בידוד, תרבית ואפיון של פיברובלסטים הקשורים לסרטן הערמונית

סרטן הערמונית (PCa) הוא הסרטן השכיח ביותר המאובחן בקרב גברים בכמעט שני שליש מהמדינות ברחבי העולם. בשנת 2022 דווח על כ-1.5 מיליון מקרים חדשים, וכתוצאה מכך 3,97,000 מקרי מוות ברחבי העולם. נתונים אלה הופכים את PCa לסרטן השני בשכיחותו ולגורם החמישי המוביל לתמותה הקשורה לסרטן בקרב גברים¹.

PCa היא מחלה מולטיפוקלית ומורכבת ביולוגית, המאופיינת בהטרוגניות בין-גידולית משמעותית ^2,3,4, תת-סוגים מולקולריים מגוונים ותוצאות קליניות משתנות ^5,6, כל אלה משפיעים באופן משמעותי על הפרוגנוזה והתגובה הטיפולית⁷.

בעוד שהתפקיד הקריטי של מיקרו-סביבת הגידול (TME) בהתחלה והתקדמות של גידול הערמונית מבוסס היטב ^8,9, האינטראקציות המולקולריות בין תאי הגידול לתא הסטרומה שמסביב נותרו לא מובנות לחלוטין. בעוד שידוע היטב כי המיקרו-סביבה של גידול הערמונית (TME) ממלאת תפקיד קריטי בהתחלת הגידול והתקדמותו, האינטראקציות המולקולריות בין תאי הגידול לסטרומה שמסביב נותרות לא מוגדרות מספיק. ה-TME מורכב ממגוון תאי סטרומל, כולל אלה ממקור מזנכימלי וחיסוני, המופעלים בתגובה לאותות שמקורם בגידול ובהמשך רוכשים פונקציות מקדמות גידול^10,11. בין אלה, פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) מייצגים לעתים קרובות את אוכלוסיית הסטרומה הנפוצה ביותר. CAFs תורמים לעיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית (ECM), מקדמים צמיחת גידול ומקלים על פלישת תאים סרטניים ונדידה 4,11,12,13. באמצעות גורמים מופרשים ואינטראקציות ישירות בין תאים, CAFs משפיעים גם על התפשטות, פלישה ועמידות לטיפול. יש לציין כי CAFs הם אוכלוסייה הטרוגנית. בעוד שבדרך כלל קשורים לפונקציות פרו-גידוליות, תת-סוגים מסוימים עשויים למלא תפקידים מדכאי גידול^14,15. חשוב לציין, היעדר סמנים ייחודיים ל-CAFs מציב אתגרים לזיהויים המדויק ולניתוח התפקודי של תפקידיהם המגוונים^12,16.

גישה חזקה לחקירת הדיבור התפקודי בין CAFs לתאי גידול כוללת בידוד CAFs ראשוניים ופיברובלסטים נורמליים תואמים (NFs), ולאחר מכן הערכת השפעתם על התנהגויות תאי הגידול כגון התפשטות, נדידה, היווצרות מושבה וצמיחה בלתי תלויה בעיגון 17,18,19 . מאמר זה מתאר פרוטוקול מעודן וניתן לשחזור מאוד לבידוד CAFs ו-NFs מדגימות כריתה רדיקלית של הערמונית של חולי PCa בסיכון גבוה. מרכיב קריטי בפרוטוקול זה הוא זיהוי ונתיחה מדויקים של גידול ואזורים נטולי גידול על ידי אורופתולוג מומחה, המאפשר גזירת CAFs ו-NFs מאותו מטופל. גישה זו של דגימה זוגית מסייעת לשלוט בהטרוגניות בין-גידולית ובמשתנים ספציפיים לחולה בודד שיכולים להשפיע על פנוטיפים פיברובלסטים 20,21,22. כדי להבטיח מספיק רקמת גידול זמינה, אנו מתמקדים בדגימות ממטופלים עם ציון גליסון ≥7.

אפיון פנוטיפי אמין של הפיברובלסטים המבודדים דורש שימוש בסמנים מרובים כדי להבדיל אותם מסוגי תאים אחרים, במיוחד תאי אפיתל, שעשויים לחלוק ביטוי סמן חופף¹⁶. מכיוון שפיברובלסטים ראשוניים של PCa עוברים בדרך כלל הזדקנות לאחר 10-15 מעברים, מה שמסבך ניתוחים ארוכי טווח, אנו מציגים גם פרוטוקול לאימורטליזציה של תאים באמצעות ביטוי יציב של הטלומראז האנושי (hTERT)²³.

כדי לחקור את ההשפעות התפקודיות של CAFs ו-NFs על תאי גידול, בדקנו וביצענו אופטימיזציה של מספר אסטרטגיות ניסוי. בהתחשב בכך ש-CAFs מפעילים את השפעתם הן באמצעות גורמים מופרשים והן באמצעות מגע ישיר בין תא^{לתא 24}, פותחו שתי מערכות בדיקה משלימות: (1) טיפול בתאים סרטניים עם מדיום מותנה פיברובלסטים (CM), ו-(2) תרבית משותפת ישירה של פיברובלסטים ותאי גידול. בדיקות אלו מעריכות תכונות מפתח של תאי סרטן, כולל התפשטות, צמיחה בלתי תלויה בעיגון ונדידה. כדי לתקנן את ההשפעה של גורמים מופרשים, מדיה מותנית מ-CAFs ו-NFs רוכזו וכומתו (conCM) על סמך תכולת החלבון הכוללת.

