מאמר שיטה

מודל עכבר אופטימלי לגרימת סרטן המעי הגס הקשור לקוליטיס באמצעות אזוקסימתאן ונתרן דקסטרן סולפט למחקרי אימונולוגיה וטיפול בגידולים

DOI:

10.3791/68351

⸱

25 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Immunology, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, 4University of Florida Health Cancer Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן המעי הגס הקשור לקוליטיס המושרה על ידי אזוקסימתאן (AOM)/דקסטרן סולפט נתרן (DSS) הוא גישה מבוססת וחסכונית למידול גידולים אוטוכטוניים של המעי הגס בעכברים. אנו מציגים פרוטוקול מעודכן ודנים בשיקולים קריטיים לאופטימיזציה של מינון DSS ספציפי למין ובתרומת המיקרוביום לקפדנות, חוסן ושחזור.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אזוקסימתאן (AOM, חומר מזיק ל-DNA) ונתרן דקסטרן סולפט (DSS, חומר מקדם קוליטיס) יכולים לגרום לגידולים במעי הגס של עכברים עם חדירה גבוהה. מודל סרטן המעי הגס הקשור לקוליטיס עכברים (CAC) המושרה על ידי AOM/DSS עומד כסטנדרט זהב בחקירת סרטן המעי הגס הקשור לדלקת, בהתחשב בדיוק שלו בסיכום המאפיינים הקליניים של CAC אנושי. יתרונות המודל כוללים את מקורו והתפתחותו מרקמה אנדוגנית, יכולת חיסונית המשמרת רפרטואר מלא של אינטראקציות גידול-חיסוניות, יכולת הסתגלות לזני עכברים רבים, נוחות של חביון של 3 חודשים ועלויות נמוכות יחסית. למרות יתרונות אלה, מספר אתגרים מגבילים את יעילות הפרוטוקול. שונות במינון DSS ובחדירת הגידול בין מחקרים מובילה לתצפיות לא עקביות. בנוסף, וריאציות במיקרוביוטה של המעיים תורמות לשונות ניסויית מוגברת, ומשפיעות לרעה על הכוח הסטטיסטי. הבדלים בין המינים בתגובה ל-AOM/DSS מסבכים עוד יותר את פירוש התוצאות. יתר על כן, השונות של DSS ממנה למנה מעכבת את יכולת השחזור של הממצאים. התמודדות עם אתגרים אלה חיונית לשיפור האמינות והישימות של מודל זה במחקר פרה-קליני. כדי לפתור זאת, תוך שימוש בעכברי C57BL/6J כמודל, חידדנו את הפרוטוקול שנקבע עם אסטרטגיות לאופטימיזציה יעילה כדי לשפר את יכולת השחזור וההרמוניה בין המחקרים. אלה כוללים המלצות לטיטרציה של מינון DSS בעכברים זכרים ונקבות כאחד, יישום הומוגניזציה של מיקרוביוטה לפני כל מחזור DSS כדי להפחית את ההטרוגניות של חיידקי המעיים מכלוב לכלוב. שלבים אלה הפחיתו משמעותית את השונות ושיפרו את יכולת השחזור, וכתוצאה מכך אינדוקציה חזקה של CAC. מתוך הכרה בתפקיד המרכזי של דלקת ומנגנוני חיסון תאיים בהתפתחות CAC, הפרוטוקול מתאר גם הליכי עיבוד רקמות המתאימים לבידוד RNA או חלבון ולפרופיל ציטוקינים דלקתיים מגידולי המעי הגס ורקמת המעי הגס שמסביב. בסופו של דבר, השימוש בשיטה זו מבטיח ייצור CAC קפדני, חזק וניתן לשחזור יותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן המעי הגס (CRC) הוא הסרטן השלישי בשכיחותו בעולם והגורם המוביל למקרי מוות הקשורים לסרטן 1,2. בהשוואה ל-CRC ספורדי, סרטן המעי הגס הקשור לקוליטיס (CAC) מתעורר כתוצאה מנזק מעיים ממושך וחוזר בחולים עם מחלת מעי דלקתית (IBD)3,4, מאופיין בדרגה ממאירה גבוהה יותר ונטייה להצגה מולטיפוקלית בגיל צעיר יותר. בשל גורמים אלה, CAC בדרך כלל מחייב טיפול אגרסיבי יותר עם תוצאות קליניות פחות טובות5. למרות ש-CAC נחשב לישות נפרדת לפחות בחלקו בשל העיתוי הייחודי של רכישת מוטציות ותפקיד גדול מדי של מנגנוני החיסון הדלקתיים והמיקרוביום, CAC ו-CRC ספורדי חולקים קווי דמיון רבים ביחס לנופים גנומיים כלליים ותכונות פתוגניות. כדי לקדם את ההבנה שלנו לגבי CRC בכלל ו-CAC בפרט, וכדי לשפר אסטרטגיות טיפוליות, מודלים פרה-קליניים חזקים הם חיוניים.

מבין המודלים השונים המשמשים לחקר CRC, מודל ה-CAC המושרה על ידי AOM/DSS הוא המאומץ ביותר ונחשב לתקן הזהב הנוכחי 6,7. מודל זה, שהחל עם עלבון מוטגני חזק המועבר על ידי AOM, מסתמך על התקפים חוזרים ונשנים של קוליטיס הנגרמים על ידי DSS המחקים באופן הדוק את IBD האנושי, כגון מחלת קרוהן וקוליטיס כיבית, שהם גורמי סיכון מבוססים היטב ל-CAC8. מודל AOM/DSS מציע מספר יתרונות מרכזיים על פני גישות in vivo אחרות. בניגוד לשיטות המסתמכות על הזרקת חומר אקסוגני יוזם סרטן כדי ליצור גידולים אגפיים או אפילו אורתוטופיים, CAC המושרה על ידי AOM/DSS הוא אוטוכטוני, כלומר התחלת הגידול מתרחשת באופן אנדוגני והתקדמות הסרטן מתפתחת במיקרו-סביבת הרקמה הטבעית, המשקפת יותר את הביולוגיה וההיסטוריה הטבעית שלו. בניגוד ל-xenografts של קווי תאים אנושיים או של חומר שמקורו בחולה שניתן לגדל רק בעכברים מדוכאי חיסון, הוא בעל יכולת חיסונית, ומאפשר לחקור אינטראקציות חיסוניות-סרטניות. בניגוד למודלים מהונדסים גנטית המייצרים גידולים עם מניעים גנטיים ספציפיים, הוא אגנוסטי למוטציות מוגדרות מראש, ומאפשר מודלים רחבים יותר של מסלולי איתות סרטן ומנגנוני חינוך חיסוני. לבסוף, ניתן להתאים בקלות את מודל AOM/DSS לזנים רבים ושונים של עכברים, מה שמבטל את הצורך בתוכניות רבייה ממושכות, מה שהופך אותו לחסכוני בזמן ובעלות. עם זאת, גורמים כמו מין בעלי חיים, מינון DSS והבדלים במיקרוביוטה של המעיים יכולים להכניס שונות, להשפיע על יכולת השחזור ולסבך את יישומה במחקר תרגומי.

מטרתנו הייתה לחדד פרוטוקול זה כדי להפחית את ההשפעה של גורמים אלה העומדים בבסיס חוסר עקביות בהיקף הדלקת במעי הגס וגידול CAC. קיימת שונות משמעותית בריכוזי ה-DSS המשמשים להשראת דלקת חריפה, קוליטיס או דלקת כרונית, ו-CAC 9,10. DSS הוא פולימר, והמשקל המולקולרי הממוצע יכול להשתנות בין קבוצות ויצרנים, מה שמשפיע על השונות בתוצאות הניסוי. לכן, חיוני לבדוק כל אצווה של DSS כדי להבטיח עקביות בכל המחקרים. בנוסף, היקף הדלקת הנגרמת על ידי DSS מושפע מאוד ממיקרוביום המעי, שיכול להיות שונה באופן משמעותי בין מתקני עכברים ברחבי העולם, ואפילו בין מקומות החזקה ומושבות שונות בתוך אותו מוסד11,12. שונות זו בהרכב החיידקים יכולה להשפיע על תוצאות המודל ולתרום לתוצאות לא עקביות13. שיכון משותף של בעלי חיים מקבוצות הניסוי השונות, במידת האפשר, הוא קריטי להפחתת השונות, אך ייתכן שלא יספיק כדי לטפל בבלבול זה, מכיוון שהקהילות המיקרוביאליות עוברות סחיפה סטוכסטית לאורך זמן ומובילות להשפעות כלוב במודלים של דלקת כרונית14. מכיוון שפרוטוקול AOM/DSS כולל טיפול ארוך טווח לשמירה על דלקת כרונית, יישמנו הומוגניזציה של מיקרוביוטה על ידי ערבוב תקופתי של המצעים מכל הכלובים המאכלסים בעלי חיים שטופלו ב-AOM/DSS. תרגול זה מסייע להומוגניזציה של סביבת המיקרוביוטה, וכתוצאה מכך להפחית את השונות הניסיונית. חוץ מזה, תצפיות מצביעות על כך שההשפעות של DSS יכולות להשתנות בהתאם למין בעלי החיים15,16, מה שעלול להוביל לתגובות דיפרנציאליות בדלקת ובהתפתחות סרטן. חידדנו את הפרוטוקול הקיים על ידי טיטרציה של DSS בעכברים נקבות וזכרים בנפרד כדי לבחור מינון מתאים של DSS לשני המינים, מה שמבטיח תוצאות אחידות יותר ומספק תשומות קריטיות לחישובי כוח סטטיסטיים לקביעת גדלי מדגם אופטימליים בעכברים זכרים ונקבות כאחד.

בסך הכל, כדי לשפר את יכולת השחזור של מודל AOM/DSS, אנו מתארים קבוצה סטנדרטית של הנחיות פרוטוקול המביאות בחשבון ומפחיתות את הגורמים המבלבלים הללו. אנו משתמשים בטכניקות הומוגניזציה של מיקרוביום, כמו גם מתארים התאמת מינון DSS מדויקת כדי להשיג תוצאות עקביות וניתנות לשחזור יותר, ובכך לשפר את התועלת של מודל AOM/DSS והרמוניזציה במחקרים שונים. הפרוטוקול שלנו בולט כמדגים שונות מופחתת מכלובים הומוגניים של מיקרוביוטה ומספק הוראות ברורות שלב אחר שלב ליישום שיטות שחזור אלה. כתוצאה מכך, השונות הנמוכה בתוך הקבוצה המושפעת משיפורי פרוטוקול אלה מובילה להפחתה בגודל המדגם הדרוש להשגת הכוח הסטטיסטי הרצוי בזיהוי הבדלים בין קבוצות ניסוי. פרוטוקול אופטימלי זה מותאם לחוקרים שמטרתם להתאים את מודל AOM/DSS למודלים של עכברים ועיצובים ניסיוניים משלהם, ללא קשר לזן או לרקע מגדרי, לחקר מנגנוני גידול, מטרות טיפוליות או חקר דינמיקה של תאי חיסון.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים חייבים להתבצע בהתאם לפרוטוקול מאושר מוסדי כדי להבטיח טיפול אנושי ועמידה בסטנדרטים אתיים. המחקרים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פלורידה (IACUC).

1. אופטימיזציה של מינון DSS

  1. השג עכברים בגיל, בזן ובמקור שישמשו בניסוי העיקרי, עם התפלגות שווה של זכרים ונקבות. סמן כל עכבר לפי ניקוב אוזניים, סימן זנב או שיטה מאושרת אחרת למעקב פרטני. מדוד ורשום את משקל הגוף ההתחלתי של כל בעל חיים.
    הערה: יש לשכן עכברים זכרים לפני הגמילה ואין לחלק אותם מחדש בין הכלובים כדי למזער את הלחימה.
  2. אם משתמשים בהשקיה אוטומטית, שבוע לפני תחילת הניסוי, העבירו בעלי חיים לבקבוקי מים ובמקביל חסמו את חרירי הכלוב (צינורות לגימת מתכת בכלוב) עם פקקים סטריליים.
    הערה: ודא שכל שינוי באספקת המים, כגון חרירי מי שתייה אוטומטיים חסומים, מאושר על ידי IACUC או הגוף הרגולטורי המתאים המפקח על שימוש הומני בבעלי חיים. כלובי בעלי חיים עשויים לדרוש בדיקות יומיות כדי להבטיח גישה ללא הפרעה למי שתייה.
  3. הכינו את תמיסת ה-DSS על ידי המסת DSS במי שתייה סטריליים שעברו חיטוי בריכוזים משתנים מ-1.5% עד 5% (w/v), באמצעות מוט ערבוב מגנטי וצלחת ערבוב. המתן 30 דקות בטמפרטורת החדר עד שאבקת ה-DSS תתמוסס לחלוטין במים. הכינו את מי ה-DSS טריים מדי שבוע ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבוע.
  4. מלאו שני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל במי DSS בכל ריכוז (אחד לזכרים, אחד לנקבות) והצמידו היטב פיית שתייה סטרילית חיטוי כדי למנוע דליפה.
  5. לתת מי DSS בכל ריכוז לעכברים נקבות וזכרים, כאשר 3 עכברים בכל כלוב מקבלים את אותו ריכוז. השתמש במי שתייה סטריליים ללא DSS כבקרה שלילית. החלף מי DSS כל יומיים.
  6. יש לתת מי DSS למשך 7 ימים. רשום את משקל הגוף של כל עכבר מדי יום.
  7. ביום 8, החזירו את כל בעלי החיים למי שתייה רגילים.
  8. ביום ה-8, העריכו את חומרת השלשול על סמך עקביות הצואה תוך שימוש במערכת ניקוד סטנדרטית כמתואר17 ורשמו ציונים. ציון "1" ככדור צואה רך אך עדיין מעוצב, "2" ככדור צואה רך מאוד, ו-"3" כשלשול.
  9. ביום ה-8, אספו 2-3 כדורי צואה טריים והעריכו נוכחות של דם סמוי (ראו טבלת חומרים). רשום נוכחות או היעדר דם בדגימה.
  10. יש להעריך דימום במעי על סמך שילוב של שני קריטריונים לניקוד, סמיכות הצואה (0-3) ונוכחות דם בצואה (0-3), לציון כולל שנע בין 0 ל-6.
  11. מהיום ה-9 עד היום ה-12, רשמו את משקל הגוף של כל עכבר מדי יום ועקבו מקרוב אחר בעלי חיים שטופלו ב-DSS לירידה משמעותית במשקל הגוף ושלשול חמור. המתת חסד מיידית של בעלי חיים המגיעים או חורגים מנקודות קצה הומאניות על ידי חנק פחמן דו חמצני (CO2) או שיטה מתאימה אחרת בהתאם לפרוטוקול השימוש המאושר בבעלי חיים והנחיות אתיות שנקבעו.
  12. מהיום ה-13 עד היום ה-18, המשיכו לעקוב אחר בעלי חיים ורשמו את משקל הגוף של כל עכבר מדי יום עד להתאוששות מלאה לרמות שלפני הניסוי.
  13. קבעו את ריכוז ה-DSS האופטימלי, וכתוצאה מכך ירידה של כ-20% במשקל הגוף מלווה בצואה רכה אך דוממת. מינון ה-DSS האופטימלי עשוי להשתנות בין זכרים ונקבות, זני עכברים, גילאים, מגרשי DSS ומתקנים לבעלי חיים.

2. אינדוקציה CAC

  1. יום 0-6: טיפול AOM יום 7-28: מחזור ראשון של טיפול DSS
    1. הכנת מלאי AOM: ממיסים אבקת AOM במי מלח סטריליים כדי להשיג ריכוז מלאי של 10 מ"ג/מ"ל. מסננים את התמיסה דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר, מחלקים כמות של 1 מ"ל לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שנה.
      הערה: AOM הוא חומר מסרטן נדיף ויש לטפל בו בזהירות מתחת למכסה מנוע עם ציוד מגן אישי מתאים (PPE), בהתאם להמלצות הבטיחות של היצרן. יש להשליך את AOM וכל חומר מזוהם ב-AOM בהתאם לפרוטוקולי סילוק הפסולת הכימית המסוכנת של המוסד. באחריות החוקר להבטיח את אישורי הבריאות והבטיחות הסביבתיים הדרושים מבעוד מועד.
    2. אם משתמשים בהשקיה אוטומטית בכלוב, שבוע לפני תחילת הניסוי, חסמו את פיית מי השתייה האוטומטית והעבירו בעלי חיים לבקבוקי מים להתאקלמות כמו בשלב 1.2.
    3. ביום 0, שקלו ורשמו את משקל הגוף של כל עכבר כדי לחשב את הכמות הכוללת הנדרשת של AOM. לאחר מכן חשב את הנפח הכולל של AOM (ריכוז עבודה סופי של 1 מ"ג/מ"ל) על סמך המשקל של כל בעל חיים כדי להשיג מינון של 10 מ"ג/ק"ג, למשל, 200 מיקרוליטר לעכבר של 20 גרם.
    4. יש להפשיר את המספר הנדרש של מינויים חדשים של 10 מ"ג/מ"ל AOM על קרח לפני כל שימוש. יש לדלל כל מנה של 1 מ"ל של AOM ב-9 מ"ל של מי מלח סטריליים כדי להשיג ריכוז עבודה של 1 מ"ג/מ"ל.
    5. מתן AOM לעכברים באמצעות הזרקה תוך-צפקית. בצע הליך זה בתוך ארון בטיחות ביולוגית תוך לבישת PPE מתאים כגון כפפות כפולות ומסכת N95 להגנה מיטבית.
      זהירות: השלך כל שאריות תמיסת AOM בהתאם לדרישות סילוק פסולת כימית מסוכנת.
    6. ביום השלישי, העבירו בעלי חיים שטופלו ב-AOM לכלובים נקיים. ללבוש PPE מתאים בעת טיפול בכלובים מזוהמים ב-AOM וחומרים אחרים להגנה.
      זהירות: השלך מצעי כלוב מלוכלכים וכל שאריות מזון בהתאם לנהלי סילוק הפסולת הכימית המסוכנת המאושרים של המוסד.
      הערה: AOM והמטבוליטים שלו מופרשים לחלוטין עד 72 שעות לאחר מתן18, ובשלב זה ניתן להיפטר מתשתית כלוב מלוכלכת.
    7. ביום השביעי, בצעו הומוגניזציה של מיקרוביוטת המעיים כדי למזער את השונות בין כלוב לכלוב. לשם כך, דגמו 25% מהמצעים מכל כלוב, ערבבו היטב והפיצו אותם מחדש לכל כלוב.
      הערה: הימנע מהחלפת כלובים במהלך שבוע הטיפול ב-DSS ובמשך חמישה ימים לאחר מכן. יש לתאם עם שירות החלפת כלובי הגידול של המתקן, לפי הצורך.
    8. התחל אינדוקציה של קוליטיס על ידי מתן DSS במי שתייה באמצעות צינורות חרוטיים של 50 מ"ל המצוידים בחרירים מתאימים. בדוק עכברים מדי יום כדי לוודא שלבעלי חיים יש גישה בלתי מוגבלת למי DSS. החלף מי DSS כל יומיים. רשום את משקל הגוף של כל עכבר מדי יום.
    9. ביום ה-14, החלף את מי DSS בבקבוקי מי שתייה רגילים. המשיכו לעקוב מקרוב אחר בעלי חיים לאיתור כאב ומצוקה.
    10. בימים 14-19, שקלו כל עכבר מדי יום. המתת חסד של בעלי חיים שמאבדים יותר מ-25% ממשקל גופם, או אם בעל חיים מגיע לאחת מנקודות הקצה ההומאניות המתוארות בפרוטוקול הטיפול והשימוש המאושר בבעלי חיים. בנוסף, עקוב ורשום כל מקרה של דימום רקטלי.
  2. יום 7-28: מחזור ראשון של טיפול DSS
    1. ביום השביעי, בצעו הומוגניזציה של מיקרוביוטת המעיים כדי למזער את השונות בין כלוב לכלוב. לשם כך, דגמו 25% מהמצעים מכל כלוב, ערבבו היטב והפיצו אותם מחדש לכל כלוב.
      הערה: הימנע מהחלפת כלובים במהלך שבוע הטיפול ב-DSS ובמשך חמישה ימים לאחר מכן. יש לתאם עם שירות החלפת כלובי הגידול של המתקן, לפי הצורך.
    2. התחל אינדוקציה של קוליטיס על ידי מתן DSS במי שתייה באמצעות צינורות חרוטיים של 50 מ"ל המצוידים בחרירים מתאימים. בדוק עכברים מדי יום כדי לוודא שלבעלי חיים יש גישה בלתי מוגבלת למי DSS. החלף מי DSS כל יומיים. רשום את משקל הגוף של כל עכבר מדי יום.
    3. ביום ה-14, החלף את מי DSS בבקבוקי מי שתייה רגילים. המשיכו לעקוב מקרוב אחר בעלי חיים לאיתור כאב ומצוקה.
    4. בימים 14-19, שקלו כל עכבר מדי יום. המתת חסד של בעלי חיים שמאבדים יותר מ-25% ממשקל גופם, או אם בעל חיים מגיע לאחת מנקודות הקצה ההומאניות המתוארות בפרוטוקול הטיפול והשימוש המאושר בבעלי חיים. בנוסף, עקוב ורשום כל מקרה של דימום רקטלי.
  3. יום 29-49: מחזור שני של טיפול DSS
    1. חזור על הומוגניזציה של מיקרוביוטה יחד עם מתן DSS, בהתאם לאותם נהלים כמו בשלבים 2.2.1-2.2.4. אופציונלי: לאחר מחזור ה-DSS השני ו/או השלישי, בצע קולונוסקופיה כמתואר קודם לכן19.
  4. יום 50-70: מחזור שלישי של טיפול DSS
    1. חזור על הומוגניזציה של מיקרוביוטה יחד עם מתן DSS, בהתאם לאותם נהלים כמו בשלבים 2.2.1-2.2.4. מכיוון שעכברים נוטים לרדת במשקל הרב ביותר שלושה ימים לאחר המחזור השלישי של DSS, יש לעקוב מקרוב אחר כל בעלי החיים לאיתור ירידה מוגזמת במשקל הגוף או לכל אינדיקציה לדימום רקטלי במהלך תקופה זו ולספק צ'או לח לטיפול תומך במידת הצורך.

3. הערכת חומרת קוליטיס ופתולוגיה גסה של CAC

  1. ביום ה-70, אספו 2-3 כדורי צואה טריים מכל עכבר כדי לבדוק נוכחות של דם סמוי ו/או סמני דלקת כגון ליפוקלין-220 כדי להעריך את חומרת הקוליטיס. השתמש בריאגנטים/ערכות מתאימות (ראה רשימת חומרים וציוד) ופעל לפי הוראות היצרן לביצוע הבדיקות, המפורטות בקצרה להלן.
  2. להכנת דגימות צואה להערכת רמות סמן הדלקת ליפוקלין-2, הנח כדורי צואה טריים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. ממיסים כדורים ב-1 מ"ל של מי מלח סטריליים עם פוספט (PBS) באמצעות מערבל מערבולת עד להשגת תמיסה אחידה. צנטריפוגה את התמיסה ב-10,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. ניתן להשתמש בסופרנטנט באופן מיידי עבור ליפוקלין-2 ELISA או לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
  3. בצע עכבר lipocalin-2 ELISA לפי הוראות יצרן הערכה. הפעל ניסויי דילול סדרתי פיילוט כדי לקבוע דילול אופטימלי של דגימות צואה ביחס לתקנים.
    הערה: רמות הליפוקלין-2 צפויות לעלות לפחות פי 1000 בעכברים שטופלו ב-DSS בהשוואה לחיות ביקורת שטופלו במים20.
  4. העריכו את חומרת הקוליטיס באמצעות מערכת ניקוד שלשול17 כמתואר בשלבים 1.8-1.10.
  5. ביום ה-70, המתת חסד של בעלי חיים על ידי חנקCO2 או בכל שיטה הומאנית מאושרת אחרת.
  6. רססו את אזור הבטן של כל בעל חיים באתנול 70% כדי למזער את הזיהום במהלך השלבים הבאים.
  7. השתמש במלקחיים כירורגיים עדינים כדי להרים את העור ואת שכבת הצפק. בצע חתך אופקי במספריים כדי לחשוף את חלל הבטן.
  8. משוך את המעי הדק החוצה וזהה את הצקום. הרם בעדינות את הצקום והמעי הגס באמצעות מלקחיים. נתח בזהירות את המעי הגס על ידי חיתוך המזנטריה וכלי הדם הנלווים באמצעות מספריים, הימנע מניקוב או חיתוך דרך המעי הגס.
  9. חתכו את עצם האגן ואת העור המקיף את אזור פי הטבעת כדי לחשוף את המעי הגס הדיסטלי השלם. חשוב לנתח את כל המעי הגס כשהחלק הדיסטלי שלם, מכיוון שרוב הגידולים מתרחשים בדרך כלל באזור זה.
  10. הניחו את המעי הגס המנותח על רצועת נייר פילטר נקייה, ויישרו אותו בעדינות.
  11. מדוד את אורך הנקודתיים בעזרת סרגל ותעד אותו עם תמונה. כלול את הסרגל בתצלום לקנה מידה.
  12. נקו את הכתמים של פייר בחלק החיצוני של המעי הגס, והקפידו לא לנקב את הרקמה.
  13. שוטפים את המעי הגס ב-PBS סטרילי קר.
  14. אבטח קצה מיקרופיפטה של 200 מיקרוליטר (ללא מסנן) על מזרק של 3 מ"ל באמצעות סרט פרפין. השתמש בהגדרה זו כדי למלא את המזרק ב-PBS סטרילי, להכניס את קצה הפיפטה ללומן המעי הגס ולשטוף בעדינות את תוכן המעי הגס 2-3 פעמים, תוך הבטחת הסרה מלאה של כדורי הצואה.
  15. מתחו בעדינות את המעי הגס על רצועת נייר פילטר נקייה ורטובה מראש. חותכים את המעי הגס לאורך ומניחים אותו שטוח על נייר המסנן.
  16. זהה גידולים גדולים יותר, המופיעים בדרך כלל ככתמים בולטים הבולטים מדופן המעי הגס עם מראה אדום ומודלק.
  17. עבור גידולים קטנים יותר, יש לנקוט משנה זהירות במהלך הזיהוי. השתמש בלולאת זריעה חיידקית סטרילית כדי לחקור בעדינות את פני המעי הגס לאיתור אי סדרים או בליטות. ודא שכל בליטות שזוהו אינן שרידים של בלוטות לימפה או כלי דם הממוקמים בחלק החיצוני של דופן המעי הגס.
  18. השתמש במחוגה דיגיטלית כדי למדוד את הרוחב והאורך של כל גידול.
  19. רשום את ספירת הגידול ואת גודלו ומיקומו של כל גידול על מפת המעי הגס המודפסת מראש.

4. הערכה היסטולוגית

  1. השתמש בשני זוגות מלקחיים בעלי קצה דק כדי לתפוס את שני הקצוות הצדדיים של המעי הגס הדיסטלי. גלגל את הנקודתיים מהקצה הדיסטלי לקצה הפרוקסימלי לצורת גליל שוויצרי כמתואר במקום אחר21. ודא שהקצה הדיסטלי נמצא במרכז הגליל, והקצה הפרוקסימלי יוצר את השכבה החיצונית ביותר.
  2. אבטח כל מעי גס מגולגל שוויצרי באמצעות מחט 271/2-G.
  3. הנח כל מעי גס מגולגל שוויצרי מאובטח לתוך קלטת טישו עם תווית מתאימה.
  4. טבלו את קלטות הרקמה המכילות מעי גס מגולגל שוויצרי ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS סטרילי. אפשר לרקמות להישאר בקיבוע למשך 24 שעות.
  5. לאחר 24 שעות, העבירו את הרקמות ל-70% אתנול. ניתן לשמור את הרקמות ב-70% אתנול ב-4 מעלות צלזיוס עד שלושה חודשים.
  6. ניתן להשתמש ב-Swiss-roll לבדיקות היסטופתולוגיה מרובות, כולל צביעה קונבנציונלית של המטוקסילין ואאוזין (H&E), אימונוהיסטוכימיה ואימונופלואורסצנטיות.

5. קצירת רקמות לבידוד חלבונים ורנ"א מגידולים ומהמעי הגס שמסביב

  1. עבדו על קרח והשתמשו בצינורות וריאגנטים מקוררים מראש כדי לשמור על שלמות החומר הביולוגי.
  2. לאחר הערכת הגידול, נתחו גידולים ואספו לתוך צינורות מקוררים מראש עם תווית מראש עם חיץ מתאים (ראה להלן) על קרח. בהתאם לתכנון הניסוי, אסוף את כל הגידולים מאותה חיה או עבד אותם בנפרד. אם תרצה, אסוף באופן דומה ~1 ס"מ חתיכות של רקמת המעי הגס שאינה גידולית.
  3. בידוד חלבונים
    1. הוסף 0.5 מ"ל של חרוזי זכוכית שחיקה של 800 מיקרומטר ו-400 מיקרוליטר של מאגר ליזה (1% NP-40 ב-150 מ"מ NaCl עם 20 מ"מ Tris-HCl (pH 7.5) וקוקטייל מעכב פרוטאז ופוספטאז 1% לכל צינור הומוגניזציה של רקמות והעביר את רקמת המעי הגס/גידול לכל צינור.
    2. הומוגניזציה של רקמת המעי הגס/גידול באמצעות הומוגנייזר רקמות מבוסס חרוזים ב-6 M/S למשך 30 שניות, חזור פעמיים להומוגניזציה מלאה.
      הערה: הנח צינורות על קרח בין המחזורים כדי למנוע התחממות יתר של הדגימה מהומוגניזציה מכנית.
    3. לאחר ההומוגניזציה, יש לשאוב 150 מיקרוליטר מהליזאט (סופרנטנט) ולהעביר לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל.
    4. סובב את הליזאט ב-10,000 גרם ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול כל חומר בלתי מסיס. העבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת נקייה אם רוצים.
    5. כימות ריכוז החלבון הכולל על ידי בדיקת חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) או שיטה מתאימה אחרת.
    6. אם תרצה, התאם את ריכוז החלבון הכולל ל-4 מ"ג/מ"ל עבור כל דגימה עם אותו מאגר ליזה.
    7. השתמש בליזטים של חלבון באופן מיידי לבדיקות במורד הזרם כגון אימונובלוטינג או ניתוח ציטוקינים, או אחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
  4. טיהור RNA:
    1. לאחר הדיסקציה, יש להניח את המעי הגס/גידולים בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ולטבול ב-200 מיקרוליטר של מגיב מתאים לשימור RNA.
      הערה: נקודת השהיה: ניתן להקפיא רקמת מעי גס/גידול טרייה בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר
    2. להפשיר רקמת מעי גס/גידול על קרח.
    3. העברת המעי הגס/גידול לתוך צינור הומוגניזציה של רקמות המכיל 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה מתאים המתאים לבידוד RNA ו-200 מיקרוליטר של חרוזי זכוכית שחיקה.
    4. הומוגניזציה באמצעות הומוגנייזר רקמות מבוסס חרוזים ב-6 M/S למשך 30 שניות שלוש פעמים, עם הפסקה של שתי דקות בין כל מחזור.
      הערה: העבירו את הצינור על קרח בין מחזורים כדי למנוע התחממות יתר של RNA כתוצאה מהתחממות יתר במהלך הומוגניזציה מכנית.
    5. העבירו 300 מיקרוליטר של ליזאט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש של 1.5 מ"ל.
    6. בודד את ה-RNA הכולל באמצעות הליך טיהור ה-RNA המתאים לפי הצורך. למדוד את ריכוז ה-RNA, הטוהר והאיכות/שלמות בהתאם לשימוש במורד הזרם.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצענו אופטימיזציה של מינון DSS עבור תנאי הניסוי שלנו. יש לכייל מחדש את מינון ה-DSS עבור כל מתקן של בעלי חיים, זן עכברים, תכנון מחקר ומנת DSS. במחקר זה, עכברי C57BL/6J שוכנו בוויווריום ספציפי נטול פתוגנים בכלובים מאווררים עם תזונה סטנדרטית של מכרסמים עם 18% חלבון מוקרן. גם עכברים זכרים וגם נקבות מתחילים לרדת במשקל החל מהיום החמישי אחרי שהושמו על מי DSS, ומגיעים למשקל הנמוך ביותר שלהם שלושה ימים אחרי הפסקת DSS (איור 1A,C). ביום הירידה הגדולה ביותר במשקל, עכברים זכרים הראו ירידה של כ-15% במשקל, בעוד שעכברים נקבות הראו ירידה של כ-20% במשקל (איור 1B,D). על סמך תוצאות אלה, קבענו שהמינון האופטימלי לתנאי הניסוי הספציפיים שלנו היה 3.0% לנשים ו-3.25% לגברים. לוח הזמנים לטיפול ב-AOM/DSS מתואר באיור 2A, כאשר הומוגניזציה של המיקרוביום מתרחשת בתחילת כל מחזור טיפול DSS עד לסיום הניסוי כדי להפחית את השפעות הכלוב והשונות. דינמיקה אופיינית של ירידה במשקל והתאוששות של בעלי חיים לאורך כל הניסוי מוצגת באיור 2B. בעלי חיים מתאוששים לחלוטין למשקל הגוף המקורי תוך שבועיים לאחר הפסקת מתן DSS. מודל קוליטיס DSS מכויל היטב מביא לכדורי צואה רכים אך עדיין נוצרים במקום שלשול (ציון עקביות צואה 1-2), עם גילוי מדי פעם של דם סמוי בצואה המעיד על דימום תת-קליני ומקרים מעטים של דם גלוי בצואה (ציון נוכחות דם 1-2)17. כדי להעריך עוד יותר את חומרת הקוליטיס, נאספו דגימות צואה כדי לנתח את רמות הסמן הדלקתי ליפוקלין-2. נוכחות של דם סמוי לא זוהתה בעכברים שקיבלו מי שתייה קבועים במהלך הניסוי, בניגוד לחיות שטופלו ב-DSS (איור 2C). באופן עקבי, רמות הליפוקלין-2 היו גבוהות פי 1,000 בעכברים שטופלו ב-AOM/DSS בהשוואה לבקרות AOM/מים בלבד (איור 2D).

בנקודת הסיום ניתחנו את המעי הגס וספרנו גידולים באמצעות מפת רשומות גידול (איור 3A). קוליטיס DSS גורמת לאורך המעי הגס קצר יותר באופן משמעותי, בניגוד לבקרות AOM/מים בלבד (איור 3B). יתר על כן, חיות שטופלו ב-AOM/DSS מפתחות גידולי מעי גס גלויים, שרובם נוצרים בקצה הדיסטלי (איור 3C). בדיקה היסטולוגית של חלקי המעי הגס המוכתמים ב-H&E חשפה שחיקה משמעותית של תאי אפיתל, חדירה חיסונית וכיב בעכברי AOM/DSS (איור 4A). ניתן לכמת את חומרת ההיסטופתולוגיה של המעי הגס באמצעות מערכות ניקוד מבוססות עבור CAC עכברי המושרה על ידי DSS, בהתבסס על ארבעה פרמטרים (איור 4B): חדירה חיסונית ובצקת (0-3), כיב (0-3), מורפולוגיה של אפיתל המעי הגס (0-4) וניאופלזמות (0-4)22,23,24. התוצאות של הערכות כאלה, כפי שיושמו על דוגמאות היסטולוגיה באיור 4A, מוצגות באיור 4C. התפשטות האפיתל של המעי הגס הוערכה באמצעות ניתוח אימונוהיסטוכימי באמצעות צביעת Ki67, והוכיחה כי טיפול ב-DSS מקדם התפשטות של תאי אפיתל במעי הגס. בנוסף, ניתן להשתמש בחלקי המעי הגס לצביעה אימונו-פלואורסצנטית של סמנים שונים, כגון סמן האנגיוגנזה CD31 (איור 4D,E).

הערכנו עוד את ההשפעות של הומוגניזציה של מיקרוביוטה על נקודות קצה ניסיוניות כגון גודל הדלקת במעי הגס, ירידה במשקל הגוף ועומס הגידול המצטבר בכל בעל חיים. קבוצה אחת של עכברים שוכנו בכלובים שעברו ערבוב וחלוקה מחדש של מצעים מלוכלכים ביום 0 כדי להשיג הומוגניזציה של מיקרוביוטה, לצד חיות ביקורת בכלובים שבהם המניפולציה הזו הושמטה. בעלי חיים בשתי הקבוצות קיבלו 2.5% מים DSS במשך 7 ימים. בעוד שהרמות הממוצעות של הסמן הדלקתי ליפוקלין-2 בצואה לכלוב ביום השמיני לא היו שונות באופן משמעותי בין הקבוצות (מבחן ה-t של וולש), ראינו שונות נמוכה משמעותית בין נקודות נתונים בכלובים שעברו הומוגניזציה של מיקרוביוטה (איור 5A, מבחן F של וולש להשוואת שונות, p<0.0001). באופן עקבי, עד היום השמיני, כל בעלי החיים הראו ירידה דומה במשקל הגוף בהשוואה לקו הבסיס של יום 0. אולם עכברים בקבוצת ההומוגניזציה של המיקרוביוטה הראו פחות שונות בירידה במשקל הגוף בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 5B). יתר על כן, בפרוטוקול אינדוקציה של CAC בן 10 שבועות (איור 2A) עם (הומוגניזציה של מיקרוביוטה) וללא ערבוב מצעי כלוב (ביקורת) לפני כל מחזור DSS, נטל הגידול המצטבר לעכבר היה עקבי יותר בקבוצה ההומוגנית של המיקרוביוטה בהשוואה לבקרות שהיו משתנות יותר באופן משמעותי (איור 5C). בסך הכל, נתונים אלה מספקים ראיות חזקות לכך שהומוגניזציה של מיקרוביוטה משפרת מאוד את החוסן והשחזור של מודל AOM/DSS.

figure-results-1
איור 1. טיטרציה במינון DSS בעכברים זכרים ונקבות. (A-D) אחוז שינוי במשקל הגוף בהשוואה ליום 0 בעכברי בר בני 14 שבועות (A, B) ונקבה (C, D) C57BL/6J שהוחזקו על המים עם ריכוזי DSS מצוינים (1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3% לזכרים ו-2%, 3%, 4% לנקבות). (א, ג) בעלי החיים קיבלו DSS במשך 7 ימים והיו במעקב אחר ירידה במשקל הגוף עד 12 ימים. B ו-D מראים ירידה במשקל הגוף של עכברים זכרים ביום 8 (B) ועכברים נקבות ביום 9 (D) מתחילת הטיפול ב-DSS. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SEM; n=3 ב-A ו-B, n=4 ב-C ו-D. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2. ציר זמן וניטור CAC המושרה על ידי AOM/DSS. (A) ציר זמן ניסיוני CAC המושרה על ידי AOM/DSS. (B) משקל גוף ביחס ליום 0 בעכברי טבע מסוג C57BL/6J שטופלו ב-AOM/DSS (אדום) או ביקורת (AOM בלבד, ללא DSS, שחור). כל בעלי החיים קיבלו מנה אחת של AOM (10 מ"ג/ק"ג) וחולקו באקראי לשלושה מחזורים של 3% DSS (אדום) או מי שתייה רגילים (ביקורת, שחור) למשך 70 יום בסך הכל. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SEM, n=2 ו-11. (C) בדיקת המוקולט צואתית מביקורת (AOM בלבד) או עכברים נקבות שטופלו ב-DSS (AOM ו-1.5% DSS). (D) רמות צואה של ליפוקלין-2 מ-6 עכברי ביקורת (AOM בלבד, שחור) או 35 עכברים נקבות שטופלו (AOM ו-1.5% DSS, אדום) ביום 70. הנתונים מוצגים כממוצעים ± SEM. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3
איור 3. הערכה מקרוסקופית של המעי הגס. (A) דוגמה למפת רשומות גידול. (B) תמונות מייצגות של המעי הגס מביקורת (AOM בלבד) או מעכברים נקבות שטופלו ב-DSS (AOM ו-1.5% DSS) ביום 70. קיצור אורך המעי הגס מעיד על דלקת גדולה יותר בבעלי חיים שטופלו ב-DSS. בר - 5 מ"מ; p=0.002, מבחן סכום דירוג מאן-ויטני;, n=12 ו-30. (C) תמונות פתולוגיות גסות מייצגות של מעי גס עם גידולים ביום 70 מעכברים נקבות שטופלו ב-AOM ו-3% DSS (הגידולים מוקפים בעיגול ומסומנים במשולשים שחורים). בר - 5 מ"מ. הסבר - תצוגה מוגדלת של אזורי המעי הגס הדיסטליים עם גידולים; בר - 1 מ"מ). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4. הערכה היסטולוגית של CAC. (A) חלקים מייצגים מוכתמים ב-H&E של מעכברים שטופלו ב-AOM/DSS ובקרה (AOM בלבד) ביום 70 עם אזורים דיסטליים מוגדלים מ-3 בעלי חיים המוצגים מימין. נקודתיים בקרה מראים ארגון קריפטה מעי גס שלם. מעי גס מעכברים שטופלו ב-AOM/DSS מאופיינים בעיבוי תת-רירי (ראשי חץ), חדירה חיסונית (חצים), שיבוש או אובדן ארכיטקטורת קריפטה (כוכב), שחיקה של שכבת האפיתל, היפרפלזיה של אפיתל או אפיתל דיספלסטי (עיגולים) עם היווצרות אדנומה ואדנוקרצינומה (מתוארת בקו מקווקו). בר - 500 מיקרומטר. (B) מערכת ניקוד היסטופתולוגיה המשמשת להערכת חומרת פנוטיפ CAC. (C) דוגמה לציונים היסטולוגיים של המעי הגס מעכברים שטופלו ב-AOM בלבד או בעכברים שטופלו ב-AOM/DSS שמוצגים ב-A. (D) צביעה אימונוהיסטוכימית מייצגת עבור סמן התפשטות Ki67 במעי גס מגולגלים שוויצריים מבעלי חיים שטופלו ב-AOM לאחר מחזור אחד או שלושה של DSS. תאים חיוביים ל-Ki67 מתרבים (חומים) מתמקמים בתחתית קריפטות המעי הגס אך מתפשטים כלפי מעלה ופולשים לתוך הקריפטה עם התחלת CAC ופתולוגיה מתקדמת יותר. בר - 100 מיקרומטר. צביעה אימונו-פלואורסצנטית מייצגת המעריכה כלי דם על סמך סמן אנדותל CD31 (אדום) וצבוע נגדי עם DAPI כדי לדמיין גרעינים (כחולים) בחלקי המעי הגס מעכברים שטופלו ב-AOM/DSS. בר - 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5. הומוגניזציה של מיקרוביוטה מפחיתה את השונות בדלקת המעי הגס ובעומס גידול CAC. (A) רמות ממוצעות של ליפוקלין-2 בצואה בעכברים שטופלו ב-2.5% DSS ביום ה-8. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן ה-t של וולש כדי להשוות את הרמות הממוצעות של ליפוקלין-2 בצואה בין שתי הקבוצות (p=0.137, n=6 ו-12 כלובים). בנוסף, נערך מבחן F על שונות, שהניב ערך p של 0.0001, המצביע על הבדלים משמעותיים בשונות בין שתי הקבוצות. (B) ירידה ממוצעת במשקל הגוף בחיות שטופלו ב-AOM/DSS שקיבלו מי DSS ביום ה-8. בעוד שהירידה הממוצעת במשקל הגוף בין שתי הקבוצות אינה שונה באופן משמעותי (מבחן ה-t של וולש, p=0.194, n=6 ו-12), השונות בתוך הקבוצות שונה באופן משמעותי (מבחן F, p=0.027). (C) עומס גידול לעכבר לאחר 10 שבועות של טיפול AOM/DSS. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t של וולש כדי להעריך את ההבדלים בעומס הגידול הממוצע בין קבוצות (p=0.211, n=8 ו-18) ומבחן F כדי להעריך את ההבדל בין השונות (p=0.013). (א-ג) עלילות כינור כחול מתארות את הקבוצה שעברה הומוגניזציה של מיקרוביוטה, בעוד שחלקות כינור ירוק מייצגות את קבוצת הביקורת (ללא הומוגניזציה של מיקרוביוטה), ns - לא משמעותי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול AOM/DSS הוצג לראשונה בשנת 1996 על ידי Okayasu et al.25 ומאז הוכר כמודל מצוין לחיקוי נאמן של התחלה והתקדמות של סרטן המעי הגס מרקמה תקינה לשינויים אדנומטיים ובסופו של דבר קרצינומה, כפי שהודגם על ידי סוזוקי ואחרים בשנת 200626, במיוחד בהקשר של דלקת במעי הגס. מחקרים עוקבים העריכו את ההשפעות של AOM ו-AOM/DSS על זני עכברים שונים, כמו גם את ההשפעה של משכי טיפול משתנים על פנוטיפ הגידול וחדירת הגידול 26,27,28. בשנת 2018, כריסטופר וויליאמס וקבוצתו פרסמו פרוטוקול29 מעודכן שהניח בסיס מכריע לפיתוח מתודולוגיה זו. ההתקדמות האחרונה הדגימה עוד יותר את התועלת של מודל AOM/DSS לחקר חסינות רירית על ידי שילוב שיטות לבידוד חדירות חיסוניות במעי ואימונופנוטיפ באמצעות זרימה ציטומטרית30.

אחת מנקודות החוזק העיקריות של פרוטוקול AOM/DSS היא ביכולת ההסתגלות הקלה כמעט לכל זן של עכברים, מה שמעורר חקירה של ההשפעות של רקעים גנטיים שונים. לפיכך, סוזוקי ועמיתיו השוו את הרגישות לסרטן המעי הגס המושרה על ידי AOM/DSS בארבעה זני עכברים שונים תוך שימוש בחדירת אדנומה של המעי הגס כקריאה, עם התוצאות הבאות: BALB/c > C57BL/6N > DBA/2N = C3H/HeN26. מחקרים נוספים מצאו כי עכברי FVB/N מפתחים גידולי מעי גס בקלות רבה יותר לאחר טיפול חוזר ב-AOM בהשוואה לזנים C57BL/6J ו-129/SvJ27. יש לציין כי התפתחות של אדנוקרצינומה של המעי הגס עם כמעט 100% חדירה דווחה בעכברי FVB/N בפרוטוקול אינדוקציה של AOM/DSS CAC31 למשך 10 שבועות. ממצאים אלה מצביעים באופן קולקטיבי על כך שזני עכברים שונים עשויים שלא להיות רגישים באותה מידה לטיפול ב-AOM/DSS, מה שתורם לשינויים בגידול ומדגיש עוד יותר את הצורך בסט עקבי של הנחיות להרמוניזציה ושחזור של פרוטוקול AOM/DSS על פני זני עכברים, מתקני דיור ומשתנים אחרים. בין אלה, שונות משמעותית במיקרוביום המעי מעכבת את יכולת השחזור של מחקרים המתמקדים בדלקת וחדירת גידול 9,10. באופן ספציפי, להרכב המיקרוביום של המעי, כולל מיני Duncaniella muricolitica ו-Alistipes okayasuensis, יכולה להיות השפעה גדולה על חומרת קוליטיס DSS13. מחקר אחר הדגיש את החשיבות של הרכב המיקרוביוטה באינדוקציה של CAC על ידי הוכחה כי עכברים עם מחסור ב-NLRP3 הפגינו פנוטיפ קוליטיס מחמיר המאופיין בנוכחות מוגברת של פילת החיידקים Bacteroidetes (במיוחד Prevotellaceae) ו-TM710.

למרות הפופולריות של השיטה, פרוטוקולי AOM/DSS הקיימים לא התייחסו לנושא המשמעותי של שונות גבוהה שנצפתה בין בעלי חיים בקבוצות ניסוי32. כדי להתמודד עם אתגר זה, הצגנו סט של המלצות לאופטימיזציה והרמוניזציה של פרוטוקולים על ידי יישום טיטרציה של DSS (תוך התחשבות במין בעלי חיים) והומוגניזציה של מיקרוביוטה. הגישה שלנו שואפת להפחית את השונות ולשפר את יכולת השחזור של מודל AOM/DSS על פני זנים של בעלי חיים, עיצובים ניסויים ונקודות קצה. למרות שאיננו יכולים לספק המלצות ספציפיות לגבי גודל המדגם, מספר שכפולי הניסוי יונחה על ידי תכנון המחקר הספציפי וגדלי ההשפעה הצפויים עבור כל ניסוי. השונות הנמוכה בתוך הקבוצה המושגת על ידי שיפורים אלה דורשת פחות בעלי חיים בכל מצב כדי להשיג את אותו כוח סטטיסטי בזיהוי הבדלים אלה. אנו צופים כי שיפורים אלה יקדמו עוד יותר שימוש אתי בבעלי חיים, ניהול אחראי של כספי מחקר וצמצום כוח אדם, מה שיוביל להגברת היעילות.

למודל AOM/DSS יש ערך תרגומי משמעותי בחקר סרטן המעי הגס הקשור לקוליטיס אנושי. בהתחשב באתגרים של מידול CRC אנושי בשל האטיולוגיה המורכבת שלו, חשוב להדגיש שלמרות שמודל AOM/DSS עשוי לספק כמה תובנות לגבי הפתוגנזה של CRC ספורדי, הוא מתאים ביותר למחקרים על ממאירות הקשורה לדלקת. יתר על כן, לסרטן המושרה על ידי AOM/DSS יש שכיחות נמוכה של גרורות33,34 ולכן אינו מתאים לחקר התפשטות גרורתית. למרות מגבלות אלה, מודל AOM/DSS הוא חודר מאוד, אמין, מדגים היסטופתולוגיה רלוונטית לבני אדם, ומחקה במדויק את התקדמות המחלה מדלקת לדיספלזיה לאדנוקרצינומה, כל זאת תוך שמירה על עלות-תועלת. בפרוטוקול זה, אנו מספקים המלצות ליצירת תוצאות הניתנות לשחזור ולמזעור גורמים מבלבלים על סמך זרימות עבודה קיימות 8,35.

זיהוי מינון ה-DSS האופטימלי באמצעות ניסויי פיילוט של מינון-תגובה, תוך התחשבות במין בעלי חיים כמשתנה ביולוגי 16,36,37, הוא הצעד הקריטי הראשון לקראת ביסוס פרוטוקול AOM/DSS חזק (איור 1). מצאנו שטיפול ב-3% DSS במשך 7 ימים הביא לירידה משמעותית יותר במשקל הגוף אצל נשים (~20%) בהשוואה לגברים (~15%) (איור 1B,D). עם זאת, עכברים זכרים עשויים להיות רגישים יותר, פחות או באותה מידה ל-DSS בהשוואה לנקבות. ניתן לייחס זאת לזנים שונים של עכברים ולשינויים בהרכב המיקרוביום של המעיים בין מתקנים של בעלי חיים, מה שמחייב התאמה מחדש של ריכוז ה-DSS המותאם לכל קבוצת ניסויים ספציפית. ריכוז ה-DSS האופטימלי הוא פשרה בין מקסום דלקת המעי הגס לבין השראת הגידול מבלי לחרוג מהרעילות הנסבלת. מניסיוננו, איזון זה מושג ככל הנראה במינוני DSS וכתוצאה מכך ירידה של כ-20% במשקל הגוף לאחר המחזור הראשון. בעלי חיים נוטים לרדת פחות במשקל במחזור השני של הטיפול, אך ירידה גדולה יותר במשקל הגוף נצפית בדרך כלל במחזור השלישי של DSS, אולי עקב היווצרות גידול במעי הגס. לכן, ניתן לאמץ ירידה של 25% במשקל הגוף כנקודת קצה הומאנית לפרוטוקולים מוסדיים לשימוש בבעלי חיים. יתר על כן, קוליטיס DSS מכוילת היטב גורמת לכדורי צואה רכים אך עדיין נוצרים במקום שלשול ובדיקת המוקולט חיובית מדי פעם, אך מקרים מעטים של עקבות דם גלויים בצואה, כאשר בעלי חיים צפויים להתאושש לחלוטין תוך שבועיים לאחר הפסקת מתן DSS.

DSS הוא פולימר בעל משקל מולקולרי הנע בין 36,000 ל-50,000 Da. בשל השונות ממנה לאצווה בייצור DSS, חיוני לבצע ניסויי כיול מחדש של מינון DSS עבור כל אצווה חדשה של המוצר. כדי לשמור על עקביות, מעשי להעריך את הכמות הכוללת של DSS הדרושה לרכישת המחקר כולו מאותו מגרש. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר גם צעדים לסטנדרטיזציה של הרכב המיקרוביוטה על פני כל קבוצת הניסוי של עכברים במהלך השראת CAC, ובכך להפחית את השפעות הכלוב הפוטנציאליות כדי להפחית את השונות. כאמצעי זהירות נוסף כדי למזער את השפעות הכלובים, מומלץ לשכן בעלי חיים מקבוצות ניסוי שונות במידת האפשר. בהתאם למטרות הניסוי הספציפיות ולמדיניות השימוש האתית בבעלי חיים, שיקולים אלה צריכים לבוא לידי ביטוי בניסויי פיילוט. סחף המיקרוביוטה עשוי להיגרם גם על ידי החלפת מצעים בכלוב רטוב עם בקבוקי שתייה דולפים. עדיף להימנע מהחלפת כלובים במהלך מתן DSS ובמשך חמישה ימים לאחר מכן. שימוש בצינורות של 50 מ"ל לניהול מים DSS מפחית את הסיכון לדליפה וממזער את פסולת DSS. שיקולים לוגיסטיים אלה עשויים לדרוש שיתוף פעולה הדוק בין צוות המחקר לטכנאי טיפול בבעלי חיים המבצעים שירותי החלפת כלובים וגידול.

בפרוטוקול זה, אנו מספקים גם זרימת עבודה בסיסית לקצירת רקמות ותאים, כמו גם איסוף נתונים. זה כולל בדיקות לנוכחות של דם סמוי (איור 2C) ומיפוי גידולים (איור 3A). מודל AOM/DSS מתאים לעכברים בעלי יכולת חיסונית, מה שהופך אותו למערכת אידיאלית לחקר המיקרו-סביבה החיסונית של הגידול בגלל מערכת החיסון השלמהלחלוטין 38,39, בניגוד לגישות קסנוגרפטים. יש לציין כי הוא ניתן להפרעה ניסיונית של מערכת החיסון או רכיבי סטרומל, בין אם באמצעות מערכת Cre-Lox גנטית עבור דפיקות/יציאות של גנים ספציפיים לסוג התא או קלטות מדווח, או השתלה או דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיות. כדוגמה אחת, על ידי שילוב מודל AOM/DSS עם השתלת מח עצם, חקרנו בעבר כיצד מוטציות במערכת ההמטופויאטית מווסתות את חומרת ה-CAC ועומס40. כדי לסייע במחקרים כאלה, ישנן שיטות מצוינות שפורסמו לבידוד לויקוציטים חודרים לגידול ברי קיימא המתאימים לניתוחים נוספים, כגון אימונופנוטיפ, מבחנים פונקציונליים ומולטי-אומיקס של תא בודד41. לבסוף, בגלל החדירה הגבוהה והשהייה העקבית, מודל AOM/DSS מתאים למחקרים טיפוליים פרה-קליניים המשתמשים בעומס הגידול הכולל כקריאה ראשונית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי פרסי ה-NIH R01 DK121831 (OAG) ו-R01 AI067846 (DA). OAG נתמך גם על ידי קרן אדוארד פ. אוונס וקרן משפחת אוקסנארד. DA נתמך על ידי פרס Merit Society. UFHCC הוא מרכז סרטן ייעודי של ה-NCI (P30 CA247796).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אבקת אזוקסימתאןSigma-AldrichCAS 25843-45-2, Cat# A4586מסרטן לגרימת גידולים במעי הגס
מיקרוצנטריפוגהספסל NA  NAלהכנה לדוגמא 
עכברי C57BL/6Jמעבדת ג'קסון000664זן וגיל בהתאם לכל מחקר ספציפי
צינורות חרוטיים, 50 מ"לפישר14955239למתן מי DSS
מלח נתרן דקסטרן סולפט, MW כ-40,000קיימן כימיקלים 23250לגרימת התפשטות המעי הגס 
אתנול, 70%פישר 43655223לחיטוי משטחי עבודה וכלי חיתוך
טחינת חרוזי זכוכית, 800 ומיקרו; מ VWR12621-148כדי להקל על ההומוגניזציה של רקמת המעי הגס/הגידול
HemoCue America  בקמן קולטר Hemoccult ICT אימונוכימיה צואה סמויה ערכת בדיקת דם סמויHemoCue America 395065Aקטלוג מס' 23280010לגילוי דם סמוי בצואה
מזרק אינסולין 27GX5/8 1CC BD 3294-12עבור זריקות AOM
חוסם LixitNANAלחסימת אספקת מים אוטומטית לכלובי עכברים, אם קיים (מסופק על ידי מתקן בעלי החיים, סטריל) 
מוט ערבוב מגנטי וצלחת ערבוב NANAלפרק את DSS 
הומוגנייזר חרוזי מיקרו-צינור, BeadBlaster 24 BenchmarkD2400להומוגניזציה של עכבר המעי הגס/גידול
Lipocalin-2/NGAL DuoSet ELISAR& D Systemsקטלוג מס' DY1857כדי לזהות את הליפוקלין-2 מדגימות צואה
תמיסת NP-40, 10%Thermo Fisher Scientific85124עבור גידול ליזיס/רקמת המעי הגס
ערכת בדיקת חלבון BCA Pierce BCAThermo Fisher ScientificA65453לכימות ריכוז החלבון בליזאטים של רקמות כוללות, או כל שיטה מתאימה אחרת
קוקטייל מעכב פרוטאז ופוספט פישרPI78440להכין דגימות לניתוח ציטוקין/חלבון 
מאגר RLTplusQiagen1053393לבידוד RNA, או כל שיטת בידוד RNA מתאימה אחרת
RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7021לשימור דגימות רקמה לפני בידוד
RNA ערכת RNeasy Microprep QIAGEN74004לבודד RNA, או שיטת בידוד וטיהור RNA אחרת לפי הצורך
זרבובית בקבוק מים מכרסמים (30 מ"מ)ראייהמסוג Eלניהול מים או תמיסת DSS
מספריים ומלקחיים סטרילייםNANAלמחטי מזרק לדיסקציה של רקמות
, 27G x 1/2 אינץ' אורך (קצר)BD 305109לקיבוע רקמות שוויצריות במעי הגס 
מזרקים, מנעול לואר, 3 מ"לBD 309657 לשטיפת המעי הגס לפני דיסקציה ושלב
TapeStationAgilentלריכוז RNA והערכת איכות/תקינות
Teklad 2918Evigo BioproductsT.2918M.15תזונת מכרסמים סטנדרטית, 18% חלבון, קלטת רקמות מוקרנת
VWR#87002-472לשימור דגימה להטמעת
איזון מעבדה לטעינה עליונה, 0-220 גרםNANAלשקילת בעלי חיים
Whatman Blotting PaperVWR InternationalCat# 28298-020לבימוי מעי גס מנותח לפתולוגיה גסה וספירת גידולים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, E., et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from globocan. Gut. 72 (2), 338-344 (2023).
  2. Siegel, R. L., Wagle, N. S., Cercek, A., Smith, R. A., Jemal, A. Colorectal cancer statistics 2023. CA Cancer J Clin. 73 (3), 233-254 (2023).
  3. Lu, C., et al. Survival outcomes and clinicopathological features in inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer: A systematic review and meta-analysis. Ann Surg. 276 (5), e319-e330 (2022).
  4. Porter, R. J., Arends, M. J., Churchhouse, A. M. D., Din, S. Inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer: Translational risks from mechanisms to medicines. J Crohns Colitis. 15 (12), 2131-2141 (2021).
  5. Pan, Q., et al. Genomic variants in the mouse model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate improperly mimic human colorectal cancer. Sci Rep. 7 (1), 25(2017).
  6. Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 39-61 (2013).
  7. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9(2011).
  8. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (aom) and dextran sulfate sodium (dss). J Vis Exp. (67), e4100(2012).
  9. Chen, Y., Zhang, P., Chen, W., Chen, G. Ferroptosis mediated DSS-induced ulcerative colitis associated with Nrf2/Ho-1 signaling pathway. Immunol Lett. 225, 9-15 (2020).
  10. Elinav, E., et al. Nlrp6 inflammasome regulates colonic microbial ecology and risk for colitis. Cell. 145 (5), 745-757 (2011).
  11. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3), G544-G551 (1998).
  12. Bleich, A., Fox, J. G. The mammalian microbiome and its importance in laboratory animal research. ILAR J. 56 (2), 153-158 (2015).
  13. Forster, S. C., et al. Identification of gut microbial species linked with disease variability in a widely used mouse model of colitis. Nat Microbiol. 7 (4), 590-599 (2022).
  14. Mccafferty, J., et al. Stochastic changes over time and not founder effects drive cage effects in microbial community assembly in a mouse model. ISME J. 7 (11), 2116-2125 (2013).
  15. Wagnerova, A., et al. Sex differences in the effect of resveratrol on dss-induced colitis in mice. Gastroenterol Res Pract. 2017, 8051870(2017).
  16. Son, H. J., et al. Effect of estradiol in an azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mouse model of colorectal cancer: Implication for sex difference in colorectal cancer development. Cancer Res Treat. 51 (2), 632-648 (2019).
  17. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  18. Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. Cancer. 40 (5 Suppl), 2436-2445 (1977).
  19. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
  20. Chassaing, B., et al. Fecal lipocalin 2, a sensitive and broadly dynamic non-invasive biomarker for intestinal inflammation. PLoS One. 7 (9), e44328(2012).
  21. Dooley, S. A., et al. Optimized protocol for intestinal swiss rolls and immunofluorescent staining of paraffin embedded tissue. J Vis Exp. (209), e66977(2024).
  22. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab Invest. 69 (2), 238-249 (1993).
  23. Arthur, J. C., et al. Intestinal inflammation targets cancer-inducing activity of the microbiota. Science. 338 (6103), 120-123 (2012).
  24. Karrasch, T., Kim, J. S., Muhlbauer, M., Magness, S. T., Jobin, C. Gnotobiotic IL-10-/-;NF-Kappa B(egfp) mice reveal the critical role of TLR/NF-Kappa B signaling in commensal bacteria-induced colitis. J Immunol. 178 (10), 6522-6532 (2007).
  25. Okayasu, I., Ohkusa, T., Kajiura, K., Kanno, J., Sakamoto, S. Promotion of colorectal neoplasia in experimental murine ulcerative colitis. Gut. 39 (1), 87-92 (1996).
  26. Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Nakagama, H., Tanaka, T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27 (1), 162-169 (2006).
  27. Nambiar, P. R., et al. Preliminary analysis of azoxymethane induced colon tumors in inbred mice commonly used as transgenic/knockout progenitors. Int J Oncol. 22 (1), 145-150 (2003).
  28. Arnesen, H., et al. Induction of colorectal carcinogenesis in the C57BL/6J and a/j mouse strains with a reduced dss dose in the aom/dss model. Lab Anim Res. 37 (1), 19(2021).
  29. Parang, B., Barrett, C. W., Williams, C. S. AOM/DSS model of colitis-associated cancer. Methods Mol Biol. 1422, 297-307 (2016).
  30. Eich, C., Vogt, J. F., Langst, V., Clausen, B. E., Hovelmeyer, N. Isolation and high-dimensional flow cytometric analysis of tumor-infiltrating leukocytes in a mouse model of colorectal cancer. Front Immunol. 15, 1295863(2024).
  31. Barderas, R., et al. Sporadic colon cancer murine models demonstrate the value of autoantibody detection for preclinical cancer diagnosis. Sci Rep. 3, 2938(2013).
  32. Dzhalilova, D., Zolotova, N., Fokichev, N., Makarova, O. Murine models of colorectal cancer: The azoxymethane (AOM)/dextran sulfate sodium (DSS) model of colitis-associated cancer. PeerJ. 11, e16159(2023).
  33. Rosenberg, D. W., Giardina, C., Tanaka, T. Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
  34. Pothuraju, R., et al. Colorectal cancer murine models: Initiation to metastasis. Cancer Lett. 587, 216704(2024).
  35. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2 (8), 1998-2004 (2007).
  36. Lee, S. M., et al. The effect of sex on the azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mice model of colon cancer. J Cancer Prev. 21 (4), 271-278 (2016).
  37. Jang, S., Han, H., Oh, Y., Kim, Y. Sex differences in inflammation correlated with estrogen and estrogen receptor-beta levels in azoxymethane/dextran sodium sulfate-induced colitis-associated colorectal cancer mice. Heliyon. 10 (6), e28121(2024).
  38. Xin, B., et al. Enhancing the therapeutic efficacy of programmed death ligand 1 antibody for metastasized liver cancer by overcoming hepatic immunotolerance in mice. Hepatology. 76 (3), 630-645 (2022).
  39. Rivera, M., et al. Patient-derived xenograft (pdx) models of colorectal carcinoma (crc) as a platform for chemosensitivity and biomarker analysis in personalized medicine. Neoplasia. 23 (1), 21-35 (2021).
  40. Feng, Y., et al. Hematopoietic-specific heterozygous loss of dnmt3a exacerbates colitis-associated colon cancer. J Exp Med. 220 (11), (2023).
  41. Mcmanus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. aJ., Pillai, A. B. Isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e. J Vis Exp. (151), e59821(2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Azoxymethane DSSDSSC57BL 6J
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים