מאמר שיטה

שימוש בשיטת העברת טיפות להכנה אמינה של שלפוחיות יונילמלריות ענקיות

DOI:

10.3791/68340

⸱

19 בספטמבר 2025

 ,  ,  , 
1The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, 2Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מדריך זה למתחילים מציג פרוטוקול כללי להכנת שלפוחיות ענק חד-פעמיות (GUVs) באמצעות שיטת העברת טיפות, דן בשלבים הקריטיים ומספק תובנות שיעזרו להתאמות אפשריות הנדרשות ליישומים שונים, כולל ביולוגיה סינתטית ומיקרו-רובוטיקה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך שני העשורים האחרונים, שיטת העברת הטיפות, הידועה גם בשם אמולסיה הפוכה, אמולסיה כפולה, העברת פאזה או העברת אמולסיה, הוכיחה את עצמה כמועילה להכנת שלפוחיות ענק חד-צדדיות (GUVs) ובמיוחד להעמסתן במטענים שונים, ובכך ממלאת תפקיד מכריע בביולוגיה סינתטית. בגלל יעילות האנקפסולציה ופשטות הביצוע, נעשה בו שימוש נרחב לפיתוח תאים מלאכותיים. שונות גדולה במספר פרמטרים נצפתה בספרות, מה שמוביל לתוצאות משתנות ביותר. זה נובע בחלקו מההתאמות הנדרשות לצרכים וליישומים שונים של שיטה רב-תכליתית זו, אך זה עשוי להיות מבלבל עבור חוקרים שניגשים לטכניקה זו בפעם הראשונה.

כדי לספק למתחילים הבנה בסיסית של השיטה ותפקידם של פרמטרים קריטיים, מוצג פרוטוקול לצד רמזים על העקרונות הפיזיקוכימיים הבסיסיים העומדים בבסיס היווצרות GUV באמצעות העברת טיפות. מדריך צעד אחר צעד זה להכנת GUVs כולל אפוא שיקולים והצעות מעשיות המבוססות על ספרות וניסיון ישיר.

בהתחשב במקורות אפשריים לשונות, כמה היבטים מזוהים כקריטיים: הרגישות של פוספוליפידים לאור, חמצון והידרוליזה; בחירת השמן להמסת פוספוליפידים (תמיסת השומנים או LS); והתאוששות של GUVs לאחר צנטריפוגה. מוצעים אמצעים חסכוניים כדי למזער את ההפרעות של חמצן ולחות באטמוספירה. כדי לסייע בזיהוי שילובים מתאימים של שמן ופוספוליפידים, הפרוטוקול הכללי משלים עם דיון על התכונות הפיזיקוכימיות הרלוונטיות של ה-LS. לבסוף, כדי להימנע מהליכים לא מעשיים, מוצעת שיטה פשוטה ובטוחה להסיר לחלוטין את שלב השמן בבת אחת ולשחזר פיזור GUV נקי. אמצעים אלה מאיצים את יישום ההתאמות להרכבי GUV חדשים, ועשויים להרחיב את אימוצם בביולוגיה סינתטית ובתחומים שכנים, כולל מיקרו-רובוטיקה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביישום טכניקה שתוארה קודם לכן לייצור ליפוזומים1, Pautot et al. הקימו פרוטוקול לייצור שלפוחיות ליפידים בקוטרשנע בין 0.1 ל-1 מיקרומטר בקוטר 2. שיטת העברת הטיפות הוכחה במהירות כיעילה בייצור שלפוחיות גדולות עוד יותר, (קוטר העולה על 1 מיקרומטר)3, וצברה פופולריות הולכת וגוברת בשל פשטות הביצוע ויעילות האנקפסולציה הגבוהה. ואכן, בהשוואה לשיטות נפיחות (כגון נפיחות ג'ל או אלקטרופורמציה), פרוטוקול זה מפחית את נפח תמיסת המטען הנדרשת ליצירת מספר דומה של שלפוחיות והפסולת הנלווית4. ניתן להרכיב GUVs מממשקי נוזלים בשיטות חלופיות עם יעילות אנקפסולציה דומה. עם זאת, בהשוואה לאלה המבוססים על שבבים מיקרופלואידיים 5,6 או אנקפסולציה חוצת ממשק טיפות רציפה (cDICE)7, העברת הטיפות מציעה את ההתקנה הפשוטה ביותר במחיר סביר בכל מעבדה עם ציוד בסיסי. יתר על כן, שיטות מיקרופלואידיות עלולות להוביל ל-GUVs עם תכלילי שמן לא רצויים בממברנה. מסיבות אלה, העברת הטיפות הייתה השיטה המועדפת להעמסת GUVs עם מטענים יקרי ערך בתחומי התאים המלאכותיים 3,8,9,10 ולאחרונה, מיקרו-רובוטיקה 11,12.

השיטה מבוססת על יצירת עלוני ממברנות באמצעות ייצוב ממשקי מים/שמן בתיווך פוספוליפידים. ראשית, פוספוליפידים מומסים בשמן (תמיסת שומנים, LS), ואז מכינים תחליב מים בשמן עם התמיסה המימית המכילה את מטען ה-GUV הרצוי (תמיסה פנימית, IS) ב-LS השומני. לאחר מכן האמולסיה מועברת לצינור שבו תמיסה מימית אחרת (הנקראת תמיסה חיצונית, OS) אוזנה בעבר עם LS ליצירת ממשק מים-שמן. GUVs נוצרים כאשר טיפות מים נאלצות לחצות ממשק OS/LS זה על ידי צנטריפוגה: העלון הפנימי של GUVs נוצר על פני השטח של טיפות IS, בעוד שהעלון החיצוני נוצר בין OS ל-LS (איור 1).

גרסאות פרוטוקול רבות תוארו עם פרמטרים המותאמים בהתאם לצרכי הניסוי המותנים. ניסיון נרחב ראשון לייעל את התהליך תואר על ידי Moga et al.13, בעוד ש-Zhang et al. אספו את רוב הדוגמאות הרלוונטיות בסקירה שנערכה לאחרונה14. למרות הפרמטרים הרבים המתוארים המשפיעים על הפרוטוקול, אין אינדיקציה כיצד ניתן לבצע תהליך אופטימיזציה עבור פורמולציה חדשה של GUV, וגם לא את השיטות המומלצות לשחזור ומניפולציה של GUV לאחר הייצור. בהתבסס על הספרות המדעית הזמינה והניסיון הישיר שלנו, אנו מספקים כאן פרוטוקול כללי לייצור GUVs תוך דיון בעקרונות הבסיסיים. על ידי כך, אנו מספקים אינדיקציות שימושיות לאופטימיזציה של פורמולציות GUV חדשות ושני אמצעי זהירות החלים תמיד על הפרוטוקול: הכנת LS בסביבה מבוקרת ושיטה להסרת שלב השמן העליון בקלות לשחזור דגימת GUV נקייה. בחרנו שתי דוגמאות: האחת עם 240 מ"מ סוכרוז כ-IS ו-0.2 מ"מ DOPC בשמן סיליקון AR20 כ-LS (מצב E [ריק], ראה טבלה 1) והשנייה מורכבת מ-0.2% מיקרו-חלקיקי פוליסטירן 1.1 מיקרומטר ב-240 מ"מ סוכרוז כ-IS ו-3.18 מ"מ DOPC בשמן מינרלי כ-LS (מצב P [עם חלקיקים], ראה טבלה 1). שתי הדגימות הופקו עם 240 מ"מ גלוקוז כ-OS. בחרנו באוסמולריות זו כדי להשיג GUVs שבתנאים פיזיולוגיים יש להם קרום שומני רגוע (מתח ממברנה נמוך).

figure-introduction-1
איור 1: ייצוג סכמטי של שיטת העברת הטיפות. (A) מכינים שלוש תמיסות בבקבוקונים נפרדים: פוספוליפידים בשמן (פאזה צהובה) ליצירת תמיסת שומנים, תמיסה המכילה סוכרוז (בציאן) כתמיסה פנימית, ותמיסת גלוקוז שווה ערך (לבן) כתמיסה חיצונית. (B) לאחר מכן LS מעורבב עם ה-IS ליצירת תחליב יציב, ואז (C) ממשק בין OS ל-LS מותר להתאזן לפני (D) האמולסיה נשפכת עליו. (E) טיפות מים נאלצות לחצות את ממשק LS/OS בכוח צנטריפוגלי כדי (F) לאפשר היווצרות של GUVs. הנתון אינו בקנה מידה ונועד לספק רק סכימה של השיטה. קיצורים: LS = תמיסת שומנים; IS = פתרון פנימי; OS = פתרון חיצוני; GUV = שלפוחית חד-שלמית ענקית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: אלא אם צוין אחרת, התהליכים מתבצעים בטמפרטורת החדר.

