מאמר שיטה

חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית מבוססי פלואורופור להדמיית פלואורסצנציה רציומטרית בחיידקים

DOI:

10.3791/68339

⸱

1 באוגוסט 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, 2Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, 3Institute of Cell and Interaction Biology, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, 4Université de Lyon, INSA Lyon, CNRS, Université Claude Bernard Lyon 1

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את היישום של חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית מבוססי פלואורופור בחיידקים להדמיה פלואורסצנטית יחסית כמותית בתנאים מבוקרים. על ידי שילוב אסטרטגיות חישה ביולוגיות אלה עם טכניקות הדמיה מתקדמות, השיטה מאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה בזמן אמת ברמת התא הבודד, ומספקת תובנות עמוקות יותר לגבי דינמיקה של מולקולות קטנות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקירת דינמיקה של מולקולות קטנות בתוך חיידקים חיונית למחקרים מקיפים של תפקוד מיקרוביאלי. גם דינמיקה של מולקולות קטנות תוך-אורגניזם וגם בין-אורגניזם ממלאות תפקידים קריטיים בפיזיולוגיה מיקרוביאלית, סימביוזה ומחלות. עם זאת, ניטור דינמיקה זו נותר מאתגר ביותר באמצעות רוב הטכניקות הקיימות. חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית מבוססי פלואורופור הם כלים רבי עוצמה למעקב אחר דינמיקה של מולקולות קטנות in vivo ויש להם פוטנציאל גבוה להניע תגליות חדשות. חיישנים ביולוגיים אלה משמשים לרוב בהדמיה פלואורסצנטית, לרוב בשילוב עם התקני זלוף המאפשרים שליטה מדויקת על תנאי הסביבה. בשילוב עם טכניקות הדמיה מתקדמות, גישה זו מספקת נתונים ברזולוציה גבוהה, נפתרים מרחבית וזמנית, ומאפשרת תובנות לגבי תגובות מיקרוביאליות של תא בודד. למרות ההבטחה שלהם, יישום חיישנים ביולוגיים כאלה נותר מאתגר מבחינה טכנית. הבנת השלבים העיקריים חיונית לאימוץ רחב יותר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שנועד לתמוך בפריסה יעילה של חיישנים ביולוגיים מהונדסים חדשים לתוך חיידקים להדמיה פלואורסצנטית יחסית כמותית בתנאים מבוקרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיישנים ביולוגיים מבוססי עוצמת פלואורופור יחיד ופלואורופור כפול נמצאים בשימוש נרחב על ידי חוקרים למגוון יישומים1. מחקרים מסוימים השתמשו בניתוחי חיישנים ביולוגיים מרובים כדי לעקוב בו זמנית אחר אותות מרובים בתוך אותם תאים2. רבים מהחיישנים הביולוגיים הללו מסתמכים על תחומי קשירת ליגנד, שבהם אירועי קשירה גורמים לשינויים קונפורמטיביים המשנים את תכונות הקרינה 3,4. חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית הפכו לכלים חיוניים להדמיה in vivo במגוון מערכות5, המאפשרים ניטור ברזולוציה גבוהה של רמות יונים ומטבוליטים במרחב ובזמן1. עם זאת, חיישנים ביולוגיים מוקדמים היו מוגבלים בטווח הדינמי וביחס אות לרעש (SNR)6. ההתקדמות האחרונה בביו-חיישנים אינטנסיביים של פלואורופור יחיד המבוססים על חלבונים פלואורסצנטיים רגישים לקונפורמציה (csFPs) שיפרו משמעותית את הביצועים. עם זאת, וריאציות ברמות ביטוי החלבון יכולות להשפיע על מדידות in vivo באמצעות חיישנים ביולוגיים מבוססי פלואורופורמקודדים גנטית 6, המשמשים בדרך כלל להמחשת מולקולות איתות ומטבוליטים בתאים חיים 7,8. חיישנים ביולוגיים אינטנסיביים בודדים של פלואורופור אינם מאפשרים נורמליזציה לרמות ביטוי חיישנים ביולוגיים, שעלולות להשתנות in vivo. שילוב חלבון פלואורסצנטי ייחוס, לעומת זאת, יכול להמיר חיישנים ביולוגיים של פלואורופור יחיד לגרסאות יחס פלואורופור כפולות, מה שמאפשר כימות אמין יותר9. עקב אובדן אנרגיה מתהליכים שאינם קרינה, ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית מוסט ביחס לספקטרום הספיגה, תופעה המכונה משמרת סטוקס10. חלבון פלואורסצנטי גדול של סטוקס (LSSFPs) שימש כפלואורופורים ייחוס אופטימליים בחיישנים ביו-מטריים של יחס פלואורופורכפול 9,11. התקדמות אחרונה היא פיתוח חיישנים ביולוגיים של Green-Apple (GA) Matryoshka מעוררים מונוכרומטית, הידועים בשם GA-MatryoshCaMP6s, המשלבים LSSFP אדום, הנקרא LSSmApple12. בשילוב עם מיקרו-התקנים כגון מערכות מיקרופלואידיות, חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית מבוססי פלואורופור מציעים גישה זעיר פולשנית להדמיה רציומטרית כמותית באמצעות טכניקות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית. אינטגרציה זו מאפשרת הדמיה במהירות גבוהה וניטור בזמן אמת של דינמיקה של מולקולות קטנות בתאים בודדים תחת לחץ סביבתי. לדוגמה, חיישנים ביולוגיים של cAMP וגלוקוז יושמו בהצלחה בשמרים. כאשר משתמשים בהם בשילוב עם זנים מוטנטיים, חיישנים ביולוגיים אלה עזרו להבהיר רשתות רגולטוריות מרכזיות השולטות בספיגת סוכר13,14. למרות ההתקדמות המשמעותית, טכנולוגיות אלה עדיין לא הגיעו למלוא הפוטנציאל שלהן לחקור שאלות ביולוגיות קריטיות הכוללות דינמיקה של מולקולות קטנות in vivo15. כתוצאה מכך, האימוץ הנרחב שלהם במעבדות נותר מוגבל, ועדיין חסרות מתודולוגיות סטנדרטיות ליישום רחב יותר.

