסה חיצונית.
  5. לאחר שהכבד נחשף, העבר את העכבר לשלב המיקרוסקופ.

6. מיקום העכבר על שלב המיקרוסקופ

  1. מקם את בטן העכבר המורדם כלפי מטה מעל פלטפורמת ה-RHIT של המיקרוסקופ.
    1. כוון את חרוט האף כך שהעכבר יישאר תחת הרדמה.
    2. השתמשו באפליקטור עם קצה כותנה רטוב במי מלח כדי להזיז בעדינות את האונה הצדדית השמאלית של הכבד נגד הכיסוי תוך הפעלת לחץ חיצוני עדין על חלל החזה.
      הערה: נצל את כוח הכבידה כדי לנווט בזהירות את הכבד החוצה אל זכוכית הכיסוי.
    3. השתמש ברצועת גזה כדי להפריד בעדינות את הכבד מגוף העכבר (איור 2E-H).
  2. בדקו שוב את חרוט האף כדי לוודא שהעכבר נשאר תחת הרדמה במהלך ההדמיה.
  3. מנעו התייבשות רקמית על ידי מריחת ג'ל מבוסס מים סביב קצוות החלל החשוף והימנעות ממגע ישיר עם כרית החום.
    הערה: שמירה על טמפרטורה ולחות יכולה להיות מועילה גם באמצעות מיקרוסקופ עם תא לחות סגור 5,6,7.
  4. מרחו משחה עינית על העיניים כדי למנוע ייבוש בקרנית.
  5. הגדר IVM עם טיימלפס כדי להתחיל בהדמיה 7,52.
    1. פתח תריסי לייזר, הערך סימון פלואורסצנטי, וזיהוי אזור יציב עם זרימת דם משמעותית. בחרו פרמטרים מתאימים לרכישת תמונה, כולל פורמט תמונה, מהירות צילום, מרווחי דימות, משך רכישה כולל וממוצע שורה/פריימים (512 × 512 פיקסלים; 1-5 פריימים שניות/שנייה לאזור; מרווחי הדמיה של 5-30 שניות; זמן רכישה כולל של 5-20 דקות; ממוצע שורה/פריים של 2-8, בהתאם לדרישות הניסוי). אופטימיזציה לחשיפה לפלואורסצנציה כדי להתאים לפלואורופורים שבהן משתמשים.
    2. הגדר גבולות עליונים ותחתונים עבור ערימות Z על ידי בחירת Z-Stack בפאנל הרכישה , התאמת מישורי המוקד העליון והתחתון באמצעות בקרות מיקום Z, ואישור הטווח באמצעות Set First/Set Last; לאחר מכן התחל את הקלטת הטיימ-לפס על ידי לחיצה על Start Experiment (או Start Acquisition). בסיום ההדמיה, יש להמתים את בעל החיים בהתאם לפרוטוקולים מוסדיים שאושרו על ידי הוועדה.

figure-protocol-2
איור 3: מדידת היציבות המשופרת של RHIT ב-IVM בכבד באמצעות SSIM. IVM כבדי של האונה השמאלית התחתונה של הכבד תחת שלושה תנאי ייצוב: (א) ללא החדרה (לא), (ב) החדרה מקרטון, ו-(ג) RHIT. רקמות מסומנות ב-BODIPY (מג'נטה, ליפידים), Hoechst 33342 (ירוק, גרעינים) ודקסטרן (טורקיז, כלי דם); פאנלים A ו-B מציגים עיוות נראים ותכונות תנועה, בעוד ש-C מציג בהירות מוגברת עם RHIT. (D) מדד דמיון מבני (SSIM) חושב לכימות יציבות התמונה. הפסים מציגים ממוצע ± SEM, וכל נקודה צבעונית מייצגת שכפול ביולוגי בודד: RHIT (n = 14), קרטון (n = 10), No Insert (n = 8). קבוצות אלו הן תת-קבוצות שנלקחו מקבוצת הניסוי הכוללת כ-50-70 עכברים. רק מפגשים שעמדו בקריטריונים ספציפיים להדמיה (למשל, יישור פריימים עקבי ואיכות תמונה) נותחו באמצעות SSIM. RHIT ייצר בעקביות ערכי SSIM גבוהים יותר (ממוצע 0.511 ± SEM), מה שמעיד על שיפור ביציבות וברזולוציה בתנאי הדמיה. פסי סולם = 15 מיקרון. מוצגות תמונות מייצגות; SSIM משקף מפגשי IVM סדרתיים ללא נזק או הפרעה נראים לעין. קיצורים: RHIT = כלי דימות כבד רב-פעמי; IVM = מיקרוסקופיה תוך-חיונית; SSIM = מדד דמיון מבני; CARD = תוספת מקרטון. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מוגדלת של הדמות הזו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RHIT תוכנן באמצעות יישום CAD (איור 1). ממדי RHIT מותאמים להתאים לעכברים קטנים, בינוניים וכבדים (טבלה 1). עיצוב RHIT מורכב מחומר ABS שטוח באורך 107.50 מ"מ עם פתח הממוקם כך שיאפשר הדמיית כבד. IVM בוצע בתנאים אופטימליים (RHIT) ופחות אופטימליים (ללא החדרה או קרטון) (ראו איור 3A-C). זה ממחיש את טווח התוצאות האפשריות ואת מידת היציבות שהושגה בעת שימוש ב-RHIT. RHIT נבדק בכ-50-70 עכברים בגדלים שונים, אשר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה תוך-חיונית של הכבד נחקרה לעומק, אך שיטות קודמות דורשות לעיתים הליכים כירורגיים פולשניים ובלתי סטנדרטיים להדמיה סופית מיוצבת 5,6,7,9,31,32. תנועה היא ככל הנראה המחסום המאתגר ביותר שמונע הדמיה שחוזרת ב-IVM בכבד. הפתרון היעיל ביותר למניעת תופעות נשימתיות הוא אינטובציה והנשמה מבוקרת, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר הפנימית במכון הלאומי לבריאות של ארה"ב, המכון הלאומי לסרטן וספריית NIH. H. Sanchez Cornejo מודה לסוכנות הפרואנית CONCYTEC על תמיכה כספית באמצעות מענק מס' PE501087367-2024-PROCIENCIA. אנו רוצים להודות לחברי מעבדת פורת-שלם ולשותפים בקבוצת פיזיקת הקוונטים של אוניברסיטת קיימברידג' על קריאה ביקורתית, לצוות ספריית NIH ולגנטי גאגא על הסיוע הטכני. התמונה המוצג בתלת-ממד באיור 2A נוצרה באמצעות Biorender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סרט מסיכה ½inchסרט מסכה כללי 3M:b40069428
כיסויי 40 מ"מביופטק40-1313-03191
70% (v/v) אתנולתרמו פישר סיינטיפיקBP2818-470% אתנול בנפח ו-30% מים בנפח
מכונת הרדמה: AMD-3 PlusסומניAMD-17106
ג'ל העברת אולטרסאונד Aquasonic 100מעבדות פארקר  01 08
בודיפי 665/67תרמו פישר סיינטיפיק (Invitrogen)B3932ראו טבלה 2
תוכנת CAD (Autodesk Inventor או מקביל) Autodesk (תוכנת CAD מייצגת)לא זמיןתוכנה
מערכת צריבהתאומיםGEM 5917
חיטוי Clidoxמעבדות המחקר של פארמקול בע"מVWR, MSPP-96118F
מיקרוסקופ קונפוקלי (Leica SP8 או מקביל)לייקהSP8
אפליקטורים עם קצה כותנהמוצרים רפואיים פוריטניים25-806 1WC
תוספת שלב מאלומיניום מותאמת אישית (בעובי 3 מ"מ, שקע של 35 מ"מ)לא זמיןלא זמין
נוזל FORANE (איזופלורן, USP) לשאיפה, 250 מ"לבקסטר10019-360-60
מכונת תספורת (אופציונלי)אוניקס פיין אינסטרומנטסASWRHC
רפידת חימום עם גלאי רקטליALA Scientific Instrumentsפד חימום-1/2
הפארין נתרן, 1000 USP U/mLהיקמה0641-0391-12
Hoechst 33342תרמו פישר סיינטיפיק (Invitrogen)62249ראו טבלה 2
כרית חימום עכברALA Scientific Instrumentsפד חימום-1/2
Mus musculusמעבדת ג'קסוןC57BL/6עכבר מעבדה
סליין רגיל (0.9% נתרן כלוריד)תרמו פישר סיינטיפיק7210-16
RHIT (כלי הדמיה כבדית רב-שימושי) בגודל מתאיםסופקולא זמיןראו טבלה 1
מלקחיים כירורגיים, קצה מעוקלכלי המדע המדויק11251-23
גזה כירורגיתמקסון6939
מספריים כירורגייםכלי המדע המדויק14001-14
טטרמתילרודאמין דקסטרןתרמו פישר סיינטיפיק (Invitrogen)D7139ראו טבלה 2
מזרקי אינסולין U-100 אולטרה-דקים, 31 גרםבטי מילסBD326730

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 89(2022).
  2. Hor, J. L., Germain, R. N. Intravital and high-content multiplex imaging of the immune system. Trends Cell Biol. 32 (5), 406-420 (2022).
  3. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J Cell Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  4. Meyer, K., et al. A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule. Cell Syst. 4 (3), 277-290.e9 (2017).
  5. Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
  6. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  7. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  8. Zhang, X. Y., Sun, C. K., Wheatley, A. M. A novel approach to the quantification of hepatic stellate cells in intravital fluorescence microscopy of the liver using a computerized image analysis system. Microvasc Res. 60 (2), 232-240 (2000).
  9. Gola, A., et al. Commensal-driven immune zonation of the liver promotes host defence. Nature. 589 (7840), 131-136 (2021).
  10. Kamoun, W. S., Schmugge, S. J., Kraftchick, J. P., Clemens, M. G., Shin, M. C. Liver microcirculation analysis by red blood cell motion modeling in intravital microscopy images. IEEE Trans Biomed Eng. 55 (1), 162-170 (2008).
  11. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2020).
  12. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  13. Soulet, D., Lamontagne-Proulx, J., Aube, B., Davalos, D. Multiphoton intravital microscopy in small animals: motion artefact challenges and technical solutions. J Microsc. 278 (1), 3-17 (2020).
  14. Mempel, T. R., Bauer, C. A. Intravital imaging of CD8+ T cell function in cancer. Clin Exp Metastasis. 26 (4), 311-327 (2009).
  15. Lee, S., Courties, G., Nahrendorf, M., Weissleder, R., Vinegoni, C. Motion characterization scheme to minimize motion artifacts in intravital microscopy. J Biomed Opt. 22 (3), 036005(2017).
  16. Rhodes, G. J. Surgical preparation of rats and mice for intravital microscopic imaging of abdominal organs. Methods. 128 (1), 129-138 (2017).
  17. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  18. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2019).
  19. Dawson, C. A., et al. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nat Protoc. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  20. Murphy, K. J., Reed, D. A., Trpceski, M., Herrmann, D., Timpson, P. Quantifying and visualising the nuances of cellular dynamics in vivo using intravital imaging. Curr Opin Cell Biol. 72 (1), 41-53 (2021).
  21. Pereira, E. N. G. dS., et al. Hepatic microvascular dysfunction and increased advanced glycation end products are components of non-alcoholic fatty liver disease. PLoS One. 12 (6), e0179654(2017).
  22. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  23. Lu, Z., et al. Long-term intravital subcellular imaging with confocal scanning light-field microscopy. Nat Biotechnol. 43 (4), 569-580 (2025).
  24. Lu, Z., et al. A practical guide to scanning light-field microscopy with digital adaptive optics. Nat Protoc. 17 (8), 1953-1979 (2022).
  25. Zhang, Y., et al. Computational optical sectioning with an incoherent multiscale scattering model for light-field microscopy. Nat Commun. 12 (1), 6391(2021).
  26. Zhao, Z., et al. Two-photon synthetic aperture microscopy for minimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deep tissue. Cell. 186 (11), 2475-2491.e22 (2023).
  27. Lu, Z., et al. Virtual-scanning light-field microscopy for robust snapshot high-resolution volumetric imaging. Nat Methods. 20 (5), 735-746 (2023).
  28. Chen, S., et al. Hepatocyte-specific Mas activation enhances lipophagy and fatty acid oxidation to protect against acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. J Hepatol. 78 (3), 543-557 (2023).
  29. Chen, S., et al. Myeloid-Mas signaling modulates pathogenic crosstalk among MYC+CD63+ endothelial cells, MMP12+ macrophages, and monocytes in acetaminophen-induced liver injury. Adv Sci. 11 (1), 2306066(2024).
  30. Wu, J., et al. Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale. Cell. 184 (12), 3318-3332 (2021).
  31. Benechet, A. P., Ganzer, L., Iannacone, M. Intravital microscopy analysis of hepatic T cell dynamics. Methods Mol Biol. 1514 (1), 49-61 (2017).
  32. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following Leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics. J Vis Exp. 98 (1), e52303(2015).
  33. Heymann, F., et al. Long-term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (98), e52607(2015).
  34. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128 (1), 12-19 (2017).
  35. Wang, J., Kubes, P. A reservoir of mature cavity macrophages that can rapidly invade visceral organs to affect tissue repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
  36. Wang, Y., Wang, J. Intravital imaging of inflammatory response in liver disease. Front Cell Dev Biol. 10 (1), 922041(2022).
  37. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  38. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  39. Liu, T. W., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, D. Multi-modal multi-spectral intravital microscopic imaging of signaling dynamics in real time during tumor-immune interactions. Cells. 10 (3), 499(2021).
  40. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  41. Kuss, M., Crawford, A. J., Alimi, O. A., Hollingsworth, M. A., Duan, B. Three-dimensional printed abdominal imaging windows for in vivo imaging of deep-lying tissues. Machines. 10 (8), 697(2022).
  42. Xie, W., et al. 3D-printed lightweight dorsal skin fold chambers from PEEK reduce chamber-related animal distress. Sci Rep. 12 (1), 11599(2022).
  43. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  44. Urciuolo, A., et al. Intravital three-dimensional bioprinting. Nat Biomed Eng. 4 (8), 901-915 (2020).
  45. Dul, S., Gutierrez, B. J. A., Pegoretti, A., Alvarez-Quintana, J., Fambri, L. 3D printing of ABS nanocomposites: comparison of processing and effects of multi-wall and single-wall carbon nanotubes on thermal, mechanical and electrical properties. J Mater Sci Technol. 121 (1), 52-66 (2022).
  46. Stansbury, J. W., Idacavage, M. J. 3D printing with polymers: challenges among expanding options and opportunities. Dent Mater. 32 (1), 54-64 (2016).
  47. Ligon, S. C., Liska, R., Stampfl, J., Gurr, M., Mulhaupt, R. Polymers for 3D printing and customized additive manufacturing. Chem Rev. 117 (15), 10212-10290 (2017).
  48. Das, A., et al. Current understanding and challenges in high-temperature additive manufacturing of engineering thermoplastic polymers. Addit Manuf. 34 (1), 101218(2020).
  49. Turaka, S., Jagannati, V., Pappula, B., Makgato, S. Impact of infill density on morphology and mechanical properties of 3D-printed ABS/CF-ABS composites using design of experiments. Heliyon. 10 (9), e29920(2024).
  50. Ahmad, M. N., Yahya, A. Effects of 3D printing parameters on mechanical properties of ABS samples. Designs. 7 (6), 136(2023).
  51. Nguyen, T. T., Tran, V. T., Nguyen, V., Nguyen, V. T. T. Effect of infill ratios in SLA 3D printing on mechanical properties of castable wax patterns for molded shells in investment casting. PLoS One. 20 (2), e0311245(2025).
  52. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  53. Wang, Z., Bovik, A. C., Sheikh, H. R., Simoncelli, E. P. Image quality assessment: from error visibility to structural similarity. IEEE Trans Image Process. 13 (4), 600-612 (2004).
  54. Madhav, B. T. P., Rao, M. V. G., Pisipati, V. G. K. M. Identification of liquid crystalline phases in 7O.O9 compound based on structural similarity index measure. Liq Cryst. 42 (2), 198-203 (2015).
  55. Zhou, W., Bovik, A. C. A universal image quality index. IEEE Signal Process Lett. 9 (1), 81-84 (2002).
  56. Winkler, S. Human Vision and Electronic Imaging IV. , 175-184 (1999).
  57. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Front Cell Dev Biol. 8 (1), 620471(2020).
  58. Matsumoto, S., Kikuta, J., Ishii, M. Intravital Imaging of Dynamic Bone and Immune Systems: Methods and Protocols. Ishii, M. , 137-143 (2018).
  59. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  60. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (5), 551-558 (2013).
  61. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  62. de Paz, J. L., et al. Profiling heparin-chemokine interactions using synthetic tools. ACS Chem Biol. 2 (11), 735-744 (2007).
  63. Taqueti, V. R., Jaffer, F. A. High-resolution molecular imaging via intravital microscopy: illuminating vascular biology in vivo. Integr Biol (Camb). 5 (3), 278-290 (2013).
  64. Freund, J. B., Goetz, J. G., Hill, K. L., Vermot, J. Fluid flows and forces in development: functions, features and biophysical principles. Development. 139 (7), 1229-1245 (2012).
  65. Tabira, K., et al. An in vitro study of digital impressions and three-dimensional printed models of orbital defects using mobile devices and monoscopic photogrammetry. J Oral Sci. 65 (2), 127-130 (2023).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים