הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פיברובלסטים הקשורים לסרטן מגידולי חלב של עכברים ככלים למחקרים מולקולריים וחישוביים

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68364

⸱

3 ביולי 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Human Technopole, 3Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטות לתרבות, מניפולציה וניתוח CAFs של עכברים, כולל מבחנים פונקציונליים במבחנה/in vivo , טרנסקריפטומיקה וניתוח חישובי. יתר על כן, הוא מתאר פלטפורמה מבוססת אינטרנט שפותחה כדי לנתח את הטרנסקריפטומים הזמינים לציבור של רכיבי סטרומה ואפיתל של לכידת לייזר מאוסף של גידולי סרטן שד אנושיים.

תקציר

גוף מחקר משכנע אישר את התפקיד הקריטי של מיקרו-סביבת הגידול (TME) בצמיחה ובאגרסיביות של סרטן השד (BC). פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAF), מרכיב התא הדומיננטי ב-TME, משפיעים באופן משמעותי על התנהגותו באמצעות דיבור צולב מורכב עם סרטן ותאי סטרומה אחרים בתגובה לאותות הפעלה שמקורם בגידול. מודלים של עכברים נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס תפקידו של CAF בהתקדמות BC, מכיוון שהם מאפשרים הערכה של ה-TME האנדוגני והערכת מעורבות מערכת החיסון באמצעות מחקרי קסנוגרפט סינגניים. כאן, אנו מציגים קבוצה של שיטות לתרבית CAFs שמקורם ב-BC, מניפולציה של ביטוי גנים והערכת התפקודים הפרו-גידוליים שלהם באמצעות גישות in vitro ו-in vivo . אנו מתארים גם פרוטוקולים לפרופיל ביטוי גנים CAF וניתוח טרנסקריפטומי, לצד הליך חישובי להסקת חתימות שעתוק בגידולים ראשוניים באמצעות נתוני RNA-seq בתפזורת הזמינים לציבור. בנוסף, אנו מציגים כלי ידידותי למשתמש מבוסס אינטרנט לניתוח הטרנסקריפטומים של רכיבי סטרומה ואפיתל מגידולי BC מיקרו-מנותחים. בסופו של דבר, שיטות אלו יכולות לספק תובנות חשובות לגבי המנגנונים המולקולריים המניעים אינטראקציות CAF-גידול ולהחזיק בפוטנציאל לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות.

מבוא

סרטן השד (BC) הוא הגידול הממאיר השכיח ביותר הפוגע בנשים ומאופיין בהטרוגניות מולקולרית משמעותית, עם פרופילים מולקולריים מובהקים המנחים את האבחון, החלטות הטיפול והפרוגנוזה. המיקרו-סביבה של הגידול (TME) היא גם הטרוגנית מאוד וממלאת תפקיד קריטי בהתקדמות הגידול, בחסינות ובתוצאות הטיפול.

פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) הם סוג התאים הנפוץ ביותר ב-TME ומווסתים מרכזיים של התפתחות הגידול. הם תורמים לתצהיר מטריצה חוץ-תאית ועיצוב מחדש, אנגיוגנזה, התחמקות חיסונית ועמידות לתרופות 1,2,3,4,5,6. CAFs משפיעים על תאי הגידול באמצעות מגע ישיר בין תאים, שחרור שלפוחיות חוץ-תאיות7 והפרשת גורמים מסיסים שונים 2,5 כדי לקדם צמיחת גידול, פלישה ועמידות לטיפול 8,9,10. ואכן, לחתימות גנים הקשורות לסטרומה יש ערך ניבוי להתקדמות BC ולתגובה לטיפול והן קשורות לעמידות לכימותרפיה 11,12,13,14. עם זאת, למרות ראיות משמעותיות המצביעות על CAFs כמטרה טיפולית אטרקטיבית, ניסויים קליניים המכוונים לתאים אלה נכשלו ברובם15. אתגר מרכזי אחד הוא ההבנה המוגבלת של המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם CAFs מווסתים את התנהגות הגידול. ההתקדמות האחרונה בניתוחי תעתיק חד-תאיים ומרחביים סיפקה תובנות עמוקות יותר לגבי המורכבות של CAFs ב-BC 16,17,18,19,20,21, מה שמאפשר זיהוי של תת-סוגים מובהקים של CAF עם תוכניות פונקציונליות ספציפיות 16,22 והדגיש עוד יותר את המורכבות והפלסטיות שלהם 23.

מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMMs), שבהם אונקוגנים או גנים מדכאי גידול מתבטאים יתר על המידה או מושבתים, הם מודלים מבוססים היטב לחקר סרטן אנושי 24,25,26,27. בהשוואה למודלים סינגניים, הכוללים השתלת תאי גידול בעכברים מסוג בר23,28, GEMMs מחקים בצורה מדויקת יותר את ההתקדמות הרב-שלבית של BC ואת האינטראקציות בין תאי סרטן ל-TME. עם זאת, מניפולציה של פעילויות CAFs ב-GEMMs הייתה מאתגרת בשל ההטרוגניות שלהם, מה שמקשה על מיקוד כל תת-הסוגים של CAF ללא השפעות מחוץ למטרה על רכיבי סטרומה או אפיתל אחרים5. שילוב GEMMs עם גישות משלימות, כגון מניפולציה של CAF במבחנה, יכול לסייע ביצירת מודלים תאיים לניסויים באובדן תפקוד הן במבחנה והן ב-vivo. עם זאת, פיתוח מודלים תאיים יציבים לחקר התפקידים התפקודיים של גנים ספציפיים נותר מאתגר בשל ההתחלה המהירה של ההזדקנות.

כאן, אנו מתארים פלטפורמה חזקה לניסויים יציבים של אובדן תפקוד ב-CAFs, ואחריהם ניתוח פונקציונלי במבחנה וב-vivo ופרופיל שעתוק של התאים המהונדסים; גישה זו מציעה אסטרטגיה מקיפה לניתוח הרלוונטיות התפקודית של גנים המתבטאים ב-CAF בסרטן השד, עם יתרונות בספציפיות, שחזור ויכולת הסתגלות על פני השיטות הקיימות. גישה זו משלימה גם כלי חדשני מבוסס אינטרנט לחקר טרנסקריפטומים של תאי סטרומה ואפיתל מנותחים בלייזר מגידולי שד אנושיים, המאפשר השוואות בין מינים ומקל על יצירת השערות מנתונים אנושיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה עומד בכל ההנחיות המוסדיות לגבי טיפול בעכברים ודגימת רקמות. כל ההליכים בוצעו בהתאם לחוקים ולמדיניות הלאומיים והבינלאומיים. העכברים שוכנו ביחידה טרנסגנית נטולת פתוגנים ספציפיים במחזור אור/חושך של 12 שעות ב-22 מעלות צלזיוס עם 50% לחות וסיפקו מזון ומים אד-ליביטום. הליכים כירורגיים חייבים לעקוב אחר הוראות וטרינריות מוסדיות כדי להבטיח הרדמה ושיכוך כאבים מתאימים, הן במהלך ההליך והן בתקופה שלאחר הניתוח. טבלת החומרים מספקת פרטים על חומרים, ריאגנטים ומכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. תרבית תאים

  1. תאי תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 עם לחות יחסית של 95%, ב-DMEM (HEK293T, CAFs ו-CAFs אימורטליים (iCAFs)) או מדיום RPMI (4T1), בתוספת 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (1% עט/סטרפטו).
    הערה: הרכב מדיה מלאה (cDMEM, cRPMI): 10% FBS מושהה בחום, הרכב אמצעי רעב (sDMEM, sRPMI): ללא FBS. זמני הכפלה ממוצעים לתאים: HEK293T ו-iCAFs הם 24 שעות; תאי 4T1 הם 12 שעות.
  2. תאי מעבר כאשר מגיעים למפגש של 80%, ביחס של לא יותר מ-1:5, לעולם לא יותר מ-10 פעמים לאחר ההפשרה כדי למנוע סחיפה פנוטיפית, כמתואר להלן.
    1. שואבים את המדיום ומוסיפים בעדינות 7 מ"ל PBS לצד צלחת 100 מ"מ. שאפו את ה-PBS, הוסיפו 1 מ"ל של טריפסין-EDTA. יש לדגור במשך 2-3 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
      זהירות: EDTA רשום כתרכובת סיכון בקטגוריה 2 לגירוי בעיניים. ידית במכסה מנוע ביולוגי/אדים לובשת PPE מתאים.
    2. השבת טריפסין-EDTA עם 5 מ"ל של cDMEM, נתק תאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, ואסוף לצינור חרוטי של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 290 x גרם למשך 5 דקות.
    3. הסר בזהירות את ה-supernatant והשהה מחדש את כדורית התא ב-5 מ"ל של cDMEM. לפיצול 1:5, זרע 1 מ"ל של תאים מרחפים בצלחת 100 מ"מ המכילה 9 מ"ל cDMEM.
  3. ספירת תאים: טען 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים משלב 1.2.3 בצד תא ספירה של נויבאואר, ספור את התאים בריבועים הגדולים והכפל את המספר המתקבל ב-1 x 104 כדי לחשב את מספר התאים הכלולים ב-1 מ"ל של תרחיף תאים.
  4. שימור בהקפאה: הקפיאו 50% מצלחת 100 מ"מ (בסביבות 3 x 106 תאים) ב-0.5 מ"ל של מדיום קפוא קר כקרח (10% DMSO ב-FBS מושבת חום) כמתואר להלן.
    1. מצלחת של 100 מ"מ, נסה את התאים כמתואר בשלבים 1.2.1 ו-1.2.2, אלא שהתאים מושעים מחדש ב-1 מ"ל של מדיום מקפיא קר כקרח.
    2. יש להוציא 0.5 מ"ל בכל קריוביאל, ולהניח בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס במיכל המבטיח קצב קירור של כ-1 מעלות צלזיוס לדקה. ניתן להפשיר כל אליקוט בצלחת של 100 מ"מ.
  5. בדיקת זיהום מיקופלזמה: אסוף 1 מ"ל של מצע גידול של תאים קונפלואנטים שגודלו במשך 3 ימים לפחות. מרתיחים בחום של 95 מעלות למשך 20 דקות. סובב ב-16200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הוסף 5 מיקרוליטר של סופרנטנט ל-45 מיקרוליטר של תערובת תגובת PCR (0.15 מ"מ dNTPs, 1.5 מ"מ MgCl2, 1x מאגר תגובה, 1 U Taq פולימראז, 0.5 מיקרומטר פריימרים A ו-B, ראה טבלה 1). בצע PCR, כולל בקרות חיוביות ושליליות, ומוצרי PCR נפרדים על ג'ל אגרוז 1% יחד עם סולם DNA. דגימות מזוהמות במיקופלזמה יראו פס של 600 bp.

2. בידוד CAFs מגידולי שד

הערה: שלב זה מותאם לגידולים בשלב מתקדם בקוטר 5-10 מ"מ (ראה התייחסות29 ).

  1. להקריב את העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם. לבודד גידולי חלב של לפחות 125 מ"מ3. כרתו את הגידול בזהירות, הסירו את העור שמסביב, רקמת החלב והאזורים הנמקיים הנראים לעין. בעזרת פינצטה אוספים במיקרו-צינור של 1.5 מ"ל המונח על קרח.
  2. שקלו את הגידול באיזון מדויק, כרתו חתיכה מעוקבת של 0.1-0.3 גרם בעזרת אזמל, העבירו למיקרו-צינור חדש של 1.5 מ"ל מלא ב-PBS קר כקרח, והמשיכו לעלות על קרח. ודא שהרקמה שקועה כדי למנוע התייבשות.
  3. מעבירים לכלי בקוטר 60 מ"מ, על קרח. קוצצים דק 1 מ"ל PBS בעזרת אזמל עד לקבלת חתיכות של כ 1-2 מ"מ.
  4. העברה לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל לכל 0.1 גרם גידול ב-cDMEM בתוספת 10 מיקרוגרם/מ"ל קולגנאז. שוטפים את המנה עם 1 מ"ל מאותו מדיום, בעזרת פיפטה P1000 עם קצה חתוך כדי למנוע נזק לתאים. אבטח את המכסה עם סרט איטום כדי למנוע דליפה.
  5. דגירה אופקית למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלול. הניחו מסננת תאים של 70 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל והעבירו את ההומוגנאט בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. השתמש בחלק האחורי של בוכנת מזרק של 5 מ"ל כדי לטחון ולדחוף את הדגימה דרך המסנן.
  6. השתמש ב- cDMEM (לא יעלה על 30 מ"ל נפח סופי) כדי לשחזר הכל מהמסננת. סובב תאים ב-129 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והשליך סופרנטנט.
  7. הוסף 3 מ"ל של מאגר ליזה אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) כדי להסיר כדוריות דם אדומות (RBC). סוגרים היטב את הצינורות ומערבבים בהיפוך. דגירה למשך 5 דקות ב-RT על שייקר מסלולי.
  8. עצור ליזיס RBC על ידי הוספת PBS לנפח סופי של 30 מ"ל. סובב תאים ב-129 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והשליך סופרנטנט.
  9. השעו מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של cDMEM וספרו תאים ברי קיימא כמו בשלב 1.3 באמצעות 10 מיקרוליטר של מתילן כחול: תאים חיים מפחיתים את הצבע לתוצר חסר צבע והופכים ללא כתמים, בעוד שתאים מתים צבועים בכחול.
  10. זרע 5 x 105 תאים/צלחת 60 מ"מ ב-5 מ"ל cDMEM, דגירה 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 , איסוף תאים שאינם דבקים וצלחת מחדש למשך הלילה.
  11. לאחר 48 שעות או 72 שעות, בצע טריפסיניזציה דיפרנציאלית. מכיוון שפיברובלסטים מתנתקים מהר יותר מתאי אפיתל ומיואפיתל30, המשך כמתואר בשלב 1.2. אבל לפקח מקרוב על ניתוק התאים תחת מיקרוסקופ. תאים בצורת פיברובלסטים יהפכו עגולים ויתנתקו בזמן שתאי האפיתל יישארו מחוברים.
  12. הוסף cDMEM כדי לנטרל את הטריפסין ולאסוף CAFs מנותקים, ולהעביר אותם לצלחת חדשה של 60 מ"מ ב-5 מ"ל cDMEM. מעבר CAFs ראשיים 1:3 (ראה שלב 1.2) עבור שלושה קטעים, ולאחר מכן הכן מעבר מוקדם של אליקוטים קפואים כמתואר בשלב 1.4.

3. אימורטליזציה על ידי התמרה ויראלית

הערה: יש לבצע חלק מהשלבים הבאים בסביבה המתאימה לטיפול בווקטורים רטרו-ויראליים (למשל, BSL2+); בדוק את הכללים המוסדיים שלך.

  1. הכנת הנגיף הרקומביננטי
    1. תרבית HEK293T תאים ובדוק אם יש זיהום מיקופלזמה (ראה שלב 1).
    2. מצפים צלחת בקוטר 100 מ"מ על ידי פיפטינג של 6 מ"ל של תמיסה של 0.1 מ"ג/מ"ל של פולי-L-ליזין ב-ddH2O למשך 5 דקות ב-RT, שואבים ומניחים להתייבש מתחת למכסה המנוע (כ-10 דקות).
    3. זרע 3 x 106 HEK293T תאים (מעבר נמוך, מיקופלזמה שלילית) ב-10 מ"ל של cDMEM בצלחת המצופה פולי-L-ליזין משלב 3.1.2 (ראה שלב 1.3).
    4. למחרת, הכינו שני צינורות המכילים 0.75 מ"ל של מדיום מותאם להעברה ללא אנטיביוטיקה. לאחד מהם, הוסף 30 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה בתיווך ליפידים (T1). לשני, הוסף 2 מיקרוגרם של pCL-Ampho (וקטור אריזה רטרו-ויראלי) ו-2 מיקרוגרם של וקטור cDNA pBABE-neo largeT רטרו-ויראלי (T2). מוסיפים T2 ל-T1, מערבבים בעדינות ודוגרים במשך 10 דקות.
    5. מחלקים באופן שווה את המדיום על התאים לאחר החלפתו במדיום מותאם להעברה ללא אנטיביוטיקה + 10% FBS מושבת בחום. העבר את הצלחת למתקן תרבית רקמות ברמת בטיחות ביולוגית 2+ (BSL-2+). החלף את המדיום ב- cDMEM לאחר 6-12 שעות ודגר את התאים למשך 24-48 שעות.
    6. מסננים את המדיום המכיל את החלקיקים הפסאודו-ויראליים דרך מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים או -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
  2. התמרה ויראלית של CAF
    1. זרע 7.5 x 105 CAFs בכל אחת משתי צלחות 60 מ"מ ב -4 מ"ל cDMEM (ראה שלב 1.3) ותרבית אותם כמו בשלב 1.1.
    2. למחרת, החלף את המדיום של מנה אחת ב -2 מ"ל של המדיום המכיל פסאודו-וירוס משלב 3.1.6 (CAFs מותמר), הוסף 2 מ"ל של cDMEM ודגירה למשך 24 שעות. השאירו את המנה השנייה ללא מגע (CAFs לא מתמרים).
    3. למחרת, חזור על שלב 3.2.2 על ה-CAFs המועברים. לאחר 24 שעות, החלף את המדיום של שתי המנות ב -4 מ"ל cDMEM.
    4. לאחר 24 שעות נוספות, התחל את הבחירה על ידי החלפת המדיום של שתי המנות ב-cDMEM בתוספת 400 מיקרוגרם/מ"ל G418. החלף את המדיום המכיל G418 כל 2-3 ימים עד שלא יישארו תאים חיים בצלחת הבקרה של CAFs לא מתמרים.
      הערה: תאים לא מתמרים רגישים ל-G418 וימותו תוך 7-10 ימים, מה שמצביע על כך שרק תאים מתמרים עמידים ל-G418 ישרדו במצב CAFs המומר. יש לקבוע את ריכוז האנטיביוטיקה האופטימלי עבור כל סוג תא, תוך ביצוע עקומות הרג (בדוק טווח של 50 עד 1000 מיקרוגרם/מ"ל G418 ריכוז למשך 7-10 ימים ובחר את המינון הורג את כל התאים תוך 10 ימים).
    5. העבר את התאים המומרים שנבחרו פי 2 ביחס של 1:3 (ראה שלב 1.2) לפני היציאה ממתקן BSL. הכן ציטוטים שמורים בהקפאה של קטעים מוקדמים כמו בשלב 1.4.
    6. ודא שהתאים ממשיכים להתרבות מבלי להראות פנוטיפ מזדקן במשך מספר קטעים והמשך לאפיון פנוטיפי ופונקציונלי (ראה שלבים 4 ו-6-9).

4. אפיון פנוטיפי

הערה: ניתן להעריך סמני CAFs כגון אקטין שריר חלק אלפא (α-SMA), קאוולין, חלבון מפעיל פיברובלסטים (FAP), N-cadherin, גורם גדילה שמקורו בטסיות דם בטא (PDGFR-β), S100A4 ווימנטין29 על ידי RT-qPCR ו-Western Blot.

  1. RT-qPCR: חלץ RNA כולל עם תמיסה מונופאזית של פנול וגואנידין איזותיוציאנט כמתואר בהתייחסות15. תמלל הפוך 2 מיקרוגרם של RNA כולל בנפח של 20 מיקרוליטר, בהתאם להוראות היצרן לתנאי התגובה. יש לדלל cDNA 1:20 ולהשתמש ב-3 מיקרוליטר לביצוע תגובות RT-qPCR, בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלה 1 לפריימרים).
    הערה: אנו ממליצים להכין את ה-RNA ממנה של 12 בארות.
  2. כתם מערבי
    1. שטפו פי 2 עם PBS כמתואר בשלב 1.2.1, הוסיפו 0.2 מ"ל של מאגר ליזה קר כקרח, נתקו תאים עם מגרד ואספו אותם במיקרו-צינור של 1.5 מ"ל כמתוארב-29. השאירו למשך 20 דקות על קרח.
    2. סובבו את הדגימות ב-16,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ואספו את הסופרנטנט. כימות חלבונים על ידי בדיקה קולורימטרית לפי הוראות היצרן. השתמש לפחות ב-20 מיקרוגרם חלבון עבור הכתם המערבי (ראה טבלה 2 לנוגדנים).
      הערה: אנו ממליצים להכין חלבונים לא פחות מ -6 בארות במנה.
  3. ניתוח חלבונים מופרשים
    1. זרע 2 x 106 iCAFs (ראה שלב 1.3) בצלחת בקוטר 100 מ"מ ב-10 מ"ל cDMEM ותרבית אותם כמתואר בשלב 1.1.
    2. לאחר 24 שעות, הסר את המדיום, שטוף פעמיים עם 10 מ"ל PBS, ודגר במשך 48 שעות עם 10 מ"ל sDMEM (ראה שלב 1.1) כדי ליצור מדיום מותנה (CM).
    3. לאחר 48 שעות נוספות, סנן את ה-CM דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל. החזיקו את המזרק ואת הצינור בחוזקה והיו מוכנים להתנגדות מסוימת. ניתן לאחסן CM בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים.
    4. רכז CM בערך פי 10 באמצעות רכזי חלבון לפי הוראות היצרן, ליצירת CM מרוכז (conCM). כמת את ה-conCM, הרתיח ובצע כתם מערבי (ראה טבלה 2 לנוגדנים).

5. ניתוח נוקדאון גנים

הערה: כדי להפריע ביציבות לביטוי גנים, אנו מתמירים iCAFs עם חלקיקים לנטי-ויראליים המבטאים shRNAs שתוכננו במיוחד. ניתן להשיג אותם על ידי שיבוט רצפי המיקוד בווקטור לנטי-ויראלי מתאים כגון pLKO.1-Puro, בהתאם לפרוטוקולים הזמינים ב-https://www.addgene.org/protocols/plko/#C. ניתן לבחור את רצפי המיקוד הספציפיים באמצעות כלי תכנון shRNA הזמינים לציבור (כלומר, GPP-Genetic Perturbation Portal על ידי Broad Institute, https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/). לחלופין, קבוצות של וקטורי מיקוד מוכנים מראש זמינות מסחרית (https://en.vectorbuilder.com/products-services/service/shrna-knockdown-solutions.html, https://www.sigmaaldrich.com/IT/it/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/mission-shrna-getting-started, https://www.origene.com/products/rnai/shrna-lentiviral-particles). אנו ממליצים לתכנן 4-5 shRNAs שונים כנגד כל גן ולבחור את 2 הטובים ביותר לניסויים. צור גם וקטורים שאינם מכוונים כבקרות שליליות. יש לנקוט בחלק מהצעדים הבאים בסביבה המתאימה לטיפול בנגיפים הנגזרים מ-HIV (למשל, BSL2+). בדוק את הכללים המוסדיים שלך.

  1. יצירת חלקיקים לנטי-ויראלים
    1. זרע 3 x 106 HEK293T תאים כמו בשלבים 3.1.1-3.1.3. למחרת, הכינו את קומפלקסי ה-DNA של ריאגנט טרנספקציה בתיווך ליפידים כמו בשלב 3.1.4, תוך שימוש ב-9 מיקרוגרם ו-3 מיקרוגרם, בהתאמה, של וקטורי האריזה pCMV-R8.74 ו-pCMV-VSVG, ו-7 מיקרוגרם של ה-pLKO.1 המכיל shRNA ב-0.75 מ"ל של מדיום מותאם לטרנספקציה נטול אנטיביוטיקה, והמשיכו כמתואר בשלבים 3.1.5 ו-3.1.6.
  2. התמרת CAFs
    1. להדביק תאים כמתואר בשלבים 3.2.1, 3.2.2 ו-3.2.4. לאחר 24 שעות, הסר את מדיום הזיהום והתחל בבחירה עם 2 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין ב-cDMEM. ראה הערה בשלב 3.2.5 לקביעת ריכוז אופטימלי.
    2. החלף puromycin/cDMEM לאחר 48 שעות. הבחירה מסתיימת בדרך כלל תוך 3 ימים. הרחב והקפיא תאים כמו בשלב 3.2.6. הערך את יעילות ההפלה הן על ידי RT-PCR והן על ידי כתם מערבי כמתואר בשלבים 4.1. ו-4.2.

6. הפעלת על של iCAFs עם CM מתאי גידול

הערה: השלבים הבאים ממחישים שיטות לאפיון במבחנה של פעילויות פרו-גידוליות של iCAFs. ניתן לשפר את הפעילות הפרו-גידולית של CAFs על ידי דגירה שלהם עם CM מתאי גידול BC של עכבר (הפעלת על, s.a.), כמתואר להלן.

  1. ספור 4T1 תאי BC של עכברים כמתואר בשלב 1.3 וזרע 2 x 106 תאים בצלחת בקוטר 100 מ"מ ב-10 מ"ל של cRPMI (ראה שלב 1.1).
  2. לאחר 24 שעות, הסר את המדיום, שטוף פעמיים עם 10 מ"ל PBS, ודגר במשך 48 שעות עם 10 מ"ל sRPMI (ראה שלב 1.1) כדי ליצור CM.
  3. למחרת, זרעו 2 x 106 iCAFs על צלחת בקוטר 100 מ"מ, ב-10 מ"ל של cDMEM (ראה שלב 1.3) ותרבו אותם כמתואר בשלב 1.1. סנן את ה-CM דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל כמו בשלב 4.3.3.
  4. הפעלת על (s.a.): הסר את המדיום מכלי ה-iCAFs, שטוף פעמיים עם 10 מ"ל PBS, והוסף את ה-4T1 CM המסונן (8-10 מ"ל). דגירה במשך 48 שעות כדי להשיג s.a. iCAFs.

7. התפשטות תאי גידול

  1. טפל בתאי 4T1 למשך 48 שעות עם iCAFs CM, מוכן כמו בשלבים 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3.
  2. טריפסין וספור אותם, ואז זרע 4 x 103 תאים/באר של צלחת של 96 בארות ב-100 מיקרוליטר של cRPMI כמתואר בשלב 1.3 ותרבית כמו בשלב 1.1. צלחת טכנית משולשת.
    1. הכינו צלחת אחת של 96 בארות ליום של מהלך הזמן. מספר התאים המוצע כאן מותאם לפרוטוקול של 4 ימים; הקטינו אותו לזמנים ארוכים יותר.
  3. לאחר 4 שעות, או ברגע שהתאים מחוברים, הסר את המדיום, שטוף עם PBS על ידי הוספה עדינה של 100 מיקרוליטר, הקפד לא לנתק תאים על ידי הנחת הקצה על קצה הבאר, עם פיפטה רב ערוצית ושימוש במאגר סטרילי. הסר PBS, ולאחר מכן הוסף באופן דומה 100 מיקרוליטר של sDMEM (בקרה) או iCAF CM, שניהם בתוספת FBS מומת חום של 2% (ראה שלבים 4.3.1, 4.3.2, 4.3.3).
  4. לאחר 4 שעות, עצור את לוחית היום 0 כמתואר מנקודה 7.5. עבור נקודות הזמן האחרות, החלף את המדיום כל יומיים עד סוף הניסוי.
  5. כדי להעריך את צפיפות התאים, הסר את צלחת 96 הבארות מהחממה ושטוף את הבארות פי 2 עם 100 מיקרוליטר PBS, כמתואר בשלב 7.3.
  6. מתחת למכסה אדים, הוסף 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד (PFA) לכל באר וקבע את התאים למשך 10 דקות ב-RT.
    זהירות: PFA עלול לגרום לנזק חמור לעיניים ולגירוי בעור; הוא מזיק אם הוא נבלע ושאף ונחשד כגורם לפגמים גנטיים ולסרטן. ידית במכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים (PPE).
  7. יש לשטוף 3 פעמים עם 100 מיקרוליטר PBS כמו בשלב 7.3 ולהניח להתייבש מתחת למכסה האדים (כ-10 דקות).
  8. דגירה עם 50 מיקרוליטר של 0.1% סגול קריסטל ב-20% מתנול למשך 10 דקות ב-RT.
    זהירות: סגול קריסטל עלול לגרום לנזק חמור לעיניים ומדווח כסכנה בקטגוריה 4 לרעילות חריפה בפה וכסכנה בקטגוריה 2 כמסרטן. טפל בזה במכסה אדים לובש PPE מתאים.
  9. יש לשטוף 3 פעמים עם 100 מיקרוליטר ddH2O, לרוקן את הבארות ולהקיש על הצלחת על כרית סופגת או מגבת נייר כדי להסיר לחלוטין את הנוזלים.
  10. ממיסים סגול גביש ב-100 מיקרוליטר של 10% חומצה אצטית למשך 15 דקות ב-RT ומודדים צפיפות אופטית (OD) באורך גל של 600 ננומטר בקורא מיקרו-פלטות, תוך שימוש ב-100 מיקרוליטר של 10% חומצה אצטית כריק. נרמל את ה-OD לאותו יום ל-0 לכל תנאי.

8. הגירה ופלישה

  1. פיפטה 700 מיקרוליטר של DMEM בתוספת 1% FBS מומת חום, 1% עט/סטרפטו, לבארות של צלחת של 24 בארות. הנח הכנסת נקבוביות של 8 מיקרומטר, מצופה (פלישה) או לא (נדידה) עם מטריצה פעילה ביולוגית, בכל באר. השאירו את הצלחת בחממה לאיזון ב-37 מעלות צלזיוס תוך איסוף וספירה של תאי 4T1 כמו בשלב 1.3.
  2. נתק תאי 4T1 שטופלו מראש במשך 48 שעות עם iCAFs CM מצלחת בקוטר 100 מ"מ כמו בשלבים 4.3.1, 4.3.2 ו-4.3.3, תוך שימוש ב-1 מ"ל של 5 מ"מ EDTA במקום טריפסין-EDTA.
  3. הוסף 5 מ"ל של cDMEM, קצור את התאים בצינור חרוטי של 15 מ"ל, וגלולה על ידי צנטריפוגה כמו בשלב 1.2. השעו מחדש תאים ב-sDMEM, ספרו כמו בשלב 1.3, ודללו ל-1 x 105 תאים/100 מיקרוליטר.
  4. הוסף 100 מיקרוליטר מתרחיף התא לתא העליון של הטרנסוול. כבקרת ציפוי, זרע 100 מיקרוליטר של תאים בצלחת של 24 בארות, ב-500 מיקרוליטר של cDMEM. דגירה למשך 16 שעות (נדידה) או 24 שעות (פלישה), והפסקת הניסוי כמתואר להלן.
    הערה: יש לקבוע את זמני הדגירה באופן אמפירי אם משתמשים בתאים שונים.
  5. סמן את התוספות בצד העליון שלהן בטוש דק וטבל אותן בצינור חרוטי של 50 מ"ל מלא ב-PBS לשטיפה באמצעות פינצטה. נקו בזהירות את החלק הפנימי של הטרנסוול בעזרת צמר גפן.
  6. מתחת למכסה אדים, דגרו דגימות ב-700 מיקרוליטר של 4% PFA למשך 10 דקות ב-RT (ראה שלב 7.6).
  7. שוטפים 3 פעמים עם 700 מיקרוליטר PBS ומניחים להתייבש מתחת למכסה המנוע (כ-10 דקות). דגירה עם 700 מיקרוליטר של 0.1% סגול קריסטל ב-20% מתנול למשך 10 דקות ב-RT (ראה שלב 6.10).
  8. יש לשטוף את התוספות פי 3 ולהטביע אותן בצינור חרוטי של 50 מ"ל מלא ב-ddH2O באמצעות פינצטה. נקו בזהירות את החלק הפנימי של הטרנסוול בעזרת צמר גפן. אחסן דוגמאות ב-RT וצלם תמונות עד 3 ימים לאחר מכן.
  9. באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, צלם תמונה אחת עם הדמיה אובייקטיבית פי 10 של רוב פני הבאר, ולאחר מכן רכוש תמונות מ-5 אזורים עצמאיים עם מטרה של פי 20.
  10. ממיסים סגול קריסטל ב -10% חומצה אצטית באופן הבא: לבארות, מוסיפים 100 מיקרוליטר חומצה אצטית ומערבבים על שייקר אורביטלי למשך 10 דקות ב- RT; עבור טרנסוולים, הניחו אותם, המשטח התחתון למעלה, על ספסל, הפקידו 50 מיקרוליטר של חומצה אצטית על פני השטח וערבבו על ידי פיפטינג עד להמסה מלאה של סגול קריסטל.
  11. קרא את הספיגה ב-600 ננומטר בצלחת של 96 בארות באמצעות 50 מיקרוליטר של החומר המומס מהשלב לעיל. השתמש ב -10% חומצה אצטית כריק.
  12. לנרמל את הצפיפות האופטית (OD) של בקרת הציפוי משלב 8.5 ולבטא נדידה או פלישה ביחס למצב הבקרה.

9. גידול ראשוני והיווצרות גרורות בריאות

הערה: השלב הבא ממחיש שיטות לאפיון in vivo של הפעילויות הפרו-גידוליות של CAFs. שלב זה מותאם להערכת תכונות פרו-גידוליות in vivo של CAFs על ידי הזרקה משותפת במודלים של עכברים סינגניים. מכיוון שגם תאי CAFs וגם תאי 4T1 הם מרקע העכבר BALB/c, משתמשים בעכברי BALB/c.

  1. יומיים לפני ההזרקה, מספר 6 שבועות נקבות עכברי BALB/c עם תגי אוזניים מתכתיים ומגלחים את אזור בלוטת החלבהרביעי עם מכונת גילוח.
  2. אספו וספרו תאי 4T1 ו-s.a. iCAFs, שהוכנו כמתואר בשלב 6. בצינור חרוטי של 15 מ"ל, מערבבים 1 x 105 4T1 תאים ו-3 x 105 s.a. iCAFs/עכבר, בהתחשב בעודף של לפחות 20%. השתמש ב- 4T1 רק כבקרה.
  3. צנטריפוגה ב-290 x גרם למשך 5 דקות, השעיה מחדש בנפח PBS המחושב כדי להשיג את מספר התאים/עכברים הנ"ל ב-50 מיקרוליטר, העברה למיקרו-צינור של 1.5 מ"ל ושמירה על קרח.
    הערה: לדוגמה, כדי להזריק 10 עכברים, ערבבו 1.2 x 106 4T1 תאים עם 3.6 x 106 s.a. iCAFs, תאי גלולה, והשעו מחדש ב-600 מיקרוליטר של PBS. הזרקו 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל עכבר.
  4. הכן את אזור העבודה על ידי ניקוי וחיטוי פני השטח של מכסה מנוע זרימה למינרית. כסו לוח ניתוחי קצף ביריעת מגן ספסל.
  5. יש להרדים את העכברים בזה אחר זה, על פי נהלים מוסדיים (אנו משתמשים בהזרקה תוך צפקית של בסיס טילטמין/בסיס זולזפם + קסילזין 70 מ"ג/ק"ג + 5 מ"ג/ק"ג). מרחו משחה וטרינרית על העיניים למניעת יובש. בעזרת קצה כותנה יש לחטא את העור בתמיסת פובידון-יוד.
  6. השתמש בבדיקת צביטת הבוהן כדי לוודא שהעכברים נמצאים בהרדמה מתאימה. בעזרת מחט היפודרמית, הזרקו 50 מיקרוליטר מתרחיף התאים לכרית השומן הרביעית של החלב. השתמש בפטמה כהתייחסות והזריק כ-3 מ"מ לכיוון הרגל המקבילה.
  7. בדוק את העכברים מספר שעות לאחר ההזרקה ובימים שלאחר מכן. הגידולים הופכים מוחשיים לאחר 4 ימים.
  8. מדוד את גודל הגידול כל 48 שעות עם קליפר, וקבע את הקוטר המקסימלי והמינימלי. חשב את נפח הגידול באמצעות הנוסחה: (אורך x רוחב2)/2.
  9. לאחר 10 ימי הזרקה יש להסיר בניתוח את הגידולים הראשוניים כמתואר להלן.
    1. הכן את אזור הניתוח כמו בשלב 9.5. עקרו כלים על ידי חיטוי והניחו אותם על משטח סטרילי בזמן העבודה. עקר כלים בין בעלי חיים באמצעות מעקר חרוזים חם.
    2. הרדמו את העכברים כמו בשלבים 9.6 ו-9.7. בעזרת להב אזמל, בצע חתך של 5-8 מ"מ קרוב לגידול ומשוך בעדינות את העור, ויוצר כיס קטן לגישה לגידול. צרבו כל כלי דם גלוי עם עט צריבה בטמפרטורה נמוכה כדי למנוע שטפי דם בעת הניתוח.
    3. השתמש באזמל כדי להסיר את הגידול, השתדל לא להסיר שום עור. החזירו את דשי העור למקומם המקורי, תפרו אותם יחד באמצעות חוט כירורגי 5-0 עם מחט 17 מ"מ 1/2c, והוסיפו דבק כירורגי כדי לאטום לחלוטין את הפצע.
    4. אל תשאיר את העכברים ללא השגחה עד שהם יחזרו להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה על עצם החזה. בעלי חיים שעברו ניתוח אינם מוחזרים לחברת בעלי חיים אחרים עד להחלמתם המלאה.
  10. יש לעקוב מקרוב אחר בעלי החיים לאחר הניתוח ובימים שלאחר מכן, לתת טיפול משכך כאבים במידת הצורך, על פי הפרוטוקולים המוסדיים. אנו משתמשים בזריקות תת עוריות של קרפרופן (3-5 מ"ג/ק"ג).
  11. שקלו את הגידול באמצעות איזון מדויק כמו בשלב 2.2. חתכו את הגידול לשניים באמצעות האזמל. מניחים מחצית אחת במיקרו-צינור של 1.5 מ"ל, מקפיאים בחנקן נוזלי ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאנליזות מולקולריות. תקן את החצי השני ב-5 מ"ל של 4% PFA בצינור חרוטי של 15 מ"ל למשך 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס לניתוח היסטולוגי.
  12. ביום ה-21 לאחר ההזרקה, הקריבו את העכברים על ידי חשיפה ל-CO2 ואספו את הריאות בעירוי תוך קנה הנשימה עם 4% PFA כמתואר להלן. עבדו מתחת למכסה אדים.
    1. פתח את חלל החזה באמצעות מספריים כירורגיים. הסר את העור מהאזור התת-לסת ומבלוטות הרוק כדי לחשוף בבירור את קנה הנשימה.
    2. הכן מזרק מחט 22 גרם המכיל תמיסת PFA 4%. הכנס את המחט לקנה הנשימה של העכבר, כוון אותה לכיוון הריאות תוך הידוק קנה הנשימה לכיוון הראש. הזרקו את התמיסה עד שהריאות מתנפחות (בסביבות 2 מ"ל).
    3. נתחו את הריאות והניחו אותן בצינור של 15 מ"ל המכיל תמיסת PFA של 4%. הפוך בעדינות את הצינור כמה פעמים, ואפשר לו לתקן למשך 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
  13. בצע חתכים חצי סדרתיים של הריאות, וצבוע בהמטוקסילין ואאוזין (H&E), פרוסה אחת כל 50/100 מיקרומטר עד למיצוי הדגימה, כמתואר בהתייחסות31.
  14. ציון גרורות על ידי ניתוח מונחה תוכנה של מיקרו-צילומים של החלקים המוכתמים ב-H&E.

10. חתימות ביטוי גנים

  1. הגדר חתימת גן כמתואר להלן.
    1. בהתאם לסביבת הניסוי ולשאלה הביולוגית הספציפית שנחקרה, השג חתימת גן בכמה דרכים. לרוב, העריכו את הביטוי הדיפרנציאלי בין שני מצבים (למשל, CAFs לעומת עמיתים רגילים, או מטופלים במספר דרכים (למשל, מופעלים או מושתקים) לעומת לא מטופלים.
    2. לחלופין, זהה את הגנים המתבטאים או האינפורמטיביים ביותר על פני הדגימות שנותחו (למשל, גנים עם שונות גבוהה או עם עומסים גבוהים על המרכיבים הראשונים של ניתוח רכיבים עיקריים). כאן, נשתמש בחתימה מוסדרת STAT3 כדוגמה. חתימה זו הוגדרה כגנים המווסתים עם השתקת STAT3 ב-BC CAFs29, כמתואר להלן. לתיאור יסודי של ריצוף RNA, ראה הפניות32,33.
  2. חלץ את סך ה-RNA במשולש טכני מכל דגימה כמו בשלב 4.1.1 והעריך את איכות ה-RNA כדי לבדוק את תקינות ה-RNA (RIN ≥ 9).
  3. הכן ספריות מ-2 מיקרוגרם של RNA נבחר פולי (A) ורצף אותן. השתמשנו בפלטפורמת NextSeq 500.
  4. המפה קוראת למכלול הייחוס Mus musculus mm9 באמצעות TopHat v2.0. 1034.
  5. חשב ספירת גנים באמצעות כלי htseq-count מחבילת HTSeq (http://www.huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html).
  6. בצע ניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות R וחבילת DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/DESeq2.html). סנן גנים מווסתים עם FDR < 0.05 כדי להגדיר את חתימת STAT3.

11. הערכת ביטוי החתימה בגידולים ראשוניים

הערה: השלבים הבאים מתארים הליך להערכה חישובית של הביטוי של חתימה29 המווסתת על ידי STAT3 על פני נתוני טרנסקריפטום זמינים לציבור של גידולים ראשוניים של BC, ובודקים את הקשר שלה עם שיעור הסטרומה המשוער באותה קבוצת דגימות.

  1. התקן R (https://cran.r-project.org/) ו-RStudio (https://posit.co/products/open-source/rstudio/). הפעל אותו והתקן את הספריות הנדרשות: GSVA35, TCGAbiolinks36.
  2. הורד נתוני ביטוי גנים ראשוניים של גידול, כגון נתוני TCGA מ-https://portal.gdc.cancer.gov/, נתוני METABRIC מ-http://synapse.org/ (syn1757063), או נתונים טרנסקריפטומיים אחרים מ-Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) כמטריצות ביטוי מנורמלות מראש. יש לעצב את הנתונים כמטריצה מספרית עם שורות כגנים ועמודות כדגימות, ולנרמל אותם בהתאם לפלטפורמה ולשנות את קנה המידה באמצעות היסט של 1.
    1. הורד את רשימת האורתולוגיות של גנים אנושיים של עכבר מ-Biomart ב-https://www.ensembl.org/biomart/martview/, בחר את מסד הנתונים: אנסמבל גנים, בחר את מערך הנתונים של גנים אנושיים ולחץ על בחירת התכונות בכרטיסייה השמאלית.
    2. מהתכונות שנבחרו מראש, פתח את הכרטיסייה חיצוני וסמן את סמל HGNC, בחר הומולוג בתיבה בראש העמוד וסמן בדגל אורתולוגים של עכבר / שם גן עכבר.
    3. לחץ על כפתור התוצאות בפינה השמאלית העליונה, בחר בפורמט CSV ולחץ על כפתור GO כדי להוריד את הקובץ.
  3. טען את חתימת ביטוי הגנים (קבוצה של גנים) ב-R. במקרה זה, אנו משתמשים ברשימת הגנים המווסתים עם השתקת STAT3 ב-CAF של עכברים.
  4. טען את רשימת האורתולוגיות של גנים אנושיים של עכבר ב-R ומפה את חתימת STAT3 לאורתולוגים האנושיים המתאימים באמצעות טבלת Biomart.
  5. טען נתוני ביטוי גנים ראשוניים של גידול ב-R וקרא לפונקציית GSVA עם פרמטרים כאובייקט ssgseaParam, כולל נתוני גידול ראשוניים, ורשימה הכוללת את חתימת STAT3.

12. לבחון את הקשר בין ביטוי חתימת הגן לבין המאפיינים הקליניים

  1. זהה את המשתנים המעניינים. אחוז סטרומה מייצג את שיעור התאים בדגימת הגידול המרוצפת השייכת לסטרומה של הגידול. השתמש במאפיינים הקליניים הבאים הקשורים לעתים קרובות לנתונים אומיים: גודל הגידול, שלב, גיל המטופל בעת האבחנה, מצב בלוטות הלימפה, מצב גרורות וכו'. הערכות אחוז סטרומליות מחושבות מראש זמינות עבור TCGA.
    הערה: באופן ספציפי, הערכות סטרומליות זמינות הן: EDec Immune/Stromal = Epigenomic Deconvolution of stromal/immune percentage37; ציון חיסוני = ssGSEA בהתבסס על פרופילי ביטוי גנים של 141 גנים חיסוניים38; LUMP = לויקוציטים Unmethylation for Purity, שהוא ממוצע של 44 אתרי CpG ספציפיים למערכת החיסון ללא מתילציה39; ציון סטרומלי = ssGSEA בהתבסס על פרופילי ביטוי גנים של 141 גנים סטרומליים38; IHC = מוערך על ידי ניתוח תמונה של שקופיות מוכתמות בהמטוקסילין ואאוזין שהופקו על ידי משאב הליבה של בית החולים לילדיםלילדים 40; ABSOLUTE = מבוסס על נתוני מספר עותק סומטיים41.
  2. הורד נתוני EDEc מציוני http://genboree.org/theCommons/documents/569, סטרומה ומערכת החיסון מ-https://bioinformatics.mdanderson.org/estimate/disease.html (RNASeqV2), ונתוני טוהר הגידול (LUMP, IHC, ABSOLUTE) מ-TCGAbiolinks. עבור מערכי נתונים אחרים, חשב את אחוז הסטרומה העושה שימוש בחבילת GSVA, חישוב ה-ssGSEA עבור סטרומה וחתימות חיסוניות שהתקבלו מיושיהארה ואחרים.38.
  3. חשב את המתאם בין הווקטור המספרי של הפרופורציה הסטרומלית המשוערת לבין הווקטור המספרי של ביטוי חתימת STAT3 על פני דגימות גידול ראשוניות. ניתן להשיג זאת באמצעות הפונקציה cor.test ב-R.
  4. הורד נתונים קליניים הקשורים למערך הנתונים הטרנסקריפטומיים של הגידולים הראשוניים כטבלה עם דגימות בשורות ומאפיינים קליניים בעמודות.
  5. טען את הנתונים הקליניים ב-R ובדוק שהדגימות במטריצה הטרנסקריפטומית ובטבלת המטא-נתונים הן באותו סדר כמו פונקציית ההתאמה.
  6. עבור משתנים מספריים (למשל, גודל הגידול), חשב את המתאם בין הווקטור המספרי של ביטוי חתימת STAT3 על פני דגימות גידול ראשוניות לבין הווקטור של ערכי המאפיינים הקליניים עם פונקציית cor.test.
  7. עבור משתנים קטגוריים (למשל, מצב גרורות), בדוק את ההבדל בביטוי חתימת STAT3 בין שתי קבוצות דגימות (למשל, גידולים גרורתיים לעומת גידולים לא גרורתיים) עם מבחן Wilcoxon rank-sum לא פרמטרי (בהנחה ששתי קבוצות הדגימות אינן תלויות). ניתן להשיג זאת באמצעות הפונקציה wilcox.test ב-R.

13. בדיקת ויסות החתימה בסטרומה של הגידול

הערה: לביטוי של חתימה סטרומלית בגידולים ראשוניים שנותחו באמצעות ריצוף RNA בתפזורת יש יתרון בהסתמכות על קבוצות מטופלים גדולות עם הערות קליניות מפורטות. מצד שני, רק הפרדה בין סטרומה לאפיתל מאפשרת להגדיר שינויים בביטוי גנים בכל אחד משני התאים בגידול בהשוואה לרקמה רגילה42. MetaLCM היא ShinyApp המאפשרת ניתוח של מערכי נתונים טרנסקריפטומיים של גידולי שד מנותחים בלייזר. באמצעות כלי זה, המשתמש יכול לחפש גנים חזקים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין שני מצבים על פני מערכי נתונים טרנסקריפטומיים של גידולי שד שנותחו בלייזר ולבדוק את ויסות חתימות הגנים שהוגדרו בעבר בסטרומה של הגידול. השלבים הבאים מתארים כיצד להשתמש ב-MetaLCM.

  1. גש ליישום בקישור https://aurorasavino.shinyapps.io/metalcm/. כדי להתחיל בניתוח, בחר את התכונות של התנאים המושווים.
  2. בחר את כיוון ההשוואה. על ידי בחירת גנים מווסתים, מוצגים הגנים בעלי ביטוי גבוה יותר במצב 1.
  3. בחר את סף ערך p עבור ביטוי דיפרנציאלי ולחץ על הפעלה כדי להפעיל את הניתוח, ובכל פעם שההגדרות משתנות.
  4. כדי להגביל את הניתוח לרשימת גנים מוגדרת מראש, הקלד סמלי גנים מופרדים בפסיקים או ייבא קובץ CSV המכיל סמלי גנים בעמודה אחת.
  5. לחץ על שלח רשימת גנים כדי לייבא סמלי גנים. לחץ על איפוס כדי לשחזר את הניתוח באמצעות כל הגנים. שמור את רשימת הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי: כאשר מסופקת רשימת גנים, מבוצע תיקון בדיקות מרובות על גנים אלה בלבד. הטבלה כוללת את ה-logFC הממוצע, ערך p מכווץ וערכי logFC ו-p בודדים עבור ביטוי דיפרנציאלי בכל מערך נתונים זמין.
  6. שרטט מפת חום עם שינויי הקיפול של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. מפת החום מציגה רק את הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי עם סימן קוהרנטי לחלוטין של ביטוי דיפרנציאלי על פני מערכי נתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הערכה חוץ גופית של פעילות CAFs
התרומה של פיברובלסטים הקשורים לסרטן שמקורם בגידול שד (CAFs) למאפיינים האגרסיביים של סרטן השד (BC) נחקרה באמצעות CAFs אימורטליים (iCAFs) שנוצרו על פי שלב 3. iCAFs הופעלו כמתואר בשלב 6, ואז הורעבו ב-sDMEM כדי לאסוף את ה-CM שלהם, ששימש לטיפול בתאי 4T1 במשך 48 שעות (ראה שלב 7.1). לאחר טיפול זה נערכו בדיקות תפקודיות במבחנה . איור 1 מראה כי התפשטות תאי 4T1 מוגברת באופן משמעותי על ידי הטיפול ב-s.a. iCAFs CM בהשווא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקולים אופטימליים לאימורטליזציה של CAFs עכברים ואפיון פעילותם הפרו-גידולית הן במבחנה והן ב-vivo. במקום לבודד באופן סלקטיבי תת-סוגים ספציפיים של CAF על סמך ביטוי סמן, בחרנו לשמור על כל אוכלוסיית התאים כדי לשמר הטרוגניות. התאים אופיינו מבחינה תפקודית כמכלול, ופרופילי ביטוי הגנים שלהם נותחו כדי ללכוד את המגוון שלהם. הנצחת CAFs הייתה חיונית למחקר זה בשל המספר המוגבל של מעברים ש-CAFs ראשוניים יכולים לעבור לפני שהם הופכים למזדקנים. התאים האימורטליים ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי האגודה האיטלקית לחקר הסרטן (AIRC, IG16930 ו-IG24851 ל-V.P.); משרד האוניברסיטה והמחקר האיטלקי (MIUR PRIN 2017 ו-2022 לסמנכ"ל); קרן טראוס וגריט ואן רימסדייק, ליכטנשטיין, תרומה לסגן נשיא; אזור פיימונטה (סטייה). A.S נתמכה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של הקרן האיטלקית לחקר הסרטן (FIRC), ולוס אנג'לס נתמכה על ידי Fondazione Umberto Veronesi.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סולם DNA 1Kb פלוסתרמו-פישר סיינטיפיק10787018
צלחת 24 בארסרשטדט833922
צלחת 96 בארסרשטדט833924
חומצה אצטיתסיגמא אלדירץ'695092
AgeI-HFמעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד₪752יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
בטדיןמדה פארמה23907076
Bü לשכת הספירה של רקר VWR40443703
Cautery Low Temp FineTip DispקילרAX10339KL
צנטריפוגהאפנדורף5810R
צינור חרוטי 15 מ"לסרשטדט62554502
צינור חרוטי 50 מ"לסרשטדט62547254
מיקרו-צינורות Cryopure 2 מ"לסרשטדט72380992
סגול קריסטלסיגמא אלדירץ'ג0775אחסן ב-RT, השתמש במכסה אדים 
צלחת תרבית בקוטר 100 מ"מ סרשטדט833902
צלחת תרבית בקוטר 60 מ"מ סרשטדט833920
ד.ד.ה20תוצרת ביתאחסן ב-RT, השתמש בקולט אדים ביולוגי
קליפר דיגיטליPreciva02-301-2
מיקרוסקופ דיגיטלילייקהDM6B
דימתיל סולפוקסידסיגמא אלדירץ'D8418שימוש במכסה מנוע ביולוגי
דולבקו s Modified Eagle' s בינוני (DMEM)ג'יבקו11965092יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
אקורי-HFמעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד₪700יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)סיגמא אלדירץ'E6758אחסן ב-RT, השתמש בקולט אדים ביולוגי
סרום בקר עוברי (FBS)ג'יבקו16000044יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
טיפים מסוננים 10 ומיקרו; Lסרשטדט703010255
טיפים מסוננים 100 ומיקרו; Lסרשטדט703030255
טיפים מסוננים 1000 ומיקרו; Lסרשטדט703060255
טיפים מסוננים 20 ומיקרו; Lסרשטדט703030265
טיפים מסוננים 200 ומיקרו; Lסרשטדט703031255
פילטרופור S פלוס 0,20 ומיקרו; מ סרשטדט831826102
פילטרופור S פלוס 0,45 ומיקרו; מ סרשטדט831826
מספריים עדינים2ביול1406009
מלקחיים2ביול1102412
גנטיציןג'יבקו10131035יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
ליפופקטמין 2000 מגיב טרנספקציהתרמו-פישר סיינטיפיק11668019יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
תאי פלישה של מטריג'ל עם 8 μ m ממברנת PET קורנינג354480
קורא מיקרו-פלטות (ספיגה של 600 ננומטר)פרומגהג'י.אם.3500
מיקרו-צינורות 1.5 מ"ל סרשטדט7269001
אופטימםג'יבקו31985047יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
פרפורמלדהיד (PFA)סיגמא אלדירץ'158127אחסן ב-RT, השתמש במכסה אדים
pBABE-neo גדולTcDNA אדג'ן1780יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
pCL-אמפונובוס ביולוגי 18746853יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
pCMV-R8.74אדג'ן22036יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
pCMV-VSVG אדג'ן8454יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
פניצילין-סטרפטומיצין (Pen Strepto, 10,000 μ גרם/מ"ל) ג'יבקו15140122יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה אולימפוס BX42
מי מלח חומציים פוספט  (PBS)תוצרת ביתאחסן ב-RT, השתמש בקולט אדים ביולוגי
pLKO.1-Puro אדג'ן10878יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
תמיסת פולי-L-ליזיןסיגמא אלדירץ'עמ' 8920יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
פורומיצין דיהידרוכלוריד מ  סטרפטומיצס אלבוניגרסיגמא אלדירץ'עמ' 8833
מאגר rCutSmart מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדB6004יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
מכונת גילוח מכרסמיםאסקולאפGT416
מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI)ג'יבקו61870010יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
ספוגיות צמא עם קצה עגולסיגמא אלדירץ'Z744127
אזמלגימה27041
Secura חצי מיקרו איזוןסרטוריוסSECURA125-1S
פיפטה סרולוגית 10 מ"ל סרשטדט861254001
פיפטה סרולוגית 2 מ"ל סרשטדט861252001
פיפטה סרולוגית 25 מ"ל סרשטדט861256001
פיפטה סרולוגית 5 מ"ל סרשטדט861253001
תפרים 5-0אתיקון1866 גרם
מזרק 10 מ"לפנטפרטהברקוד 00202250E14
מזרק 5 מ"לפנטפרטהברקוד 00202250E12
מזרק אינסולין אומניקן 1 מ"לבראוןברקוד 9151125S
אדזי רקמות3M ווטבונד1469 ס"ב
תוספות Transwell 8 ומיקרו; נקבוביות בז353097
תוספות Transwell Matrigel 8 ומיקרו; נקבוביות קורנינג354480
טריפסין-EDTA (0.5%), ללא פנול אדוםג'יבקו15400054
רכז צנטריפוגלי Vivaspin 20 MWCO 10,000 Da סיגמא אלדירץ'Z614602

מקורות

  1. Bhattacharya, S., et al. Group behavior and emergence of cancer drug resistance. Trends Cancer. 7 (4), 323-334 (2021).
  2. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
  3. Marusyk, A., et al. Spatial proximity to fibroblasts impacts molecular features and therapeutic sensitivity of breast cancer cells influencing clinical outcomes. Cancer Res. 76 (22), 6495-6506 (2016).
  4. Su, S., et al. Cd10(+)gpr77(+) cancer-associated fibroblasts promote cancer formation and chemoresistance by sustaining cancer stemness. Cell. 172 (4), 841-856.e16 (2018).
  5. Sahai, E., et al. A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).
  6. Watson, S. S., et al. Microenvironment-mediated mechanisms of resistance to HER2 inhibitors differ between HER2+ breast cancer subtypes. Cell Syst. 6 (3), 329-342.e6 (2018).
  7. Xie, J., et al. Cancer-associated fibroblast-derived extracellular vesicles: Regulators and therapeutic targets in the tumor microenvironment. Cancer Drug Resist. 8, 2(2025).
  8. Du, R., et al. PDPN-positive CAFs contribute to HER2-positive breast cancer resistance to trastuzumab by inhibiting antibody-dependent NK cell-mediated cytotoxicity. Drug Resist Updat. 68, 100947(2023).
  9. Zhang, H., et al. Define cancer-associated fibroblasts (CAFs) in the tumor microenvironment: New opportunities in cancer immunotherapy and advances in clinical trials. Mol Cancer. 22 (1), 159(2023).
  10. Zheng, S., et al. Dissecting the role of cancer-associated fibroblast-derived biglycan as a potential therapeutic target in immunotherapy resistance: A tumor bulk and single-cell transcriptomic study. Clin Transl Med. 13 (2), e1189(2023).
  11. Bainer, R., et al. Gene expression in local stroma reflects breast tumor states and predicts patient outcome. Sci Rep. 6, 39240(2016).
  12. Farmer, P., et al. A stroma-related gene signature predicts resistance to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer. Nat Med. 15 (1), 68-74 (2009).
  13. Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Res. 17 (1), 23(2015).
  14. Xie, J., et al. Turning up a new pattern: Identification of cancer-associated fibroblast-related clusters in TNBC. Front Immunol. 13, 1022147(2022).
  15. Chen, Y., Mcandrews, K. M., Kalluri, R. Clinical and therapeutic relevance of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Clin Oncol. 18 (12), 792-804 (2021).
  16. Bartoschek, M., et al. Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Commun. 9 (1), 5150(2018).
  17. Liu, S. Q., et al. Single-cell and spatially resolved analysis uncovers cell heterogeneity of breast cancer. J Hematol Oncol. 15 (1), 19(2022).
  18. Massa, D., Tosi, A., Rosato, A., Guarneri, V., Dieci, M. V. Multiplexed in situ spatial protein profiling in the pursuit of precision immuno-oncology for patients with breast cancer. Cancers. 14 (19), 4885(2022).
  19. Tietscher, S., et al. A comprehensive single-cell map of T cell exhaustion-associated immune environments in human breast cancer. Nat Commun. 14 (1), 98(2023).
  20. Tzoras, E., et al. Dissecting tumor-immune microenvironment in breast cancer at a spatial and multiplex resolution. Cancers. 14 (8), 1999(2022).
  21. Wu, S. Z., et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers. Nat Genet. 53 (9), 1334-1347 (2021).
  22. Ning, L., et al. Scrna-seq characterizing the heterogeneity of fibroblasts in breast cancer reveals a novel subtype sfrp4(+) caf that inhibits migration and predicts prognosis. Front Oncol. 14, 1348299(2024).
  23. Salemme, V., et al. The role of tumor microenvironment in drug resistance: Emerging technologies to unravel breast cancer heterogeneity. Front Oncol. 13, 1170264(2023).
  24. Attalla, S., Taifour, T., Bui, T., Muller, W. Insights from transgenic mouse models of pymt-induced breast cancer: Recapitulating human breast cancer progression in vivo. Oncogene. 40 (3), 475-491 (2021).
  25. Ferreira, T., Azevedo, T., Silva, J., Faustino-Rocha, A. I., Oliveira, P. A. Current views on in vivo models for breast cancer research and related drug development. Expert Opin Drug Discov. 19 (2), 189-207 (2024).
  26. Holen, I., Speirs, V., Morrissey, B., Blyth, K. In vivo models in breast cancer research: Progress, challenges and future directions. Dis Model Mech. 10 (4), 359-371 (2017).
  27. Pedroza, D. A., Gao, Y., Zhang, X. H., Rosen, J. M. Leveraging preclinical models of metastatic breast cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1879 (5), 189163(2024).
  28. Nuckhir, M., Withey, D., Cabral, S., Harrison, H., Clarke, R. B. State of the art modelling of the breast cancer metastatic microenvironment: Where are we. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 14(2024).
  29. Avalle, L., et al. Stat3 induces breast cancer growth via angptl4, mmp13 and stc1 secretion by cancer associated fibroblasts. Oncogene. 41 (10), 1456-1467 (2022).
  30. Halaban, R., Alfano, F. D. Selective elimination of fibroblasts from cultures of normal human melanocytes. In Vitro. 20 (5), 447-450 (1984).
  31. Avalle, L., et al. Micrornas-143 and -145 induce epithelial to mesenchymal transition and modulate the expression of junction proteins. Cell Death Differ. 24 (10), 1750-1760 (2017).
  32. Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with rna-seq. J Biomed Biotechnol. 2010, 853916(2010).
  33. Ura, H., Togi, S., Niida, Y. A comparison of mrna sequencing (rna-seq) library preparation methods for transcriptome analysis. BMC Genomics. 23 (1), 303(2022).
  34. Kim, D., et al. Tophat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36(2013).
  35. Hanzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. Gsva: Gene set variation analysis for microarray and rna-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 7(2013).
  36. Mounir, M., et al. New functionalities in the tcgabiolinks package for the study and integration of cancer data from gdc and gtex. PLoS Comput Biol. 15 (3), e1006701(2019).
  37. Onuchic, V., et al. Epigenomic deconvolution of breast tumors reveals metabolic coupling between constituent cell types. Cell Rep. 17 (8), 2075-2086 (2016).
  38. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  39. Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nat Commun. 6, 8971(2015).
  40. Liu, J., et al. An integrated tcga pan-cancer clinical data resource to drive high-quality survival outcome analytics. Cell. 173 (2), 400-416.e11 (2018).
  41. Carter, S. L., et al. Absolute quantification of somatic DNA alterations in human cancer. Nat Biotechnol. 30 (5), 413-421 (2012).
  42. Savino, A., De Marzo, N., Provero, P., Poli, V. Meta-analysis of microdissected breast tumors reveals genes regulated in the stroma but hidden in bulk analysis. Cancers. 13 (13), 3371(2021).
  43. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral rnai system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  44. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of crispr-cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  45. Pfefferle, A. D., et al. Transcriptomic classification of genetically engineered mouse models of breast cancer identifies human subtype counterparts. Genome Biol. 14 (11), R125(2013).
  46. Hahn, W. C., et al. Enumeration of the Simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation. Mol Cell Biol. 22 (7), 2111-2123 (2002).
  47. Counter, C. M., et al. Dissociation among in vitro telomerase activity, telomere maintenance, and cellular immortalization. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14723-14728 (1998).
  48. Ferrari, N., et al. Dickkopf-3 links hsf1 and Yap/Taz signalling to control aggressive behaviours in cancer-associated fibroblasts. Nat Commun. 10 (1), 130(2019).
  49. Herrera, M., et al. Cancer-associated fibroblast-derived gene signatures determine prognosis in colon cancer patients. Mol Cancer. 20 (1), 73(2021).
  50. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  51. Cobos, F. A., et al. Effective methods for bulk RNA-seq deconvolution using scRNA-seq transcriptomes. Genome Biol. 24 (1), 177(2023).
  52. Cheng, P. S. W., Zaccaria, M., Biffi, G. Functional heterogeneity of fibroblasts in primary tumors and metastases. Trends Cancer. 11 (2), 135-153 (2025).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מיקרו-סביבת הגידולסרטן השדפרופיל ביטוי גניםאנליזה טרנסקריפטומיתמבחן פלישהמבחן נדידהגני מטרה של STAT3מיקרו-דיסקציה בשבי capture לייזר
פיברובלסטים הקשורים לסרטן מגידולי חלב של עכברים ככלים למחקרים מולקולריים וחישוביים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.