הדגמת השפעות תפקודיות משמעותיות באמצעות בדיקות אלו יכולה לתמוך בזיהוי מתווכים קריטיים של גידול מונע CAF, ולהציע יעדים פוטנציאליים להתערבות טיפולית.

מחקר זה נערך תוך התאמה מלאה להנחיות המוסדיות לשימוש בדגימות קליניות, כפי שאושרו על ידי הוועדה הביו-אתית של בית החולים Città della Salute Molinette בטורינו, איטליה. כל הדגימות נלקחו לאחר חתימה על הסכמה מדעת של המטופלים המשתתפים. הסעיף הבא מספק פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב לבידוד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) ועמיתיהם הפיברובלסטים הרגילים (NF) התואמים. הפרוטוקול כולל דיסקציה של הגידול ואזורים לא גידוליים סמוכים, עיבוד רקמות, תרבית תאים ואפיון פנוטיפי ותפקודי של התאים המבודדים. יש לבצע את כל ההליכים בתנאים סטריליים בתוך ארון בטיחות ביולוגית מוסמך. התאים גודלו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 5% CO₂ באמצעות מדיום הנשר המותאם (cDMEM) של Dulbecco, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 U/mL פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, אלא אם צוין אחרת. כל שלבי הצנטריפוגה מתבצעים כשהבלם מופעל. עיין בטבלת החומרים לרשימה מקיפה של ריאגנטים, חומרים וציוד המשמשים לאורך הפרוטוקול. מתודולוגיה זו עברה אופטימיזציה עבור דגימות סרטן הערמונית בסיכון גבוה, עם ציון גליסון של 4+3 ומעלה.

1. דיסקציה כירורגית של דגימה

הערה: הליך זה בוצע על דגימות כירורגיות שנאספו מהליכי כריתה רדיקלית של הערמונית²⁵ שבוצעו בחולים עם סרטן ערמונית בדרגה גבוהה (PCa), ונוהל על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, בהתבסס על הנחיות מוסדיות פנימיות וספרות בינלאומית מבוססת ושיטות עבודה מומלצות 26,27,28.

1. הניחו את בלוטת הערמונית מתחת למכסה המנוע על וילון סטרילי, וכוונו אותה לפי ציוני דרך אנטומיים.
   הערה: הליך זה חייב להתבצע על ידי אורופתולוג מנוסה.
2. בעזרת להב סטרילי, פרוסות רקמה מאזורים שזוהו בדוח הביופסיה לפני הניתוח כניאופלסטיים או נקיים מתאי גידול.
3. בצע ניתוח קריוסטטי מהיר²⁹ על שתי דגימות הרקמה, על ידי הכנת קטעי רקמה בעובי 2.5 מיקרומטר וצביעתם בהמטוקסילין ואאוזין (H&E) כדי לאמת נוכחות או היעדר תאי גידול באזורים שנבחרו, בהתאם לקריטריונים האבחנתיים לאדנוקרצינומה של הערמונית מהמהדורה האחרונה של סיווג³⁰ של ארגון הבריאות העולמי (ראה איור 1A).
   הערה: אם מתעוררים אי התאמות, חזור על תהליך הדגימה עד לקבלת אישור היסטולוגי של אזורים ניאופלסטיים ולא ניאופלסטיים כאחד.
4. הוציאו כ-10 מ"מ² דגימות מהאזורים הניאופלסטיים והלא ניאופלסטיים, הניחו אותן בצינורות חרוטיים של 15 מ"ל המכילים 7 מ"ל של מאגר אחסון רקמות קר כקרח, ושמרו אותן על קרח להליכים הבאים.
   הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 48 שעות במאגר זה.

2. בידוד פיברובלסטים

הערה: יש לבצע את כל הליכי העיבוד הבאים על קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס אלא אם צוין אחרת. ראה איור 1 א לסכמה.

1. יום 1: שקלו את דגימות הרקמה.
   הערה: 70-100 מ"ג מתקבלים בממוצע.
2. עברו לכלים של 6 ס"מ ובצעו ארבע שטיפות עוקבות, פעמיים ב-4 מ"ל של PBS קר כקרח ופעמיים ב-4 מ"ל של cDMEM קר כקרח, שניהם בתוספת 200 U/mL פניצילין, 200 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (2x), באמצעות מלקחיים סטריליים להעברת הרקמה ממנה אחת לאחרת.
3. לשבש את הרקמה באופן מכני על ידי הנחתה בצלחת של 6 ס"מ על קרח, עם 1 מ"ל של DMEM בתוספת 100 U/mL פניצילין-G ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, ואז לטחון אותה לשברים קטנים (<1 מ"מ²) באמצעות מספריים או להבים.
4. מעבירים לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל cDMEM קר כקרח. צנטריפוגה ב-754 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
5. השתמש בפיפטה של 10 מ"ל כדי להסיר בזהירות את הסופרנטנט ולהשעות מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של cDMEM קר כקרח. שוב צנטריפוגה ב-754 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
6. יש להסיר את הסופרנטנט כאמור לעיל ולהשעות מחדש את הגלולה בקולגנאז II (1 מ"ג/מ"ל ב-DMEM), תוך שימוש ב-1 מ"ל/100 מ"ג של רקמה. עברו למיקרו-צינור של 1.5 מ"ל.
   הערה: בשל השונות של אצוות קולגנאז, בדוק קבוצות שונות וודא שיש להן מספיק כדי לבצע את כל הבידודים הצפויים.
7. מכסים את הצינורות בניילון פרפין ומעכלים דגימות O/N (8-12 שעות) ב-37 מעלות צלזיוס עם נדנדה מתמשכת.
   הערה: בצע את השלבים הבאים ביום השני.
8. העבירו את הדגימות לצינורות חרוטיים של 15 מ"ל והוסיפו 5 מ"ל של cDMEM קר כקרח לתרחיף התא כדי לנטרל קולגנאז, ואז צנטריפוגה ב-754 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
   הערה: קולגנאז נפטר על ידי שאיבתו למיכל המכיל חומר ניקוי.
9. שאפו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA. יש לדגור במשך 5 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, תוך ניעור מדי פעם.
10. הוסף 1 מ"ל של DNase I לדגימות וערבב היטב. השתמש בתמיסה טרייה של 25 מ"ג/מ"ל שהוכנה ב-PBS.
    הערה: טיפול ב-DNase I בשלב זה מסייע בהשגת הפתרון החד-תאי.
11. צנטריפוגה ב-754 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
12. השתמש בפיפטה של 10 מ"ל כדי לשאוב את הסופרנטנט, והשהה מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של cDMEM קר. צנטריפוגה ב-754 x גרם למשך 5 דקות 4 מעלות צלזיוס.
13. השעיה מחדש של תאים ב-20% FBS cDMEM. צלחת ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ו-95% לחות למשך 3 ימים לפחות. הקפד לא להזיז/להטות את הצלחת. עבור 70-100 מ"ג רקמה, יש לחלק את תרחיף התאים בכלים בגודל 2X3.5 ס"מ, ב -2 מ"ל בינוני. צמצם בהתאם במידת הצורך.
    הערה: פחות מ-50 מ"ג של רקמה יגרום להפקת תאים לא יעילה. סכימת הפיצול וההקפאה מוצגת באיור 1B.
14. לאחר 3 ימים, בדוק את התאים עבור מורפולוגיה/כדאיות והחלף 2/3 מהמדיום כדי לשמור על גורמי גדילה המיוצרים בתאים. ייקח בערך 7-10 ימים עד שהתאים יגיעו למפגש, ויחליפו את המדיום כל יומיים.
15. לאחר התכנסות, העבירו את התאים לצלחת אחת של 10 ס"מ ב-20% FBS cDMEM.
16. החלף את המדיום כל יומיים, השתמש במדיום FBS 15% פעמיים, ואז פעם אחת, 12.5%, ואז 10%. עבור ניתוחי FACS, מיצוי RNA וחלבון ומלאי הקפאה עוקבים אחר התוכנית באיור 1B.
17. פיצול תאים כאשר כ-100% מתכנסים (כ-10 ימים). שוטפים 2-3 פעמים עם PBS בשפע למשך 5 דקות כל אחת. מוסיפים 1% טריפסין/EDTA (2x) ומכניסים לאינקובטור, בודקים אם יש ניתוק תאים כל כמה דקות.

3. תנאי תרבות

1. מעבר התאים רק כאשר 100% מתלכדים, לא יותר מ-1:3.
2. הקפיאו ציטוטים המתאימים ל -50% ממנה משולבת של 10 ס"מ ב -0.5 מ"ל של מדיום מקפיא קר כקרח (10% DMSO ב- FBS). מפשירים כל אליקוט בכלי של 10 ס"מ.
   הערה: זמן ההכפלה הממוצע הוא 80-90 שעות.

4. ניתוח FACS

הערה: פרוטוקול זה מבטיח אפיון אמין של אוכלוסיית הפיברובלסטים ומזהה זיהום פוטנציאלי מתאי אפיתל, אנדותל או חיסון. ניתוח FACS מבוצע בקטע 2, כפי שמוצג באיור 2A.

1. קצור תאים והשהה אותם מחדש במאגר FACS (PBS בתוספת 2% FBS) בריכוז של 10⁶ תאים/מ"ל.
2. סמן צינורות ציטומטריית זרימה והוסף 1 x 10⁵ תאים בנפח של 100 מיקרוליטר בכל אחד מהם. לצביעה עם 4 נוגדנים, הכינו 11 צינורות כדי לקחת בחשבון גם את הצביעה וגם את השער, כדלקמן (טבלה 1)
   הערה: שפופרת אחת, ללא נוגדנים (בקרה לא מוכתמת), להערכת אוטופלואורסצנטיות של תאים, שפופרת אחת עם בקרת איזוטיפ נוגדנים, להערכת קשירה ספציפית, 4 צינורות, כל אחת עם נוגדן יחיד, לפיצוי; חרוזי פיצוי יכולים להחליף תאים, 4 צינורות פלואורסצנטיים מינוס אחד (FMO) לשער, כל אחד משאיר אחד מהנוגדנים, צינור אחד עם כל 4 הנוגדנים (דגימה בפועל). נעשה שימוש בנוגדנים המסומנים פלואורסצנטיים הבאים (ראה טבלת חומרים): (1) Anti-EpCAM-PE (סמן תאי אפיתל), (2) Anti-CD31-VioBlue (סמן תאי אנדותל), (3) Anti-CD45-FITC (סמן תאי חיסון), (4) Anti-CD90-APC (סמן תאי פיברובלסטים). ניתן להשתמש בנוגדנים המצומדים לפלואורופורים אחרים, על פי מסנני ציטומטר זרימה זמינים. בצע את כל השלבים על קרח כדי לשמר את כדאיות התאים.
3. דגירה של תאים עם חוסמי קולטנים גבישיים (FcR), כגון נוגדנים מטוהרים נגד CD16/CD32 או מאגר חוסם (PBS 1%-2% BSA). השתמש במגיב חוסם FcR של 1-5 מיקרוליטר לכל 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים, ודגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
4. המשך ישירות עם הצביעה ללא כביסה. הוסף דילול נוגדנים מתאים או את בקרות האיזוטיפ המתאימות לצינורות, כמפורט בטבלה 1.
5. מערבבים בעדינות ודוגרים בחום של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 30 דקות.
6. שטפו עם 2 מ"ל של מאגר FACS.
7. צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 300 x גרם, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
8. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של מאגר FACS טרי.
9. הוסף צבע חיוני (פרופידיום יודיד) בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
10. רכוש את הדגימות על ציטומטר זרימה.
11. השתמש בבקרות פיצוי מוכתמות בודדות כדי להגדיר את מטריצת הפיצוי. לניתוח נתונים, יישם את אסטרטגיית השער הבאה על תרשימי צפיפות FACS:
12. שער פיזור קדימה וצדדית: תרשים FSC-A לעומת SSC-A ולעצב אזור סביב אוכלוסיית התאים העיקרית כדי לא לכלול פסולת תאית.
13. להחרגה כפולה: תרשים FSC-A לעומת FSC-W (או FSC-H לעומת FSC-A) ולעצב אזור כך שלא יכלול גושי תאים, שיראו רוחב מוגדל ביחס לאזור (או שטח מוגדל ביחס לגובה). בחר את התאים הבודדים ובצע את אותו הליך, תוך התוויית SSC-A לעומת SSC-W (או SSC-H לעומת SSC-A) כדי להגביר את טוהר אוכלוסיית התא הבודד.
14. שרטט את צבע הכדאיות (כלומר, פרופידיום יודיד) לעומת SSC-A ובחר תאים חיים שליליים.
15. בתאים חיים, תרשים CD326 (ציר x) לעומת CD31 (ציר y); השתמש בדגימות ה-FMO המתאימות כדי להגדיר במדויק שערים. FMO מאפשר להסביר את התפשטות הקרינה לערוץ ספציפי הנגרמת על ידי הפלואורופורים האחרים.
    1. בהסתכלות על דגימת CD326 FMO, צייר שער רביע הכולל את כל התאים ברבעים השמאליים (כלומר, שלילי ל-CD326). חזור על אותו הליך באמצעות דגימת CD31 FMO כדי לכוונן את השער על מנת שכל תאי ה-FMO יהיו ברבעים התחתונים (כלומר, שליליים עבור CD31). השתמש ברביע זה כדי לנתח את הדגימות, ובחר תאים ברביע השמאלי התחתון (CD31^- CD326^-).
16. חזור על אותו הליך המתווה CD326 (ציר x) לעומת CD45 (ציר y), תוך שימוש ב-CD326 FMO וב-CD45 FMO כדי להגדיר את שער הרביע. השתמש ברביע זה כדי לנתח את כל הדגימות ולבחור תאים ברביע השמאלי התחתון (CD45^- CD326^-).
17. חלקה CD90 לעומת SSC-A והשתמש ב-CD90 FMO כדי להגדיר אזור שאינו כולל תאים שליליים וכולל רק CD90⁺. השתמש באזור זה כדי לנתח את כל הדגימות, ולמדוד את אחוז תאי CD90⁺ . תוצאות מייצגות מוצגות באיור 2A.

5. אלמורטליזציה של פיברובלסטים

הערה: אימורטליזציה של אוכלוסיות CAF ו-NF מושגת על ידי התמרה יציבה עם וקטור רטרו-ויראלי המבטא hTERT. להלן הפרוטוקולים להכנת חלקיקים פסאודו-ויראליים זיהומיים והתמרת תאים.