1. הכנת פתרונות

  1. הכנת תמיסות מימיות (IS ו- OS)
    1. בשתי סירות שקילה שונות, שוקלים 2.16 גרם גלוקוז וכמות הסוכרוז המצוינת בטבלה 1. הוסיפו את האבקות לשתי כוסות של 150 מ"ל, הוסיפו 40 מ"ל מים טהורים במיוחד וערבבו תוך ערבוב.
    2. העבירו את התמיסות לשני מיכלים של 50 מ"ל והוסיפו מים טהורים במיוחד עד 50 מ"ל כדי לקבל תמיסות גלוקוז של 240 מ"מ ותמיסות סוכרוז בריכוזים המצוינים בטבלה 1. מכסים את הצילינדרים בחתיכת פרפילם ומערבבים את התמיסות על ידי היפוך הצילינדרים כמה פעמים.
    3. סנן את התמיסות עם מזרקים של 50 מ"ל ומסננים של 0.22 מיקרומטר כדי למנוע זיהום ממיקרואורגניזמים.
    4. למצב P, הכינו את התערובת הבאה: 2 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל 1.1 מיקרומטר פיזור חלקיקי פוליסטירן, 24 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז שהוכנה בשלב 1.1.1, ומים טהורים במיוחד עד 100 מיקרוליטר (תרחיף סופי: 0.2% מיקרו-חלקיקים בתמיסת סוכרוז 240 מ"מ). אחסן את התמיסות בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס עד שבוע או הכן 1 מ"ל בצינורות של 1.5 מ"ל ואחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
  2. הקמת תא כפפות להכנת LS בסביבה מבוקרת
    1. חותכים חמש חתיכות צינור סיליקון בקוטר פנימי של 7 מ"מ, קוטר חיצוני של 13 מ"מ והאורכים המצוינים בטבלה 2 (צינורות 1 עד 5).
    2. חותכים ארבע חתיכות צינור סיליקון בקוטר פנימי של 3 מ"מ, קוטר חיצוני של 7 מ"מ והאורכים המצוינים בטבלה 2 (צינורות 6 עד 9).
    3. חבר קצה אחד של צינור 1 לשסתום דו-כיווני ואת הקצה השני לצומת תלת-כיווני (איור 2A).
    4. חבר את צינור 2 לקצוות האחרים של השסתום הדו-כיווני, ולאחר מכן חבר את צינור 3 וצינור 4 לצומת התלת-כיווני, כאשר צינור 3 מחובר לקצוות המנוגדים לצינור 1 (איור 2A).
    5. חבר את הקצה החופשי של צינור 4 לכניסה של תא הכפפות (צינור כניסה, איור 2B).
    6. חבר את השסתום התלת-כיווני המסופק עם תא הכפפות לשקע , ולאחר מכן חבר את השסתום לצינור 5 (צינור יציאה, איור 2C).
    7. חבר קצה אחד של צינור 6 למחט 18 גרם ואת הקצה השני לצומת דו כיווני. חזור על כך עם צינור 7 ומחט 21 G (איור 2D).
    8. הכנס את שתי המחטים למכסה בקבוקון עם מחיצה: מכסה נושא מחטים זה יאפשר זרימה מבוקרת של חנקן ויציאת חנקן וכלורופורם. אחסן את המכסה בצינור ריק ללא מכסה של 50 מ"ל כדי למנוע מגע עם המחטים (איור 2D).
    9. סחטו והכנסו צינורות 8 ו-9, בהתאמה, לתוך פתחי הכניסה והיציאה מהצד הפנימי של תא הכפפות (איור 2E).
  3. הכנת LS
    1. הזיזו את תא הכפפות פנימה או לצד מכסה מנוע כימי. פתחו את תא הכפפות והכניסו מגבש מלא בחלקיקי סיליקה בתחתית התא (איור 2F). מכסים את המגבש במשטח התמיכה הלבן ומכסים אותו במגבות נייר.
    2. הכניסו את כל החומרים הדרושים לתא הכפפות (איור 2G): מד לחות, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) בתמיסת כלורופורם, השמן(ים) (טבלה 1), בקבוקוני זכוכית כהים נקיים של 20 מ"ל (פתוחים ועם המכסים המתאימים), מזרק המילטון (טבלה 1), מיקרופיפטה P10000 וטיפים. הנח את בקבוקון הזכוכית המכיל את תמיסת הכלורופורם על מחזיק טבעת שעם, 150 מ"ל או כל מחזיק מתאים אחר קרוב ככל האפשר לצד המפעיל.
      הערה: אמצעי זהירות זה ימנע הטיה של בקבוקים הנגרמת על ידי ניפוח ודפלציה של כפפות על פני מחזורים של זרימת ואקום וחנקן.
    3. סגור את תא הכפפות, וודא ששני החצאים לא יכולים להחליק, ואטום אותם עם ברגי הפלסטיק המסופקים עם תא הכפפות.
    4. סגור את שסתום היציאה וטבל את צינור 5 בכוס של 500 מ"ל מלאה למחצה במים (איור 2H).
    5. חבר את הקצה המווסת על ידי השסתום של צינור הכניסה (צינור 2) לקו הוואקום ואת הקצה השני לחנקן (צינור 3, איור 2A). תא הכפפות מוגדר כעת לחלוטין כפי שמוצג באיור 2J.
    6. פתח את השסתום ואת קו הוואקום עד שהלחץ מנפח את הכפפות עד כדי כך שהן נוקשות מכדי להתכופף. סגור את קו הוואקום ואת השסתום.
    7. פתח את החנקן עד שהלחץ מרוקן את הכפפות עד לנקודה שהן יוצאות מתא הכפפות. סגור את קו החנקן.
    8. חזור על שלבים 1.3.6 עד 1.3.7 לפחות פי 10, וודא שהלחות הפנימית יורדת מתחת ל-40%.
    9. שלוט בלחץ הפנימי באמצעות ואקום וחנקן כדי להקל על המפעיל ללבוש כפפות.
    10. באמצעות מזרק המילטון, העבירו את נפח ה-DOPC בתמיסת כלורופורם המצוינת בטבלה 1 לבקבוקון זכוכית כהה. סגור את הבקבוקון עם מכסה נושא המחטים שהוכן בשלב 1.2.9.
    11. חבר את צינור 6 לצינור 8 ואת צינור 7 לצינור 9 דרך הצמתים הדו-כיווניים (איור 2I).
    12. הסר את הכפפות ופתח את שסתום היציאה.
      הערה: מפעיל שני יכול לעזור משלבים 1.3.13 עד 1.3.15 כדי להאיץ את התהליך.
    13. פתח את זרימת החנקן לאט מאוד ובדוק את זרימת הגז על ידי התבוננות בבועות בכוס שבה הונח בעבר צינור 5 (שלב 1.3.4). התאם בהדרגה את זרימת החנקן עד שהיא תגיע לקצב גבוה יחסית שבו בועות בודדות נשארות נצפות. תנו לחנקן לזרום במשך 3 דקות, ואז סגרו את קו החנקן.
      הערה: לחץ חנקן מוגזם עלול לגרום לתמיסת ה-DOPC בכלורופורם להתפזר בכל הבקבוקון, ולהפחית את כמות הפוספוליפידים הזמינה לתמיסת השומנים הבאה (LS). בנוסף, לחץ גבוה מגביר את הסיכון להוצאת המחטים מהבקבוקון. לכן, חיוני להתאים בזהירות את זרימת החנקן לרמה אופטימלית המערבבת בעדינות את הכלורופורם מבלי לגרום להתזה בלתי מבוקרת.
    14. בינתיים, הכינו אמבט מים בגביש וחממו אותו בחום של 80 מעלות צלזיוס על פלטה חמה.
    15. המתן עד שהבועה האחרונה תצא בכוס, ואז סגור את שסתום היציאה. ללבוש שוב את הכפפות ולנתק את צינורות 8 ו -9 מהצמתים הדו-כיווניים.
    16. בדוק שכל הכלורופורם התאדה מהבקבוקון הכהה, ואז פתח אותו והעבר את הפקק בחזרה לצינור של 50 מ"ל. פתח את בקבוק השמן, העביר את נפח השמן הנדרש (טבלה 1) לתוך הבקבוקון הכהה, וסגור אותו עם המכסה. הסר את הכפפות ופתח את תא הכפפות.
    17. אטום את ה-LS עם פרפילם. מערבולת את הבקבוקון במרץ במשך 30 שניות לפחות. דגירה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמבט המים שהוכן בשלב 1.3.14. מערבולת את הבקבוקון במרץ במשך 30 שניות לפחות. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
    18. המשך בהכנת GUVs או אחסן אותם בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס עד שבוע.
      הערה: בתכשירי GUV אסימטריים, ניתן להשתמש בשני LS שונים עבור הממשק והאמולסיה כדי להשיג שני עלוני ממברנה שונים15.

2. ייצור GUV

  1. הקמת מיכל להסרה קלה של שמן
    1. בעזרת מספריים חותכים את הכובע מצינור של 5 מ"ל. קדחו חור של ~8 מ"מ במרכז המכסה ובדקו שהחור רחב מספיק כדי לאפשר לקצה P1000 להתאים ולהינעל (איור 3A). אם החור צר מדי, חזור על שני השלבים הקודמים; אם רחב מדי, השלך את המכסה והפעל מחדש עם מכסה חדש משלב 2.1.1.
    2. חותכים פיסת נייר זכוכית בגודל 2X5 ס"מ ומשייפים את החור. הנח את המכסה המחורר בחזרה על גבי צינור 5 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 3,000 × גרם למשך 5 דקות כדי להסיר את כל שאריות הפלסטיק מהחור. הסר את המכסה והשליך את הצינור.
    3. חותכים את המכסה מצינור חדש של 5 מ"ל ומחליפים אותו במכסה החורים. הנח טבעת O על גבי הפקק והכנס קצה P1000 דרך החור. נעלו את טבעת ה-O בין הקצה למכסה וודאו שלא ניתן לדחוף את הקצה הלאה במורד הצינור (איור 3B). מלאו את הצינור של 5 מ"ל ב-5.5 מ"ל של מערכת הפעלה דרך הקצה.
  2. יצירת ממשק OS/LS
    1. מכינים אמבט מים במגבש ומחממים אותו בחום של 50 מעלות צלזיוס על פלטה חמה.
    2. מערבולת בקבוקון ה-LS שהוכן בסעיף 1.3, במרץ במשך 30 שניות לפחות. מחממים את ה-LS ב-50 מעלות צלזיוס באמבט המים למשך 30 דקות.
    3. יש לאזן את תמיסות המים שהוכנו בסעיף 1.1 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות.
    4. פיפטה 300 מיקרוליטר של מערכת הפעלה בצינור של 1.5 מ"ל או צינור של 5 מ"ל שונה לפי שלב 2.1. פיפטה לאט 100 מיקרוליטר של LS על גבי מערכת ההפעלה, וודא שנוצרים שני שלבים נפרדים ורציפים בצינור. תן לממשק להתאזן למשך 10 דקות.
      הערה: כדי לאפשר היווצרות של שכבה חד-שכבתית הומוגנית של פוספוליפידים, יש להפיץ את ה-LS באופן הומוגני על גבי מערכת ההפעלה (איור 4A). אם שכבת ה-LS אינה רציפה, חלק מחדש את נפח ה-LS עם מיקרופיפטה או הגדל את נפח ה-LS (זה יכול להיות מועיל מאוד עם שמנים צמיגים מאוד כמו פרפין).
  3. תצורת תחליב מים בשמן
    1. בשפופרת של 2 מ"ל, פיפטה, בסדר זה, 250 מיקרוליטר של LS ו-6.25 מיקרוליטר של IS עבור תחליב מים בשמן.
      הערה: מניסיוננו, יחס מים-בשמן זה מספק ככל הנראה תחליב יציב, ובכך מגדיל את שיעור ההצלחה של הפרוטוקול (איור 5). כדי להגדיל את תפוקת ה-GUV, אנו ממליצים להגדיל את נפח האמולסיה ולא את יחס ה-IS/LS.
    2. מערבבים את שני השלבים באחת או יותר מהשיטות הבאות עד שהתערובת נראית הומוגנית ויציבה: מערבולת, תסיסה מכנית על מתלה מיקרו-צינור רגיל, או הקשה על הצינור באצבע (עיין באיור 5 לדוגמאות של תחליב הומוגני).
    3. העבר 200 מיקרוליטר של האמולסיה על גבי ממשק OS/LS שהוכן בסעיף 2.2.
    4. אם אתה משתמש בצינור של 1.5 מ"ל, פשוט סגור את הצינור; אם אתה משתמש בצינור 5 מ"ל ששונה מקטע 2.1, הנח מכסה גומי על גבי הקצה והעביר בזהירות את הצינור לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
  4. העברת טיפות באמצעות צנטריפוגה
    1. צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורת החדר בהתאם לאינדיקציות של טבלה 1. בסוף הצנטריפוגה, ודא נוכחות של כדור אטום בתחתית הצינור ושלב שמן שקוף בחלקו העליון.

3. התאוששות GUV

  1. הסרת שמן
    הערה: על פי צרכי הניסוי, ניתן להסיר את השמן בשלושה שלבים חלופיים שונים.
    1. אם הוכנו GUVs בצינורות סטנדרטיים של 1.5 מ"ל, הסר לאט את השמן בעזרת פיפטה P1000 ו- P200 לטיפות האחרונות, וודא שהגלולה לא מופרעת.
      הערה: טיפים צרים יותר מסייעים בהסרת השמן, כך שהכנסת קצה לנפחים קטנים יותר (10-200 מיקרוליטר) לקצה P1000 תשפר את הדיוק של שלב זה.
    2. אם מתמודדים עם תכשירי GUV מרובים בצינורות שונים של 1.5 מ"ל, הסר את השמן בעזרת בקבוק Büchner. חבר חתיכה אחת של צינור סיליקון עבה (קוטר פנימי 7 מ"מ, חיצוני 13 מ"מ) לקו הוואקום והכנס צינור נוסף על פתח הבקבוק, ואטום אותו באטם גומי. בקצה השני של צינור זה, הכנס קצה P1000, עטוף אותו בפרפילם, חתוך כ -3 מ"מ מהקצה והכנס אותו לקצה P200. פתח את הוואקום ושאף את השמן עם קצה P200, ולאחר מכן סגור את הוואקום והסר את הטיפות האחרונות דרך פיפטה P200.
    3. אם GUVs הוכנו במיכל המפורט בשלב 2.1, הסירו את הקצה מהצינור, וודאו שמכסה הגומי לא יורד (איור 3D). לאחר מכן, השליכו את הקצה ושמרו את מכסה הגומי, טבעת ה-O והכובע החורים לשימוש חוזר.
    4. בעזרת מיקרו-פיפטה P1000, הסירו את מערכת ההפעלה מהצינור (איור 3E), והשאירו כ-50 מיקרוליטר מהנפח, וודאו שהגלולה לא מופרעת.
    5. החלף את הקצה, השהה מחדש את הכדור בנפח השארי והעביר אותו לצינור נקי של 2 מ"ל.
  2. שטיפות GUV
    הערה: מטרת שלבים אלה היא להסיר עקבות של שלב השמן שלא הוסרו בשלב 3.1. במידת הצורך, יש לחזור על שלבים 3.2.1 ו-3.2.2 עד שלא נצפתה טיפת שמן בצינור.
    1. מלאו את הצינור ב-2 מ"ל OS וצנטריפוגה בחום של 1,500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הסר את מערכת ההפעלה, והשאיר כ-50 מיקרוליטר מהנפח, וודא שהגלולה לא מופרעת.
    3. חזור על שני השלבים האחרונים.
  3. שיווי משקל נפח
    הערה: אנו כוללים סעיף זה כדי לאפשר השוואה של היבול בין תכשירי GUV שונים.
    1. בעזרת מיקרופיפטה P200, השעו מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר של הנפח הנותר מהחזרה האחרונה על שלב 3.2.2.
    2. מדוד נפח זה על ידי הגדרת הפיפטה ל-20 והגדלת הנפח כאשר הקצה טבול בפיזור ה-GUV מבלי לגעת בדופן הצינור כדי לאפשר לנוזל לזרום בתוך הקצה.
    3. הוסף מערכת הפעלה כדי להגיע לנפח הסופי של 100 μL.

