מאמר שיטה

ניתוח תלת מימד סימולטני של נזק לבבי ותגובה חיסונית באוטם שריר הלב החריף באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור

DOI:

10.3791/68347

⸱

26 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שחזור תלת מימדי (תלת מימדי) של נזק לבבי באוטם שריר הלב החריף (repAMI) מאפשר כימות נאמן ולוקליזציה משותפת של דפוסים המשפיעים על המחלה הקשורים. כאן, ניתנת גישת הדמיה מונחית יריעת אור אוטומטית למדידה בו-זמנית של נזק לבבי, אזור בסיכון ותגובת תאי חיסון.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אינטראקציות תאיות מורכבות קובעות עיצוב מחדש של רקמות תפקודיות ומבניות במהלך אוטם שריר הלב החריף (repAMI). תהליכים אלה מראים פיזור מרחבי מובהק כאשר שריר הלב הפגוע מפולח לאזורים שונים (אזור נזק, אזור בסיכון (AAR) ואזור מרוחק). הדמיה תלת מימדית (תלת מימדית) של אזורים אלה חיונית לניתוח אינטראקציות שונות בין תאי לב תושבים לתאי חיסון חודרים, ומאפשרת זיהוי מטרות טיפול אפשריות. כאן, מתואר פרוטוקול להדמיה וכימות תלת מימדיים בו-זמנית ואוטומטיים של אזור הנזק הלבבי, AAR ותאי חיסון חודרים (למשל, נויטרופילים) לאחר repAMI. זה כולל צביעה תוך-חיונית בתיווך נוגדנים של אזור נזק לבבי (CD31neg) וחדירת נויטרופילים (Ly6G+) לאחר הדמיה ex vivo של AAR על ידי זלוף נוגדנים רטרוגרדי וניקוי רקמות לא רעיל נוסף להדמיית מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות קלות (LSFM). טכניקה זו מאפשרת ניתוח מרחבי של תאי מטרה, למשל, תאי חיסון חודרים ואזורים פגומים בלב עכבר שלם לאחר repAMI. ניתן לבצע היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה מסורתית לאחר ניקוי רקמות לא רעילות ורכישת תמונה עם עיבוד לאחר בעזרת מחשב. זה מאפשר צבירת מידע מרובה בתוך אותו לב עכבר, מחזק את חוסן הנתונים ומשמעותי במיוחד בפציעה מורכבת מאוד כמו repAMI.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגיעה ברקמות באוטם שריר הלב החריף (repAMI) היא הגורם המניע העיקרי לשיפוץ הלב והתפתחות אי ספיקת לב1. מתווכים מקומיים מרובים ותאי לב תושבים אך גם תאי חיסון חודרים משפיעים על התפשטותו באינטראקציה מורכבת 2,3. הבנת הארגון המרחבי של תהליכים אלה חיונית לרכישת ידע מעמיק לזיהוי יעדי טיפול חדשים להגבלת פגיעה ברקמות לאחר repAMI ושיפור תפקוד הלב.

מכיוון ששריר הלב עצמו מורכב מסוגי תאים שונים, ניתוח מפורט של נזק לבבי הוא מאתגר מכיוון שכל סוג תא מראה את יכולת ההתנגדות הספציפית שלו במהלך איסכמיה ופגיעת רפרפוזיה 4,5. אחד מסימני ההיכר החשובים בהקשר של repAMI הוא אובדן משמעותי של כלי הדם המלווה בהידרדרות בתפקוד תאי האנדותל6. הסמן המבוסס ביותר המשמש לתיאור מבנה כלי הדם וניתוח תפקוד לקוי של האנדותל בעכברים ובבני אדם הוא CD31 (הידוע גם בשם PECAM-1), מולקולת הידבקות המתבטאת על פני תא האנדותל7. במודלים שונים של איסכמיה/רפרפוזיה, אובדן CD31 הוכח כסמן חלופי טוב להבחנה של נזק לרקמת האנדותל 8,9,10. יתר על כן, שלושה תאי פציעה עיקריים מובחנים בכל הלב במהלך repAMI. רקמת לב שאינה מושפעת מפגיעה באיסכמיה/רפרפוזיה (I/R) מייצגת את האזור המרוחק. שריר הלב במורד הזרם של חסימת כלי דם מוגדר כאזור בסיכון (AAR)11,12. לאחר תחילת הרפרפוזיה, ניתן להבדיל אזור מובהק של רקמת הלב בתוך ה-AAR, שנפגע מאיסכמיה קודמת (אזור נזק)13. הערכה קונבנציונלית של פגיעה ב-I/R לבבי בעכברים משתמשת בטריפניל טטרזוליום כלוריד (TTC) בחתכים עבים סדרתיים המציגים ירידה בפעילות המטבולית של תאי לב פגומים13,14. במקביל, ניתן להוסיף את הצביעה הכחולה של ex vivo Evan לקביעת AAR15. עם זאת, לשיטות מבוססות אלה יש מספר מגבלות, כולל האפשרות המופחתת להערכה משותפת של חדירת תאי חיסון, הבחנה של פגיעה ספציפית לסוג התא ושחזור רקמות תלת מימד מדויק.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור (LSFM) מאפשר את האפשרות לדמיין איברי עכבר שלמים עם רזולוציית אות פלואורסצנטי עד לרמה התאית. לאחרונה הוצגה שיטה משופרת לניקוי רקמות לא רעילה באמצעות אתיל צינמט (ECi) להדמיה תלת מימדית של לבבות עכברים שלמים8. כדי להתמודד עם המגבלות של הצביעה הכחולה של TTC/Evan, נעשה שימוש בצביעה פלואורסצנטית CD31 מבוססת נוגדנים תוך-חיוניים, וחשפה פגיעה באנדותל הלב כאזורים ללא צביעת CD31 (CD31neg) במהלך repAMI8. מתן נוסף של הזרקת אבי העורקים לאחור ex vivo עם נוגדן אנטי-CD31 מצומד פלואורופור עם ספקטרום פלואורסצנטי נוסף באשר לצביעה תוך-חיונית מהווה תיאור תלת מימדי עכשווי של AAR. יתר על כן, ניתן להרחיב שיטה זו על ידי הוספת צביעת נויטרופילים, המאפשרת ניתוח חלוקת תאים המופרדים על ידי אזור מרוחק, AAR ונפח פגיעה באנדותל הלב כדי לשפר את ההבנה של תפקוד הנויטרופילים במהלך repAMI.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הליכי חיות הניסוי אושרו על ידי הסוכנות הממשלתית המקומית האחראית (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) ועמדו בכל התקנות האתיות הרלוונטיות לניסויים ומחקר בבעלי חיים. ניסויים נערכו בעכברי C57BL/6J זכרים (בגילאי 9-30 שבועות). בעלי החיים שוכנו ושימשו בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים (SPF) בבית החיות המקומי במחזור של 12 שעות ו-12 שעות ביום ובלילה.

הערה: כל ההתערבויות הכירורגיות בוצעו תחת אינדוקציה תוך-צפקית של הרדמה באמצעות קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) עם תחזוקה באמצעות איזופלורן (1.5% נפח). כדי להפחית את סבלם של בעלי החיים, כל בעלי החיים קיבלו זריקות תת עוריות של 0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין לפני ואחרי הרדמה במהלך היום בשילוב עם מי שתייה המכילים בופרנורפין למשך הלילה. הפרוטוקול הכירורגי להשראת repAMI תואר בעבר במקום אחר16,17. לפני שמתחילים בהזרקת נוגדנים תוך-חיוניים, הכינו שתי צלחות פטרי בגודל 6 ס"מ המשמשות להזרקת נוגדנים רטרוגרדיים ex vivo בשלבים המאוחרים יותר המתוארים להלן. יש צורך בצלחת פטרי רדודה אחת עם PBS על קרח להסרה גסה של רקמות סביב מוגזמות מהלב (מומלץ להשתמש בחתיכות גזה חתוכות לגודל בתוך הכלי כדי להקל על תהליך הטיפול המאוחר יותר). יש צורך במנה נוספת לקנולרציה של אבי העורקים עם מחט צינורית פלדה קהה 20 גרם שקועה ב-PBS על קרח עם קשר רופף של תפר 5-0 מעל חריץ הצינורית. הימנע או הסר בועות אוויר בתוך הצינורית, מכיוון שהן עלולות לחסום כלי דם כליליים ולמנוע זלוף מוחלט.

1. הזרקת נוגדנים תוך חיוניים

  1. הרדמו את העכבר באמצעות קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג).
  2. הזרקת 10 מיקרוגרם כל אחד של נוגדנים נגד CD31 של עכבר עם תווית ישירה (שיבוט: MEC13.3; פלואורופור: AlexaFluor 790) ועכבר נגד Ly6G (שיבוט: 1A8; פלואורופור: AlexaFluor 647) ב-PBS בנפח כולל של 5 מיקרוליטר לגרם משקל גוף (100 מיקרוליטר לעכבר של 20 גרם) באמצעות הזרקת וריד זנב תוך ורידי.
    הערה: הזרקת נוגדנים זו תסמן את כל האנדותל בתוך הלב ונועדה לכמת את גודל הפגיעה של repAMI.
  3. תן לנוגדנים המוזרקים להסתובב במשך 10 דקות לפני שתמשיך בהליך.

2. קצירת לב

הערה: סעיפים 2 ו-3 הם קריטיים לזמן ויש להשלים אותם תוך פחות מ-6 דקות.

  1. להקריב את החיה על ידי פריקת צוואר הרחם 10 דקות לאחר הזרקת נוגדנים. בדוק את המוות על ידי הערכת רפלקסים.
    הערה: אם יש צורך בדגימות דם, קח אותן לפני שתמשיך לשלב הבא.
  2. הנח את העכבר מתחת למיקרוסקופ סטריאו.
  3. פתח את חלל החזה וחתך את הווריד הנבוב העליון החשוף קרוב ליציאת הכלי מכלוב הצלעות לצוואר.
    הערה: שמור על אבי העורקים שלם כפי שהוא נחוץ להזרקת נוגדנים רטרוגרדיים ex vivo .
  4. החדרת לבבות באתרם דרך אפרכסת הפרוזדורים הימנית והשמאלית עם PBS המכיל הפרין (20 IE/mL) באמצעות מחט 27 גרם עם משאבת רולר (70 מיקרוליטר לשנייה) למשך 3 דקות בסך הכל. הסרת דם מספקת של הלב מורגשת על ידי דהייה של משיכת כלי דם שטחית של הלב והלבנת הריאה והכבד.
    הערה: הימנע מזלוף לב דרך החדר הימני או השמאלי מכיוון שהוא עלול לגרום לחפצי הדמיה במהלך מיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון קל.
  5. יש לכרות את הלב ולפחות 5 מ"מ של אבי העורקים הנותר יחד עם רקמת הריאה שמסביב.
    הערה: אין להחזיק את שריר הלב ישירות במהלך הכריתה כדי למנוע נזק לרקמות וחפצי הדמיה במהלך מיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור.

3. הזרקת נוגדנים לאחור ex vivo

  1. העבירו את הלב לצלחת פטרי בגודל 6 ס"מ עם PBS קר כקרח וגזה שהוכנה קודם לכן.
  2. חתכו את רקמת הריאות, השומן וכלי הדם שנותרו מסביב עד שיישאר רק הלב עם אבי העורקים של כ-5 מ"מ.
  3. העבירו את הלב למנה מוכנה לקנולציה של אבי העורקים.
  4. משוך את אבי העורקים הנותר מעל צינורית הפלדה הקהה 20 G וקשר אותה עם תפר 50 הקשר מראש לחריץ הצינורית.
    הערה: יש לדחוף את קצה הצינורית קרוב לשסתום אבי העורקים כדי להבטיח שלא תהיה דליפה של נוזל הזלוף.
  5. קשר מחדש את העורק היורד הקדמי השמאלי (LAD) לצמיתות עם תפר 6-0 במיקום המדויק ששימש לזירוז repAMI בעבר.
  6. הזרקו 400 מיקרוליטר של PBS המכיל נוגדן 20 מיקרוגרם נגד CD31 (שיבוט: MEC13.3) של עכבר, המסומן ב-AlexaFluor 546, רטרוגרדית באמצעות צינורית מוחדרת.
    הערה: סגור את הצומת בין מזרק ההזרקה לצינורית המוכנסת עם סרט איטום כדי להבטיח זלוף נוגדנים מלא דרך העורקים הכליליים. הזרקת נוגדנים זו תכתים רק את האנדותל מחוץ ל-AAR ולכן ניתן להשתמש בה לכימות AAR.
  7. משוך החוצה את הצינורית המוכנסת מאבי העורקים.
  8. העבירו את הלב לצינור תגובת פוליפרופילן בנפח 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ודגרו ללא תסיסה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך.

4. עיבוד וניקוי דוגמאות

  1. שטפו את הלב הקבוע בשלושה שינויים של 5 מ"ל PBS למשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר (RT) בחושך, תמיד מתסיסים עם סיבוב כמעט תקורה בצינורות תגובה מפוליפרופילן של 5 מ"ל.
  2. לייבש לב קבוע בסדרת אתנול עולה של 5 מ"ל ב-50%, 70% ו-100% במים נטולי יונים, כל אחד למשך שעתיים לפחות ב-RT בחושך תמיד מתסיס עם סיבוב כמעט תקורה בצינורות תגובה של פוליפרופילן של 5 מ"ל.
    הערה: ניתן להאריך את הדגירה באתנול 50% ו-70% עד למחרת, בעוד שהדגירה באתנול 100% יכולה להתארך עד 3 ימים.
  3. אקונומיקה לב מיובש בצינורות תגובת פוליפרופילן של 15 מ"ל המכילים 10 מ"ל של 100% אתנול עם 5% DMSO ו-5% H2O2 ללא תסיסה למשך 4 שעות ב-4 מעלות צלזיוס בחושך.
    הערה: ייתכן שהצטברות לחץ בתוך הצינור במהלך תהליך ההלבנה; היזהר בעת פתיחת הצינור לאחר מכן.
  4. שטפו את הלב המולבן ב-5 מ"ל של 100% אתנול שלוש פעמים למשך 12 שעות כל אחת ב-RT בחושך, תמיד מתסיסים עם סיבוב כמעט תקורה בצינורות תגובה מפוליפרופילן של 5 מ"ל.
    הערה: ניתן להאריך כל שלב דגירה עד 3 ימים.
  5. העבירו את הלב לצינור תגובת פוליפרופילן בנפח 5 מ"ל המכיל 4 מ"ל של אתיל צינמט (ECi) לניקוי רקמות ודגירה ללא תסיסה במשך 3 ימים ב-RT בחושך.
    הערה: לב נקי יכול להישאר ב-ECi לפחות 3 חודשים ללא ירידה בעוצמת הקרינה תחת אחסון נכון בחושך ב-RT. אין לאחסן ECi או דגימות המאוחסנות ב-ECi מתחת ל-6 מעלות צלזיוס, מכיוון ש-ECi קופא בטמפרטורה זו, ופוגע בדגימה בתהליך.

5. הכנת גושי מסטיק גלאן

  1. מערבבים 1 גרם אבקת מסטיק גלאן ב 100 מ"ל מי ברז מחוממים (50-60 מעלות צלזיוס).
  2. מניחים לערבב עד לפתרון מלא בעזרת מערבל מגנטי.
    הערה: אם האבקה אינה מתמוססת כראוי, מחממים את התמיסה עד לרתיחה במיקרוגל.
  3. מסננים את תמיסת מסטיק הגלאן דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר.
  4. תמיסה מסוננת בצלחת לצלחת פטרי רדודה בגודל 10 ס"מ.
  5. מניחים להתקרר עד שהג'ל מתקשה.
  6. חותכים ג'ל לבלוקים של 15 מ"מ 15 מ"מ 5 מ"מ.
  7. התייבשו בלוקים ב-50 מ"ל של סדרת אתנול עולה ב-50% ו-70% במים נטולי יונים, כל אחד למשך שעתיים לפחות ב-RT תמיד מתסיסים עם סיבוב כמעט תקורה בצינור תגובה אחד של פוליפרופילן של 50 מ"ל.
    הערה: מלאו את צינור התגובה באתנול לאחר הוספת גושי ג'ל. מלאו את צינור התגובה רק עד חצי בבלוקים של ג'ל.
  8. דגרו בלוקים מיובשים ב-50 מ"ל של 100% אתנול שלוש פעמים למשך 12 שעות כל אחד ב-RT תמיד מתסיסים עם סיבוב כמעט תקורה בצינור תגובה פוליפרופילן אחד של 50 מ"ל.
    הערה: מלאו את צינור התגובה באתנול לאחר הוספת גושי ג'ל. מלאו את צינור התגובה רק עד חצי בבלוקים של ג'ל. בלוקים של ג'ל יכולים להישאר בצינור התגובה האחרון עם 100% אתנול לתקופות ממושכות עד לניקוי ב-ECi.
  9. מעבירים בלוקים לצינור תגובת פוליפרופילן של 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל של ECi ודוגרים ללא תסיסה למשך 3 ימים ב-RT.
    הערה: שים רק כמה בלוקים בצינור תגובה אחד עם ECi כדי למנוע פינוי חפצים. בלוקים שנוקו יכולים להישאר ב-ECi לפחות 6 חודשים ולאחסן ב-RT.

6. הדמיה

  1. חותכים גושי מסטיק גלאן מנוקים לגודל הדרוש לייצוב הלב הנקי במחזיק דגימת המיקרוסקופ.
    הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בקוביות מסטיק גלן מספר פעמים.
  2. זיהוי אותות פלואורסצנטיים מעניינים (אוטופלואורסצנטי, צביעת AAR [נוגדן נגד CD31 המסומן ב-AlexaFluor 546], נוגדן אנטי-Ly6G בשילוב AlexaFluor647 וצביעהנגדית CD31 [נוגדן נגד CD31 המסומן ב-AlexaFluor 790]) עם הגדרות מסנן עירור ופליטה מתאימות. לרכישה, השתמש בעדשת אובייקט NA 0.1 עם מרחק עבודה של 17.6 מ"מ.
    הערה: זיהוי אותות באמצעות לייזר אור לבן (200 mW; 480-2400 ננומטר). לזיהוי אוטופלואורסצנציה שמקורה ברקמת חיבור, השתמש במסנן עירור פס פס של 470/30 ננומטר ובמסנן פליטת פס פס של 525/50 ננומטר; צביעת CD31 עם נוגדן מצומד AlexaFluor 546 מזוהה עם מסנן עירור פס פס של 520/40 ננומטר ומסנן פליטת פס פס של 585/40 ננומטר; צביעת Ly6G עם נוגדן מצומד AlexaFluor 647 מזוהה עם מסנן עירור פס פס של 630/30 ננומטר ומסנן פליטת פס פס של 680/30 ננומטר; צביעת CD31 עם נוגדן מצמד AlexaFluor 790 מזוהה עם מסנן עירור פס פס של 740/40 ננומטר ומסנן פליטת פס פס של 824/55 ננומטר. יש להתאים את זמני ההארה ואחוז הנחתת הלייזר בהתאם לאיכות האות.
  3. בחר את ההגדרות הבאות עבור הדמיית מיקרוסקופיה של גיליון אור:
    1. בחר גיליון NA של 0.079, וכתוצאה מכך עובי יריעה קל של 5 מיקרומטר.
    2. בחר 10 מיקרומטר כמרחק בין שני מישורי z בודדים.
      הערה: התוצאה היא תת-דגימה ואובדן דיוק לאחר מכן עבור מדידות מעקב ונפח. כדי להימנע מכך, מרחק בין שני מישורי z בודדים צריך להיות שווה למחצית מעובי גיליון האור, כך שבמקרה זה, 2.5 מיקרומטר. מחקר זה בחר לדגום את הנתונים, מכיוון שהיתרונות שהושגו על ידי הפחתת זמן ההדמיה וגודל ערימת הנתונים עולים על האובדן המינימלי של דיוק הניתוח.
    3. השתמש ברוחב גיליון של 100% כדי לקבל תאורה הומוגנית של המדגם.

7. עיבוד לאחר תמונה

הערה: נתוני התמונה הדיגיטלית שנרכשו עובדו עוד יותר באמצעות תוכנת עיבוד וניתוח תמונה תלת מימדית מדעית המפורטת בטבלת החומרים.