1. ייצור חלקיקים רטרו-ויראלים
   1. יום 1, ציפוי פולי-L-ליזין וציפוי תאים: מצפים צלחת בגודל 10 ס"מ ב-6 מ"ל של תמיסת פולי-L-ליזין (0.1 מ"ג/מ"ל ב-H₂O), דוגרים 5 דקות מתחת למכסה המנוע TC, שואבים ומניחים לכלי הפתוח להתייבש מתחת למכסה המנוע לפני ציפוי 3 x 10⁶ HEK293T תאים.
   2. יום 2: הוסף 30 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה בתיווך ליפידים לקטיון 0.75 מ"ל מדיום מותאם לליפופקציה ללא אנטיביוטיקה.
   3. במקביל, הוסף 2 מיקרוגרם של וקטור אריזה רטרו-וירוס pCL-Ampho ו-2 מיקרוגרם של פלסמידים pBABE-puro-hTERT לעוד 0.75 מ"ל של מדיום מותאם לליפופקציה ללא אנטיביוטיקה.
   4. דגירה למשך 5 דקות ב-RT.
   5. מערבבים את שני הדילולים בצינור חרוטי של 15 מ"ל ודוגרים למשך 20 דקות ב-RT.
   6. בינתיים, החלף את המדיום HEK293T ב-6 מ"ל של מדיום מותאם לליפופקציה בתוספת 10% FBS.
   7. פזרו בעדינות את קומפלקסי ה-DNA על פני הכלי ודגרו במשך 6 שעות עד O/N בחממת CO₂ לחה.
   8. יום 3: החלף את המדיום ב-7 מ"ל cDMEM ודגירה למשך 48 שעות.
      הערה: החל משלב זה, יש לבצע עבודה במתקן תרבית רקמות ברמה 3 (BSL3), בהתאם לכללים המוסדיים.
   9. ביום החמישי, אספו את המדיום המכיל את הנגיף וסננו דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר.
   10. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
2. התמרה ויראלית
   1. יום 1: צלחת פיברובלסטים במעבר נמוך במפגש של 60% ב-2 בארות של צלחת של 6 בארות.
   2. יום 2: החלף את המדיום ב-1 מ"ל של התכשיר הרטרו-ויראלי pBABE-puro-hTERT שיוצר בעבר המכיל 8 מיקרוגרם/מ"ל של פוליברן ודגירה למשך 12-16 שעות.
   3. יום 3: החלף את המדיום המכיל את הנגיף ב-2 מ"ל של cDMEM.
   4. יום 4: לאחר 24 שעות, התחל שני סבבים של 48 שעות של בחירת פורומיצין (2 מיקרוגרם/מ"ל).
      הערה: יש לקבוע את הריכוז באופן אמפירי עבור כל אצווה של אנטיביוטיקה וסוג תאים, ויש לבחור את הריכוז הנמוך ביותר כדי להרוג את כל התאים תוך 4 ימים מהבחירה.
   5. יום 8: בדקו שכל תאי הבקרה הלא נגועים מתו. החלף את המדיום ב-cDMEM ותן לתאים נגועים לגדול עד להתלכדות לפני שעוברים אותם 1:3. תן לתאים להגיע למפגש ולהתפצל שוב 1:3. בשלב זה, התאים יכולים לצאת ממתקן BLS3.
      הערה: הכינו מנות קפואות בהקדם האפשרי. כדי להבטיח התרחשות אימורטליזציה, עברו את התאים 5-6 פעמים ודרגו את שיעורי המורפולוגיה והשכפול שלהם, שלא אמורים להשתנות עם המעברים. להשוות פונקציונלית תאים אימורטליים לעמיתיהם העיקריים, באמצעות השיטות המתוארות להלן.

6. אפיון פיברובלסטים

1. לנתח פנוטיפית את התאים המבודדים לביטוי סמני CAF/NF, ולאפיין פונקציונלית את פעילותם הפרו-אונקוגנית הפוטנציאלית על תאי הגידול.
   הערה: האוליגונוקלאוטידים והנוגדנים qPCR המותאמים להערכת רמות ביטוי הסמנים הן ברמות RNA והן ברמות החלבון מדווחים בטבלה 2 ובטבלת החומרים, בהתאמה. היזהר כי נוגדנים נגד חלבון הפעלת פיברובלסטים (FAP) הם לרוב לא ספציפיים. הקפד לכלול בקרות חיוביות ושליליות מתאימות^31,32. ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי להעריך את הדיבור בין פיברובלסטים לתאי גידול. כאן, מתוארות שתי גישות חלופיות, המורכבות מטיפול בתאי גידול עם מדיום מותנה (CM) שמקורו ב-CAFs או NFs, או תרבית משותפת של פיברובלסטים ותאי גידול. מתוארת היעילות של כל אחת מהגישות להגברת התפשטות תאי הגידול.

7. הכנה וריכוז של מדיום מותנה

הערה: המדיום המותנה מרוכז ומינון מדויק לאחר האיסוף כדי להקל על ההשוואה בין תאים שונים.

1. צלחת את התאים במפגש של 70% בצלחת של 15 ס"מ ב-cDMEM.
2. למחרת, עברו ל-15 מ"ל של מדיום רעב (DMEM ללא FBS) ודגרו במשך 48 שעות כדי לייצר את ה-CM.
3. אסוף את ה-CM, צנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות ב-RT, וסנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי לחסל פסולת תאים ולעקר.
4. מעבירים לצינורות ריכוז (MWCO 10,000 Da), ולצנטריפוגה 20 דקות ב-2000 x g ו-4 °C, או לפי הוראות היצרן, כדי לקבל כ-1 מ"ל של ה-CM המרוכז (conCM), כלומר ריכוז פי 15.
5. בחר את ה-conCM ואחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
6. כמת את תכולת החלבון של ה-conCM שנאסף באמצעות בדיקת חלבון קולורימטרי.
   הערה: הריכוז הממוצע המתקבל הוא 0.5 ו-2 מיקרוגרם/מיקרוליטר. עדיין ניתן להשתמש בריכוזים נמוכים יותר.

8. בדיקת התפשטות

הערה: התפשטות תאים (באמצעות קווי תאי PCa אנושיים DU145 או LNCaP) הוערכה באמצעות מכשיר ניתוח תאים חיים בשתי הגדרות שונות, או טיפול בתאי הגידול עם conCM, או טיפוח משותף שלהם עם CAFs או NFs. במקרה זה, יש להשתמש בתאי גידול פלואורסצנטיים. תוצאות מייצגות מוצגות באיור 3.

1. בדיקת התפשטות בעת טיפול ב-conCM
   הערה: פרוטוקול זה ממוטב עבור תאי DU145; תאים שונים עשויים לדרוש התאמות.
   1. תאי גידול צלחת ב-cDMEM בצלחת של 96 בארות (750 תאים/באר), בהתחשב בלפחות 3 שכפולים לכל מצב, ודגירה O/N.
   2. החלף את cDMEM במדיום רעב, בתוספת או לא, ב-50 מיקרוגרם/מ"ל של conCM.
   3. העבר את הצלחת לתא המכשיר לניתוח תאים חיים בתוך החממה.
   4. מניחים להתחמם ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז מתחילים את הסריקה הראשונה.
   5. השתמש בערוץ ניגודיות הפאזה, בחר מטרה מתאימה ומספר שדות/באר רצויים (מומלץ 10x מטרה ו-5 שדות/באר), וסוג סריקה סטנדרטי. סרוק כל 6 שעות למשך 4-5 ימים (יש לקבוע אמפירית משך זמן לתנאים וסוגי תאים).
   6. בצע את הניתוח בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
   7. חשב עבור כל באר (שכפולים טכניים עבור כל תנאי) את שינוי הקיפול ביחס לערכו בזמן אפס. צור את הגרפים המתאימים והעריך מובהקות סטטיסטית באמצעות תוכנה מתאימה.
2. בדיקת התפשטות בעת תרבית משותפת
   1. צלחת משותפת 750 תאי DU145 ו-CAFs או NFs המבטאים RFP ביחס של 1:3 ב-cDMEM בצלחת של 96 בארות.
   2. למחרת, עבור ל-2% FBS DMEM. העבירו את הצלחת לתא המכשיר לניתוח תאים חיים בחממה והתחילו בסריקה סטנדרטית כל 6 שעות למשך 4 ימים, תוך שימוש הן בניגודיות הפאזה והן בערוץ הכתום.
   3. בצע ניתוח התפשטות בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
   4. חשב עבור כל באר (שכפולים טכניים עבור כל תנאי) את שינוי הקיפול ביחס לערכו בזמן אפס. צור את הגרפים המתאימים והעריך מובהקות סטטיסטית באמצעות תוכנה מתאימה.

9. בדיקת נדידת ריפוי פצעים

הערה: כאן, מוצגת גרסה אוטומטית של בדיקת השריטה הקלאסית³³ למדידת נדידת תאים, באמצעות מכשיר ניתוח תאים חיים.

1. תאי גידול צלחת בצלחת של 96 בארות המתאימה למכשיר ניתוח התאים החיים להשגת שכבה חד-שכבתית קונפלונטית.
2. למחרת, טפל בתאים עם 10 ug/mL של מיטומיצין C למשך שעתיים.
   הערה: שלב זה חיוני כדי למנוע התפשטות תאים במהלך הבדיקה, מה שיבלבל את התוצאות.
3. יש למרוח את השריטה על הבארות בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
4. שטפו עם 100 מיקרוליטר PBS כדי להסיר תאים מנותקים.
5. הוסף מדיום רעב, עם 50 מ"ג/מ"ל או בלי (בקרה).
6. הנח את הצלחת בתא ניתוח התאים החיים בחממה.
7. לאחר 30 דקות, תכנת את פרוטוקול הסריקה המומלץ לריפוי פצעים, כל 4 שעות למשך יום אחד או יותר, בהתאם לתאים ולמצבים.
8. נתח את התוצאות בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).

10. צמיחה בלתי תלויה בעיגון על ידי בדיקת אגר רכה

1. CAFs או NFs במפגש של 70% בלוחות של 12 בארות, ומשאירים שלוש בארות ריקות כבקרה.
2. למחרת, הכינו תמיסת מלאי אגר רכה פי 4 (3.6%) על ידי הוספת 0.45 גרם אגר נמס נמוך ל-12.5 מ"ל PBS בצינור חרוטי של 50 מ"ל בתנאים סטריליים.
3. ממיסים במיקרוגל. היזהרו מרתיחה מוגזמת שתגרום לתמיסה להתרכז.
4. מצננים ב-37 מעלות צלזיוס, ואז מכינים תמיסת עבודה 1x על ידי דילול 1:4 עם cDMEM מחומם מראש.
5. שאפו את המדיום מצלחת 12 הבארות והוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת אגר 1x לכל באר.
6. תן לו להתמצק במשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, תוך אחסון שאר תמיסת האגר ב-37 מעלות צלזיוס.
7. בינתיים, נסה את תאי הגידול והכין תרחיף תאים של 2 x 10⁴ תאים / מ"ל.
8. מערבבים נפחים שווים של תרחיף התא ותמיסת האגר 1x על ידי פיפטינג מספר פעמים, ומוציאים 500 מיקרוליטר (כלומר, 5000 תאים) על גבי שכבת האגר הראשונה בכל באר. הקפד להכין לפחות 10% עודף של תרחיף תאים.
9. תנו לאגר להתמצק על ידי דגירה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
10. הוסף 1 מ"ל cDMEM לכל באר וחדש אותו כל יומיים על ידי שאיבת המדיום בעדינות מקצה הבאר והוספת המדיום הטרי למרכז, כמעט טיפתי כדי למנוע עקירת שכבת האגר הרכה.
11. דגירה עד להופעת מושבות גלויות בקלות. תאי DU145 נמשכים בדרך כלל כ-12 יום, עם שינויים קלים.
12. השליכו את המדיום והכתים את המושבות על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של תמיסת טטרזוליום כלוריד ניטרובלו (1 מ"ג/מ"ל ב-PBS). דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח.
13. לאחר שהמושבות מוכתמות, השליכו את תמיסת הצבע ורכשו תמונות באמצעות סטריאומיקרוסקופ. הנח את הצלחת על המיקרוסקופ stage והגדר את ההגדלה לערך הנמוך ביותר שלה (0.8x) כדי להבטיח שהבאר כולה נראית לעין. השתמש בכפתור המיקוד הגס כדי להביא את המושבות למיקוד חד, ולאחר מכן התאם את הגדרות התאורה והמצב לפני צילום התמונות.
14. השתמש בתוכנה מתאימה³⁴ כדי לכמת את מספר המושבה והשטח התפוס על ידי ביצוע השלבים המפורטים בקובץ משלים 1.
15. ציון מספר והתפלגות הגודל של המושבות (ראה איור 4).

זוגות CAF ו-NF מ-7 חולי PCa בדרגה גבוהה בודדו בהצלחה עם פרוטוקול זה. גיל המטופלים בעת הניתוח וציוני גליסון מסוכמים בטבלה 3. כדי להעריך את הטוהר של אוכלוסיות הפיברובלסטים הנגזרות, מעבר שני CAFs ו-NFs ראשוניים נותקו ונצבעו בנוגדנים הפלואורסצנטיים שצוינו או בפרופידיום יודיד כדי להעריך אפופטוזיס. תוצאות מייצגות מניתוח ה-FACS העוקב מוצגות באיור 2A, המדגישות את אסטרטגיית השער ואת אחוזי התאים החיוביים עבור כל סמן. הניתוח כלל סמנים לתאי אפיתל (EpCAM), תאי אנדותל (CD31), תאי חיסון (CD45) ופיברובלסטים מופעלים (CD90). התוצאות מאשרות את הבידוד המוצלח של פיברובלסטים טהורים, שכן התאים היו שליליים בעיקר לסמני אפיתל, אנדותל או תאי חיסון, והראו חיוביות משתנה עבור CD90, הנחשב לסמן להפעלת CAF35,36. במקרים רבים, במיוחד במעברים מוקדמים, CAFs הציגו מורפולוגיה דמוית ציר יותר בהשוואה ל-NFs, כפי שמוצג באיור 2B. עם זאת, הבדלים מורפולוגיים אלה נטו להצטמצם עם הקטעים הבאים.

כדי להעריך את ההשפעות של CAFs ו-NFs על התפשטות תאי DU145, מבחני התפשטות בוצעו באמצעות שתי גישות חלופיות: או טיפול בתאי PCa עם conCM מזוגות CAF/NF (איור 3A,B), או ציפוי משותף של תאי PCa ופיברובלסטים ביחס של 1:3 (איור 3C,D). השימוש בתאי RFP-DU145 פלואורסצנטיים, הניתנים לזיהוי ספציפי על ידי המסנן הכתום של מכשיר ניתוח התאים החי, איפשר להבחין בין שני סוגי התאים. הניסויים שהוצגו בוצעו באמצעות CAFs ו-NFs שמקורם באותו מטופל. שתי הגישות יכולות להדגים פעילות פרו-פרוליפרטיבית של פיברובלסטים. עם זאת, ההבדלים בין CAFs ל-NFs היו ברורים בעיקר בגישת conCM, כפי שמוצג בבירור בגרפים (איור 3B,D). ההשפעות המשתנות של conCM מזוגות CAF/NF שונים מומחשות באיור 3E.

צמיחה בלתי תלויה בעגינה היא תכונה הנחשבת לעתים קרובות כפרוקסי ליכולת גרורתית. בין מספר שיטות להערכת השפעות CAFs/NFs על צמיחה בלתי תלויה בעיגון של תאי PCa, התוצאות הטובות ביותר הושגו על ידי תרבית משותפת של פיברובלסטים ותאי גידול ללא מגע ישיר. פיברובלסטים נזרעו בצלחות של 12 בארות וכוסו בשכבה של 0.9% אגר רך ב-cDMEM, ומעליו שכבות תאי גידול ב-0.45% אגר רך cDMEM. היווצרות המושבה נוטרה במשך 12 ימים. תמונות מייצגות של מושבות DU145 שהתקבלו מוצגות באיור 4A, יחד עם גרפים תואמים המנתחים את מספרי המושבות בגדלים שונים. יש לציין כי גם CAFs וגם NFs הצליחו באופן דומה לעורר את יכולת יצירת המושבה של תאי DU145 בהשוואה לתאי הבקרה המצופים ללא שכבת הזנה פיברובלסטים. המושבות גם נטו לגדול, מה שמרמז על התפשטות מוגברת. בעיה אחת שנתקלנו בה מדי פעם בבדיקה זו היא ניתוק מוקדם של שכבת הפיברובלסטים, אולי בגלל צפיפות אגר רכה או טמפרטורה שגויה בעת הציפוי. במקרים האלה הניסוי הופסק (איור 4B).

צמיחה בלתי תלויה בעיגון הנגרמת על ידי CAFs/NFs הוערכה גם בטיפול ב-conCM. בקצרה, תאי DU145 מצופים באגר רך הוכנסו לשכבות של 1 מ"ל של 5% FBS DMEM, פלוס או מינוס 50 מיקרוגרם/מ"ל של conCM, והחליפו אותו כל 4 ימים עד להשלמת הבדיקה. עם זאת, בתנאים אלה, תאי DU145 לא היו מסוגלים ליצור מושבות בגודל טוב, ולא נצפה שיפור בטיפול ב-conCM, כפי שמוצג באיור 4C.

איור 1: תוכניות בידוד ותרבות פיברובלסטים. (A) ייצוג מדורג של הליך החיתוך והבידוד של פיברובלסטים מדגימות של חולי PCa. התמונות מייצגות את ההקפאה של H&E המזהים את הגידול ואת אזורי הרקמה הנורמליים שיש לנתח. (ב) ייצוג סכמטי של סכימת הפיצול וההקפאה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ניתוח FACS ותמונות מייצגות של פיברובלסטים מבודדים. (A) פיברובלסטים ממטופל 11 הופקו בהתאם להליך המתואר באיור 1A, וניתוח ציטופלואורימטרי בוצע על תאים במעבר 2 כמתואר באיור 1B. תרשימי צפיפות FACS מייצגים המציגות את אסטרטגיות השער העוקבות (חיצים אדומים) המשמשות להערכת הביטוי של CD45, CD31, EpCAM ו-CD90 באוכלוסיית התאים שמקורה בגידול או באזורים שאינם גידול (CAFs ו-NFs, בהתאמה). CD326 = EpCAM, סמן תאי אפיתל; CD31, סמן תאי אנדותל; CD45, סמן תאי חיסון; CD90, סמן להפעלת פיברובלסטים. התאים היו שליליים בשלושת הסמנים הראשונים וחיוביים ל-CD90. (B) תמונות מייצגות של הזוג המבודד 11 NFs ו-CAFs במהלך מעבר 2. פסי קנה מידה = 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מבחני התפשטות על תאי DU 145 PCa. (א,ב) טיפול ב-conCM. 750 תאי DU145 צופו בצלחות של 96 בארות, ולמחרת עברו למדיום רעב המכיל או לא 50 מיקרוגרם/מ"ל של זוג 11 CAF/NF conCM כמתואר בטקסט והונחו במכשיר ניתוח תאים חיים. (א) מציג חמישה שדות/בארות סרוקים בזמנים שצוינו. גרף ההתפשטות הרלוונטי, המחושב כשינוי קיפול בצפיפות התאים עבור שלושת התנאים, שכל אחד מהם מנורמל לערך הזמן שלו 0, מוצג ב-(B). (C,D) 750 תאי DU145 המבטאים RFP צופו בצלחות של 96 בארות ב-cDMEM, לבד או יחד עם CAFs או NFs מאותו מטופל ביחס של 1:3. למחרת, התאים הועברו ל-2% FBS DMEM והוכנסו למכשיר ניתוח תאים חיים. 5 שדות סרוקים של התאים הפלואורסצנטיים/באר בזמנים המצוינים מוצגים ב-(C), בעוד ש-(D) מציג את גרף ההתפשטות הרלוונטי, המחושב כשינוי קיפול באזור האובייקט הכתום, המייצג את תאי הגידול, עבור שלושת התנאים, כל אחד מנורמל לערך הזמן שלו 0. השפעות משתנות של conCM הנגזרות מ-7 חולים שונים CAF/NF מיוצגות ב-(E). הנתונים מוצגים כממוצע +/-SEM של בארות משולשות. כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין שלושת המצבים (ANOVA דו-כיווני במדידות חוזרות עם Tukey לאחר מבחן). *עמ' < 0.05; עמ' < 0.001; עמ' < 0.0001. פסי קנה מידה = 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מבחני אגר רך. (A) צמיחה בלתי תלויה בעגינה של תאי DU145 הוערכה על ידי זריעת תאי גידול במטריצת אגר על גבי שכבת הזנה של CAFs או NFs מאותו זוג שצופה יום קודם, או ללא תאי הזנה כביקורת (Ctrl), רענון המדיום עם 10% FBS DMEM כל יומיים כמתואר בטקסט. הגרפים מייצגים את ממוצע +/- SEM של מספר המושבות, או שמדרגים את כל המושבות ≥8 × 103 מיקרומטר2, או בגודל ≥16 × 103 מיקרומטר2 . (B) מראה ניסוי כמו ב-(A), שהיה צריך להפסיק אותו עקב ניתוק שכבת ההזנה. ראה טקסט לפרטים. (C) תאי DU145 נזרעו באגר רך כמתואר בטקסט, וטופלו/או לא ב-conCM שמקורו ב-CAFs או NFs ב-5% FBS DMEM. מדיום לא התרענן. בתנאים אלה, המושבות גדלו פחות באופן משמעותי מאשר בעת שימוש בתאי הזנה של CAFs/NFs. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הכנת דגימות FACS. הטבלה מפרטת כיצד להכין צינורות ציטומטריית זרימה לצביעה בארבעה נוגדנים, הגדרת השער ותכנון הפרוטוקול לניתוח FACS. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: רצפי פריימר עבור qRT-PCR. הטבלה מפרטת את רצפי הפריימר קדימה ואחורה המשמשים להערכת הביטוי של גנים ידועים של סמני CAF. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 3: מידע על מטופלים. הטבלה מדווחת על הגילאים בכריתת ערמונית רדיקלית (RP) וציוני גליסון של כל החולים שמהם נגזרו זוגות CAF ו-NF. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

קובץ משלים 1: כיול תמונה לבדיקת אגר רך. הליך ניתוח תמונה שלב אחר שלב לציון המושבות ולמדידת השטח הכבוש הכולל. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.