4. תצפית וניתוח מימדים

  1. רכישת תמונה מיקרוסקופית
    1. מערבבים את פיזור ה-GUV בעדינות על ידי הקשה על הצינור באצבע.
    2. טען תא בורקר עם 10 מיקרוליטר של דגימת ה-GUV והמתן לפחות 5 דקות כדי לאפשר ל-GUVs לשקוע בתחתית החדר.
    3. התבונן בדגימה תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. השתמש בקווי בורקר כהפניות, עבור על פני המדגם ורכוש לפחות 20 תמונות, וודא שאזורי התצפית אינם חופפים.
  2. ניתוח מימדים
    1. טען את התמונות ב-ImageJ.
    2. כדי לחשב את מקדם ההמרה של פיקסל/מיקרומטר, בחר תמונה אחת המציגה ריבוע של 50 x 50 מיקרומטר של תא בורקר (עיין בגיליון הנתונים של היצרן לזיהוי הנכון), ולאחר מכן בחר בכלי בחירת הקו הישר , צייר קו בין שתי פינות רצופות של הריבוע ומדוד את הקו על ידי לחיצה על נתח | למדוד. חזור על 3x וחשב את הערך הממוצע.
    3. הגדר את מקדם ההמרה על ידי לחיצה על נתח | הגדר קנה מידה. הוסף את הערך משלב 4.2.2 בתיבה מרחק בפיקסלים, ולאחר מכן הכנס את הערך 50 במרחקים ידועים ומיקרומטר ביחידת אורך.
    4. לחץ על נתח | הגדר מידות ובחר בתיבה אזור . בחר בכלי הבחירה הסגלגל , ולאחר מכן לחץ על הלחצן השמאלי של העכבר והחזק את מקש Shift כדי לחפוף את העיגול שנוצר סביב GUV. מדוד את הקוטר על ידי לחיצה על נתח | למדוד. חזור על פעולה זו עבור כל GUV בכל תמונה.
    5. בחלון התוצאות, לחץ על קובץ | שמור בשם... כדי לייצא את קובץ ה-csv של האזור של GUV, ולאחר מכן נתח את התפלגות הגודל עם הסקריפט הזמין ב-GitHub16.
      הערה: ניתן לדלג על שלב 4.2.3 ולהפעיל את הסקריפט המציין את גורם ההמרה של פיקסל/מיקרומטר. כדי לחשב ערך זה, חלקו את הערך שהתקבל בשלב 4.2.2 ב- 50.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תכשיר GUV אופטימלי מאופיין בהיווצרות פאזת שמן שקופה וכדור מובהק (איור 4A). במקרים בהם טיפות מים אינן מצליחות להפוך ל-GUVs, הן בדרך כלל קורסות ומשאירות פסולת פוספוליפידים בממשק OS/LS (איור 4C). השפעה זו נגרמת ככל הנראה על ידי הצטברות של פוספוליפידים ומולקולות אחרות משלב השמן, הנובעת משיווי משקל לא מספיק של פוספוליפידים בממשק מים/שמן. עם זאת, למרות היעדר כדור גלוי או נוכחות של פסולת בממשק, GUVs עדיין עשויים להיווצר, מה שמאפשר את המשך התהליך. בעוד ששלבי הכביסה אינם יעילים לחלוטין בהסרת כל פסולת הפוספוליפידים, הם מסייעים באופן משמעותי בסילוק טיפות שמן, ומשפרים את איכות הדגימה הכוללת (השווה איור 6A ואיור 6B).

השימוש ב-LS או LS ישנים שהוכנו בתנאי לחות גבוהה מביא לעתים קרובות להפחתת פיזור GUV עם תפוקה נמוכה יותר ותכולה גבוהה יותר של אגרגטים לא מסודרים שנוצרים ככל הנראה על ידי פוספוליפידים ומולקולות אחרות משלב השמן (איור 6C). עבור LS שהוכן בתנאי לחות גבוהים, ראינו מקדמי שונות מעל 0.8 בייצור GUV (עם דגימות המכילות מעט מאוד GUVs), בעוד שעבור LS שהוכן בתא הכפפות המותאם, מקדם השונות היה מתחת ל-0.5.

תנאי צנטריפוגה שונים עשויים להשפיע על תפוקת ה-GUV ואיכותו. מניתוח איכותני, 20 דקות ב-3,300 × גרם זוהו כמצב טוב עבור GUVs טעוני סוכרוז (דגימה E). הורדת המהירות (45 דקות ב-500 × גרם) הביאה לירידה בתפוקה, בעוד שעלייה (5 דקות ב-16,600 × גרם) הובילה להיווצרות גבוהה יותר של אגרגטים פוספוליפידים לא מסודרים. כוח צנטריפוגלי חלש עשוי למנוע מטיפות רבות לחצות את ממשק OS/LS, ומכאן התפוקה המופחתת, בעוד שכוח חזק עשוי שלא לספק מספיק זמן לארגון הפוספוליפידים על העלון החיצוני במהלך חציית הממשק (איור 7). ניתן לייעל את האנקפסולציה של מיקרו-חלקיקים גם עם התאמות לפרמטרי הצנטריפוגה, בתנאי שצפיפות המסה של המיקרו-חלקיקים תואמת בערך לזו של IS. למטרה זו, הורדת תאוצת הצנטריפוגה (ובתורו הגדלת זמן הצנטריפוגה) מאפשרת אנקפסולציה הומוגנית יותר של חלקיקים, על ידי הימנעות משבירה של הממברנה הפוספוליפידית עקב הכוח שמפעילים החלקיקים המוצקים (דוגמה לאנקפסולציה טובה מוצגת באיור 6D בעוד שהחקירה של פרמטרי צנטריפוגה אופטימליים עדיין נמשכת17).

מכיוון שהדיפוזיה של פוספוליפידים יכולה להיות מושפעת משלב השמן, ניתן להריץ בדיקה איכותית פשוטה כדי להעריך את יציבות האמולסיה (איור 5). בעזרת צבע צביעה (Brilliant Blue FCF) המומס ב-IS כדי לשפר את ההדמיה, ניתן להכין ולצפות באמולסיות עם יחסי מים/שמן שונים לאורך זמן. ניתן לדמיין את אובדן היציבות על ידי הצטברות טיפות מים וכתוצאה מכך הפרדה משלב הנפט. מכיוון שטיפות גדולות (הנראות לעין בלתי) נוטות פחות להיות מומרות ל-GUVs, אנו ממליצים להשתמש בתנאי האמולסיה המספקים את הפרדת הפאזה הנמוכה ביותר.

ניתן לאמת את השפעת הווריאציות בפרוטוקול באמצעות ניתוח התפלגות גודל כמתואר בסעיף פרוטוקול 4: ניתן למדוד את הקוטר של GUVs באמצעות ImageJ מתמונות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, וניתן לנתח את התפלגות הגודל באמצעות סקריפט זמין ב-GitHub16. בעקבות פרוטוקול זה, היה אפשרי, למשל, לצפות בעלייה ב-GUVs עם קטרים גדולים יותר כאשר שמן מינרלי נבחר על פני שמן סיליקון AR20 (איור 8).

figure-results-1
איור 2: הגדרת תא כפפות. איור זה מציג את השינויים העיקריים בתא הכפפות להכנת תמיסת השומנים. (א) חיבור כניסה עם חנקן ואקום; (ב) חיבור כניסה לתא הכפפות; (ג) שסתום יציאה; (ד) מכסה נושא מחטים לאידוי ממס; (ה) צינורות דקים לאידוי ממס; (F) חלקיקי סיליקה לספיגת לחות; (ז) פריטים שיש להציב בתא הכפפות: תרמו-היגרומטר דיגיטלי (1), תמיסת שומנים בממס אורגני (2), מחזיק טבעת שעם (3), מזרק זכוכית (4), מכסה פתוח עם מחיצה ומחטים (5), תמיסת שמן (6), בקבוקון כהה פתוח עם מכסה (7), קצות 10 מ"ל (8), פיפטה P10000 (9); (H) קצה צינור יציאה טבול במים; (I) בקבוקון סגור עם מכסה נושא מחטים המחובר לכניסה ויציאה; (J) סכמות של תא הכפפות המותאם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 3: מיכל להסרת שמן קלה. שלבים עיקריים בהכנת GUVs במיכל להסרה קלה של השמן לפי סעיף פרוטוקול 2.1. (א) נקדח חור במכסה צינור של 5 מ"ל כדי לאפשר לקצה P1000 להתאים; ואז (ב) הפקק מונח על צינור ריק של 5 מ"ל כשהקצה מוכנס לחור דרך טבעת O. (C) התמיסות מונחות בצינור לפי סעיפי פרוטוקול 2.2 ו-2.3, הקצה מכוסה, והצינור מונח בתוך צינור של 50 מ"ל. GUVs שהוכנו מ-0.2 mM DOPC בשמן סיליקון הועמסו בסוכרוז של 230.7 mM ו-3.1 mM Brilliant Blue FCF כדי לשפר את ההדמיה. (D) אחרי הצנטריפוגה, שלב השמן העליון נלכד בתוך הקצה יחד עם חלק ממאגר ה-GUV (שנראה ציאן בגלל שחלק מהטיפות לא מצליחות להפוך ל-GUVs ומשחררות את הצבע במערכת ההפעלה). הודות למכסה הגומי, ניתן להסיר בקלות את הקצה מצינור ה-5 מ"ל יחד עם תכולת הנוזל, ובכך לאפשר הסרה מהירה וקלה של כל שלב השמן. (E) ניתן לאסוף בקלות את כדור ה-GUV מתחתית הצינור בפיזור ברור, ללא זיהום שמן נראה לעין, כפי שאומת (F) על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: LS = תמיסת שומנים; IS = פתרון פנימי; OS = פתרון חיצוני; GUV = שלפוחית חד-פעמית ענקית; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 4: היווצרות GUV. דוגמאות ל-(A) ממשק OS/LS, (B) כדור GUV נקי עם פאזת שמן שקופה, ו-(C) כדור GUV עם פסולת בממשק OS/LS (הפסולת והגלולה נראים אדמדמים מכיוון שה-IS של אוכלוסיית GUV זו הושלם עם 1.65 מ"מ צבע קוקסין חדש כדי לשפר את ההדמיה). קיצורים: LS = תמיסת שומנים; IS = פתרון פנימי; OS = פתרון חיצוני; GUV = שלפוחית חד-שלמית ענקית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 5: יציבות אמולסיה עם יחסי שמן ומים בשמן. האיור מציג את היציבות של תחליבים לאורך זמן, בהתאם לסוג השמן ויחס המים/שמן (w/o) בשימוש. ייצוב התמונה הורכב מ-230.7 מ"מ סוכרוז ו-3.1 מ"מ כחול מבריק FCF כדי לשפר את ההדמיה של האמולסיות. תחליבים שהוכנו עם שמן מינרלי פחות יציבים ממקביליהם העשויים משמן סיליקון AR20. השפעה זו מוגברת עוד יותר עם הגדלת יחסי ה-w/o. למרות שתחליבים בשמן סיליקון AR20 יציבים יותר באופן משמעותי, היציבות שלהם פוחתת גם ככל שיחס ה-w/o עולה, כאשר הפרדת פאזה נראית מיד לאחר האמולסיה (שמן סיליקון AR20 ב-10%). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 6: תצפית על GUVs עם מיקרוסקופ ניגודיות-פאזה. הגדלה פי 20 של GUVs טעוני סוכרוז שהוכנו מ-LS המורכב מ-3.18 מ"מ DOPC בשמן מינרלי. (א) דגימה שנמצאה לאחר הסרת השמן; (ב) דגימה שנמצאה לאחר שלבי כביסה; (C) תפוקת GUV ירודה המתקבלת מ-LS שהוכן בסביבות עם חמצן ולחות לא מוסדרים; (D) GUVs טעונים במיקרו-חלקיקים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר; טיפות שמן מוקפות בעיגול, ודוגמאות לאגרגטים לא מסודרים של פוספוליפידים ומולקולות שמן מסומנות על ידי חץ. קיצורים: LS = תמיסת שומנים; GUVs = שלפוחיות חד-כיווניות ענקיות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 7: השפעת תנאי צנטריפוגה שונים על היווצרות GUV. תמונות ניגודיות פאזה של GUVs טעוני סוכרוז שהוכנו עם LS המורכב מ-0.2 מ"מ DOPC בשמן סיליקון AR20. האיור מציג השוואה איכותית של GUVs ב-(A) 16,600 × גרם למשך 5 דקות, (B) 3,300 × גרם למשך 20 דקות, ו-(C) 500 × גרם למשך 45 דקות. בעוד שמהירות צנטריפוגה גבוהה מביאה לנוכחות גבוהה יותר של אגרגטים פוספוליפידים, מהירות צנטריפוגה נמוכה מובילה לתשואה מופחתת. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: LS = תמיסת שומנים; GUV = שלפוחית חד-פעמית ענקית; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 8: ניתוח התפלגות גודל. השוואה בין שתי דגימות GUV טעונות סוכרוז שהתקבלו מ-(A) 0.2 מ"מ DOPC בשמן מינרלי ו-(B) 0.2 מ"מ DOPC בשמן סיליקון AR20 (*הדגימה דוללה פי 10 כדי לאפשר הבחנה ברורה של GUVs תחת מיקרוסקופ ניגוד פאזה). הניתוח שבוצע בעקבות סעיף 4 של פרוטוקול מראה התפלגות גודל שהועברה לכיוון קטרים גבוהים יותר עבור דגימת השמן המינרלי ביחס לדגימות שמן סיליקון AR20. עם זאת, התשואה של דגימת הסיליקון גבוהה כמעט פי 20. קיצורים: GUV = שלפוחית חד-שלמית ענקית; DOPC = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

צעדמצב Eתנאי Pתיאור
1.1.14.11 גרם17.11 גרםמסת סוכרוז
1.1.12.16 גרם2.16 גרםמסת גלוקוז
1.1.2240 מ"מ1000 מ"מריכוז סוכרוז
1.1.2240 מ"מ240 מ"מריכוז הגלוקוז
1.3.2שמן סיליקוןשמן מינרלישלב שמן ל-LS
1.3.2מזרק זכוכית 0.1 מ"למזרק זכוכית 0.5 מ"למזרק זכוכית להעברת DOPC בתמיסות כלורופורם
1.3.1063 מיקרוליטר500 מיקרוליטרנפח DOPC בתמיסת כלורופורם
1.3.1610 מ"ל5 מ"לנפח שמן
2.4.13300 גרם 20 דקות500 גרם 45 דקותמצב צנטריפוגה

טבלה 1: וריאציות בפרוטוקול. הטבלה מדווחת על וריאציות לשלבים שונים של הפרוטוקול (המצוין בעמודה הראשונה) להכנת שתי אוכלוסיות GUV שונות: GUVs טעוני סוכרוז (מצב E) ו-GUVs טעונים במיקרו-חלקיקים (מצב P).

מזהההשלבים המעורביםקוטר פנימי (מ"מ)קוטר חיצוני (מ"מ)אורך (מ"מ)
11.2.1; 1.2.371350
21.2.1; 1.2.4; 1.3.571350
31.2.1; 1.2.4; 1.3.5713100
41.2.1; 1.2.4; 1.2.57132000
51.2.1; 1.2.6; 1.3.137132000
61.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
71.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
81.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200
91.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200

טבלה 2: צינורות לחיבורי גז ואקום בתא הכפפות. הטבלה מפרטת את מידות צינורות הסיליקון המשמשים לחיבור תא הכפפות לקווי החנקן והוואקום. מזהי סימוכין מסופקים כדי להקל על תהליך ההרכבה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן לחלק את השיטות לייצור GUVs לשתי קבוצות עיקריות: שיטות המבוססות על נפיחות ממצעים באמצעות הידרציה ואלו המבוססות על הרכבה מממשקי נוזלים. שיטות מהקבוצה הראשונה יעילות מאוד במתן אוכלוסיות GUV גדולות לאפיון ביופיזיקלי של ממברנות שומנים או חלבונים טרנסממברניים. לעומת זאת, שיטות כמו העברת טיפות נבחרות בעיקר עבור עטיפת מטען בגלל הצריכה המופחתת של מטענים ויעילות אנקפסולציה גבוהה יותר18.

מסיבה זו, שפע של מטענים שונים נעטפו ב-GUVs, מה שהופך את העברת הטיפות לתהליך ייחוס לתאים מלאכותיים 3,8,9,10 ופתרון אפשרי לבניית מיקרו-רובוטים ביומימטיים חדשים 11,12. כדי לווסת את התכונות הפיזיקוכימיות של ממברנות GUV, ניתן לכלול מולקולות שונות, כגון פוספוליפידים יוניים10, חומצות שומן19, פולימרים כמו PEG20 או כולסטרול21 (אם כי למולקולות הידרופוביות כמו כולסטרול יש זיקה גבוהה לשמן, וכתוצאה מכך שליטה נמוכה יותר בהרכב הממברנה ביחס לשיטות נפיחות22). הפרוטוקול רב תכליתי מספיק כדי לאפשר שינויים אלה, אך לשלבים מסוימים יש השפעה גבוהה יותר מאחרים.

כדי לדון בקריטיות של השיטה, תיארנו כאן פרוטוקול להכנה של שתי אוכלוסיות GUV שונות: תכשיר אחד של GUVs המכילים תמיסת סוכרוז והכנה אחת של GUVs העוטפים מיקרו-חלקיקים. ההבדלים בפרוטוקול מפורטים בטבלה 1 כתנאי E (ריק) ומצב P (עם חלקיקים). שיטה זו מאפשרת היווצרות GUVs על ידי העברת טיפות מים משלב שמן לשלב מים בתהליך דו-יציב המונע על ידי פוספוליפידים23 ומושפע מהתכונות הפיזיקוכימיות של כל שלושת השלבים המעורבים: IS, OS ו-LS.

מבין השלושה, LS הוא הרגיש ביותר בגלל הרגישות של פוספוליפידים לאור, חמצון והידרוליזה 24,25,26. מסיבה זו, השלב הראשוני של אידוי הממס האורגני המשמש לאחסון ארוך טווח של פוספוליפידים ב-20 מעלות צלזיוס (בדרך כלל כלורופורם או מתנול) חייב להתבצע בבקבוקוני ענבר תחת זרימת חנקן או ארגון. אם לא מובטחות רמות לחות נמוכות בסביבת המעבדה, פוספוליפידים עלולים להינזק13, 14, 27. לכן, יש להכין LS בסביבה סגורה כגון תא כפפות או תא כפפות שונה חסכוני המתואר בפרוטוקול זה. לאחר הוספת השמן לסרט השומנים, ניתן להסיר את ה-LS מתא הכפפות, והפירוק המוחלט של הפוספוליפידים מתבצע על ידי מערבולת וחימום התמיסה.

למרות שחלק מהפרוטוקולים כוללים סוניקציה בשלב13 זה, עליות מקומיות בטמפרטורה עלולות להוביל לנזקים שעדיין לא תוארו עבור ניסוחים מסוימים של LS. מסיבה זו, חימום התמיסה באמבט מים עשוי לספק תהליך מבוקר והומוגני יותר. כדי להפחית עוד יותר את הסיכוי לפגיעה ב-LS, פרוטוקול זה מציע שימוש בשתי טמפרטורות שונות: מכיוון שפירוק של LS שהוכן לאחרונה דורש אנרגיה גבוהה יותר מאשר LS שהומס בעבר (עקב אריזה צפופה יותר של מולקולות פוספוליפידים בסרט המפוזר על פני בקבוקון הזכוכית), 80 מעלות צלזיוס מאומצים לפירוק סרט השומן הראשון ו-50 מעלות צלזיוס פשוט להמסת פוספוליפידים ממש לפני השימוש בהם. מכיוון שבדרך כלל נצפית עלייה בשונות הביצועים לאורך זמן עבור 3.18 מ"מ DOPC בשמן מינרלי (איור 4C), שימוש ב-LS תוך שבוע הוא פרקטיקה מומלצת בדרך כלל. עם זאת, שילובים מסוימים של שמן ופוספוליפידים עשויים להאריך את תוחלת החיים, ונראה כי השימוש בתא כפפות משפר גם את היציבות של LS לאורך זמן.

התאמה אישית של ממברנות GUV עם שילובים ספציפיים של פוספוליפידים עשויה לדרוש יישומים מותאמים אישית של הפרוטוקול. כדי לנווט בין כל הווריאציות האפשריות, ניתן לקבל הדרכה מהתכונות הפיזיקוכימיות של ה-LS. הריכוזים המיסלרים הקריטיים (CMC) והדיפוזיביות של פוספוליפידים ב-LS מושפעים מהאינטראקציות הכימיות עם המולקולות בתמיסה28. היווצרות טיפות מים בתחליב IS/LS מושפעת אפוא מהמהירות שבה פוספוליפידים יכולים להתפזר בשלב השמן ולהגיע לממשקי מים/שמן ליצירת שכבה חד-שכבתית יציבה (העלון הפנימי של הממברנה). נצפו הבדלים בדיפוזיביות עבור שני השמנים שנוצלו בפרוטוקול זה, כאשר שמן סיליקון AR20 מספק יציבות גבוהה יותר של תחליב IS/LS (איור 6). מכיוון שהאמולסיה היציבה ביותר עבור שני השמנים נצפתה כאשר מים התפזרו ביחס של 2.5% (עקבי עם תצפיות קודמות בשמן מינרלי13), קבענו זאת כיחס תקף באופן כללי.

עם זאת, מכיוון שיחסים גבוהים יותר יכולים לספק תכונות שימושיות (למשל, POPC בשמן מינרלי הראה מעבר ל-GUVs גדולים יותר13), אנו ממליצים להריץ בדיקה איכותית ראשונית כמו זו שדווחה באיור 6 כדי לקבל תובנות לגבי יציבות האמולסיה ומכאן היעילות הצפויה של האנקפסולציה. כאן, אנו ממליצים לקוראים לא להסתמך על תזמון מדויק או איטרציות של נהלים להיווצרות האמולסיה מכיוון שהיעילות תלויה אך ורק במפעיל או במכשיר המאומץ. במקום זאת אנו מספקים נקודת ביקורת כדי לעזור למפעיל להבין מתי איכות האמולסיה טובה מספיק כדי - לפחות תיאורטית - למקסם את הסיכוי להמיר טיפות ל-GUVs. הדיפוזיביות של פוספוליפידים בשמן משפיעה גם על יכולתם להתארגן מחדש במהלך העברת הטיפות וליצור את העלון החיצוני של ממברנת GUV 2,7,18,29. שלב זה מועדף על ידי שיווי משקל נכון של ממשק LS/OS. בעוד שזמן הדגירה שאומץ על ידי פרוטוקול זה עולה בקנה אחד עם המלצות כלליות18, עם מדידות מתח בין-פנים מדוחות קודמים7 והניסויים הראשוניים שלנו, GUVs שהוכנו עם LS שונה עשויים להפיק תועלת מזמן דגירה ארוך יותר.

היווצרות העלון החיצוני מושפעת גם ממהירות טיפות המים החוצות את ממשק LS/OS, שלב הקשור לצפיפות ולצמיגות של שלושת השלבים30. הבדלי הצפיפות חייבים תמיד לפי הסדר: IS > OS > LS. זה חיוני כדי לאפשר תחילה שקיעה של טיפות IS לכיוון ממשק LS/OS, ולאחר מכן חציית הממשק להמרה ל-GUVs ושקיעתם לכיוון תחתית הצינור. למרות שהתהליך יכול להתרחש באופן ספונטני גם כאשר מים נטולי יונים משמשים הן כ-IS והן כ-OS23, הוצג הבדל בצפיפות בין IS ל-OS לטובת היווצרות GUV31. הזוג הנפוץ ביותר למטרה זו הוא סוכרוז ב-IS וגלוקוז ב-OS: בריכוזים שווי-מולאריים הנדרשים למניעת נזק ל-GUVs הנוצרים עקב עקה אוסמוטית, סוכרוז מספק תמיסה צפופה יותר מגלוקוז. מכיוון שההבדל בצפיפות גדל עם האוסמולריות של תמיסות אלה, התשואה של GUVs משתנה בהתאם, ללא שיפור נוסף שנצפה מעבר ל-600 mOsm13.

תנאי צנטריפוגה אופטימליים קשורים קשר הדוק לצפיפות ולצמיגות של שלושת השלבים ולדיפוזיביות של הפוספוליפידים. בהיעדר אפיון מלא של שלושת השלבים, יש לסנן מספר מצבים. ממבחנים איכותניים (איור 4E ואיור 5) וניתוח שיטתי ראשוני17, ניתן היה להגדיר תנאי צנטריפוגה טובים עבור שתי הדגימות המתוארות בפרוטוקול זה; עם זאת, איכות הדגימות פתוחה לשיפור אם ייבדקו תנאים נוספים. כאשר האיזון בין דיפוזיביות פוספוליפידים ב-LS, לבין הצפיפות והצמיגות של שלושת השלבים אינו נשמר כראוי, לפוספוליפידים אין מספיק זמן לאזן בממשק LS/OS ולהתארגן מחדש בצורה נכונה כאשר טיפות מים נעות לכיוון מערכת ההפעלה. זה מוביל לעתים קרובות להיווצרות משקעים לבנבנים בממשק או ממש מתחתיו, המורכב ככל הנראה מפוספוליפידים ומולקולות אחרות בשלב הנפט הנגררות על ידי טיפות שאינן מצליחות להתאסף ל-GUVs במהלך הצנטריפוגה.

האנקפסולציה של תמיסה הומוגנית יכולה להיות מונעת על ידי הגדלת צפיפות ה-IS תוך שמירה על איזון אוסמוטי עם מערכת ההפעלה (כמו עבור צמד סוכרוז-גלוקוז), אך האנקפסולציה של פיזור מיקרו-חלקיקים דורשת את צפיפות הפאזה המימית כך שתתאים לזו של מיקרו-חלקיקים32. היעילות של עטיפת המטען מושפעת גם מההרכב הכימי של תמיסת המטען/פיזור. דיווחים קודמים הראו השפעה שלילית על תפוקת GUV הנגרמת על ידי הלידים רבים של מתכות אלקליות33 או וריאציות pH13, ככל הנראה בגלל אינטראקציות או תזוזות במטען הנקי של ראשים הידרופיליים זוויטריונים של פוספוליפידים. לכן, עטיפת תגובות ביולוגיות (כגון סינתזת חלבון אנזימטית או נטולת תאים) דורשת לעתים קרובות פשרה, שכן יש להתאים את ריכוזי ה-pH והמלח (כגון KCl או NaCl) לרמות שאינן אופטימליות לתגובה עצמה. עם זאת, אפילו תערובות תגובה מורכבות כגון סינתזת חלבון נטולת תאים ניתנות לשינוי כדילספק תאים מלאכותיים פונקציונליים מבוססי GUV.

מנקודת מבט מעשית, למרות ששיטת העברת הטיפות מציעה תהליך פשוט מאוד, התאוששות של GUVs ממערכת ההפעלה יכולה להוות מגבלות מסוימות. כדי לסייע בהוצאת השמן מהשלב העליון לאחר שלב הצנטריפוגה, ניתן לנצל שני קצות פיפטה להסרה עדינה יותר (שלב פרוטוקול 3.1.1) או בקבוק בוכנר להסרה מהירה יותר כאשר מכינים מספר דגימות (שלב פרוטוקול 3.1.2). עם זאת, מכיוון שהשמן אינו מוסר לגמרי, יש צורך לבצע שלב שטיפה כדי לקבל פיזור GUV נקי (פרוטוקול שלב 3.2). למרות ששלבי הכביסה הביאו להסרה יעילה של טיפות שמן שיוריות ללא אובדן ניכר של GUVs (איור 4A,B), מעבר זה עשוי להיות פחות פשוט עם שמן צמיג מאוד, והוא יכול לגזול זמן רב כאשר מכינים פורמולציות GUV מרובות. תוארה שיטה חלופית לעקיפת הסרת השמן ולשחזור ה-GUV מתחתית הצינור דרך חור מנוקב בעזרת מחט35. עם זאת, תהליך זה עשוי שלא לאפשר התאוששות מלאה של כדור ה-GUV אם הצינור אינו מנוקב במיקום הנכון, ויתרה מכך, הוא עלול להזיק למפעיל.

כדי לעזור להתאוששות ה-GUV, אנו מציגים כאן גישה חדשה ופשוטה להסרת שלב הנפט במהירות. זה מבוסס על לכידת שלב השמן העליון והפחות צפוף בקצה פיפטה מכוסה כך שלאחר הצנטריפוגה ניתן להסיר את הקצה בצורה כזו שלא יטפטף נוזל. אסטרטגיה פשוטה זו מאפשרת הסרה מהירה וקלה של כל שלב השמן בבת אחת, ומפשטת באופן עקבי את השלב הגוזל זמן זה.

כדי להעריך את יעילות הפרוטוקול, יושמו מספר שיטות לזיהוי אוטומטי של GUVs כדי להאיץ את הספירה וניתוח התפלגות הגודל. תיוג GUVs עם בדיקות פלואורסצנטיות מספק אסטרטגיה פשוטה ויעילה המיושמת הן על זרימה ציטומטרית36,37 והן על הדמיית מיקרוסקופ בשילוב עם אלגוריתמים לזיהוי מעגלים 13,37,38,39. לאחרונה, כלים מבוססי בינה מלאכותית לזיהוי אובייקטים נחקרים כדי לשפר את התהליך הזה40,41. עם זאת, צבעים פלואורסצנטיים יכולים להשפיע על תכונות GUV, ובכך להכניס חפצים לניתוח. אם לא כוללים אות פלואורסצנטי הניתן לזיהוי, מיקרוסקופיה נותרה האפשרות האמינה ביותר, כאשר מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה היא השיטה המועדפת להדמיה אופטימלית18 ויישום אלגוריתמים לזיהוי מעגלים38.

לחלופין, ניתן לנצל מאפיינים ייחודיים של ניסוחים ספציפיים לאסטרטגיות זיהוי ייחודיות. Hadorn et al., למשל, מינפו את נוכחותם של אלקטרוליטים ב-IS כדי לזהות GUVs עם מונה תאים מבוסס עכבה33. כאשר אף אחת מהשיטות האוטומטיות או הספציפיות לניסוח אינן אפשריות, הערת מעגל ידנית נשארת גיבוי אוניברסלי. במקרים כאלה, ImageJ מציעה כלי מעשי להאיץ את התהליך ולחלץ בקלות מדידות קוטר גולמיות כמתואר בפרוטוקול זה.

למרות האימוץ הרחב של שיטת העברת הטיפות, תשומת לב מועטה מוקדשת לתהליכי האופטימיזציה הנדרשים לניסוחים חדשים של GUV. בעבודה זו, אספנו את המידע הזמין מהספרות כדי ליישם פרוטוקול שיטתי לניווט ופישוט אופטימיזציה זו. מדריך מעשי זה בוחן את העקרונות הבסיסיים הכרוכים בייצור פורמולציות GUV חדשות ובשחזור דגימה מזוהמת בשמן, היבט שלעתים קרובות מתעלמים ממנו בפרוטוקול13,14. בעוד שחיזוי האופטימיזציה שכל ניסוח GUV דורש אינו אפשרי, מדריך זה מספק טיפים ותובנות שימושיות כדי להאיץ את היישום של GUVs חדשים, מה שעלול להוביל ליישומים הכוללים תאים מלאכותיים ומיקרו-רובוטים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות אלו הן חלק מפרויקט CELLOIDS (מיקרו-רובוטים אינטליגנטיים מבוססי חלקיקים בהשראת תאים) שקיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס' 948590). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הנציבות האירופית באמצעות פרויקט NextGenerationEU BRIEF. אנו מודים למישל איברהימי על התמיכה הטכנית בהקמת תא הכפפות ועל הדיון המועיל על יישום המיכל להסרה קלה של שמן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 ומיקרו; ממברנת אסטרי תאית מעורבים M  מסנני מזרקמרקSLGSVR255F
צינורות 1.5 מ"למחלקה ביולוגית06.0279.00
100 μ מזרק זכוכית Lמרק20737
150 מ"לאוונטור 213-1123לפחות 3
בקבוקוני זכוכית כהה 20 מ"ל ND24אוונטור 548-9001א
צינורות 2 מ"למחלקה ביולוגית07.3534.99
צילינדר 50 מ"לאוונטור 612-3843
500 μ מזרק זכוכית Lהמילטון549-1166
שפופרת פלקון 50 מ"למרקCLS352070
מזרק 50 מ"ל פישר סיינטיפיק8SS50L1
צינורות 5 מ"לגריינר ביו-וואן622201
600 מ"לאוונטור 213-1126
Bü בקבוק CHNERמרקZ740682
טבעות שעם לצלוחיות תחתונות עגולותאוונטור 217-1000
מגבשדוצ'ר080474א
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270
D-(+)-סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S9378
תרמו-היגרומטר דיגיטליבולנדרV1863-07
DOPCמחקר אוונטיברקוד 850375ג
מקדחהדרמל4000
מלח דיסודיום אריוגלאוצין (כחול מבריק FCF)סיגמא-אולדריץ'861146
מחט מזרק G18טרומוAN1838R1
מחט מזרק G21טרומוAN2138R1
תא כפפותבל-ארטF50030-0000אם זמין, ניתן להשתמש בתא כפפות, אך במעבדות עם רמות לחות נמוכות יתכן שלא יהיה צורך בכך.
בוחש מגנטי פלטה חמהתוכנת מעבדה LLG6.263 448
שמן מינרלי קלסיגמא-אולדריץ'330779
קוצ'יני חדשסיגמא-אולדריץ'199737
טבעת O טבעת O מגומי ניטריל, קדח 8 מ"מ, קוטר חיצוני 12 מ"מר.ס.196-4863
מכסי בורג פתוחים עם מחיצה ND24אוונטור 548-0031א
מיקרופיפטה P1000פישר סיינטיפיק12346132
מיקרופיפטה P10000אוונטור 89079-978
מיקרופיפטה P200פישר סיינטיפיק12326132
מגבות נייראוונטור KIMB6657
פרפילםאוונטור 291-1214
קצות פיפטה (1000)אפנדורף0030000919
קצות פיפטה (10000)אפנדורף0030000765
קצות פיפטה (200)אפנדורף0030000870
חלקיקי פוליסטירן, 1.1 ומיקרו; mסיגמא-אולדריץ'LB11-1 מ"ל
כובע גומיביוקלאס S.r.l.12.2300.05
אטם חרוטי גומיאוונטור 217-0211
מכסי ברגים  ND24אוונטור 548-0161א
שמן סיליקון AR20סיגמא-אולדריץ'10836
צינור סיליקון (קוטר פנימי 1.6 מ"מ, קוטר חיצוני 3 מ"מ)ר.ס.667-8441
צינור סיליקון (קוטר פנימי 6 מ"מ, קוטר חיצוני 12 מ"מ)ר.ס.273-2541לפחות 6 מ'
צומת תלת-כיווניר.ס.795-405
צומת דו כיווניר.ס.419-7287
שסתום דו כיווניקלבר91280
מים טהורים במיוחדתרמו פישר סיינטיפיק 22934כאשר זמין, ניתן להחליף מוצר זה במים מטוהרים באמצעות מערכות Milli-Q
מספריים אוניברסלייםבוצ'ם4154