  1. הפעל את תוכנת ממיר הקבצים של Imaris 10.1 וטען את מערך הנתונים הגולמי לתוכנה על ידי גרירה ושחרור של התיקיה עם קבצי התמונה לחלון ממיר הקבצים של Imaris או לחיצה על עיון וניווט לתיקיה עם קבצי התמונה.
  2. בחר את תיקיית הפלט באמצעות בחר תיקיה.
  3. נקישה התחל הכל והמתן להמרת הקבצים לקבצי .ims Imaris.
  4. הפעל את התוכנה ובחר מעבר בפינה השמאלית העליונה.
  5. פתח אוספי תמונות על-ידי בחירה באפשרות Open ובחר בקובץ הנתונים .ims המתאים.
  6. כדי ליצור משטח שנוצר באופן אוטומטי של כל הלב, בחרו 'תצוגה תלת-ממדית ' ו'משטחים'.
  7. בחר Segment רק אזור עניין, עבד את כל התמונה לבסוף, וסטטיסטיקת אובייקט-אובייקט תוך השבתת סיווג משטחים בקטע הגדרות אלגוריתם .
    הערה: הפעלת סטטיסטיקת אובייקט-אובייקט מאפשרת חישוב שכבת-על של משטחים שונים ופונקציות נקודתיות שונות.
  8. לחץ על לחצן החץ הכחול בפינה השמאלית התחתונה של גיליון היצירה כדי להמשיך בשלבים הבאים.
  9. קבע את אזור העניין התלת-ממדי באמצעות המניפולטורים המופיעים בתצוגת התמונה.
  10. המשך לשלב הבא על ידי בחירת ערוץ המקור (ערוץ אוטופלואורסצנטי).
  11. הפעל את Smooth ובחר את הגדרת ברירת המחדל של 11.8 מיקרומטר.
  12. המשך לשלב הבא וקבע את הסף הדרוש ליצירת משטח תלת מימדי מספק אופטית המופיע בתוך תצוגת התמונה.
  13. בשלב האחרון, התאם את מסנן פני השטח, בחר מספר Voxels כסוג המסנן וקבע 10 כסף.
  14. צור משטח על-ידי לחיצה על לחצן החץ הירוק בפינה השמאלית התחתונה של המקטע Create . על ידי שימוש בגיליון הצבעים , שנה את החומר והצבע של המשטח שנוצר לפי הצורך.
  15. צור שני משטחים נוספים שנוצרו באופן ידני עבור AAR (נפחCD31 neg בערוץ AlexaFluor 546) ונפח פגיעה באנדותל הלב (נפח CD31neg בערוץ AlexaFluor 790) על ידי בחירה בתצוגה תלת-ממדית ומשטחים פעם נוספת.
  16. בחר פלח רק אזור עניין, עבד את כל התמונה לבסוף וסטטיסטיקת אובייקט-אובייקט תוך השבתת סיווג משטחים במקטע הגדרות אלגוריתם ולחץ על דלג על יצירה אוטומטית, ערוך ידנית.
  17. בתוך גיליון הלוח , בחר XY לכיוון, ללא לנראות והתאם ידנית את בקר הרזולוציה למקסימום.
  18. עבור אל גיליון הדגם , לחץ על מרחק סמל והגדר את מרווח הקודקודים ל-100 מיקרומטר.
  19. הפעל ציור והקף אזוריCD31 neg בערוץ AlexaFluor 546 או בערוץ AlexaFluor 790 כל 10 פרוסות תמונה.
  20. לאחר סיום הקפת כל האזורים המתאימים, בחר התאמה אוטומטית ובצע התאמה אוטומטית.
  21. לחצו על Create Surface והתאימו את החומר והצבע של המשטחים שנוצרו בגיליון הצבעים .
  22. כדי להציג נויטרופילים כנקודות Ly6G+, צור פונקציית נקודה על ידי בחירה בתצוגה תלת-ממדית וכתמים.
  23. בחר Segment only a Region of Interest, Process Whole Image Final ו-Object-Object Statistics תוך השבתת Classify Spots במקטע Algorithm Settings .
  24. המשך לשלבים הבאים באמצעות לחצן החץ הכחול בפינה השמאלית התחתונה של גיליון היצירה .
  25. קבע את אזור העניין התלת-ממדי באמצעות המניפולטורים המופיעים בתוך תצוגת התמונה כפי שהוזכר לעיל.
  26. המשך לשלב הבא באמצעות ערוץ המקור (ערוץ AlexaFluor 647).
  27. הגדר את קוטר ה-XY המשוער ל-10 מיקרומטר, הפעל את התארכות ה-PSF של המודל לאורך ציר ה-Z והגדר את קוטר ה-Z המשוער ל-20 מיקרומטר.
  28. השבת חיסור ברקע.
  29. המשך לשלב הבא, בחר Intensity Min כמסנן והגדר סף מתאים.
    הערה: להערכת רמת הסף, לחץ על פרוסה באזור העליון של חלון התוכנית ובחר בערוץ AlexaFluor 647. הזז את הסמן מעל נקודות שונות בפרוסת התמונה הגולמית המייצגת צביעה חיובית של Ly6G וקרא את ערך העוצמה בפינה השמאלית התחתונה של חלון התוכנית.
  30. צור כתמים על-ידי לחיצה על לחצן החץ הירוק בפינה הימנית התחתונה של גיליון היצירה .
  31. הגדר את קנה המידה של הרדיוס ל- 3.0 במקטע סגנון/איכות נקודות של גיליון היצירה .
  32. הגעתי לגיליון הצבעים להתאמת צבע הספוט כרצונך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגישה המוצגת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור (LSFM) מאפשרת ניתוח סימולטני של AAR, פגיעה באנדותל וחדירת נויטרופילים לאחר repAMI. איור 1A ממחיש את צביעת הנוגדנים התוך-חיוניים וה-ex vivo של עכברי C57BL/6J 24 שעות לאחר השראת repAMI. נוגדנים לצביעה של פגיעה באנדותל הלב (anti-CD31 המסומן ב-AlexaFluor 790) והסננת נויטרופילים (anti-Ly6G המסומן ב-AlexaFluor 647) הוזרקו תוך ורידי 10 דקות לפני ההקרבה. לאחר הסרת דם מספקת, AAR נצבע באמצעות זלוף אבי העורקים לאחור של נוגדן אנטי-CD31...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנן מספר ישויות הדמיה לאיתור פגיעה ברקמת הלב במהלך repAMI בעכברים. טכניקות אלו מספקות יתרונות שונים אך גם טומנות בחובן מגבלות. צביעה ירידה בפעילות המטבולית של תאי לב באמצעות TTC היא השיטה הנפוצה ביותר לכימות פגיעה ב-I/R לבבי וניתן לשלב אותה עם הצביעה הכחולה של אוון להבחנה של AAR 13,14,15. זוהי שיטה מהירה וחסכונית, אך היא מוגבלת בשחזור תלת מימד מדויק בשל הצורך ביצירת קטעי רקמה סדרתיים. כך גם לגב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אליאס חאג'-יחיא מדווח על שכר טרחה אישי ואחרים מאסטרהזניקה, שנמצאים מחוץ לעבודה שהוגשה. סיימון פ. מרץ ולאה בורנמן מועסקים כיום על ידי Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG. מתיאס טוצק וטיינוש ראסאף מדווחים על שכר טרחה אישי, ואחרים מאדוארדס ונוברטיס, בריסטול מאיירס סקוויב, באייר, דאיצ'י סאנקיו ואסטרה זנקה, שנמצאים מחוץ לעבודה שהוגשה. טיינוש רסאף ואולריקה ב. הנדגן-קוטה ייסדו במשותף את Bimyo, חברה המתמקדת בפיתוח פפטידים להגנה על הלב. מתיאס גונצר קיבל מימון מחקר כללי מ-Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG. כל שאר המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים למקורות המימון הבאים: קרן המחקר הגרמנית (UMEA Clinician Scientist, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) ואגודת הלב הגרמנית (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). חלק מעבודה זו בוצעה במרכז ההדמיה של אסן (IMCES), מתקן ליבה של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת דיסבורג-אסן, גרמניה. אנו מודים לצוות IMCES על התמיכה הטכנית המתמשכת והשימוש במכשירים שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחט 27 גרםבקטון דיקינסון305889BD Eclipse
עיבוד תמונה תלת מימד & תוכנת ניתוחמטוס סיביותVers. 10.1.0אימאריס
תפר 5-0סרג-ויסנרIC108000משי
6-0 תפראתיקוןEH7814פרולן
ערכת תיוג נוגדנים AlexaFluor 546Invitrogenא20183
ערכת תיוג נוגדנים AlexaFluor 790Invitrogenא20189
נוגדן Ly6G נגד עכבר (AlexaFluor 647)ביולג'נד127610שיבוט: 1A8
מסננת תאים (100 ומיקרו; m)קורנינג431752
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)קארל רוט7029.1
אתנולקארל רוט0911.4
אתיל צינמט (ECi)סיגמא-אולדריץ'112372
תוכנת ממיר קבציםמטוס סיביותVers. 10.1.0אימאריס
גזהפורמן10021
אבקת גומי גלןסיגמא-אולדריץ'עמ' 8169פיטאג'ל
הפרין (25.000 IE/5 מ"ל)ליאו פארמה15261203
מי חמצן (H<תת>2O2, 30%)קארל רוט8070.2
מזרק הזרקהבי בראוןברקוד 9161502Sאומניקן פ
קטמין (100 מ"ג/מ"ל)בלה-פארמה402581.00.00
מערכת מיקרוסקופ גיליון אורמילטני ביוטק-אולטרה-מיקרוסקופ בלייז
מזרק נעילת לוארבקטון דיקינסון303172BD פלסטיפק
בוחש מגנטיVWR444-0572
מצלמת Neo sCMOS (4.2 מגה פיקסל)טכנולוגיית אנדורתא ZL41 4.2
המטרהמילטני ביוטק130-133-625MI Plan 1.1x NA 0.1, WD 17.6 מ"מ
פרפורמלדהיד (PFA, 4%)סיגמא-אולדריץ'1.0049610% פורמלין, חומצה ניטרלית
צלחת פטריגריינר ביו-וואן632181
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)ג'יבקו14190-094ללא MgCl2/CaCl2
צינור פוליפרופילן (15 מ"ל)גריינר ביו-וואן188261
צינור פוליפרופילן (5 מ"ל)קארל רוטEKY9.1שחור
צינור פוליפרופילן (50 מ"ל)גריינר ביו-וואן227261
צלחת הכנה לקינולציה של לב העכברהוגו זקס אלקטרוניק73-4327צינורית כלולה
נוגדן CD31 מטוהר נגד עכברבקטון דיקינסון53369שיבוט: MEC13.3
משאבת רולראיסמטקמסת"מ 597-230
סרט איטוםבמיסPM-996פרפילם
מיקרוסקופ סטריאולייקהS6D
מסובב צינורהיידולףפולימקס 1040
לייזר אור לבןפוטוניקה של NKTSuperK קיצוני200 מגה-וואט, 480 אינץ'; 2400 ננומטר
מתח עכבר WTמעבדות ג'נוויר-C57BL/6JRj
קסילזין (2%)צ'ווה טירגסונדהייט6324464.00.00

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
  2. Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol. 30 (3), 240-245 (2015).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The biological basis for cardiac repair after myocardial infarction: from inflammation to fibrosis. Circ Res. 119 (1), 91-112 (2016).
  4. Koch, A., et al. Capillary endothelia and cardiomyocytes differ in vulnerability to ischemia/reperfusion during clinical heart transplantation. Eur J Cardiothorac Surg. 20 (5), 996-1001 (2001).
  5. Singhal, A. K., Symons, J. D., Boudina, S., Jaishy, B., Shiu, Y. T. Role of endothelial cells in myocardial ischemia-reperfusion injury. Vasc Dis Prev. 7, 1-14 (2010).
  6. Robbers, L. F., et al. Magnetic resonance imaging-defined areas of microvascular obstruction after acute myocardial infarction represent microvascular destruction and haemorrhage. Eur Heart J. 34 (30), 2346-2353 (2013).
  7. DeLisser, H. M., Newman, P. J., Albelda, S. M. Molecular and functional aspects of PECAM-1/CD31. Immunol Today. 15 (10), 490-495 (1994).
  8. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10 (1), 2312(2019).
  9. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  10. Zhong, X., et al. Tubular epithelial cells-derived small extracellular vesicle-VEGF-A promotes peritubular capillary repair in ischemic kidney injury. NPJ Regen Med. 7 (1), 73(2022).
  11. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17 (4), 268-272 (2012).
  12. Arai, A. E. Magnetic resonance imaging for area at risk, myocardial infarction, and myocardial salvage. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 313-320 (2011).
  13. Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Res Cardiol. 113 (5), 39(2018).
  14. Rassaf, T., et al. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circ Res. 114 (10), 1601-1610 (2014).
  15. Haj-Yehia, E., et al. CD47 blockade enhances phagocytosis of cardiac cell debris by neutrophils. IJC Heart Vasculature. 48, 101269(2023).
  16. Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., French, B. A., Rassaf, T. A practical approach to remote ischemic preconditioning and ischemic preconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury. J Biol Methods. 3 (4), e57(2016).
  17. Michel, L., et al. Real-time pressure-volume analysis of acute myocardial infarction in mice. J Vis Exp. (137), e57621(2018).
  18. Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2435-H2443 (2008).
  19. Clasen, L., et al. Cardiac ischemia and reperfusion in mice: a comprehensive hemodynamic, electrocardiographic and electrophysiological characterization. Sci Rep. 13 (1), 5693(2023).
  20. Lang, C. I., et al. Expedient assessment of post-infarct remodeling by native cardiac magnetic resonance imaging in mice. Sci Rep. 11 (1), 11625(2021).
  21. Coolen, B. F., et al. Three-dimensional T1 mapping of the mouse heart using variable flip angle steady-state MR imaging. NMR Biomed. 24 (2), 154-162 (2011).
  22. Zhong, X., et al. Comprehensive cardiovascular magnetic resonance of myocardial mechanics in mice using three-dimensional cine DENSE. J Cardiovasc Magn Reson. 13 (1), 83(2011).
  23. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  25. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nat Commun. 10 (1), 1944(2019).
  26. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy. J Vis Exp. (123), e55450(2017).
  27. Taki, J., et al. 14C-Methionine uptake as a potential marker of inflammatory processes after myocardial ischemia and reperfusion. J Nucl Med. 54 (3), 431-436 (2013).
  28. Michel, L., et al. PD1 deficiency modifies cardiac immunity during baseline conditions and in reperfused acute myocardial infarction. Int J Mol Sci. 23 (14), 7533(2022).
  29. Park, K. C., Gaze, D. C., Collinson, P. O., Marber, M. S. Cardiac troponins: from myocardial infarction to chronic disease. Cardiovasc Res. 113 (14), 1708-1718 (2017).
  30. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Curr Protoc Neurosci. 81 (2), 28.21-28.28 (2017).
  31. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using light sheet microscopy. J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).
  32. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nat Protoc. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  33. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  34. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  35. Merz, S. F., et al. High-resolution three-dimensional imaging for precise staging in melanoma. Eur J Cancer. 159, 182-193 (2021).
  36. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Front Immunol. 11, 599495(2020).
  37. Pichardo, A. H., et al. Optical tissue clearing to study the intra-pulmonary biodistribution of intravenously delivered mesenchymal stromal cells and their interactions with host lung cells. Int J Mol Sci. 23 (22), 14171(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Light Sheet MicroscopyArea At Risk

מאמרים קשורים