בהשוואה למתודולוגיות מסורתיות המסתמכות על חיישנים ביולוגיים לא רציומטריים של פלואורופור יחיד או מדידות ברמת תפזורת, הפרוטוקול שלנו המבוסס על חיישנים ביולוגיים GA Matryoshka מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה, תא יחיד עם ניתוח רציומטרי כמותי. על ידי שילוב הפלואורופור הגדול של סטוקס כהתייחסות פנימית, השיטה מפצה על השונות בביטוי החיישנים הביולוגיים, מגבלה מרכזית של עיצובים קודמים. בנוסף, השילוב עם התקנים מיקרופלואידיים מאפשר שליטה מדויקת בתנאי הסביבה, ומציע שיפור לעומת תאי זלוף קונבנציונליים או מערכות תרבית סטטית12. גישה זו מספקת גם יתרונות מובהקים לחקר אינטראקציות דינמיות בין חיידקים למארחים שלהם, כגון אינטראקציות צמחים-פתוגנים ואסוציאציות סימביוטיות כגון מיקוריזה, כאשר רזולוציה מרחבית וזמנית ברמת התא חיונית לחשיפת המנגנונים המולקולריים של תקשורת וחילופי חומרים מזינים.

בהקשר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב להדמיית חיישנים ביולוגיים רציומטריים בחיידקים. למרות שהוא מותאם במיוחד ליישום בשמרים, ניתן להתאים פרוטוקול זה לשימוש במיקרובים אחרים, כולל חיידקים, ולהרחיב אותו לאורגניזמים שאינם מודלים כגון חיידקים הקשורים לצמחים. לדוגמה, ניתן להשתמש בחיישנים ביולוגיים בשילוב עם מערכות מיקרופלואידיות להדמיה פלואורסצנטית כמותית של איתות סידן בשמרים, מה שמאפשר ניטור בזמן אמת של תגובות סידן תחת לחץ סביבתי14.

פרוטוקול זה נועד להנחות חוקרים בפריסה יעילה של חיישנים ביולוגיים שתוכננו לאחרונה, ובכך לקדם את חקר התהליכים הביולוגיים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית מבוססת חיישנים ביולוגיים במערכות מיקרוביאליות. הוא כולל המלצות מעשיות על תנאי גידול שמרים, הגדרות עירור/פליטה אופטימליות ותאימות לזני שמרים נפוצים (למשל, K601 ו-W303-1A MAT-a). מגבלות בולטות כוללות פוטוהלבנה במהלך מפגשי הדמיה ממושכים ואתגרים הקשורים לביטוי חיישנים ביולוגיים בדגימות ביולוגיות. מכיוון שגורמים רבים יכולים להשפיע על התוצאה של ניסויי הדמיה ביו-חיישנים in vivo , פרוטוקול שלב אחר שלב זה נועד גם לעזור לחוקרים לצפות ולהתגבר על אתגרים פוטנציאליים, ובכך להקל על יישומים הניתנים לשחזור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תכנון רציונלי של חיישנים ביולוגיים רציומטריים (איור 1)