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Träuble, H., Grell, E. Carriers and specificity in membranes. IV. Model vesicles and membranes. The formation of asymmetrical spherical lecithin vesicles. Neurosci Res Program Bull. 9 (3), 373-380 (1971).
  2. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  3. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
  5. Ernits, M., et al. Microfluidic production, stability and loading of synthetic giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 14 (1), 14071(2024).
  6. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), (2011).
  8. Elani, Y., Law, R. V., Ces, O. Vesicle-based artificial cells as chemical microreactors with spatially segregated reaction pathways. Nat Commun. 5 (1), 5305(2014).
  9. Heili, J. M., et al. Controlled exchange of protein and nucleic acid signals from and between synthetic minimal cells. Cell Syst. 15 (1), 49-62.e4 (2024).
  10. Shimane, Y., Kuruma, Y. Rapid and facile preparation of giant vesicles by the droplet transfer method for artificial cell construction. Front Bioeng Biotechnol. 10, 873854(2022).
  11. Sato, Y., Hiratsuka, Y., Kawamata, I., Murata, S., Nomura, S. M. Micrometer-sized molecular robot changes its shape in response to signal molecules. Sci Robot. 2 (4), eaal3735(2017).
  12. De Remigis, E., et al. Infiltration of cell-inspired ultra-deformable magnetic microrobots in restrictive environments. IEEE Trans Med Robot Bionics. 7 (1), 123-129 (2024).
  13. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  14. Zhang, Y., Obuchi, H., Toyota, T. A practical guide to preparation and applications of giant unilamellar vesicles formed via centrifugation of water-in-oil emulsion droplets. Membranes. 13 (4), 440(2023).
  15. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  16. Palagi, S. GUV-dimensional-analysis. , https://github.com/microrobotlab/GUV-dimensional-analysis/tree/v1.0 (2025).
  17. De Remigis, E., et al. Optimisation of encapsulation technique for confining microparticles in lipid membranes. Zenodo. 2023, DOI: 10.5281/zenodo.8069819 (2023).
  18. Dimova, R., Stano, P., Marques, C. M., Walde, P. Preparation methods for giant unilamellar vesicles. Giant Vesicle Book. , 3-20 (2019).
  19. Tyler, A. I. I., Greenfield, J. L., Seddon, J. M., Brooks, N. J., Purushothaman, S. Coupling phase behavior of fatty acid containing membranes to membrane bio-mechanics. Front Cell Dev Biol. 7, (2019).
  20. Hamada, S., et al. Giant vesicles functionally expressing membrane receptors for an insect pheromone. Chem Commun. 50 (22), 2958(2014).
  21. Roberti, E., Petrocelli, E. L., Cecchi, D., Palagi, S. Dimensions, stability, and deformability of DOPC-cholesterol giant unilamellar vesicles formed by droplet transfer. Open Res Eur. 5 (77), (2025).
  22. Weakly, H. M. J. Several common methods of making vesicles (except an emulsion method) capture intended lipid ratios. Biophys J. 123 (19), 3452-3462 (2024).
  23. Ito, H., et al. Dynamical formation of lipid bilayer vesicles from lipid-coated droplets across a planar monolayer at an oil/water interface. Soft Matter. 9 (40), 9539-9547 (2013).
  24. Reis, A., Spickett, C. M. Chemistry of phospholipid oxidation. Biochim Biophys Acta BBA Biomembr. 1818 (10), 2374-2387 (2012).
  25. Storage and handling of lipids. , https://avantiresearch.com/tech-support/storage-handling-of-lipids (2025).
  26. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  27. Faizi, H. A., Tsui, A., Dimova, R., Vlahovska, P. M. Bending rigidity, capacitance, and shear viscosity of giant vesicle membranes prepared by spontaneous swelling, electroformation, gel-assisted, and phase transfer methods: a comparative study. Langmuir. 38 (34), 10548-10557 (2022).
  28. Lehtinen, O. -P., et al. Effect of temperature, water content and free fatty acid on reverse micelle formation of phospholipids in vegetable oil. Colloids Surf B Biointerfaces. 160, 355-363 (2017).
  29. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  30. Whittenton, J., Harendra, S., Pitchumani, R., Mohanty, K., Vipulanandan, C., Thevananther, S. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  31. Hamada, T., Miura, Y., Komatsu, Y., Kishimoto, Y., Vestergaard, M., Takagi, M. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
  32. Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
  33. Hadorn, M., Boenzli, E., Hotz, P. E. A quantitative analytical method to test for salt effects on giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 1 (1), 168(2011).
  34. Toparlak, ÖD., et al. Artificial cells drive neural differentiation. Sci Adv. 6 (38), eabb4920(2020).
  35. Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoc. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  36. Matsushita-Ishiodori, Y., Hanczyc, M. M., Wang, A., Szostak, J. W., Yomo, T. Using imaging flow cytometry to quantify and optimize giant vesicle production by water-in-oil emulsion transfer methods. Langmuir. 35 (6), 2375-2382 (2019).
  37. Caliari, A., Hanczyc, M. M., Imai, M., Xu, J., Yomo, T. Quantification of giant unilamellar vesicle fusion products by high-throughput image analysis. Int J Mol Sci. 24 (9), 8241(2023).
  38. van Buren, L., Koenderink, G. H., Martinez-Torres, C. DisGUVery: a versatile open-source software for high-throughput image analysis of giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 12 (1), 120-135 (2023).
  39. Pazzi, J., Subramaniam, A. B. Nanoscale curvature promotes high yield spontaneous formation of cell-mimetic giant vesicles on nanocellulose paper. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (50), 56549-56561 (2020).
  40. Ekosso, C., Liu, H., Glagovich, A., Nguyen, D., Maurer, S., Schrier, J. Accelerating the discovery of abiotic vesicles with AI-guided automated experimentation. Langmuir. 41 (1), 858-867 (2025).
  41. Lee, I. -H., Passaro, S., Ozturk, S., Ureña, J., Wang, W. Intelligent fluorescence image analysis of giant unilamellar vesicles using convolutional neural network. BMC Bioinformatics. 23 (1), 48(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים