מאמר שיטה

בידוד, תרבית ואפיון של פיברובלסטים הקשורים לסרטן הערמונית

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68367

⸱

1 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale, 3Division of Urology, Department of Surgical Sciences, University of Turin, 4Department of Surgical Sciences and Urology, Città della Salute e della Scienza di Torino, University of Turin, 5Department of Pathology, University of Turin, and AOU Città della Salute e della Scienza

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק הליך מקיף לבידוד, הרחבה והנצחה של פיברובלסטים מכריתת ערמונית רדיקלית. יתר על כן, הוא מתאר מבחנים שפותחו כדי להעריך את ההשפעות התפקודיות של דיבור צולב בין תאי פיברובלסטים-גידול, תוך ניצול הן של טיפול במדיום מותנה והן של תרבית משותפת.

תקציר

סטרומה של גידול יכולה להיות מעוצבת באופן פעיל על ידי תאי גידול כדי לאמץ תכונות פרו-גידוליות, מה שהופך אותה למוקד של חקר הסרטן. בין מרכיבי הסטרומה, פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) - לעתים קרובות סוג התאים הנפוץ ביותר במיקרו-סביבת הגידול (TME) - ממלאים תפקיד מרכזי בקידום התקדמות הסרטן באמצעות האינטראקציות שלהם עם תאי גידול ורכיבי סטרומה אחרים. הבהרת המנגנונים מאחורי אינטראקציות אלה דורשת שיטות חזקות לבידוד ואפיון CAFs, שיכולות גם להניח את היסודות לפיתוח טיפולים חדשים לסרטן ממוקדי CAF. מחקר זה מציג שיטה לבידוד פיברובלסטים הן מהגידול והן מהאזורים הנורמליים הסמוכים של דגימות כריתה רדיקליות של הערמונית המתקבלות מחולי סרטן הערמונית (PCa). גישה זו מאפשרת בידוד בו-זמני של CAFs ועמיתיהם הרגילים (NFs) מאותו אדם, ומספקת מערכת ניסויים זוגית. פרוטוקולים מפורטים מסופקים לתחזוקה של CAFs ו-NFs ראשוניים לניתוחי מבחנה במורד הזרם, כמו גם לאמורליזציה שלהם כדי להקל על מחקרים ארוכי טווח. אנו מתארים גם מבחנים פונקציונליים שנועדו להשוות את ההשפעות של CAFs ו-NFs על התנהגויות של תאים סרטניים, כולל התפשטות, נדידה וצמיחה בלתי תלויה בעיגון. מפורטות שתי גישות משלימות: טיפול בתאי סרטן עם מדיה מותנית שמקורה בפיברובלסטים (CM), ותרבית משותפת ישירה של פיברובלסטים עם תאי גידול. יחד, מתודולוגיות אלה מייצגות ערכת כלים מקיפה לחקירת יחסי הגומלין הדינמיים בין CAFs לתאי גידול, לא רק ב-PCa אלא פוטנציאלית על פני מגוון סוגי סרטן אנושיים. יתר על כן, אפיון מולקולרי של אינטראקציות אלה עשוי לחשוף מתווכים מרכזיים של אונקוגנזה מונעת CAF, ולהציע יעדים מבטיחים להתערבות טיפולית.

מבוא

סרטן הערמונית (PCa) הוא הסרטן השכיח ביותר המאובחן בקרב גברים בכמעט שני שליש מהמדינות ברחבי העולם. בשנת 2022 דווח על כ-1.5 מיליון מקרים חדשים, וכתוצאה מכך 3,97,000 מקרי מוות ברחבי העולם. נתונים אלה הופכים את PCa לסרטן השני בשכיחותו ולגורם החמישי המוביל לתמותה הקשורה לסרטן בקרב גברים1.

PCa היא מחלה מולטיפוקלית ומורכבת ביולוגית, המאופיינת בהטרוגניות בין-גידולית משמעותית 2,3,4, תת-סוגים מולקולריים מגוונים ותוצאות קליניות משתנות 5,6, כל אלה משפיעים באופן משמעותי על הפרוגנוזה והתגובה הטיפולית7.

בעוד שהתפקיד הקריטי של מיקרו-סביבת הגידול (TME) בהתחלה והתקדמות של גידול הערמונית מבוסס היטב 8,9, האינטראקציות המולקולריות בין תאי הגידול לתא הסטרומה שמסביב נותרו לא מובנות לחלוטין. בעוד שידוע היטב כי המיקרו-סביבה של גידול הערמונית (TME) ממלאת תפקיד קריטי בהתחלת הגידול והתקדמותו, האינטראקציות המולקולריות בין תאי הגידול לסטרומה שמסביב נותרות לא מוגדרות מספיק. ה-TME מורכב ממגוון תאי סטרומל, כולל אלה ממקור מזנכימלי וחיסוני, המופעלים בתגובה לאותות שמקורם בגידול ובהמשך רוכשים פונקציות מקדמות גידול10,11. בין אלה, פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) מייצגים לעתים קרובות את אוכלוסיית הסטרומה הנפוצה ביותר. CAFs תורמים לעיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית (ECM), מקדמים צמיחת גידול ומקלים על פלישת תאים סרטניים ונדידה 4,11,12,13. באמצעות גורמים מופרשים ואינטראקציות ישירות בין תאים, CAFs משפיעים גם על התפשטות, פלישה ועמידות לטיפול. יש לציין כי CAFs הם אוכלוסייה הטרוגנית. בעוד שבדרך כלל קשורים לפונקציות פרו-גידוליות, תת-סוגים מסוימים עשויים למלא תפקידים מדכאי גידול14,15. חשוב לציין, היעדר סמנים ייחודיים ל-CAFs מציב אתגרים לזיהויים המדויק ולניתוח התפקודי של תפקידיהם המגוונים12,16.

גישה חזקה לחקירת הדיבור התפקודי בין CAFs לתאי גידול כוללת בידוד CAFs ראשוניים ופיברובלסטים נורמליים תואמים (NFs), ולאחר מכן הערכת השפעתם על התנהגויות תאי הגידול כגון התפשטות, נדידה, היווצרות מושבה וצמיחה בלתי תלויה בעיגון 17,18,19 . מאמר זה מתאר פרוטוקול מעודן וניתן לשחזור מאוד לבידוד CAFs ו-NFs מדגימות כריתה רדיקלית של הערמונית של חולי PCa בסיכון גבוה. מרכיב קריטי בפרוטוקול זה הוא זיהוי ונתיחה מדויקים של גידול ואזורים נטולי גידול על ידי אורופתולוג מומחה, המאפשר גזירת CAFs ו-NFs מאותו מטופל. גישה זו של דגימה זוגית מסייעת לשלוט בהטרוגניות בין-גידולית ובמשתנים ספציפיים לחולה בודד שיכולים להשפיע על פנוטיפים פיברובלסטים 20,21,22. כדי להבטיח מספיק רקמת גידול זמינה, אנו מתמקדים בדגימות ממטופלים עם ציון גליסון ≥7.

אפיון פנוטיפי אמין של הפיברובלסטים המבודדים דורש שימוש בסמנים מרובים כדי להבדיל אותם מסוגי תאים אחרים, במיוחד תאי אפיתל, שעשויים לחלוק ביטוי סמן חופף16. מכיוון שפיברובלסטים ראשוניים של PCa עוברים בדרך כלל הזדקנות לאחר 10-15 מעברים, מה שמסבך ניתוחים ארוכי טווח, אנו מציגים גם פרוטוקול לאימורטליזציה של תאים באמצעות ביטוי יציב של הטלומראז האנושי (hTERT)23.

כדי לחקור את ההשפעות התפקודיות של CAFs ו-NFs על תאי גידול, בדקנו וביצענו אופטימיזציה של מספר אסטרטגיות ניסוי. בהתחשב בכך ש-CAFs מפעילים את השפעתם הן באמצעות גורמים מופרשים והן באמצעות מגע ישיר בין תאלתא 24, פותחו שתי מערכות בדיקה משלימות: (1) טיפול בתאים סרטניים עם מדיום מותנה פיברובלסטים (CM), ו-(2) תרבית משותפת ישירה של פיברובלסטים ותאי גידול. בדיקות אלו מעריכות תכונות מפתח של תאי סרטן, כולל התפשטות, צמיחה בלתי תלויה בעיגון ונדידה. כדי לתקנן את ההשפעה של גורמים מופרשים, מדיה מותנית מ-CAFs ו-NFs רוכזו וכומתו (conCM) על סמך תכולת החלבון הכוללת.

הדגמת השפעות תפקודיות משמעותיות באמצעות בדיקות אלו יכולה לתמוך בזיהוי מתווכים קריטיים של גידול מונע CAF, ולהציע יעדים פוטנציאליים להתערבות טיפולית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה נערך תוך התאמה מלאה להנחיות המוסדיות לשימוש בדגימות קליניות, כפי שאושרו על ידי הוועדה הביו-אתית של בית החולים Città della Salute Molinette בטורינו, איטליה. כל הדגימות נלקחו לאחר חתימה על הסכמה מדעת של המטופלים המשתתפים. הסעיף הבא מספק פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב לבידוד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) ועמיתיהם הפיברובלסטים הרגילים (NF) התואמים. הפרוטוקול כולל דיסקציה של הגידול ואזורים לא גידוליים סמוכים, עיבוד רקמות, תרבית תאים ואפיון פנוטיפי ותפקודי של התאים המבודדים. יש לבצע את כל ההליכים בתנאים סטריליים בתוך ארון בטיחות ביולוגית מוסמך. התאים גודלו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 5% CO2 באמצעות מדיום הנשר המותאם (cDMEM) של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, אלא אם צוין אחרת. כל שלבי הצנטריפוגה מתבצעים כשהבלם מופעל. עיין בטבלת החומרים לרשימה מקיפה של ריאגנטים, חומרים וציוד המשמשים לאורך הפרוטוקול. מתודולוגיה זו עברה אופטימיזציה עבור דגימות סרטן הערמונית בסיכון גבוה, עם ציון גליסון של 4+3 ומעלה.

1. דיסקציה כירורגית של דגימה

הערה: הליך זה בוצע על דגימות כירורגיות שנאספו מהליכי כריתה רדיקלית של הערמונית25 שבוצעו בחולים עם סרטן ערמונית בדרגה גבוהה (PCa), ונוהל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, בהתבסס על הנחיות מוסדיות פנימיות וספרות בינלאומית מבוססת ושיטות עבודה מומלצות 26,27,28.

  1. הניחו את בלוטת הערמונית מתחת למכסה המנוע על וילון סטרילי, וכוונו אותה לפי ציוני דרך אנטומיים.
    הערה: הליך זה חייב להתבצע על ידי אורופתולוג מנוסה.
  2. בעזרת להב סטרילי, פרוסות רקמה מאזורים שזוהו בדוח הביופסיה לפני הניתוח כניאופלסטיים או נקיים מתאי גידול.
  3. בצע ניתוח קריוסטטי מהיר29 על שתי דגימות הרקמה, על ידי הכנת קטעי רקמה בעובי 2.5 מיקרומטר וצביעתם בהמטוקסילין ואאוזין (H&E) כדי לאמת נוכחות או היעדר תאי גידול באזורים שנבחרו, בהתאם לקריטריונים האבחנתיים לאדנוקרצינומה של הערמונית מהמהדורה האחרונה של סיווג30 של ארגון הבריאות העולמי (ראה איור 1A).
    הערה: אם מתעוררים אי התאמות, חזור על תהליך הדגימה עד לקבלת אישור היסטולוגי של אזורים ניאופלסטיים ולא ניאופלסטיים כאחד.
  4. הוציאו כ-10 מ"מ2 דגימות מהאזורים הניאופלסטיים והלא ניאופלסטיים, הניחו אותן בצינורות חרוטיים של 15 מ"ל המכילים 7 מ"ל של מאגר אחסון רקמות קר כקרח, ושמרו אותן על קרח להליכים הבאים.
    הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 48 שעות במאגר זה.

2. בידוד פיברובלסטים

הערה: יש לבצע את כל הליכי העיבוד הבאים על קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס אלא אם צוין אחרת. ראה איור 1 א לסכמה.

  1. יום 1: שקלו את דגימות הרקמה.
    הערה: 70-100 מ"ג מתקבלים בממוצע.
  2. עברו לכלים של 6 ס"מ ובצעו ארבע שטיפות עוקבות, פעמיים ב-4 מ"ל של PBS קר כקרח ופעמיים ב-4 מ"ל של cDMEM קר כקרח, שניהם בתוספת 200 U/mL פניצילין, 200 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (2x), באמצעות מלקחיים סטריליים להעברת הרקמה ממנה אחת לאחרת.
  3. לשבש את הרקמה באופן מכני על ידי הנחתה בצלחת של 6 ס"מ על קרח, עם 1 מ"ל של DMEM בתוספת 100 U/mL פניצילין-G ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, ואז לטחון אותה לשברים קטנים (<1 מ"מ2) באמצעות מספריים או להבים.
  4. מעבירים לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל cDMEM קר כקרח. צנטריפוגה ב-754 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  5. השתמש בפיפטה של 10 מ"ל כדי להסיר בזהירות את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של cDMEM קר כקרח. שוב צנטריפוגה ב-754 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. יש להסיר את הסופרנטנט כאמור לעיל ולהשעות מחדש את הגלולה בקולגנאז II (1 מ"ג/מ"ל ב-DMEM), תוך שימוש ב-1 מ"ל/100 מ"ג של רקמה. עברו למיקרו-צינור של 1.5 מ"ל.
    הערה: בשל השונות של אצוות קולגנאז, בדוק קבוצות שונות וודא שיש להן מספיק כדי לבצע את כל הבידודים הצפויים.
  7. מכסים את הצינורות בניילון פרפין ומעכלים דגימות O/N (8-12 שעות) ב-37 מעלות צלזיוס עם נדנדה מתמשכת.
    הערה: בצע את השלבים הבאים ביום השני.
  8. העבירו את הדגימות לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל והוסיפו 5 מ"ל של cDMEM קר כקרח לתרחיף התא כדי לנטרל קולגנאז, ואז צנטריפוגה ב-754 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: קולגנאז נפטר על ידי שאיבתו למיכל המכיל חומר ניקוי.
  9. שאפו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA. יש לדגור במשך 5 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, תוך ניעור מדי פעם.
  10. הוסף 1 מ"ל של DNase I לדגימות וערבב היטב. השתמש בתמיסה טרייה של 25 מ"ג/מ"ל שהוכנה ב-PBS.
    הערה: טיפול ב-DNase I בשלב זה מסייע בהשגת הפתרון החד-תאי.
  11. צנטריפוגה ב-754 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  12. השתמש בפיפטה של 10 מ"ל כדי לשאוב את הסופרנטנט, והשהה מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של cDMEM קר. צנטריפוגה ב-754 x גרם למשך 5 דקות 4 מעלות צלזיוס.
  13. השעיה מחדש של תאים ב-20% FBS cDMEM. צלחת ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-95% לחות למשך 3 ימים לפחות. הקפד לא להזיז/להטות את הצלחת. עבור 70-100 מ"ג רקמה, יש לחלק את תרחיף התאים בכלים בגודל 2X3.5 ס"מ, ב -2 מ"ל בינוני. צמצם בהתאם במידת הצורך.
    הערה: פחות מ-50 מ"ג של רקמה יגרום להפקת תאים לא יעילה. סכימת הפיצול וההקפאה מוצגת באיור 1B.
  14. לאחר 3 ימים, בדוק את התאים עבור מורפולוגיה/כדאיות והחלף 2/3 מהמדיום כדי לשמור על גורמי גדילה המיוצרים בתאים. ייקח בערך 7-10 ימים עד שהתאים יגיעו למפגש, ויחליפו את המדיום כל יומיים.
  15. לאחר התכנסות, העבירו את התאים לצלחת אחת של 10 ס"מ ב-20% FBS cDMEM.
  16. החלף את המדיום כל יומיים, השתמש במדיום FBS 15% פעמיים, ואז פעם אחת, 12.5%, ואז 10%. עבור ניתוחי FACS, מיצוי RNA וחלבון ומלאי הקפאה עוקבים אחר התוכנית באיור 1B.
  17. פיצול תאים כאשר כ-100% מתכנסים (כ-10 ימים). שוטפים 2-3 פעמים עם PBS בשפע למשך 5 דקות כל אחת. מוסיפים 1% טריפסין/EDTA (2x) ומכניסים לאינקובטור, בודקים אם יש ניתוק תאים כל כמה דקות.

3. תנאי תרבות

  1. מעבר התאים רק כאשר 100% מתלכדים, לא יותר מ-1:3.
  2. הקפיאו ציטוטים המתאימים ל -50% ממנה משולבת של 10 ס"מ ב -0.5 מ"ל של מדיום מקפיא קר כקרח (10% DMSO ב- FBS). מפשירים כל אליקוט בכלי של 10 ס"מ.
    הערה: זמן ההכפלה הממוצע הוא 80-90 שעות.

4. ניתוח FACS

הערה: פרוטוקול זה מבטיח אפיון אמין של אוכלוסיית הפיברובלסטים ומזהה זיהום פוטנציאלי מתאי אפיתל, אנדותל או חיסון. ניתוח FACS מבוצע בקטע 2, כפי שמוצג באיור 2A.

  1. קצור תאים והשהה אותם מחדש במאגר FACS (PBS בתוספת 2% FBS) בריכוז של 106 תאים/מ"ל.
  2. סמן צינורות ציטומטריית זרימה והוסף 1 x 105 תאים בנפח של 100 מיקרוליטר בכל אחד מהם. לצביעה עם 4 נוגדנים, הכינו 11 צינורות כדי לקחת בחשבון גם את הצביעה וגם את השער, כדלקמן (טבלה 1)
    הערה: שפופרת אחת, ללא נוגדנים (בקרה לא מוכתמת), להערכת אוטופלואורסצנטיות של תאים, שפופרת אחת עם בקרת איזוטיפ נוגדנים, להערכת קשירה ספציפית, 4 צינורות, כל אחת עם נוגדן יחיד, לפיצוי; חרוזי פיצוי יכולים להחליף תאים, 4 צינורות פלואורסצנטיים מינוס אחד (FMO) לשער, כל אחד משאיר אחד מהנוגדנים, צינור אחד עם כל 4 הנוגדנים (דגימה בפועל). נעשה שימוש בנוגדנים המסומנים פלואורסצנטיים הבאים (ראה טבלת חומרים): (1) Anti-EpCAM-PE (סמן תאי אפיתל), (2) Anti-CD31-VioBlue (סמן תאי אנדותל), (3) Anti-CD45-FITC (סמן תאי חיסון), (4) Anti-CD90-APC (סמן תאי פיברובלסטים). ניתן להשתמש בנוגדנים המצומדים לפלואורופורים אחרים, על פי מסנני ציטומטר זרימה זמינים. בצע את כל השלבים על קרח כדי לשמר את כדאיות התאים.
  3. דגירה של תאים עם חוסמי קולטנים גבישיים (FcR), כגון נוגדנים מטוהרים נגד CD16/CD32 או מאגר חוסם (PBS 1%-2% BSA). השתמש במגיב חוסם FcR של 1-5 מיקרוליטר לכל 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים, ודגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
  4. המשך ישירות עם הצביעה ללא כביסה. הוסף דילול נוגדנים מתאים או את בקרות האיזוטיפ המתאימות לצינורות, כמפורט בטבלה 1.
  5. מערבבים בעדינות ודוגרים בחום של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 30 דקות.
  6. שטפו עם 2 מ"ל של מאגר FACS.
  7. צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 300 x גרם, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  8. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מאגר FACS טרי.
  9. הוסף צבע חיוני (פרופידיום יודיד) בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
  10. רכוש את הדגימות על ציטומטר זרימה.
  11. השתמש בבקרות פיצוי מוכתמות בודדות כדי להגדיר את מטריצת הפיצוי. לניתוח נתונים, יישם את אסטרטגיית השער הבאה על תרשימי צפיפות FACS:
  12. שער פיזור קדימה וצדדית: תרשים FSC-A לעומת SSC-A ולעצב אזור סביב אוכלוסיית התאים העיקרית כדי לא לכלול פסולת תאית.
  13. להחרגה כפולה: תרשים FSC-A לעומת FSC-W (או FSC-H לעומת FSC-A) ולעצב אזור כך שלא יכלול גושי תאים, שיראו רוחב מוגדל ביחס לאזור (או שטח מוגדל ביחס לגובה). בחר את התאים הבודדים ובצע את אותו הליך, תוך התוויית SSC-A לעומת SSC-W (או SSC-H לעומת SSC-A) כדי להגביר את טוהר אוכלוסיית התא הבודד.
  14. שרטט את צבע הכדאיות (כלומר, פרופידיום יודיד) לעומת SSC-A ובחר תאים חיים שליליים.
  15. בתאים חיים, תרשים CD326 (ציר x) לעומת CD31 (ציר y); השתמש בדגימות ה-FMO המתאימות כדי להגדיר במדויק שערים. FMO מאפשר להסביר את התפשטות הקרינה לערוץ ספציפי הנגרמת על ידי הפלואורופורים האחרים.
    1. בהסתכלות על דגימת CD326 FMO, צייר שער רביע הכולל את כל התאים ברבעים השמאליים (כלומר, שלילי ל-CD326). חזור על אותו הליך באמצעות דגימת CD31 FMO כדי לכוונן את השער על מנת שכל תאי ה-FMO יהיו ברבעים התחתונים (כלומר, שליליים עבור CD31). השתמש ברביע זה כדי לנתח את הדגימות, ובחר תאים ברביע השמאלי התחתון (CD31- CD326-).
  16. חזור על אותו הליך המתווה CD326 (ציר x) לעומת CD45 (ציר y), תוך שימוש ב-CD326 FMO וב-CD45 FMO כדי להגדיר את שער הרביע. השתמש ברביע זה כדי לנתח את כל הדגימות ולבחור תאים ברביע השמאלי התחתון (CD45- CD326-).
  17. חלקה CD90 לעומת SSC-A והשתמש ב-CD90 FMO כדי להגדיר אזור שאינו כולל תאים שליליים וכולל רק CD90+. השתמש באזור זה כדי לנתח את כל הדגימות, ולמדוד את אחוז תאי CD90+ . תוצאות מייצגות מוצגות באיור 2A.

5. אלמורטליזציה של פיברובלסטים

הערה: אימורטליזציה של אוכלוסיות CAF ו-NF מושגת על ידי התמרה יציבה עם וקטור רטרו-ויראלי המבטא hTERT. להלן הפרוטוקולים להכנת חלקיקים פסאודו-ויראליים זיהומיים והתמרת תאים.

  1. ייצור חלקיקים רטרו-ויראלים
    1. יום 1, ציפוי פולי-L-ליזין וציפוי תאים: מצפים צלחת בגודל 10 ס"מ ב-6 מ"ל של תמיסת פולי-L-ליזין (0.1 מ"ג/מ"ל ב-H2O), דוגרים 5 דקות מתחת למכסה המנוע TC, שואבים ומניחים לכלי הפתוח להתייבש מתחת למכסה המנוע לפני ציפוי 3 x 106 HEK293T תאים.
    2. יום 2: הוסף 30 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה בתיווך ליפידים לקטיון 0.75 מ"ל מדיום מותאם לליפופקציה ללא אנטיביוטיקה.
    3. במקביל, הוסף 2 מיקרוגרם של וקטור אריזה רטרו-וירוס pCL-Ampho ו-2 מיקרוגרם של פלסמידים pBABE-puro-hTERT לעוד 0.75 מ"ל של מדיום מותאם לליפופקציה ללא אנטיביוטיקה.
    4. דגירה למשך 5 דקות ב-RT.
    5. מערבבים את שני הדילולים בצינור חרוטי של 15 מ"ל ודוגרים למשך 20 דקות ב-RT.
    6. בינתיים, החלף את המדיום HEK293T ב-6 מ"ל של מדיום מותאם לליפופקציה בתוספת 10% FBS.
    7. פזרו בעדינות את קומפלקסי ה-DNA על פני הכלי ודגרו במשך 6 שעות עד O/N בחממת CO2 לחה.
    8. יום 3: החלף את המדיום ב-7 מ"ל cDMEM ודגירה למשך 48 שעות.
      הערה: החל משלב זה, יש לבצע עבודה במתקן תרבית רקמות ברמה 3 (BSL3), בהתאם לכללים המוסדיים.
    9. ביום החמישי, אספו את המדיום המכיל את הנגיף וסננו דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר.
    10. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. התמרה ויראלית
    1. יום 1: צלחת פיברובלסטים במעבר נמוך במפגש של 60% ב-2 בארות של צלחת של 6 בארות.
    2. יום 2: החלף את המדיום ב-1 מ"ל של התכשיר הרטרו-ויראלי pBABE-puro-hTERT שיוצר בעבר המכיל 8 מיקרוגרם/מ"ל של פוליברן ודגירה למשך 12-16 שעות.
    3. יום 3: החלף את המדיום המכיל את הנגיף ב-2 מ"ל של cDMEM.
    4. יום 4: לאחר 24 שעות, התחל שני סבבים של 48 שעות של בחירת פורומיצין (2 מיקרוגרם/מ"ל).
      הערה: יש לקבוע את הריכוז באופן אמפירי עבור כל אצווה של אנטיביוטיקה וסוג תאים, ויש לבחור את הריכוז הנמוך ביותר כדי להרוג את כל התאים תוך 4 ימים מהבחירה.
    5. יום 8: בדקו שכל תאי הבקרה הלא נגועים מתו. החלף את המדיום ב-cDMEM ותן לתאים נגועים לגדול עד להתלכדות לפני שעוברים אותם 1:3. תן לתאים להגיע למפגש ולהתפצל שוב 1:3. בשלב זה, התאים יכולים לצאת ממתקן BLS3.
      הערה: הכינו מנות קפואות בהקדם האפשרי. כדי להבטיח התרחשות אימורטליזציה, עברו את התאים 5-6 פעמים ודרגו את שיעורי המורפולוגיה והשכפול שלהם, שלא אמורים להשתנות עם המעברים. להשוות פונקציונלית תאים אימורטליים לעמיתיהם העיקריים, באמצעות השיטות המתוארות להלן.

6. אפיון פיברובלסטים

  1. לנתח פנוטיפית את התאים המבודדים לביטוי סמני CAF/NF, ולאפיין פונקציונלית את פעילותם הפרו-אונקוגנית הפוטנציאלית על תאי הגידול.
    הערה: האוליגונוקלאוטידים והנוגדנים qPCR המותאמים להערכת רמות ביטוי הסמנים הן ברמות RNA והן ברמות החלבון מדווחים בטבלה 2 ובטבלת החומרים, בהתאמה. היזהר כי נוגדנים נגד חלבון הפעלת פיברובלסטים (FAP) הם לרוב לא ספציפיים. הקפד לכלול בקרות חיוביות ושליליות מתאימות31,32. ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי להעריך את הדיבור בין פיברובלסטים לתאי גידול. כאן, מתוארות שתי גישות חלופיות, המורכבות מטיפול בתאי גידול עם מדיום מותנה (CM) שמקורו ב-CAFs או NFs, או תרבית משותפת של פיברובלסטים ותאי גידול. מתוארת היעילות של כל אחת מהגישות להגברת התפשטות תאי הגידול.

7. הכנה וריכוז של מדיום מותנה

הערה: המדיום המותנה מרוכז ומינון מדויק לאחר האיסוף כדי להקל על ההשוואה בין תאים שונים.

  1. צלחת את התאים במפגש של 70% בצלחת של 15 ס"מ ב-cDMEM.
  2. למחרת, עברו ל-15 מ"ל של מדיום רעב (DMEM ללא FBS) ודגרו במשך 48 שעות כדי לייצר את ה-CM.
  3. אסוף את ה-CM, צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-RT, וסנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי לחסל פסולת תאים ולעקר.
  4. מעבירים לצינורות ריכוז (MWCO 10,000 Da), ולצנטריפוגה 20 דקות ב-2000 x g ו-4 °C, או לפי הוראות היצרן, כדי לקבל כ-1 מ"ל של ה-CM המרוכז (conCM), כלומר ריכוז פי 15.
  5. בחר את ה-conCM ואחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
  6. כמת את תכולת החלבון של ה-conCM שנאסף באמצעות בדיקת חלבון קולורימטרי.
    הערה: הריכוז הממוצע המתקבל הוא 0.5 ו-2 מיקרוגרם/מיקרוליטר. עדיין ניתן להשתמש בריכוזים נמוכים יותר.

8. בדיקת התפשטות

הערה: התפשטות תאים (באמצעות קווי תאי PCa אנושיים DU145 או LNCaP) הוערכה באמצעות מכשיר ניתוח תאים חיים בשתי הגדרות שונות, או טיפול בתאי הגידול עם conCM, או טיפוח משותף שלהם עם CAFs או NFs. במקרה זה, יש להשתמש בתאי גידול פלואורסצנטיים. תוצאות מייצגות מוצגות באיור 3.

  1. בדיקת התפשטות בעת טיפול ב-conCM
    הערה: פרוטוקול זה ממוטב עבור תאי DU145; תאים שונים עשויים לדרוש התאמות.
    1. תאי גידול צלחת ב-cDMEM בצלחת של 96 בארות (750 תאים/באר), בהתחשב בלפחות 3 שכפולים לכל מצב, ודגירה O/N.
    2. החלף את cDMEM במדיום רעב, בתוספת או לא, ב-50 מיקרוגרם/מ"ל של conCM.
    3. העבר את הצלחת לתא המכשיר לניתוח תאים חיים בתוך החממה.
    4. מניחים להתחמם ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז מתחילים את הסריקה הראשונה.
    5. השתמש בערוץ ניגודיות הפאזה, בחר מטרה מתאימה ומספר שדות/באר רצויים (מומלץ 10x מטרה ו-5 שדות/באר), וסוג סריקה סטנדרטי. סרוק כל 6 שעות למשך 4-5 ימים (יש לקבוע אמפירית משך זמן לתנאים וסוגי תאים).
    6. בצע את הניתוח בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
    7. חשב עבור כל באר (שכפולים טכניים עבור כל תנאי) את שינוי הקיפול ביחס לערכו בזמן אפס. צור את הגרפים המתאימים והעריך מובהקות סטטיסטית באמצעות תוכנה מתאימה.
  2. בדיקת התפשטות בעת תרבית משותפת
    1. צלחת משותפת 750 תאי DU145 ו-CAFs או NFs המבטאים RFP ביחס של 1:3 ב-cDMEM בצלחת של 96 בארות.
    2. למחרת, עבור ל-2% FBS DMEM. העבירו את הצלחת לתא המכשיר לניתוח תאים חיים בחממה והתחילו בסריקה סטנדרטית כל 6 שעות למשך 4 ימים, תוך שימוש הן בניגודיות הפאזה והן בערוץ הכתום.
    3. בצע ניתוח התפשטות בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
    4. חשב עבור כל באר (שכפולים טכניים עבור כל תנאי) את שינוי הקיפול ביחס לערכו בזמן אפס. צור את הגרפים המתאימים והעריך מובהקות סטטיסטית באמצעות תוכנה מתאימה.

9. בדיקת נדידת ריפוי פצעים

הערה: כאן, מוצגת גרסה אוטומטית של בדיקת השריטה הקלאסית33 למדידת נדידת תאים, באמצעות מכשיר ניתוח תאים חיים.

  1. תאי גידול צלחת בצלחת של 96 בארות המתאימה למכשיר ניתוח התאים החיים להשגת שכבה חד-שכבתית קונפלונטית.
  2. למחרת, טפל בתאים עם 10 ug/mL של מיטומיצין C למשך שעתיים.
    הערה: שלב זה חיוני כדי למנוע התפשטות תאים במהלך הבדיקה, מה שיבלבל את התוצאות.
  3. יש למרוח את השריטה על הבארות בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
  4. שטפו עם 100 מיקרוליטר PBS כדי להסיר תאים מנותקים.
  5. הוסף מדיום רעב, עם 50 מ"ג/מ"ל או בלי (בקרה).
  6. הנח את הצלחת בתא ניתוח התאים החיים בחממה.
  7. לאחר 30 דקות, תכנת את פרוטוקול הסריקה המומלץ לריפוי פצעים, כל 4 שעות למשך יום אחד או יותר, בהתאם לתאים ולמצבים.
  8. נתח את התוצאות בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).

10. צמיחה בלתי תלויה בעיגון על ידי בדיקת אגר רכה

  1. CAFs או NFs במפגש של 70% בלוחות של 12 בארות, ומשאירים שלוש בארות ריקות כבקרה.
  2. למחרת, הכינו תמיסת מלאי אגר רכה פי 4 (3.6%) על ידי הוספת 0.45 גרם אגר נמס נמוך ל-12.5 מ"ל PBS בצינור חרוטי של 50 מ"ל בתנאים סטריליים.
  3. ממיסים במיקרוגל. היזהרו מרתיחה מוגזמת שתגרום לתמיסה להתרכז.
  4. מצננים ב-37 מעלות צלזיוס, ואז מכינים תמיסת עבודה 1x על ידי דילול 1:4 עם cDMEM מחומם מראש.
  5. שאפו את המדיום מצלחת 12 הבארות והוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת אגר 1x לכל באר.
  6. תן לו להתמצק במשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, תוך אחסון שאר תמיסת האגר ב-37 מעלות צלזיוס.
  7. בינתיים, נסה את תאי הגידול והכין תרחיף תאים של 2 x 104 תאים / מ"ל.
  8. מערבבים נפחים שווים של תרחיף התא ותמיסת האגר 1x על ידי פיפטינג מספר פעמים, ומוציאים 500 מיקרוליטר (כלומר, 5000 תאים) על גבי שכבת האגר הראשונה בכל באר. הקפד להכין לפחות 10% עודף של תרחיף תאים.
  9. תנו לאגר להתמצק על ידי דגירה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  10. הוסף 1 מ"ל cDMEM לכל באר וחדש אותו כל יומיים על ידי שאיבת המדיום בעדינות מקצה הבאר והוספת המדיום הטרי למרכז, כמעט טיפתי כדי למנוע עקירת שכבת האגר הרכה.
  11. דגירה עד להופעת מושבות גלויות בקלות. תאי DU145 נמשכים בדרך כלל כ-12 יום, עם שינויים קלים.
  12. השליכו את המדיום והכתים את המושבות על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של תמיסת טטרזוליום כלוריד ניטרובלו (1 מ"ג/מ"ל ב-PBS). דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח.
  13. לאחר שהמושבות מוכתמות, השליכו את תמיסת הצבע ורכשו תמונות באמצעות סטריאומיקרוסקופ. הנח את הצלחת על המיקרוסקופ stage והגדר את ההגדלה לערך הנמוך ביותר שלה (0.8x) כדי להבטיח שהבאר כולה נראית לעין. השתמש בכפתור המיקוד הגס כדי להביא את המושבות למיקוד חד, ולאחר מכן התאם את הגדרות התאורה והמצב לפני צילום התמונות.
  14. השתמש בתוכנה מתאימה34 כדי לכמת את מספר המושבה והשטח התפוס על ידי ביצוע השלבים המפורטים בקובץ משלים 1.
  15. ציון מספר והתפלגות הגודל של המושבות (ראה איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

זוגות CAF ו-NF מ-7 חולי PCa בדרגה גבוהה בודדו בהצלחה עם פרוטוקול זה. גיל המטופלים בעת הניתוח וציוני גליסון מסוכמים בטבלה 3. כדי להעריך את הטוהר של אוכלוסיות הפיברובלסטים הנגזרות, מעבר שני CAFs ו-NFs ראשוניים נותקו ונצבעו בנוגדנים הפלואורסצנטיים שצוינו או בפרופידיום יודיד כדי להעריך אפופטוזיס. תוצאות מייצגות מניתוח ה-FACS העוקב מוצגות באיור 2A, המדגישות את אסטרטגיית השער ואת אחוזי התאים החיוביים עבור כל סמן. הניתוח כלל סמנים לתאי אפיתל (EpCAM...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הגזירה והניתוח של תאים מרקמת PCa מספקים מודל ניסיוני רלוונטי, במיוחד בהתחשב בכך שמודלים זמינים של בעלי חיים אינם משכפלים באופן מלא את האנטומיה של הערמונית האנושית ואת התקדמות המחלה37. בלוטות הערמונית של השימפנזים דומות מבחינה אנטומית לבני אדם, אך מראות התקדמות איטית של המחלה, בנוסף למגבלות אתיות. כלבים נבדלים באופן משמעותי במבנה הערמונית ובפתוביולוגיה ומפתחים מחלת ערמונית ספורדית הקשורה לגיל. מודלים מעבדתיים נפוצים כמו חולדות ועכברים נבדלים זה מזה באנטומיה של הערמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי האגודה האיטלקית לחקר הסרטן (AIRC), IG16930 ו-IG24851 ל-V.P; משרד האוניברסיטה והמחקר האיטלקי (MIUR PRIN 2017 ו-2022 לסמנכ"ל); קרן טראוס וגריט ואן רימסדייק, ליכטנשטיין, תרומה לסגן נשיא; אזור פיימונטה (סטייה). A.S נתמכה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של הקרן האיטלקית לחקר הסרטן (FIRC), ולוס אנג'לס נתמכה על ידי Fondazione Umberto Veronesi. איור 2 נוצר עם BioRender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 12 בארסרשטדט833921
צלחת 24 בארסרשטדט833922
צלחת 6 בארסרשטדט833920
צלחת 96 בארסרשטדט833924
עכבר mAb נגד GAPDH (6C5)סיגמא אולדריץ'CB1001מקור: עכבר; דילול ל-WB: 1:1000
א.ס.מ.אסיגמא אולדריץ'A5228 מקור: עכבר; דילול ל-WB: 1:3000
קבאוליןטכנולוגיית איתות תאיםCST3267מקור: ארנב; דילול ל-WB: 1:1000
CD31-VioBlueמילטני ביוטק130-119-980Flow Cytometry Ab, סמן תאי אנדותל
CD326-PE (EpCAM)מילטני ביוטק130113-826Flow Cytometry Ab, סמן תאי אפיתל
CD45-FITCמילטני ביוטק130-110769Flow Cytometry Ab, סמן פאן לויקוציטים
CD90-APCמילטני ביוטק130-114-903זרימה ציטומטריה Ab, סמן פיברובלסטים
קולגן VI (COL6A1)אבקםab182744מקור: ארנב; דילול ל-WB: 1:1000
צינור חרוטי 15 מ"לסרשטדט62554502
צינור חרוטי 50 מ"לסרשטדט62547254
מיקרו-צינורות Cryopure 2 מ"לסרשטדט72380992
צלחת תרבית בקוטר 100 מ"מ קורנינג353003
צלחת תרבית בקוטר 100 מ"מ קורנינג353025
צלחת תרבית בקוטר 60 מ"מ קורנינג353002
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא אלדירץ'D8418שימוש במכסה מנוע ביולוגי
דולבקו s Modified Eagle' s בינוני (DMEM)ג'יבקו11965092יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
FAPאבקםאילן אלכסנדרמקור: ארנב; דילול ל-WB: 1:500
מגיב חוסם FCR, אנושימילטני ביוטק130-059-901חוסם Fc
סרום בקר עוברי (FBS)ג'יבקו16000044יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
טיפים מסוננים 10 ומיקרו; Lסרשטדט703010255
טיפים מסוננים 100 ומיקרו; Lסרשטדט703030255
טיפים מסוננים 1000 ומיקרו; Lסרשטדט703060255
טיפים מסוננים 20 ומיקרו; Lסרשטדט703030265
טיפים מסוננים 200 ומיקרו; Lסרשטדט703031255
פילטרופור S פלוס 0,20 ומיקרו; מ סרשטדט831826102
מלקחיים2ביול1102412
FSP1/S100A4טכנולוגיית איתות תאיםD9F9D (13018)מקור: ארנב; דילול ל-WB: 1:2000
IL6טכנולוגיה אבקלונליתא 0286מקור: ארנב; דילול ל-WB: 1:1000
תמונהJהמכון הלאומי לבריאותגירסה 1.53cתוכנה לניתוח תמונות
צלחת Incucyte imageLock 96 בארותסארטוריוסBA-04857
Incucyte® SX5סארטוריוסSX5מכשיר לניתוח תאים חיים 
ליפופקטמין 2000 מגיב טרנספקציהתרמו-פישר סיינטיפיק11668019מגיב טרנספקציה בתיווך ליפידים קטיון
MACS® פתרון אחסון רקמותמילטני ביוטק130-100-008
קורא מיקרו-פלטות (ספיגה של 600 ננומטר)פרומגהג'י.אם.3500
מיקרו-צינורות 1.5 מ"ל סרשטדט7269001
Ncadאבקםאילן אלכסנדרמקור: ארנב; דילול ל-WB: 1:1000
ניטרו כחול טטרזוליום סיגמא אלדירץ'n5514
פרפילם סיגמא אלדירץ'HS234526B
pBABE-puro-hTERTאדג'ן1771יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
pCL-אמפונובוס ביולוגי NBP2-29541יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
PDGFRBסנטה קרוזSC-432מקור: ארנב; דילול ל-WB: 1:1000
פניצילין-סטרפטומיצין (PS, 10,000 μ גרם/מ"ל) ג'יבקו15140122יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה אולימפוס BX42
מי מלח חומציים פוספט  (PBS)תוצרת ביתNaCl, 137 מ"מ; KCl, 2.7 מ"מ; Na2HPO4, 10 מ"מ;KH2PO4, 1.8 מ"מ. אוטוקלאב ואחסון ב-RT
תמיסת פולי-L-ליזיןסיגמא אלדירץ'עמ' 8920יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע ביולוגי
פורומיצין דיהידרוכלורידסיגמא אלדירץ'עמ' 8833
Secura חצי מיקרו איזוןסרטוריוסSECURA125-1S
פיפטה סרולוגית 10 מ"ל סרשטדט861254001
פיפטה סרולוגית 2 מ"ל סרשטדט861252001
פיפטה סרולוגית 25 מ"ל סרשטדט861256001
פיפטה סרולוגית 5 מ"ל סרשטדט861253001
סטטיסטיקה3CST9139מקור: עכבר; דילול ל-WB: 1:1000
סטטיסטיקה 3 Y705CST9131מקור: ארנב; דילול ל-WB: 1:1000
סטריאומיקרוסקופלייקהMZ125
מזרק 10 מ"לפנטפרטהברקוד 00202260D12
טרמומיקסראפנדורף22331
טריפסין-EDTA (0.5%), ללא פנול אדוםג'יבקו15400054
אנונימיסנטה קרוזSC-6260מקור: עכבר; דילול ל-WB: 1:2000
רכז צנטריפוגלי Vivaspin 20 סיגמא אלדירץ'Z614602MWCO 10,000 Da 
ואגנר מספריים2ביול14070-12

מקורות

  1. Bray, F. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (6), 229-263 (2024).
  2. Yadav, S. S., Stockert, J. A., Hackert, V., Yadav, K. K., Tewari, A. K. Intratumor heterogeneity in prostate cancer. Urol Oncol. 36 (8), 349-360 (2018).
  3. Owen, J. S., Clayton, A., Pearson, H. B. Cancer-associated fibroblast heterogeneity, activation and function: Implications for prostate cancer. Biomolecules. 13 (1), 67(2023).
  4. Ge, R., Wang, Z., Cheng, L. Tumor microenvironment heterogeneity an important mediator of prostate cancer progression and therapeutic resistance. NPJ Precis Oncol. 6, 1-8 (2022).
  5. Pejčić, T., Todorović, Z., Đurašević, S., Popović, L. Mechanisms of prostate cancer cells survival and their therapeutic targeting. Int J Mol Sci. 24 (3), 2939(2023).
  6. Shoag, J., Barbieri, C. Clinical variability and molecular heterogeneity in prostate cancer. Asian J Androl. 18 (4), 543-548 (2016).
  7. Segura-Moreno, Y. Y., Sanabria-Salas, M. C., Varela, R., Mesa, J. A., Serrano, M. L. Decoding the heterogeneous landscape in the development of prostate cancer. Oncol Lett. 21 (5), 376(2021).
  8. Hägglöf, C., Bergh, A. The stroma-a key regulator in prostate function and malignancy. Cancers (Basel. 4 (2), 531-548 (2012).
  9. Teng, L. K. H., et al. Mast cell-derived SAMD14 is a novel regulator of the human prostate tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13 (6), 1-25 (2021).
  10. Galbo, P. M., Zang, X., Zheng, D. Molecular features of cancer-associated fibroblast subtypes and their implication on cancer pathogenesis, prognosis, and immunotherapy resistance. Clin Cancer Res. 27 (9), 2636-2647 (2021).
  11. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 1-30 (2021).
  12. Pederzoli, F., et al. Stromal cells in prostate cancer pathobiology: Friends or foes. Br J Cancer. 128 (6), 930-939 (2022).
  13. Sasaki, T., Franco, O. E., Hayward, S. W. Interaction of prostate carcinoma-associated fibroblasts with human epithelial cell lines in vivo. Differentiation. 96, 40-48 (2017).
  14. Cirri, P., Chiarugi, P. Cancer-associated fibroblasts, and tumor cells: A diabolic liaison driving cancer progression. Cancer Metastasis Rev. 31 (1-2), 195-208 (2012).
  15. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: A dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
  16. Kahounová, Z. The fibroblast surface markers FAP, anti-fibroblast, and FSP are expressed by cells of epithelial origin and may be altered during epithelial-to-mesenchymal transition. Cytometry A. 93 (9), 941-951 (2018).
  17. Giannoni, E., et al. Reciprocal activation of prostate cancer cells and cancer-associated fibroblasts stimulates epithelial-mesenchymal transition and cancer stemness. Cancer Res. 70 (17), 6945-6956 (2010).
  18. Paland, N., et al. Differential influence of normal and cancer-associated fibroblasts on the growth of human epithelial cells in an in vitro cocultivation model of prostate cancer. Mol Cancer Res. 7 (8), 1212-1235 (2009).
  19. Jaeschke, A., et al. Cancer-associated fibroblasts of the prostate promote a compliant and more invasive phenotype in benign prostate epithelial cells. Mater Today Bio. 8, 100073(2020).
  20. Ellem, S. J., et al. A pro-tumourigenic loop at the human prostate tumor interface orchestrated by oestrogen, CXCL12 and mast cell recruitment. J Pathol. 234 (1), 86-98 (2014).
  21. Lawrence, M. G., et al. Alterations in the methylome of the stromal tumor microenvironment signal the presence and severity of prostate cancer. Clin Epigenetics. 12 (1), 48(2020).
  22. Nguyen, E. V. Proteomic profiling of human prostate cancer-associated fibroblasts (CAF) reveals LOXL2-dependent regulation of the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 18 (7), 1410-1427 (2019).
  23. Smith, M. C., Goddard, E. T., Perusina Lanfranca, M., Davido, D. J. hTERT extends the life of human fibroblasts without compromising type I interferon signaling. PLoS One. 8 (3), e58233(2013).
  24. Kay, E. J., et al. Cancer-associated fibroblasts require proline synthesis by PYCR1 for the deposition of pro-tumorigenic extracellular matrix. Nat Metab. 4 (6), 693-710 (2022).
  25. Huynh, L. M., Ahlering, T. E. Robot-assisted radical prostatectomy: A step-by-step guide. J Endourol. 32, S28-S32 (2018).
  26. Srigley, J. R., et al. Protocol for the examination of specimens from patients with carcinoma of the prostate gland with guidance from the CAP Cancer and CAP Pathology Electronic Reporting Committees. , https://documents.cap.org/protocols/cp-prostate-2017-v4020.pdf (2017).
  27. Goldblum, J. R., Lamps, L. W., McKenney, J. K. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology E-Book. , https://books.google.it/books/about/Rosai_and_Ackerman_s_Surgical_Pathology.html?id=7ZEDwAAQBAJ (2024).
  28. Montironi, R., Beltran, A. L., Mazzucchelli, R., Cheng, L., Scarpelli, M. Handling of radical prostatectomy specimens: Total embedding with large-format histology. Int J Breast. 2012, (2012).
  29. Arcega, R. S., Woo, J. S., Xu, H. Performing and cutting frozen sections. Methods Mol Biol. 1897, 279-288 (2019).
  30. IARC. WHO Classification of Tumors, 5th edition, volume 8: Urinary and male genital tumors. , https://www.iarc.who.int/news-events/who-classification-of-tumours-5th-edition-volume-8-urinary-and-male-genital-tumours/ (2025).
  31. Sfanos, K. S., et al. If this is true, what does it imply? How end-user antibody validation facilitates insights into biology and disease. Asian J Urol. 6 (1), 10-25 (2019).
  32. Brennen, W. N., et al. Overcoming stromal barriers to immuno-oncological responses via fibroblast activation protein-targeted therapy. Immunotherapy. 13 (2), 155-175 (2021).
  33. Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration. J Vis Exp. (133), e58838(2019).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  35. Sauzay, C., Voutetakis, K., Chatziioannou, A. A., Chevet, E., Avril, T. CD90/Thy-1, a cancer-associated cell surface signaling molecule. Front Cell Dev Biol. 7, 444743(2019).
  36. True, L. D., et al. CD90/THY1 is over-expressed in prostate cancer-associated fibroblasts and could serve as a cancer biomarker. Mod Pathol. 23 (10), 1346(2010).
  37. Strand, D. W., Aaron, L. T., Henry, G., Franco, O. E., Hayward, S. W. Isolation and analysis of discreet human prostate cellular populations. Differentiation. 91 (4-5), 139(2015).
  38. Krönig, M., et al. Cell type-specific gene expression analysis of prostate needle biopsies resolves tumor tissue heterogeneity. Oncotarget. 6 (2), 1302-1314 (2014).
  39. Goldstein, A. S., et al. Purification and direct transformation of epithelial progenitor cells from primary human prostate. Nat Protoc. 6 (5), 656-667 (2011).
  40. Kassen, A., et al. Stromal cells of the human prostate: Initial isolation and characterization. Prostate. 28 (2), 89-97 (1996).
  41. Linxweiler, J., et al. Cancer-associated fibroblasts stimulate primary tumor growth and metastatic spread in an orthotopic prostate cancer xenograft model. Sci Rep. 10 (1), 12575(2020).
  42. Liu, A. Y., et al. Cell-cell interaction in prostate gene regulation and cytodifferentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10705-10710 (1997).
  43. Olumi, A., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Res. 59 (19), 5002(1999).
  44. Luthold, C., Hallal, T., Labbé, D. P., Bordeleau, F. The extracellular matrix stiffening: A trigger of prostate cancer progression and castration resistance. Cancers (Basel). 14 (12), 2887(2022).
  45. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  46. Yun, Y. R., et al. Fibroblast growth factors: Biology, function, and application for tissue regeneration. J Tissue Eng. 1 (1), 1-18 (2010).
  47. Baranyi, U., et al. Primary human fibroblasts in culture switch to a myofibroblast-like phenotype independently of TGF beta. Cells. 8 (7), 721(2019).
  48. Ortiz-Otero, N., et al. Cancer-associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים