מאמר שיטה

ריצוף Amplicon באמצעות טכנולוגיות ריצוף לקריאה ארוכה

DOI:

10.3791/68370

⸱

29 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לריצוף עמוק ממוקד של 18 אזורים עמידים לתרופות ב-Mycobacterium tuberculosis באמצעות פלטפורמת ריצוף לקריאה ארוכה, ואחריה ניתוח עם צינור ביואינפורמטיקה ספציפי לשחפת המיועד לנתונים לקריאה ארוכה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ארגון הבריאות העולמי (WHO) ממשיך להדגיש את הצורך הדחוף בשיטת אבחון מהירה, חסכונית וידידותית למשתמש לשחפת (שחפת) ושחפת עמידה לתרופות (DR-TB). טכנולוגיות ריצוף מהדור הבא (NGS), שאושרו על ידי ארגון הבריאות העולמי, שיפרו משמעותית את הזיהוי של DR-TB. בין אלה, NGS ממוקד (tNGS) מאפשר זיהוי ממוקד של מוטציות גנטיות הקשורות לעמידות לתרופות, ומבטל את הצורך באבחון מסורתי מבוסס תרבית. בדיקת tNGS אחת בשימוש נרחב מספקת בדיקת רגישות מהירה ומקיפה לתרופות, אך עברה אופטימיזציה בעיקר לפלטפורמות ריצוף עם דיוק גבוה. עם זאת, העלות הגבוהה של מערכות ריצוף אלה הגבילה את הנגישות במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית, במיוחד ברחבי אפריקה. טכנולוגיות ריצוף ניידות מציגות אלטרנטיבה מבטיחה, המציעה גמישות ודרישות תשתית מופחתות. במחקר זה, DNA חולץ מבודדי שחפת עמידים לריפמפיצין (RR-TB), הוגבר באמצעות בדיקת tNGS, ורוצף על פלטפורמת ריצוף ניידת. אותם תוצרי הגברה רוצפו גם על פלטפורמת ריצוף קריאה קצרה ברמת דיוק גבוהה כדי לשמש כהתייחסות. הנתונים מהרצף הנייד עובדו באמצעות צינור ביואינפורמטיקה המיועד לריצוף קריאה ארוכה, בעוד שנתוני ריצוף לקריאה קצרה נותחו באמצעות אפליקציה מבוססת אינטרנט מבוססת. הניתוח הראה כי גישת ריצוף הקריאה הארוכה זיהתה בהצלחה וריאנטים הקשורים להתנגדות בתדר גבוה שזוהו על ידי ריצוף קריאה קצרה, אך הראתה מגבלות בזיהוי וריאנטים בתדר נמוך.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שחפת (TB) ממשיכה להיות גורם עיקרי לתמותה ברחבי העולם ומהווה אתגר מתמשך לבריאות הציבור, במיוחד במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית 1,2. למרות יוזמות שמטרתן לשפר את אמצעי השליטה בשחפת, ההתקדמות הייתה איטית, בין היתר בשל קשיים בהשגת טכניקות אבחון מהירות, מדויקות, חסכוניות ומקיפות 3,4,5. בעוד ששיטות אבחון מולקולאריות כמו בדיקות בדיקה (LPAs) ובדיקות הגברה אוטומטיות של חומצות גרעין (NAATs) האיצו את הזיהוי של שחפת ושחפת עמידה לתרופות (DR-TB), זיהוי המוטציות המוגבל שלהן מגביל את בדיקות הרגישות לתרופות (DST). מגבלה זו משמעותית במיוחד במדינות עם נטל גבוה של שחפת 6,7,8,9.

כדי להתמודד עם מגבלות אלה, ארגון הבריאות העולמי (WHO) המליץ על שימוש בטכנולוגיות ריצוף מהדור הבא (NGS), שהתגלו ככלים רבי עוצמה למעקב אחר שחפת וזיהוי עמידות10,11. הן גישות ריצוף גנום שלם (WGS) והן גישות NGS ממוקדות (tNGS) מציעות כיסוי מוטציות רחב יותר, המאפשר זיהוי וריאנטים הקשורים לעמידות על פני מספר תרופות 8,12,13,14,15. בעוד שריצוף גנום שלם (WGS) מספק דוח DST מקיף, הסתמכותו על תרבית הופכת אותו ללא מתאים לאבחון מהיר, שכן תרבית יכולה להימשך עד שישה שבועות 15,16,17. NGS ממוקד מציע אלטרנטיבה טובה יותר מכיוון שהוא אינו תלוי בתרבות; ניתן לבצע ריצוף ישירות מדגימות קליניות18. כתוצאה מכך, ארגון הבריאות העולמי המליץ על שימוש בשלוש בדיקות tNGS לשעון קיץ: בדיקת Deeplex Myc-TB: בדיקה זו מזהה עמידות לריפמפיצין, איזוניאזיד, פלואורוקווינולונים, אמינוגליקוזידים (אמיקאצין, קנמיצין, קפראומיצין), אתאמבוטול, פירזינמיד ואתיונאמיד 19,20,21. בדיקת שחפת זקיף: זה מכוון לעמידות לריפמפיצין, איזוניאזיד, פלואורוקווינולונים ותרופות הזרקה קו שני18,20. בדיקת AQ-TB: זה מזהה עמידות לריפמפיצין, איזוניאזיד, פלואורוקווינולונים ותרופות הניתנות להזרקה קו שני. בדיקות אלו עברו אופטימיזציה לשימוש בפלטפורמת הקריאה הקצרה בשל הדיוק הגבוה שלה20. פלטפורמות ONT MinION לקריאה ארוכה, לעומת זאת, מספקות נתונים בזמן אמת, ניידות ופוטנציאל ליישום חסכוני22,23. עם זאת, השימוש הנרחב ב-NGS מוגבל על ידי דרישות התשתית והעלות, במיוחד עם מערכות לקריאה קצרה10.

בדיקת Deeplex היא המקיפה ביותר מבין שלוש הבדיקות המומלצות. הבדיקה תוכננה במקור לבצע PCR מרובה ב-18 אזורים הקשורים לעמידות ל-13 תרופות נגד שחפת. עם זאת, ארגון הבריאות העולמי המליץ עליו עבור 10 תרופות נגד שחפת, מה שמעיד על רגישות וסגוליות מספקות. מחקר זה ביצע אופטימיזציה לשימוש עם ONT MK1B MinION, פלטפורמת ריצוף לקריאה ארוכה. מערכת תאי הזרימה הניידת והניתנת לשימוש חוזר של פלטפורמה זו מפחיתה הן את עלויות התשתית והן את עלויות הריצוף הפוטנציאליות לדגימה 4,22,23. בעוד שפותחו מבחנים אחרים התואמים לקריאה ארוכה, הם נוטים להיות בעלי היקף DST מוגבל, המכוון בדרך כלל רק לטווח צר של גנים עמידים. לעומת זאת, הבדיקה מציעה כיסוי יעד רחב, מה שהופך אותה לכלי אבחון מקיף יותר עבור שעון קיץ מבוזר24,25. רשימה מפורטת של המטרות הגנומיות המוגברות על ידי הבדיקה והאסוציאציות התרופתיות המתאימות שלהן מסופקת בטבלה 1, המדגישה את יכולות האבחון של הבדיקה25.

לפני מיצוי DNA, יש לטהר דגימות ולהשבית אותן בתנאי בטיחות ביולוגית 3 (BSL-3), בהתאם לאמצעי הזהירות הדרושים 25,26,27. יש לשלב הגברה פנימית ובקרות חיצוניות בכל ריצה, עם מעקב אחר זיהום באמצעות בקרות שליליות והערכות מעבדה שגרתיות25. יש להעריך מדדי איכות חשובים, כולל עומק קריאה, רוחב כיסוי והצלחת הגברה, לאחר הרצף. עבור ריצוף ממוקד, ארגון הבריאות העולמי ממליץ על עומק קריאה מינימלי של פי 100 לכל אמפליקון וכיסוי הולם של כל אזורי העמידות לתרופות ממוקדים כדי לאפשר זיהוי של וריאנטים מינוריים הנמצאים ב-≥5%28. ארגון הבריאות העולמי תומך בשיטות ריצוף ממוקדות אלה לזיהוי עמידות לתרופות קו ראשון ושני, בהנחה שמערכות אבטחת איכות הוקמו ושכל אזורי היעד מכוסים במידה מספקת28.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נערך כחלק מפרויקט TS ELiOT, שקיבל אישור אתי מוועדת האתיקה של מחקר בבני אדם (HREC) באוניברסיטת סטלנבוש (N21/09/093) ב-20 באוקטובר 2021. בנוסף, היא קיבלה אישור ממחקר הבריאות של הכף המערבי לשימוש במתקנים ממשלתיים. הדגימות נאספו באמצעות מאמץ משותף עם NHLS Green Point ואוניברסיטת סטלנבוש, תחת מספר אישור SU HREC N09/11/296. הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מדגם

  1. השבתת חום
    1. דגרו על תרביות MGIT בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי להשיג השבתת חום מלאה בתנאי BSL-3.
    2. המשך עם מיצוי DNA בשיטת InstaGene29.
  2. מיצוי DNA
    1. הנח 5 מ"ל של תרבית MGIT מושבתת חום לתוך צינור של 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה ב-4000 x גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. הסר בזהירות את הסופרנטנט על ידי פיפטינג, והשאיר את המשקעים.
    4. הוסף 200 מיקרוליטר של מגיב מיצוי DNA מבוסס כלציה למשקעים ודגירה בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    5. העבירו את התמיסה לצינור מכסה הברגה של 2 מ"ל והוסיפו לכל אחד שלושה חרוזי זכוכית בקוטר 2 מ"מ.
    6. מערבולת למשך 10 שניות כדי לפזר תאים ולהניח את הצינורות בחממת אמבטיה יבשה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות.
    7. הומוגניזציה של הדגימות באמצעות הומוגנייזר מכה חרוזים עם ההגדרות הבאות: 3 מחזורים של 20 שניות במהירות של 4.0 מ' לשנייה.
    8. צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-RT ומעבירה בזהירות 130 מיקרוליטר של הסופרנטנט (נוזל המכיל DNA) לצינור של 1.5 מ"ל, תוך הימנעות ממשקעים ופסולת.
    9. השעו מחדש את החרוזים על ידי תנועה או מערבולת והוסיפו 156 מיקרוליטר מהחרוזים לצינור 1.5 מ"ל המכיל את ה-DNA שחולץ.
    10. פיפטה לאט למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב ולדגור ב-RT למשך 5 דקות.
    11. הנח את הצינורות על מתלה מגנטי למשך 5 דקות כדי להפריד את החרוזים הקשורים ל-DNA.
      הערה: סופרנטנט שקוף צריך להופיע מעל כדור קומפקטי של חרוזים מגנטיים כהים בצד הצינור הפונה למגנט, מה שמצביע על מוכנות להסרת סופרנטנט.
    12. פיפטה מהסופרנטנט מבלי להפריע לחרוזים.
    13. הוסף 100 מיקרוליטר של 80% אתנול טרי שהוכן לכדור החרוזים בעודו על המדף והשאיר למשך 30 שניות, ואז הסר את האתנול. חזור על שלב הכביסה.
    14. יבש באוויר את כדור החרוזים ב-RT למשך 5 דקות. ודא שגלולת החרוזים נראית מט ולא נשאר נוזל גלוי לפני שתמשיך לשלב הבא.
    15. הסר את הצינור מהמתלה המגנטי.
    16. הוסף 25 מיקרוליטר של מים ללא נוקלאז (NFW) ישירות לחרוזים המיובשים והשהה מחדש על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה 10 פעמים.
    17. דגירה ב- RT למשך 5 דקות.
    18. החזר את הצינור למתלה המגנטי למשך 5 דקות נוספות.
    19. העבירו בזהירות את ה-DNA המנומק (סופרנטנט) לצינור חדש של 1.5 מ"ל.
    20. מדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות מגיב כימות dsDNA מבוסס פלואורסצנטי בעל רגישות גבוהה.
      הערה: ניתן לאחסן את ה-DNA במקפיא של -20 מעלות צלזיוס או להמשיך עם PCR.
  3. הגברה (PCR)
    1. Multiplex PCR וניקוי לאחר PCR, בהתאם להוראות היצרן25.
    2. מדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות מגיב כימות dsDNA מבוסס פלואורסצנטי בעל רגישות גבוהה.
  4. אלקטרופורזה בג'ל
    1. הכינו ג'ל אגרוז 2% על ידי המסת אבקת אגרוז במאגר TAE 1x באמצעות חימום מיקרוגל עד להמסה מלאה.
    2. הוסף 5 מיקרוליטר של כתם ג'ל DNA פלואורסצנטי לא רעיל לאגרוז המומס וערבב היטב.
    3. יוצקים את תערובת הג'ל למגש יציקת ג'ל המצויד במסרק ליצירת בארות.
    4. אפשר לג'ל להתמצק ב-RT.
    5. לאחר ההתמצקות, הסר את המסרק והנח את מגש הג'ל במיכל האלקטרופורזה המלא במאגר TAE 1x.
    6. טען 5 מיקרוליטר של סולם DNA kb מעורבב עם 5 מיקרוליטר של מאגר טעינה לבאר הראשונה.
    7. עבור כל מוצר PCR, מערבבים 5 מיקרוליטר מהמוצר עם 5 מיקרוליטר של מאגר טעינה ומעמיסים לבארות בודדות.
    8. הפעל את הג'ל ב -100 וולט למשך שעה.
    9. דמיין את רצועות ה-DNA באמצעות מערכת תיעוד הג'ל עם transillumination.

2. הכנת ספריית ONT

  1. הכנה סופית
    1. חשב 100 ננוגרם מכל דגימת אמפליקון על סמך ריכוז והעביר את הנפח הנדרש לצינור PCR נקי.
    2. כדי לחשב את המסה הכוללת (ב-ng) של אמפליקונים בדגימה נתונה, הכפל את ריכוז הדגימה (ng/μL) בנפח הנותר שלה (μL) לאחר בקרת איכות (QC).
      הערה: לדוגמה, אם לדגימה יש ריכוז של 2 ננוגרם/מיקרוליטר ונפח נותר של 1 מיקרוליטר לאחר QC, מסת האמפליקון הכוללת היא:
      מסה כוללת = 2 ננוגרם/מיקרוליטר × 1 מיקרוליטר = 45 ננוגרם
      להכנת 10 ננוגרם של אמפליקונים לריצוף, השתמש בנוסחת הדילול:
      C1V1 = C2V2
      כאשר: C1 = 45 ng, V1 = לא ידוע, C2 = 10 ng, V2 = 1 μL, V1 = (C2 × V2) / C1 = (10 ng × 1 μL) / 45 ng = μL
      לפיכך, יש להשתמש ב-μL של דגימת האמפליקון הראשונית כדי להשיג 10 ננוגרם של DNA לריצוף.
    3. התאם את הנפח הכולל של כל דגימה ל-12.5 מיקרוליטר באמצעות NFW.
    4. מערבבים את הדגימות בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים וסיבוב קצר.
    5. הוסף 1.75 מיקרוליטר של מאגר תגובת תיקון קצה וזנב A ו-0.75 מיקרוליטר של תערובת אנזימים לתיקון קצה וזנב A לכל דגימה.
    6. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים ומסובבים לזמן קצר.
    7. דגרו את הצינורות בתרמו-סייקלר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      הערה: בשלב זה, במידה והמשתמש יחליט להפסיק את התהליך, רצוי להשתמש בחרוזים לטיהור ה-DNA שהוכן בקצה. לאחר מכן ניתן לאחסן את הדנ"א המטוהר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מקסימום של שבעה ימים.
  2. קשירת ברקוד מקורית
    1. הפשירו והכינו את החרוזים המגנטיים לטיהור DNA ובחירת גודל, חרוזי ניקוי DNA פרמגנטיים, EDTA וברקודים מקוריים (NB01-96) לפי הוראות היצרן, ולאחר מכן הניחו אותם על קרח.
    2. בצינורות PCR חדשים, הוסף את הדברים הבאים ברצף: 2.75 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז, 1 מיקרוליטר של DNA מוכן קצה, 1.25 מיקרוליטר ברקודים מקוריים (NB01-96) ו-5 מיקרוליטר של תערובת אנזים קשירת DNA.
    3. מערבבים כל תגובה על ידי פיפטינג בעדינות 10 פעמים, סובבו קצרות באמצעות מיקרו-צנטריפוגה ודגרו במשך 20 דקות ב-RT.
    4. מוסיפים 1 מיקרוליטר EDTA לכל באר, מערבבים היטב על ידי פיפטינג ומסובבים קצרות.
    5. דגימות מקודדות בבריכה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
    6. השעו מחדש את חרוזי ניקוי ה-DNA על ידי מערבולת והוסיפו פי 0.7 מנפח הדגימה הכולל (למשל, עבור 23 דגימות בנפח כולל של 253 מיקרוליטר, הוסיפו 177.1 חרוזי מיקרוליטר).
    7. מערבבים את התמיסה על ידי פיפטינג ומדגרים על HulaMixer למשך 10 דקות ב-RT.
    8. הכן 2 מ"ל של 80% אתנול על ידי ערבוב של 1600 מיקרוליטר אתנול טהור עם 400 מיקרוליטר NFW.
    9. הנח את הצינור על מתלה מגנטי למשך 5 דקות עד שהפליטה צלולה וחסרת צבע.
    10. הסר והשליך את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה.
    11. שוטפים את החרוזים עם 700 מיקרוליטר אתנול 80% טרי שהוכן מבלי להפריע לגלולה, ואז מוציאים וזורקים את האתנול.
    12. חזור על שלב שטיפת האתנול.
    13. צנטריפוגה קצרה של הצינור, חזור למתלה המגנטי והסר שאריות אתנול.
    14. הניחו לחרוזים להתייבש באוויר למשך 30 שניות.
    15. הסר את הצינור מהמתלה המגנטי, השהה מחדש את החרוזים במים נטולי נוקלאז של 35 מיקרוליטר על ידי החלקה עדינה, ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    16. החזר את הצינור למתלה המגנטי עד שהפליטה צלולה וחסרת צבע.
    17. העבירו 35 מיקרוליטר של הפליטה לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל לשלבים הבאים.
      הערה: ניתן לאחסן את הספרייה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בשלב זה.
  3. קשירת מתאם וניקוי
    1. הכן את ערכת הריאגנטים המהירה לקשירת DNA לפי הוראות היצרן והניח אותה על קרח.
    2. ערבבו את המתאם המקורי (NA) ואת הליגאז המהיר על ידי פיפטינג, ולאחר מכן הניחו על קרח.
    3. הפשירו את מאגר הפליטה (EB) ב-RT, מערבולת, צנטריפוגה, והניחו אותו על קרח.
    4. להפשיר מאגר שבר קצר (SFB) ב-RT, מערבולת, צנטריפוגה ולהניח על קרח.
    5. בצינור מיקרו-צנטריפוגה בעל קשירה נמוכה של 1.5 מ"ל, מערבבים את הדברים הבאים: 30 מיקרוליטר של דגימה ברקודית מאוחדת, 5 מיקרוליטר של מתאם מקורי (NA), 10 מיקרוליטר של מאגר תגובת קשירה מהירה, ו-5 מיקרוליטר של ליגאז T4 DNA מהיר פעולה.
    6. פיפטה בעדינות לערבב, צנטריפוגה קצרה ודגירה למשך 20 דקות ב-RT.
    7. השעו מחדש את חרוזי ניקוי ה-DNA על ידי מערבולת והוסיפו 20 מיקרוליטר (0.4x) של חרוזים לתגובה.
    8. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג ומדגרים על HulaMixer למשך 10 דקות ב-RT.
    9. גלולה את החרוזים על מתלה מגנטי ושאבו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
    10. שטפו את החרוזים על ידי הוספת 125 מיקרוליטר של מאגר שבר קצר (SFB), השעו מחדש על ידי החלקה, צנטריפוגה קצרה והחזרו למתלה המגנטי.
    11. גלול את החרוזים ושאף את הסופרנטנט; חזור על שלב הכביסה פעם אחת.
    12. צנטריפוגה קצרה, החזר את הצינור למתלה המגנטי ושאף כל שאריות סופרנטנט.
    13. הסר את הצינור מהמתלה המגנטי והשהה מחדש את החרוזים ב-15 מיקרוליטר של מאגר Elution (EB).
    14. צנטריפוגה קצרה ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לחסל את ה-DNA.
    15. הנח את הצינור על המתלה המגנטי, גלול את החרוזים עד שהפליטה צלולה וחסרת צבע, ושאבו 15 מיקרוליטר מהפליטה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל.
    16. כמת 1 מיקרוליטר של הפליטה.
    17. לדלל את הספרייה ל-20 fmol (לחשב באמצעות מחשבון NEB) ולהשתמש ב-12 מיקרוליטר מתוך הספרייה המוכנה של 20 fmol לריצוף בתא הזרימה R10.4.1.
      הערה: כעת ניתן לאחסן את הספרייה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס, מה שמאפשר שימוש חוזר.
  4. תחול וטעינה של תא הזרימה של רצף הננו-נקבוביות
    1. הפשירו את מאגר הרצף (SB), חרוזי הספרייה (LIB), קשירת תא הזרימה (FCT) ושטיפת תאי הזרימה (FCF) ב-RT, ערבבו אותם על ידי מערבולת וסובבו אותם כלפי מטה.
    2. הכן את תערובת תחול תאי הזרימה על ידי שילוב של 5 מיקרוליטר של אלבומין בסרום בקר (BSA, 50 מ"ג/מ"ל), 30 מיקרוליטר של קשירה של תאי זרימה (FCT) ו-1170 מיקרוליטר של שטיפת תאי זרימה (FCF), ערבוב התמיסה על ידי היפוך ופיפטינג.
    3. פתח את יציאת ההתחלה של תא הזרימה, שאב ~20 מיקרוליטר של מאגר כדי להסיר בועות אוויר, טען 800 מיקרוליטר מתערובת ההתחלה לתוך יציאת ההתחלה מבלי להכניס בועות אוויר, והמתן 5 דקות.
    4. הכן את הספרייה על ידי ערבוב של 37.5 מיקרוליטר של מאגר רצף (SB), 25.5 מיקרוליטר של חרוזי ספרייה (LIB) או פתרון ספרייה (LIS), ו-12 מיקרוליטר של ספריית ה-DNA של 20 fmol בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, תוך ערבוב יסודי על ידי פיפטינג.
    5. הפעל שוב את תא הזרימה על ידי הרמה עדינה של מכסה יציאת הדגימה של תא הזרימה, טעינת 200 מיקרוליטר מתערובת ההתחלה לתוך יציאת ההתחלה מבלי להכניס בועות אוויר, והכנת הספרייה לטעינה.
    6. מערבבים את הספרייה המוכנה בעדינות על ידי פיפטינג וטען 75 מיקרוליטר מהספרייה לתוך יציאת הדגימה של תא זרימת הריצוף, תוך הבטחה שכל טיפה זורמת לתוך היציאה לפני הוספת הבאה.
    7. סגור את מכסה יציאת הדגימה של תא הזרימה, וודא שהבאנג נכנס ליציאת הדגימה של תא הזרימה, ולאחר מכן סגור את יציאת ההתחלה.
    8. חבר את התקן הרצף הנייד למחשב (עם ספק כוח ללא הפרעה) והתחל ריצוף באמצעות תוכנת בקרה וניתוח של התקן ריצוף.
  5. פרמטרים של תוכנה
    הערה: יישום תוכנה זה, שפותח על ידי ONT, משמש לניהול מקיף של ריצות ריצוף והפקת דוחות מפורטים.
    1. כדי להתחיל את תהליך הרצף, אנא בחר באפשרות התחל ואחריה התחל רצף.
      הערה: לאחר מכן תתבקש להקצות תיקיה לאחסון קבצים ולספק שם להפעלת הרצף, לדוגמה, "sequencing_run_1". לאחר מכן, לחץ על המשך להגדרות כדי לבחור את שם הערכה המתאים, כגון library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96, והתאם אישית את זמן הריצה הרצוי, למשל, 20 שעות (זמן הריצה המרבי הוא 72 שעות).
    2. לאחר מכן, בחר את סוג קובץ הפלט, ובחר מבין אפשרויות כגון POD5 לקריאות פלט גולמיות ו-FASTQ עבור פלטים בסיסיים. לאחר מכן, בחר את מודל FAST-Basecalling.
    3. שים לב שחלק מהגדרות ברירת המחדל כוללות סריקת נקבוביות תכופה כל שעה וחצי, אורך קריאה מינימלי של 200 bp וציון איכות מינימלי של 8. לבסוף, סקור את ההגדרות והתחל בתהליך הקריאה.

3. ניתוח לאחר ריצוף

  1. דרישות מערכת
    הערה: מדריך להגדרת הסביבה ולניתוח נתוני ריצוף מגבר Mycobacterium tuberculosis באמצעות צינור ONT-TB-NF. ההוראות מתייחסות הן למשתמשי Windows (באמצעות WSL) והן למשתמשי macOS.
    1. השתמש במערכת ההפעלה הבאה: Windows 10/11 (עם WSL2) או macOS; זיכרון: זיכרון RAM של 8 GB לפחות (מומלץ 16 GB); אחסון: לפחות 50 ג'יגה-בייט של שטח דיסק פנוי; אינטרנט: נדרש להורדת חבילות ונתונים; הרשאות: יכולת להתקין תוכנה ולנהל סביבות.
  2. ודא את הגדרת הסביבה הבאה: משתמשי Windows (באמצעות WSL2). הפוך את WSL2 לזמין.
    1. פתח את PowerShell כמנהל והפעל: wsl - install.
    2. הפעל מחדש את המחשב כאשר תתבקש לעשות זאת.
  3. התקן את אובונטו
    1. לאחר ההפעלה מחדש, הפעל את Microsoft Store, חפש את אובונטו והתקן את הגרסה המועדפת (למשל, אובונטו 22.04 LTS).
    2. הפעל את אובונטו מתפריט התחל .
    3. צור שם משתמש וסיסמה חדשים של UNIX כאשר תתבקש לעשות זאת.
    4. עדכן רשימות חבילות: sudo apt update & sudo apt upgrade -y.
  4. משתמשי macOS
    1. התקן את Homebrew (אם עדיין לא מותקן): /bin/bash -c "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)".
    2. התקן את החבילות הנדרשות: לחלוט להתקין git wget
  5. התקנת קונדה או ממבה
    1. בקרו בדף ההורדה של Miniconda כדי להוריד את תוכנית ההתקנה הנכונה למערכת ההפעלה.
    2. כדי להתקין את Miniconda, הפעל את תוכנית ההתקנה ופעל לפי ההוראות שעל המסך. לאחר השלמת ההתקנה, הפעל מחדש את הטרמינל.
    3. הגדר ערוצי Conda:
      conda config - הוסף ברירות מחדל של ערוצים
      Conda Config - הוסף ערוצים BioConda
      conda config - הוסף ערוצים conda-forge
    4. התקנת Mambaforge (Mamba)
      עבור לינוקס:
      ווגט
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      עבור macOS:
      WGET https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
    5. התקן את Mambaforge: bash Mambaforge-*.sh
    6. עקוב אחר ההנחיות כדי להשלים את ההתקנה, והפעל מחדש את הטרמינל שלך כדי להפעיל את Mamba.
  6. הגדרת קו הצינור ONT-TB-NF
    1. צור סביבת קונדה חדשה: conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    2. לחלופין, השתמש ב-Mamba: mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    3. הפעל את הסביבה: conda activate ont_tb_env
    4. התקן את Nextflow: תלתל -s https://get.nextflow.io | באש, sudo mv nextflow /usr/local/bin/
    5. שיבוט מאגר ONT-TB-NF: GIT CLONE https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      תקליטור ONT-TB-NF
    6. משיכת תמונות Docker נדרשות (אם משתמשים ב-Docker)
      Docker Pull Hkubal/Clair3:V0.1-R12
      quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0 משיכת עגינה
  7. הפעלת הצינור
    1. שרשר את קבצי Basecalled FASTQ של כל דוגמה באופן עצמאי באמצעות הפקודה הבאה.
      חתול *.fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      הפעל את Nextflow run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /path/to/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /path/to/amplicon_regions.bed \
      אשכולות 16 \
      output_dir /absolute/path/to/output_directory
  8. קבצי פלט ופרשנות
    1. לאחר ביצוע מוצלח, ודא שהצינור מייצר את הפלטים הבאים בספריית הפלט שצוינה:
      1. קריאות מיושרות: *.bam files.
      2. קריאות וריאנט: *.vcf קבצים המכילים SNPs ו-indels.
      3. דוחות סיכום: *.csv או *.tsv המסכמים מוטציות עמידות לתרופות ומדדים רלוונטיים אחרים.
      4. דוחות בקרת איכות: קבצי *.htmL שנוצרו על ידי כלים כמו MultiQC.
      5. יומני רישום: יומנים מפורטים של ביצוע קו הצינור.
      6. קבצי ביניים: מאוחסנים בספריית העבודה (ניתן למחוק לאחר הפעלה מוצלחת).
        הערה: במקרה של נתקל בשגיאות הרשאה, חיוני לוודא שיש לך את ההרשאות הדרושות לקריאה וכתיבה של קבצים, כמו גם להפעלת סקריפטים. בנוגע לנושאים סביבתיים, אנא ודא שסביבת Conda המתאימה מופעלת לפני ביצוע הצינור. למי שמשתמש בפרופילי Docker, חובה לאשר ש-Docker מותקן ותפעולי כאחד. בנוסף, יש לנטר את משאבי המערכת בקפדנות כדי למנוע מגבלות זיכרון או אחסון במהלך הביצוע. סקירה כללית של מתודולוגיות אלה מוצגת באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת מיצוי ה-DNA שנבחרה נבחרה בשל יעילותה ותפוקתה המעולה בהשוואה לטכניקות מהירות אחרות. הוא ייצר באופן עקבי DNA גנומי באיכות גבוהה (gDNA), ושילוב שלב ניקוי מבוסס חרוזים עזר למזער את זמן העיבוד תוך הפחתת עלויות לדגימה. זה הושג על ידי ביטול הצורך בהערכות בקרת איכות נוספות כגון מדידות ספקטרופוטומטריות, כאשר פלואורומטריה היא הכלי היחיד לכימות DNA. ריכוזי פוסט-PCR נמצאו אופטימליים לריצוף הן בפלטפורמות הקריאה הקצרה והן בפלטפורמות הקריאה הארוכה (טבלה 2). שלמות האמפליקון אושרה ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פלטפורמת ריצוף הקריאה הארוכה הדגימה יתרונות בולטים במחקר זה, במיוחד יכולתה להשיג ריצוף מהיר עם רוחב כיסוי גבוה באופן עקבי. בכל המבודדים שרוצפו בהצלחה, הושג רוחב כיסוי של 99.9%, מה שמצביע על ייצוג כמעט מלא של אזורים גנומיים הקשורים לעמידות. עומק הכיסוי הממוצע של כל הגנים הממוקדים היה 4462X, כאשר הגן eis הראה את העומק הגבוה ביותר ב-22,242.08X והגן rrs הנמוך ביותר ב-99.46X. ערכים אלה משקפים את יכולתה של הפלטפורמה לייצר נתונים מספיקים לחיזוי אמין של עמידות לתרופות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להביע את תודתנו הכנה למרכז SAMRC לשחפת באוניברסיטת סטלנבוש על אספקת המשאבים והמתקנים החיוניים. אנו גם אסירי תודה למחקר TS ELiOT על אספקת הדגימות שהיו חלק בלתי נפרד ממחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 מ"ל & שפופרות קשירת לואו בנפח 1.5 מ"ל או 2 מ"לאפנדורףEP0030108051-250EA
סולם 1kbתרמו פישר סיינטיפיקSM0311
צינורות עם מכסה בורג 2 מ"לScientific Specialties IncP2TUB056C-0001.5ST
חרוזי זכוכית סטריליים בקוטר 2 מ"מסיגמא-אלדריץ'Z273627-1EA
חרוז AMPure XPבקמן קולטרA63881
Deeplex Myc-TB ג'נוסקרין20090205
תא אלקטרופורזהתרמו פישר סיינטיפיקA25977
אלכוהול אתיל, טהורסיגמא-אלדריץ'E7023-500ML
הומוגנייזר FastPrepביומדיקל MP116005500
קצות פיפטות מסנן (10 ומיקרו; L) ביו-סמארט סיינטיFT-10-R
קצות פיפטות פילטר (1000 ומיקרו; L) ביו-סמארט סיינטיFT-1000-R
קצות פיפטת פילטר (20 ומיקרו; L) ביו-סמארט סיינטיFT-20-R
קצות פיפטת פילטר (200 ומיקרו; L) ביו-סמארט סיינטיFT-200-R
Flow-cell אוקספורד ננופור טכנולוגיותFLO-MIN114
בלוק חימוםאפנדורף5382000031
מטריצת InstaGeneביו-ראדBBRD7326030
Magnetic Rack תרמו פישר סיינטיפיק 12321D
מיקרוצנטריפוגהאפנדורף 5406000046
מיניוןאוקספורד ננופור טכנולוגיותMK1B
ערכת ברקודינג מקורית V14 אוקספורד ננופור טכנולוגיותSQK-NBD114.24
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367
מודול ליגציה מהירה NEBNextNEBE6056
מודול תיקון/זנב dA של NEBNext Ultra II EndNEBE7546
מים ללא נוקלאז (NFW)תרמו פישר סיינטיפיקAM9937
פיפטות (P10, P20, P200 ו-P1000)אפנדורףEP3123000918-1EA
צינורות בדיקת קיוביטתרמו פישר סיינטיפיקQ32856
ערכת בדיקת HS של קיוביט dsDNAתרמו פישר סיינטיפיקQ33231
פלואורומטרי קיוביטתרמו פישר סיינטיפיקQ33226
זן ג'ל SYBR Safe DNAתרמו פישר סיינטיפיקS33102
אולטרהפיור אגרוזתרמו פישר סיינטיפיק17852
Universal Hood III טרנסלומיימייטור (מערכת Molecular Imager Gel Doc XR)ביו-ראד170-8170
מערבל מערבולתLasecWMBB0L0E0216

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuberculosis report. Baltimore Health News. , WHO. (2022).
  2. WHO Malaria Department report. Report 20-23. , WHO. (2023).
  3. The End Strategy TB. 53 (1), WHO. 1689-1699 (2015).
  4. Cabibbe, A. M., et al. Application of targeted nextgeneration sequencing assay on a portable sequencing platform for culturefree detection of drugresistant tuberculosis from clinical samples. J Clin Microbiol. 58 (10), e0063220(2020).
  5. Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culturefree prediction of susceptibility or resistance to 13 antituberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
  6. NG, K. C. S., et al. How well do routine molecular diagnostics detect Rifampin. J Clin Microbiol. 57 (1), e0128723(2019).
  7. MacLean, E., Kohli, M., Weber, S. F., Suresh, A. Advances in molecular diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol. 58 (10), e0158219(2020).
  8. Sibandze, D. B., et al. Rapid molecular diagnostics of tuberculosis resistance by targeted stool sequencing. Genome Med. 14 (1), 42(2022).
  9. Shah, M., Chihota, V., Coetzee, G., Churchyard, G., Dorman, S. E. Comparison of laboratory costs of rapid molecular tests and conventional diagnostics for detection of tuberculosis and drugresistant tuberculosis in South Africa. BMC Infect. Dis. 13 (1), 352(2013).
  10. Hu, T., Chitnis, N., Monos, D., Dinh, A. Nextgeneration sequencing technologies: An overview. Hum Immunol. 82 (10), 801-811 (2021).
  11. Pervez, M. T., et al. A comprehensive review of performance of nextgeneration sequencing platforms. Biomed Res Int. 2022, 3457806(2022).
  12. Tafess, K., et al. Targetedsequencing workflows for comprehensive drug resistance profiling of Mycobacterium tuberculosis cultures using two commercial sequencing platforms: Comparison of analytical and diagnostic performance, turnaround time, and cost. Clin Chem. 66 (6), 809-820 (2020).
  13. Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. WHO rapid communication. , WHO. https://www.who.int/publications/i/item/9789240076372 (2023).
  14. Hazra, D., et al. Impact of wholegenome sequencing of Mycobacterium tuberculosis on treatment outcomes for MDRTB/XDRTB: A systematic review. Pharmaceutics. 15 (6), 1408(2023).
  15. Shea, J., et al. Comprehensive wholegenome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State. J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).
  16. Meehan, C. J., et al. Whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis: Current standards and open issues. Nat Rev Microbiol. 17 (10), 533-545 (2019).
  17. Heupink, T. H., Verboven, L., Warren, R. M., Van Rie, A. Comprehensive and accurate genetic variant identification from contaminated and lowcoverage Mycobacterium tuberculosis whole genome sequencing data. Microb Genom. 7 (1), e000555(2021).
  18. Wang, X., et al. Interpretation of the third edition of WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 3: Diagnosis: Rapid diagnostics for tuberculosis detection. Chin J Antituberc. 46 (2), 120-130 (2024).
  19. Kambli, P., et al. Targeted nextgeneration sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drugresistant Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 127 (1), 102051(2021).
  20. Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. Rapid Communication. , WHO. 1-8 (2023).
  21. Nandlal, L., Perumal, R., Naidoo, K. Rapid molecular assays for the diagnosis of drugresistant tuberculosis. Infect Drug Resist. 15 (1), 4971-4984 (2022).
  22. Dippenaar, A., et al. Nanopore sequencing for Mycobacterium tuberculosis: A critical review of the literature, new developments, and future opportunities. J Clin Microbiol. 60 (5), e0123422(2022).
  23. Chan, W. S., et al. Rapid and economical drug resistance profiling with nanopore MinION for clinical specimens with low bacillary burden of Mycobacterium tuberculosis. BMC Res Notes. 13 (1), 123(2020).
  24. Feuerriegel, S., et al. Rapid genomic first and secondline drug resistance prediction from clinical Mycobacterium tuberculosis specimens using DeeplexMycTB. Eur Respir J. 57 (4), 2004784(2021).
  25. GenoScreen product brochure. Deeplex MycTB. , GenoScreen. (2023).
  26. Mtafya, B., et al. A practical approach to render tuberculosis samples safe for application of tuberculosis molecular bacterial load assay in clinical settings without a biosafety level 3 laboratory. Tuberculosis. 138 (1), 102194(2023).
  27. Suganthi, P., Usharani, B., Venkateswari, R., Muthuraj, M. Biosafety practices in mycobacteriology laboratory. Research Advances in Microbiology and Biotechnology. 3, B P International (a part of SCIENCEDOMAIN International). Chennai. 1-39 (2023).
  28. consolidated guidelines on tuberculosis. Module 4: Treatment and care. WHO guideline. , WHO. (2022).
  29. Williams, J., et al. Matrixbased DNA extraction for targeted nextgeneration sequencing on decontaminated sputum samples. J Vis Exp. (181), e68147(2025).
  30. Delahaye, C., Nicolas, J. Sequencing DNA with nanopores: Troubles and biases. PLoS One. 16 (2), e0245534(2021).
  31. Zhao, K., et al. Rapid identification of drugresistant tuberculosis genes using direct PCR amplification and Oxford Nanopore Technology sequencing. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2022, 8845672(2022).
  32. Tagliani, E., et al. Culture and nextgeneration sequencingbased drug susceptibility testing unveil high levels of drugresistantTB in Djibouti: Results from the first national survey. Sci Rep. 7 (1), 15076(2017).
  33. Smith, C., Halse, T. A., Shea, J., Modestil, H., Fowler, R. C. Assessing nanopore sequencing for clinical diagnostics: For Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 59 (7), e0123421(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Long Read SequencingAmplicon SequencingDrug Resistant TuberculosisTargeted NGSPortable SequencingDNA Library PreparationResistance Variant DetectionFlow Cell PrimingGel ElectrophoresisBioinformatics Pipeline

מאמרים קשורים