הערה: חלבון הקישור המעניין נבחר כתחום החושי על סמך קריטריונים רלוונטיים, כולל (i) ספציפיות, (ii) זיקה, (iii) מידע מבני, ו-(iv) סידור מחדש של קונפורמציה בעת קשירת ליגנד. הספציפיות מבטיחה שהחיישן הביולוגי מגיב באופן סלקטיבי למולקולת המטרה ללא תגובתיות צולבת. זיקה נחשבת כמתאימה לטווח הריכוז הצפוי של מולקולת המטרה בהקשר הביולוגי. מידע מבני, הנגזר מנתונים ניסיוניים או מודלים חישוביים כמו אלה שנוצרו על ידי AlphaFold, מספק תובנות לגבי הארגון התלת מימדי של התחום החושי והשינויים הקונפורמטיביים הנגרמים על ידי ליגנד. תובנות אלה משמשות לזיהוי נקודות החדרה מתאימות לפלואורופורים. לאחר מכן מפותחת אסטרטגיית אימות כדי להעריך את ההיענות והטווח הדינמי של החיישן הביולוגי, בהתאם ליישומים המיועדים.

  1. בנה את עיצוב המטריושקה בסיליקו על ידי הכנסת קלטת המטריושקה12 של התפוח הירוק לתחום החושי באופן כזה שהחלבון הפלואורסצנטי הירוק (cpGFP) המעגלי, הרגיש לשינויים קונפורמטיביים, מגיב לסידורים מחדש המושרים על ידי קשירת ליגנד של התחום החושי.
    1. השתמש בתוכנות הדמיה מולקולרית, כגון Chimera, כדי לנתח את מבנה תחום הכריכה. אם המבנה התלת מימדי אינו זמין, השתמש ב- AlphaFold כדי ליצור מודל אמין.
    2. זהה לולאות גמישות בתוך מבנה החלבון כנקודות תורפה ואתרי החדרה פוטנציאליים לקלטת הפלואורופור הכפולה, שנבחרו כדי למנוע שיבוש התפקוד הכללי או היציבות של החלבון.
    3. השתמש שוב ב-AlphaFold כדי לחזות את מבנה החלבון הכימרי המכיל את קלטת ה-FP הכפולה שהוכנפה, ומאשר שההחדרה אינה מציגה שינויים מבניים שליליים.
    4. שיבוט החיישן הביולוגי נבנה ל-DNA פלסמיד המאפשר ביטוי בתאי שמרים. באופן ספציפי, הכנס את הגן המקודד את החיישן הביולוגי שתוכנן לאחרונה לתוך וקטור מעבורת השמרים pAG416, המכיל אלמנטים מתאימים לביטוי שמרים, תוך שימוש בטכניקת שיבוט מתאימה 12,13,14.
    5. לאחר השיבוט, הפוך את הפלסמיד הרקומביננטי לתאי חיידקים להגברת ה-DNA של הפלסמיד. השתמש ב-DNA פלסמיד מטוהר לטרנספורמציה של שמרים.
    6. הכנס את הפלסמיד המטוהר לתאי שמרים באמצעות טרנספורמציה בתיווך פוליאתילן גליקול (PEG) כפי שפורסם16. תאי שמרים שעברו טרנספורמציה בצלחת על מדיה חסרת אורציל, הבוחרת שיבוטים חיוביים המכילים את הפלסמיד הנושא את סמן הבחירה URA3.

2. הכנת מדגם

  1. פס טרנספורמטורים של שמרים המבטאים חיישנים ביולוגיים GA-Matryoshka על צלחות בינוניות סלקטיביות (כלומר, SC-Ura) ודגר בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים כדי לאפשר צמיחת מושבה.
    הערה: זן השמרים נושא אוקסוטרופיה של ura3, אשר משלימה על ידי הגן URA3 על הפלסמיד, המאפשר בחירה על מדיה חסרת אורציל. הפלסמיד המקודד את החיישן הביולוגי כולל קלטת המשלימה את האוקסוטרופיה (למשל, pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s).
  2. צור טרנספורמציות שמרים מהזן K601/W303-1A MAT-a (גנוטיפ: ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100). בצע טרנספורמציה עם וקטור ביטוי המשמש בדרך כלל עבור Saccharomyces cerevisiae, כגון pAG41612.
  3. לאחר הטרנספורמציה, תאי שמרים בתרבית ב-30 מעלות צלזיוס על מדיום SC-Ura, שהוכנו לליטר כדלקמן, עד להופעת מושבות שעברו טרנספורמציה עצמאית: 0.77 גרם CSM-Ura, 6.7 גרם בסיס חנקן שמרים (YNB) עם אמוניום גופרתי, 20 גרם גלוקוז, 20 גרם אגר ואדנין שנוספו לריכוז סופי של 150 מיקרומטר.
  4. הכן תאי שמרים מוכשרים ובצע טרנספורמציה בתיווך PEG 3350 על פי פרוטוקול קבוע16.
  5. עבור ניסויי לכידת תאים מיקרופלואידיים, פס 25% מלאי גליצרול על צלחות SC-Ura ודגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים כדי לאפשר צמיחה של מושבות בודדות עצמאיות. השעו מושבות בודדות ב-5 מ"ל של מדיום SC-Ura נוזלי ודגרו ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור עד שה-OD600 מגיע ל-0.5-1.0, מה שהופך אותן למתאימות להעמסה למערכת הזילוף.

3. הכנת מערכת הזלוף (איור 2)

  1. הכן את הצלחת המיקרופלואידית לתאי שמרים הפלואידים על ידי העמסתה ב-50 מיקרוליטר של תאי שמרים המבטאים חיישנים ביולוגיים של GA-Matryoshka, יחד עם מצע SC-Ura סופי לצמיחה ותמיסת חוצץ לטיפולים (למשל, NaCl או סורביטול).
    1. הסר את תמיסת האחסון מבארות 1-8. שאפו את תמיסת המלח עם חוצץ פוספט (PBS) מהבארות והוסיפו 400 מיקרוליטר מים סטריליים.
    2. לשטוף בארות 1-6 ו -8. שטיפה 1: שאפו את תמיסת המים הסטרילית מבארות 1-8 והוסיפו 400 מיקרוליטר מים סטריליים. שטיפה 2: חזור על הכביסה על ידי שאיבה והוספת 400 מיקרוליטר מים סטריליים. שטיפה 3: חזור על הפעולה פעם נוספת עם 400 מיקרוליטר מים סטריליים.
    3. מילוי סופי לבארות 1-6: שואבים את תמיסת המים ומוסיפים 300 מיקרוליטר של תמיסות זילוף/גידול סופיות כגון SC-Ura לגידול שמרים, או תמיסה חוצצת המכילה את האנליטים המעניינים לטיפול.
    4. טעינת תאים בבאר 8: הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף תאי שמרים (OD600=0.5-1.0).
  2. אטום את הלוחות עם סעפת מבוקרת הטמפרטורה של הפלטפורמה המיקרופלואידית וחבר אותה למערכת הדמיית התאים החיים. הסעפות שומרות על סביבה תרמית יציבה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, בעוד שצינורות ומשאבה מבטיחים איטום נכון וזילוף רציף.
    1. יישר את הצלחת על הסעפת. הפעל את הוואקום. הפעל את הפלטפורמה המיקרופלואידית.
    2. לחץ על אטם והמתן עד שהנורית הירוקה תידלק. פתח את תוכנת הפלטפורמה המיקרופלואידית, צור ניסוי חדש ובחר את צלחת השמרים המתאימה מהרשימה הנפתחת.
    3. לחץ על כפתור הפעל רצף תחול נוזלי . לחץ על רצף טעינת התאים הפעל כדי לטעון תאי שמרים מבאר 8 לתוך תא התרבית, שם הם יילכדו ויגדלו תחת זלוף רציף של מדיום סלקטיבי SC-Ura בן לילה ב-10 kPa ב-28 מעלות צלזיוס.
    4. תחת הכרטיסייה מצב ידני, לחץ על הפעל רצף מותאם אישית או השתמש בעורך הפרוטוקול כדי להגדיר פרמטרים ניסיוניים כגון טמפרטורה ב-30 מעלות צלזיוס, קצב זרימה ב-10 kPa, משך שלב (למשל, 10 דקות) וערוצים לפתיחה לזילוף.
  3. גדל את התאים למשך הלילה בתא התרבית תחת זלוף רציף עם מדיום סלקטיבי SC-Ura בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס ולחץ של 10-17 kPa.

4. הדמיה פלואורסצנטית רציומטרית (איור 3, איור 4 וסרטון 1)

  1. להעריך את צמיחת התאים והפלואורסצנטיות באמצעות הדמיה מיקרוסקופית מהירה.
    1. הנח את הצלחת המיקרופלואידית על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. התמקד במרכז אזור התצוגה כדי לאתר את התאים.
    2. השתמש במיקרוסקופיה של שדה בהיר ו/או פלואורסצנטי כדי להעריך את המורפולוגיה של התא, הכדאיות וביטוי החיישנים הביולוגיים.
  2. חקור דינמיקת מצב יציב של סידן בתנאים מבוקרים במדויק באמצעות המערכת המיקרופלואידית ולוחות מיקרופלואידיים תואמים 4,12,13,14.
  3. בצע הדמיית תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר הפוך עם הגדלה a100x וצמצם מספרי (NA) של 1.40. נטר את החיישנים הביולוגיים הכפולים של פלואורופור על ידי GFP ו-LSSmApple מלהיבים ב-488 ננומטר באמצעות לייזר ארגון. אסוף אותות פליטה ב-520 ננומטר עבור GFP ו-610 ננומטר עבור LSSmApple (איור 5) וערוך ניסויי הדמיה פלואורסצנטית רציומטרית כדי לכמת את התגובות הדינמיות של החיישן הביולוגי. מדוד את היחס בין עוצמות הפליטה (GFP/LSSmApple) לאורך זמן כדי לנטר שינויים הנגרמים על ידי אנליטים.

5. ניתוח תמונה באמצעות תוכנת קוד פתוח (איור 6)

  1. השג את ה-CellProfiler או כל תוכנה דומה אחרת מהמאגר הרשמי והתקן אותה בתחנת עבודה מקומית.
  2. ארגן את תמונות המיקרוסקופיה הקרינה בזמן-lapse בסדר רציף (למשל, img_001.tif, img_002.tif וכו') כדי להבטיח תאימות לעיבוד אצווה אוטומטי.
  3. הפעל את התוכנה ואתחל צינור ניתוח חדש על-ידי בחירה באפשרות פרויקט חדש. ייבא את רצף התמונות של קיטועי זמן לסביבת העבודה של קו הצינור.
  4. שלב את מודול IdentifyPrimaryObjects כדי לזהות תאים בודדים בתוך כל מסגרת על סמך אות פלואורסצנטי או קריטריונים מורפולוגיים.
  5. הוסף את מודול TrackObjects כדי ליצור התכתבויות זמניות בין תאים על פני מסגרות, מה שמאפשר מעקב אחר תא בודד לאורך זמן.
  6. כלול את מודול MeasureObjectIntensity כדי לכמת פרמטרים של עוצמת הקרינה (למשל, ממוצע, חציון ועוצמה משולבת) עבור כל תא במעקב.
  7. השתמש במודול ExportToSpreadsheet כדי לאסוף ולייצא נתונים כמותיים לפורמט טבלאי (למשל, CSV) לניתוח במורד הזרם.
  8. נתח את הנתונים המיוצאים באמצעות כלים סטטיסטיים או הדמיית נתונים כגון תוכנת גיליון אלקטרוני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להשיג הדמיה רציומטרית מוצלחת של חיישנים ביולוגיים במערכות מיקרוביאליות, יש לטפל במספר אתגרים טכניים.

מערכת ביטויים: האתגר הראשון טמון בבחירת מערכת הביטויים; בין אם מבוססי פלסמיד, משולבים כרומוזומלית, מונעים על ידי מקדמים מכוננים או ניתנים להשראה, ועם או בלי תגי מיקוד תת-תאיים. גורמים אלה יכולים להשפיע באופן משמעותי על היציבות, הרעילות והלוקליזציה של החיישן הביולוגי בתוך התאים (איור 1). חיוני להבטיח רמות ביטוי אופטימליות כדי למנוע חפצים הנגרמים על ידי ביטוי יתר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיישנים ביולוגיים מבוססי פלואורופור מקודדים גנטית מאפשרים ניטור בזמן אמת של ריכוזי אנליטים תוך-תאיים בתאים חיים1. חיישנים ביולוגיים אלה מתפקדים בדרך כלל על ידי המרת שינויים קונפורמטיביים לאותות אופטיים, הניתנים לזיהוי באופן יחסי או אינטנסיבי. חיישנים ביולוגיים אינטנסיביים מסתמכים על שינויים בעוצמת הקרינה מ-FP יחיד, מה שהופך אותם לרגישים לשינויים בשפע החיישנים הביולוגיים, מה שמוביל להטיית מדידה פוטנציאלית. ניתן להפחית בעיה זו על ידי שימוש בחיישנים ביולוגיים רציומטר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי קתדרת פרופסור זוטר מהסוכנות הלאומית למחקר (ANR) הצרפתית - PROJET N° ANR-24-CPJ1-0014-01to M.S. ונתמך על ידי מענקים מה-"Agencia Estatal de Investigación (AEI), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades" (TED2021-129691B-I00), כמו גם מלגת אוניברסיטת מלאגה (B1-2022_03) שהוענקה ל-V.C.R. ברצוננו להודות למרכז להדמיה מתקדמת (CAi) באוניברסיטת היינריך היינה ולמרכז ההדמיה הרב-ממדית של ליון (LyMIC) מאוניברסיטת ליון על דיון פורה על הדמיית חיישנים ביולוגיים ו/או גישה למערכות מיקרוסקופיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אגרסיגמא-אולדריץ' ושות'A5306-250G
צלחת CellASIC ONIX לתאי שמרים הפלואידים Merck KGaAY04C-02-5PK
CellASIC ONIX2Merck KGaACAX2-S0000
CSM-UraThermo Fisher Scientific11387899
D-glucoseSigma-Aldrich Co.G8270-100G
D-סורביטולסיגמא-אולדריץ' ושות'S1876-10MG
NaClסיגמא-אולדריץ' ושות'S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6sNA7לביטוי GA-MatryoshCaMP6s בשמרים
TCS SP8 STEDLeicaNA
זן שמרים K601 / W303-1A MAT-ANA8ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNBBocaScientificGCM16.0500
&-alpha;-מלח אצטט גורם הזדווגותסיגמא-אולדריץ' ושות'T6901-.5 מ"ג

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38, 2833-2841 (2009).
  2. Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nat Cell Biol. 20, 1215-1225 (2018).
  3. Deuschle, K., et al. Rapid metabolism of glucose detected with FRET glucose nanosensors in epidermal cells and intact roots of Arabidopsis RNA-silencing mutants. Plant Cell. 18, 2314-2325 (2006).
  4. Kaper, T., Lager, I., Looger, L. L., Chermak, D., Frommer, W. B. Fluorescence resonance energy transfer sensors for quantitative monitoring of pentose and disaccharide accumulation in bacteria. Biotechnol Biofuels. 1, 1-10 (2008).
  5. Yoshinari, A., et al. Using genetically encoded fluorescent biosensors for quantitative in vivo imaging. Arabidopsis Protoc. , 303-322 (2021).
  6. Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1833, 1787-1797 (2013).
  7. Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiol. 187, 485-503 (2021).
  8. Frei, M. S., Mehta, S., Zhang, J. Next-generation genetically encoded fluorescent biosensors illuminate cell signaling and metabolism. Ann Rev Biophys. 53 (1), 275-297 (2024).
  9. Ast, C., et al. Ratiometric Matryoshka biosensors from a nested cassette of green-and orange-emitting fluorescent proteins. Nat Commun. 8, 431(2017).
  10. Stokes, G. G. On the change of refrangibility of light. , Philosoph Transact Royal Soc London. 463-562 (1852).
  11. Santos, E. M., et al. Design of Large Stokes Shift Fluorescent Proteins Based on Excited State Proton Transfer of an Engineered Photobase. J Am Chem Soc. 143, 15091-15102 (2021).
  12. Ejike, J. O., et al. A Monochromatically Excitable Green-Red Dual-Fluorophore Fusion Incorporating a New Large Stokes Shift Fluorescent Protein. Biochemistry. , (2023).
  13. Bermejo, C., Haerizadeh, F., Sadoine, M. S., Chermak, D., Frommer, W. B. Differential regulation of glucose transport activity in yeast by specific cAMP signatures. Biochem J. 452, 489-497 (2013).
  14. Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem J. 432, 399-406 (2010).
  15. Nasu, Y., Shen, Y., Kramer, L., Campbell, R. E. Structure-and mechanism-guided design of single fluorescent protein-based biosensors. Nat Chem Biol. 17, 509-518 (2021).
  16. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2, 31-34 (2007).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9, 676-682 (2012).
  18. Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: properties and evaluation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1833, 1787-1797 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vivo
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים