מאמר שיטה

הדמיה אורגנואידית רשתית בהרכבה שלמה עם רזולוציה תאית

DOI:

10.3791/68384

⸱

20 ביוני 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ICFO-Institut de Ciències Fotòniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Ophthalmology Group, Hospital Universitari Vall d'Hebron, Vall d'Hebron Institut de Recerca (VHIR)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה משלב ניקוי אופטי ותיוג חיסוני להדמיה קונפוקלית בנפח מלא של אורגנואידים ברשתית שלמה. הוא משמר מבנה תלת מימדי, מאפשר הדמיה מפורטת של מסלולים עצביים מרכזיים, משפר את חקר הבשלת הרשתית, ארגון מרחבי ויישומיו הפוטנציאליים במודלים של מחלות ורפואה מותאמת אישית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים ברשתית שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם הם מבנים תלת מימדיים מורכבים המחקים את הרשתית האנושית, ומציעים פלטפורמה רבת עוצמה לחקר התפתחות הרשתית, מנגנוני מחלה ואסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות. יתרה מכך, מכיוון שהם נגזרים ממטופלים, הם הופכים פופולריים יותר ויותר מכיוון שהם טומנים בחובם הבטחה גדולה ככלי לרפואה מותאמת אישית. בניגוד לתרביות תאים דו-ממדיות קונבנציונליות, אורגנואידים ברשתית משמרים את הארכיטקטורה התלת-ממדית המקורית של הרשתית, ומאפשרים ייצוג מציאותי יותר ומאפשרים מחקרים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית. עם זאת, המורכבות המבנית שלהם, צפיפות התאים הגבוהה וההרכב המגוון מציבים אתגרים משמעותיים לאפיון.

כדי להתמודד עם אתגרים אלה ולשפר את ההבנה שלנו לגבי הבשלת אורגנואידים ברשתית תוך שמירה על ההקשר התלת-ממדי, שילבנו שיטות ניקוי אופטי עם תיוג חיסוני כדי לדמיין את כל המבנה של אורגנואידים בהרכבה שלמה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. לשם כך, השתמשנו בשיטת סליקה התואמת ליעדי צמצם מספרי נמוך וגבוה, המאפשרת הדמיה בנפח מלא ולכידת אזורי עניין מסוימים ברזולוציה סלולרית. באמצעות גישה זו, זיהינו את המורפולוגיה וההתפלגות בתלת מימד של שלושת מסלולי הנוירונים העיקריים האחראים להעברת המידע החזותי: קולטני אור חרוט ומוט, תאים דו קוטביים וגנגליון. הממצאים שלנו שופכים אור נוסף על טכניקות ההדמיה לטיפול בארגון המרחבי של תאי הרשתית בתוך האורגנואיד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים ברשתית

אורגנואידים ברשתית הם מבנים תלת מימדיים מורכבים המחקים את הרשתית האנושית, ומציעים פלטפורמה רבת ערך לחקר התפתחות הרשתית, מנגנוני מחלה ואסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות1. הם שומרים על הארכיטקטורה התלת-ממדית הטבעית של הרשתית, מפגינים נאמנות טרנסקריפטומית ויכולת תפקודית, משחזרים פוטו-טרנסדוקציה וקישוריות סינפטית2. בנוסף, הם מחקים מקרוב את התפתחות in vivo 3,4, מה שמאפשר ייצוג מציאותי יותר בהשוואה לתרביות תאים שטוחות. במחקרים קודמים, Isla-Magrané et al. קבעו פרוטוקול דו-שלבי להשגת אורגנואידים רב-עיניים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSC) כדי לדגמן תכונות תאיות של העין האנושית בהתפתחות 5,6. בשל המחסור ברקמות עובריות, מחקר התפתחות העין האנושית הוגבל למחקרים אנטומיים.

האורגנואידים ברשתית שהושגו בפרוטוקול זה הפגינו שכבות מתאימות והכילו את כל תת-הסוגים העיקריים של תאי הרשתית, כגון קולטני אור, תאים דו קוטביים, תאי גנגליון, תאים אמקרינים ואופקיים ומקרוגליה, יחד עם מאפיינים מורפולוגיים מרכזיים וארגון וחיבורים מרחביים נכונים. מודלים אורגנואידים, למרות שהם פתרון פוטנציאלי, מציגים שונות משמעותית, מה שמקשה על השגת תוצאות עקביות. לכן, יש צורך דחוף להשתמש במגוון טכנולוגיות מתקדמות במודלים אנושיים אמינים יותר. עד כה, אורגנואידים אלה נחקרו רק באמצעות חתכים היסטולוגיים, שכן ההרכב התאי המורכב, הצפיפות והגודל שלהם מעכבים את חדירת האור, וכתוצאה מכך ביצועי הדמיה אופטית גרועים בשכבות עמוקות יותר, ובכך מגבילים את הניתוח המקיף.

הדמיה בהרכבה שלמה

טכניקות היסטולוגיות מסורתיות, הכוללות חתך וצביעה של רקמות קבועות, יכולות לספק מידע מפורט על אזורים ספציפיים אך אינן מצליחות ללכוד את הארכיטקטורה הכוללת ואת היחסים המרחביים בתוך האורגנואיד כולו. כדי להתגבר על מגבלה זו, הדמיה שלמה מתגלה ככלי רב ערך לחקר אורגנואידים ברשתית. הדמיה שלמה מאפשרת הדמיה של האורגנואיד כולו בצורתו התלת מימדית השלמה, תוך שמירה על ההתפלגות המרחבית של סוגי תאים ורכיבי מטריצה חוץ-תאיים. גישה זו מועילה במיוחד לחקירת ההרכב התאי בתוך ובין אורגנואידים, ומספקת הבנה מלאה יותר של תהליכי ההתפתחות והארגון התפקודי שלהם. עם זאת, בשל צפיפות התאים והדחיסה שלהם, אורגנואידים ברשתית אטומים (איור 1, לא נקי). האטימות המובנית של הדגימות גורמת לפיזור אור, מה שמפריע להדמיה מפורטת של מבנים פנימיים באמצעות מיקרוסקופיה. כאן, טכניקות ניקוי אופטי מתגלות ככלי רב עוצמה.

טכניקות קלירינג אופטי

ניקוי אופטי מתייחס לטיפולים פיזיקוכימיים שהופכים דגימות ביולוגיות עבות לשקופות על ידי הומוגניזציה של שיפועי מקדם השבירה (RI) של הרקמה כך שיתאימו לאלה של חומר הניקוי והסרת חומרים סופגי אור7. שיטות אלו מפחיתות באופן דרמטי את פיזור האור ומגבירות את השקיפות. טרנספורמציה זו מאפשרת לנו לראות דרך כל האורגנואיד ברשתית, ומאפשרת ניתוח מקיף של הארגון והתאים המורכבים והמורפולוגיה שלו באמצעות טכניקות הדמיה שלמות. בפועל, זה מושג על ידי הספגת הדגימה בחומר RI גבוה והסרת שומנים ופיגמנטים.

קיימות שיטות ניקוי שונות, שונות בהיבטים שונים (למשל, מידת שקיפות, תאימות לטכניקות מיקרוסקופיות, דגימות ומולקולות פלואורסצנטיות, היתכנות, משך זמן), אך אף אחת מהן אינה בולטת כפרוטוקול הנפוץ הטוב ביותר8. הם מסווגים לארבע קבוצות עיקריות: (1) טבילה פשוטה, (2) הידרופובית של מבוססת ממס אורגני, (3) מבוססת היפר-הידרציה, ו-(4) מבוססת על טרנספורמציה של רקמות או הטמעת הידרוג'ל, כפי שסוכם יפה על ידי אבילוב ואחרים7. כל השיטות כוללות שלב להתאמת ה-RI, בדרך כלל על ידי טבילת הדגימה בתמיסה התואמת את ה-RI הממוצע של הרקמה. בשיטות הידרופוביות מסירים שומנים ומים על ידי טבילת הדגימה בריכוז ממס אורגני הולך וגדל (כגון מתנול או פרופנול).

הפרוטוקול המוצג הוא שיטה אופטימלית המשלבת ניקוי אופטי עם תיוג חיסוני כדי להקל על הדמיה תלת מימדית שלמה של אורגנואידים ברשתית עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, המאפשרת הדמיה בנפח מלא תוך שמירה על שלמות המבנה. גישה זו מאפשרת זיהוי של סוגי תאי רשתית מרכזיים בתוך האורגנואיד, ומספקת לחוקרים כלי רב עוצמה לחקור את התבגרות האורגנואידים ברשתית וארגון מרחבי בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת נוגדנים משניים פלואורסצנטיים בהתאמה אישית

הערה: גישה זו משמשת כחלופה לשימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים מסחריים (ראה דיון על היתרונות של הכנת נוגדנים משניים פלואורסצנטיים). יתר על כן, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לצימוד פלואורופורים לנוגדנים ראשוניים במקרה שיש לבצע אימונופלואורסצנציה ישירה והנוגדן הראשוני הפלואורסצנטי אינו זמין מסחרית. שליטה ביחס הפלואורופור לנוגדנים על ידי התאמת כמות הפלואורופור בתגובת התיוג מייצרת נוגדנים מצומדים בהירים יותר. עם זאת, נוגדנים משניים בהתאמה אישית הם פחות יציבים, וריכוז המצומד שנוצר נמוך פי 10 מזה של הנוגדנים הפלואורסצנטיים המסחריים. פרוטוקול זה מותאם מהעבודה שתוארה על ידי Bálint et al9.

  1. ממיסים 1 מ"ג מהפלואורופור ב-DMSO נטול מים ומכניסים לצינורות לקבלת 0.02 מ"ג אחרון של פלואורופור לכל צינור. הסר את כל ה-DMSO באמצעות רכז ואקום מהיר, הפועל במשך שעה ו-30 דקות. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. עבור Alexa Fluor 405, H2O טהור במיוחד הוא הממס המתאים להכנת מכסים.
  2. לביצוע תגובת התיוג, יש להמיס כמות אחת של הפלואורופור ב-1-10 מיקרוליטר של DMSO (או H2O טהור במיוחד עבור Alexa Fluor 405).
    הערה: הכמות המדויקת של DMSO נקבעת באמצעות בדיקות צימוד בקרה קודמות. בדיקות אלו מבוצעות כאשר יש להשתמש באצווה חדשה של פלואורופור (או כאשר נגמרת אצווה קודמת של פלואורופור), או כאשר נעשה שימוש בפלואורופור חדש בפעם הראשונה בצימוד. בדיקת צימוד הבקרה כוללת ביצוע תגובות תיוג עם כמויות משתנות של פלואורופור כדי לקבוע את היחס האופטימלי בין פלואורופור לנוגדנים במצומד. במקרה שלנו, היחס האופטימלי נופל בדרך כלל בין 3 μL ל-5 μL.
  3. דגירה של 50 מיקרוליטר של IgG משני (או ראשוני), 6 מיקרוליטר של 1 M NaHCO3 ו-1-5 מיקרוליטר של פלואורופור למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על פלטפורמת נדנדה, מוגנת מפני אור.
  4. בזמן שהתגובה מתקדמת, הכן את עמודות אי הכללת גודל הטיהור על ידי הסרת המכסים שלה ומתן אפשרות למאגר לעבור. אזן את העמודה (אחת לכל תגובת תיוג) על ידי הפעלת 3 x 2-3 מ"ל של PBS דרך העמודה. במקרה ששלב שיווי המשקל האחרון מסתיים לפני סיום הדגירה, החזר את המכסים לאחור כדי למנוע התייבשות והמתן עד שתגובת התיוג תסתיים.
    הערה: עמודות אי הכללה של גודל טיהור פועלות לפי כוח הכבידה. וודאו שהעמוד לא יתייבש בכל רגע, אחרת תגובת הטיהור לא תפעל כראוי.
  5. כאשר התגובה מסתיימת (שלב 1.3), הוסף 140 מיקרוליטר של PBS לתגובת התיוג כדי להפוך את הנפח לכ-200 מיקרוליטר ולמערבל אותו. הוסף פתרון זה למרכז העמודה, אפשר לדגימה להיכנס לעמודה, ולאחר שהטיפה האחרונה נפלטה, דחוף על ידי הוספת 550 מיקרוליטר של PBS. כאשר הנוזל מפסיק ליפול, יש להוציא על ידי הוספת 300 מיקרוליטר PBS ולאסוף בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  6. חשב את ריכוז הנוגדנים ויחסי התיוג על ידי מדידת ספיגת הדגימה ב-280 ננומטר והספיגה של הפלואורופורים המשמשים. החל את חוק באר-למברט לקביעת הריכוז (במולריות) כדלקמן:
    figure-protocol-1
    כאשר A מייצג את הספיגה, ε את מקדם ההכחדה המולארית, ו-CF280 הוא מדד לספיגה שיש לפלואורופור הספציפי ב-280 ננומטר המשמש כגורם תיקון. לאחר מכן, ריכוז הנוגדן הוא:
    figure-protocol-2
    ויחס התיוג הוא:
    figure-protocol-3
  7. אחסן את הנוגדנים המסומנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנים מפני אור, עד 6 חודשים.

2. תיוג אימונופלואורסצנטי

  1. תקן את האורגנואידים עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-RT למשך 45 דקות.
    הערה: אופציונלי: דגירה על האורגנואידים עם תמיסת אחזור אנטיגן (שלבים 2.2 ו-2.3) כדי לשפר את התגובתיות החיסונית של האנטיגנים.
  2. הכן 40 מ"ל של תמיסת אחזור אנטיגן על ידי ערבוב של 0.117 מ"ג נתרן ציטראט טרי-בייסי דיהידראט ב-H2O טהור במיוחד והתאם ל-pH 9.
  3. דגרו את האורגנואידים עם תמיסת אחזור האנטיגן עם ניעור קל (30 סל"ד) ב-60 מעלות צלזיוס למשך שעה.
  4. לחדור את האורגנואידים עם PBST (PBS עם 1% Triton X-100) עם ניעור קל ב-RT למשך 4 שעות.
  5. יש לחסום את האורגנואידים באמצעות תמיסת חסימה (2% אלבומין בסרום בקר (BSA) עם 0.1% טריטון X-100) ב-RT למשך הלילה (או מעל יום אחד).
    הערה: ריכוזי הנוגדנים הראשוניים והמשניים תלויים בנוגדנים הספציפיים. עבור אימונופלואורסצנציה של דגימות שלמות, אנו משתמשים בריכוז גבוה יותר בהשוואה לדגימות חתוכות. אנו דוגרים על הנוגדן העיקרי ב-10 מיקרוגרם/מ"ל, אשר ברוב המקרים מתאים ל-1:100 מהמלאי (טבלה 1). אנו מדגרים את הנוגדנים המשניים שלנו בהתאמה אישית ב-20-50 מיקרוגרם/מ"ל.
  6. דגרו על האורגנואידים עם הנוגדנים העיקריים המדוללים בתמיסת שטיפה (0.1% BSA עם 0.1% טריטון X-100) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך יומיים עם טלטול קל.
  7. שטפו את האורגנואידים במשך 3 x 15 דקות בתמיסת כביסה עם ניעור קל ב-RT.
  8. דגרו על האורגנואידים עם הנוגדנים המשניים המדוללים בתמיסת כביסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך יומיים עם טלטול קל.
  9. שטפו את האורגנואידים במשך 3 x 15 דקות בתמיסת כביסה עם ניעור קל ב-RT.
    הערה: לאחר תיוג חיסוני, ניתן לדגור צבעים פלואורסצנטיים לבחירה. בדרך כלל אנו משתמשים בסמני גרעינים פלואורסצנטיים, כגון DAPI (1:1,000) ו-DRAQ5 (1:500), או פלואידין (1:100) להמחשת רשת חוטי האקטין.
  10. דגרו את האורגנואידים עם הצבעים הפלואורסצנטיים המדוללים בתמיסת כביסה ב-RT למשך שעה אחת עם ניעור קל.
  11. שטפו את האורגנואידים במשך 3 x 15 דקות בתמיסת כביסה עם ניעור קל ב-RT.

3. ניקוי אופטי עם FluoClear BABB

הערה: 1-פרופנול עלול לפגוע במיכלי פלסטיק, במיוחד לחשיפה ארוכת טווח. ליתר ביטחון, השתמש במכלי זכוכית.

  1. שלב התייבשות
    1. הכן תמיסות 1-פרופנול ב-H2O טהור במיוחד באחוזים הנתונים (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) ולאחר מכן התאם ל-pH 9.5 עם טרימתילאמין.
      אזהרה: טריאתילאמין רעיל בשאיפה. עבדו מתחת למכסה אדים. ניתן לעשות שימוש חוזר בתמיסות אם הן מאוחסנות כראוי (מיכל אטום היטב). התאם את ה-pH לפני השימוש.
    2. דגרו את הדגימות עם השיפוע ההולך וגדל של תמיסות 1-פרופנול (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) למשך שעתיים כל אחת ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול קל.
    3. דגרו את הדגימות עם 100% 1-פרופנול למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס עם טלטול קל.
  2. שלב ניקוי
    זהירות: BABB היא תערובת ממס חזקה הידועה ביכולתה להמיס או לפגוע משמעותית בפלסטיק רבים. ליתר ביטחון, השתמש במכלי זכוכית עם מכסים תואמים ועבוד בתוך קולט אדים.
    1. הכן את ה-BABB על ידי ערבוב בנזיל אלכוהול (BA) ובנזיל בנזואט (BB) ביחס של 1:2.
    2. טבלו את הדגימות ב-BABB ב-RT למשך הלילה.
    3. לפני ההדמיה, רענן את ה- BABB.
      הערה: עבור אורגנואידים בקוטר ~1 מ"מ, BABB גורם לאפקט ניקוי הניכר בעשרות דקות. בהתאם לגודל ואופי הדגימה, מידת הפינוי עשויה להיות שונה ו/או לדרוש זמן חשיפה ארוך יותר לתמיסת הפינוי. אנו ממליצים לרכוש תמונות לפני ואחרי טבילת BABB כדי לשפר את פרוטוקול הניקוי.
    4. אחסן דגימות מנוקות של BABB עם תמיסת BABB לטווח הארוך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש להגן מפני אור כדי לשמר את הקרינה.

4. רכישת תמונה בהרכבה שלמה

  1. בעזרת פיפטה מזכוכית, מקם את האורגנואיד בצלחת פטרי עם תחתית זכוכית עם טיפת BABB. ודא שהדגימה נוגעת במשטח זכוכית הכיסוי.
    זהירות: הקפד שטיפת ה-BABB המכילה את הדגימה לא תבוא במגע עם קצוות הפלסטיק של המנה, אחרת היא תמיס את הפלסטיק, ותפגע בדגימה ובאיכות ההדמיה.
  2. באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הפוך המצויד ביעדי הגדלה נמוכים וגבוהים, רכוש תמונות Z-stack כדי לקבל את התובנה התלת מימדית המלאה של הדגימה עם פירוט סלולרי.
    הערה: במחקר זה נעשה שימוש במטרה אווירית של 10x צמצם מספרי (NA) 0.4 ומטרה של 63x NA 1.4, עם גודל מדרגה של 3.5 מיקרומטר ו-1 מיקרומטר, בהתאמה.

5. עיבוד תמונה

  1. כייל מחדש את גודל הצעד של רכישת Z-stack בהתחשב באי-התאמה של מקדם השבירה (RI) בין תמיסת הסליקה למדיית הטבילה.
    1. חשב את גודל הצעד המכויל מחדש באופן הבא:
      figure-protocol-4
      עבור דגימה המוטמעת ב- BABB, שצולמה עם מטרת אוויר בגודל צעד של 3.5 מיקרומטר, היא תהיה כדלקמן:
      figure-protocol-5
    2. באמצעות ImageJ, שנה את עומק הווקסל (לחץ על תמונה | מאפיינים...) עבור גודל הצעד המחושב מחדש.
  2. צור הקרנות תמונה של מחסנית Z.
    1. באמצעות ImageJ, בדוק את מחסנית ה-Z לעומק (לחץ על תמונה | ערימות | תצוגות אורתוגונליות). יופיעו תצוגות XY, XZ ו-YZ של האורגנואיד ברשתית.
    2. שמור את אזורי העניין הרצויים (לחץ על קובץ | שמור בשם...).
  3. צור הנפשה של הרינדור התלת-ממדי של Z-stack באמצעות תוכנת עיבוד (ראה טבלת החומרים).
    1. בחר את הערוצים להמחשה על-ידי הפעלת תיבות הסימון שלהם.
    2. התאם את מישורי ה-Z כדי להמחיש את פנים הדגימה (הפעל חיתוך בתיבת הסימון).
    3. הקלט/י את ההנפשה באמצעות ״עורך הסרטים״ (הפעל/י את ״עורך הסרטים ״ בתיבת הסימון). גרור ושחרר, והגדל והקטן ישירות באמצעות העכבר. לחץ/י על ״הוסף ״ כדי לכלול קטע אחר עבור ההנפשה. אם אתה מכוון את מישורי ה-Z, הפעל את האפשרות Clip planes (לחץ על הגדרות... | סמן את התיבה Clip planes ).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: השוואה בין שלוש שיטות קלירינג. משמאל: תמונות שדה בהירות של דגימות (A) לא נוקו ו-(B-D). מימין: מחסנית Z עם תצוגות אורתוגונליות xz ו-yz של 90 אורגנואידים ברשתית DIV מוכתמים בסמן הגרעיני DRAQ5 (צהוב) שנרכש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד באובייקט אוויר פי 10 (RI = 1.00). (A) אורגנואיד רשתית לא מנוקה (N = 3). אורגנואידים ברשתית קבועים ב-PFA אינם שקופים מספיק להדמיה תלת מימדית. (B) אורגנואיד מנוקה מפרוקטוז/גליצרול (N = 3). (C) אורגנואיד מנוקה ECi (N = 3). (D) אורגנואיד FluoClear BABB (N = 3). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: BF = שדה בהיר; CLSM = מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי; RI = מקדם שבירה; PFA = פרפורמלדהיד; ECi = אתיל צינמט; BABB = בנזיל אלכוהול/בנזיל בנזואט; DIV = ימים במבחנה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

השוואה בין שיטות קלירינג אופטי למחקרי אימונופלואורסצנציה באורגנואידים נוירו-רטינליים

כאן, אנו מציגים את התוצאות של שלוש שיטות ניקוי כדי להדגים את היעילות של FluoClear BABB להפיכת אורגנואידים ברשתית לשקופים. באיור 1, אנו צופים באורגנואידים ברשתית שפונו עם פרוקטוז/גליצרול (איור 1B), ECi (איור 1C) ו-FluoClear BABB (איור 1D). שיטות הניקוי שנבדקו נבחרו מכיוון שכולן הוכחו10,11 כתואמות לצביעה אימונופלואורסצנטית ושומרות על פלואורסצנטיות מחלבונים אנדוגניים (למשל, GFP קיים ב-GCaMPs).

פרוקטוז/גליצרול12 הוא פרוטוקול ניקוי טבילה לא רעיל, פשוט, שאינו דורש התייבשות, ומפחית משמעותית את זמן העיבוד בהשוואה לשיטות אחרות. דווח כי הוא יעיל לשקיפת אורגנואידים שמקורם ברקמות שונות: דרכי הנשימה, הכליות, הכבד וסרטן השד האנושי12.

ECi (Ethyl Cinnamate)11 הוא טעם מזון ותוסף מאושר על ידי ה-FDA לקוסמטיקה13,14, נחשב לא מזיק, והוכח כמגיב ניקוי מצוין לרקמות יונקים. הוא ידוע ביכולת הניקוי המהירה שלו ועיוות הרקמות המינימלי שלו. היא מסווגת כשיטת ניקוי הידרופובית, אך בהשוואה לממיסים מבוססי BABB, היא אינה רעילה ושומרת על הקרינה מחלבונים פלואורסצנטיים זמן רב יותר (עד 14 יום). כפי שמקובל ברוב פרוטוקולי הפינוי, ECi דורש שלב התייבשות קודם. לקבלת תוצאות מיטביות, שלב זה מושג על ידי טבילת הדגימה בתמיסות עם ריכוזי אלכוהול הולכים וגדלים. מכיוון ש-ECi אינו מזיק, לאחר פינוי הדגימה ניתן לתפעל אותה בבטחה ולאחסן אותה במיכלי פלסטיק. עם זאת, שלבי ההתייבשות מבוצעים באמצעות 1-פרופנול, ממס אורגני שיש לתפעל מתחת למכסה אדים ולאחסן אותו במיכלי זכוכית.

FluoClear BABB10 הוא גרסה של פרוטוקול הידרופובי המבוסס על בנזיל אלכוהול/בנזיל בנזואט (BABB) כתמיסת התאמת מקדם השבירה. זה ידוע כרעיל מאוד וקורוזיבי, ולכן יש לטפל בו בזהירות. FluoClear BABB תוארה כגרסה משופרת המשמרת GFP ו-RFP טוב יותר מגרסאות קודמות ומאפשרת שימוש ב-1-פרופנול או טרט-בוטנול כחומרי התייבשות.

כדי להעריך את הביצועים של שלוש שיטות הפינוי, צילמנו מטוסי Z עם מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במטרה אווירית 10x NA0.4, המספק שדה ראייה גדול (FoV) של 2.5 x 2.5 x 2.56 מ"מ כדי ללכוד את כל נפח האורגנואיד ברשתית. השתמשנו באורגנואידים ברשתית בשלב ביניים של התבגרות (90 יום במבחנה (DIV)) המכילים את כל נוירוני הרשתית (תאי גנגליון, תאים דו קוטביים וקולטני אור), משיגים את צפיפות התאים והדחיסה ובכך אטומים. כפי שהוסבר בהקדמה, הניקוי האופטי מושג כאשר RI מותאם לכל האובייקט שיש לצלם. לפיכך, מדיית הטבילה המשמשת להדמיה תשפיע באופן דרסטי על השקיפות שהושגה. טבלה 2 מפרטת את ה-RI של מדיית הטבילה ואת פתרונות הסליקה שנבדקו.

תמיסהמקדם שבירה
מדיה סוחפתאוויר1
מים1.33
גליצרול1.45
נפט1.51
פתרונות סליקהפרוקטוז/גליצרול1.468
Eci1.558
פלואו קליר BABB1.56

טבלה 2: מקדם שבירה (RI) של אמצעי הטבילה המשמש ביותר למיקרוסקופ אור ומתודולוגיות הניקוי האופטי שנבדקו לניקוי אורגנואידים ברשתית. קיצור: RI = מקדם שבירה.

השוואת התמונות הקונפוקליות שהתקבלו (איור 1, פאנל ימני), טיפול בפרוקטוז/גליצרול הביא לשיפור הקטן ביותר בשקיפות, הגביל את ההדמיה של שכבות הרשתית ומנע הדמיה של ליבת האורגנואיד. ECi השיגה שקיפות טובה יותר, ואפשרה הדמיה של שכבות הרשתית, אך עדיין הדמיה מוגבלת של ליבת האורגנואיד ברשתית עקב פיזור אור שהפריע לזיהוי הקרינה מהחלקים הפנימיים של הדגימה. FluoClear BABB סיפק את השיפור הגדול ביותר בשקיפות, ואפשר הדמיה ברורה הן של הליבה והן של קליפת המוח של האורגנואיד ברשתית ברזולוציה גבוהה יותר עם עוצמת פלואורסצנטיות דומה.

ראוי להזכיר שגם פרוטוקולי ECi וגם FluoClear BABB גרמו להתכווצות דגימה בולטת, כפי שמומחש על ידי תמונות השדה הבהיר המתאימות של כל אורגנואיד רשתית שנוקה (איור 1, פאנל שמאלי). התכווצות הדגימה נובעת משלבי ההתייבשות הקודמים שמסירים מים, וזו הסיבה שפרוטוקול פרוקטוז/גליצרול אינו מכווץ את הדגימה. עם זאת, הצטמקות זו מהווה הזדמנות ייחודית לחקירה מעמיקה יותר. למרות שהוא דוחס את הגודל הכולל של האורגנואיד ועלול להמעיט בהערכת המרחקים הפנימיים, הוא גם מגביר את הקומפקטיות. קומפקטיות איזוטרופית זו, אחידה יחסית לכל הכיוונים, מאפשרת לנו למנף יעדי הגדלה גבוהים עם כוח רזולוציה מעולה (בשל ה-NA הגדול יותר שלהם) שאחרת היו מדמים רק את שכבת התא החיצונית ביותר בשל מרחקי העבודה הקצרים יותר שלהם (WD). לדוגמה, מטרת אוויר 10x NA 0.4 מציעה WD של 2.53 מ"מ, בעוד שמטרת שמן 63x NA 1.4 עם רזולוציה טובה משמעותית היא בעלת WD של 0.14 מ"מ בלבד. על ידי שימוש באורגנואידים קומפקטיים יותר שאושרו על ידי BABB, אנו יכולים להתגבר ביעילות על מגבלה זו ולהשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה של מבנים עמוקים יותר, כגון שכבת תאי הגנגליון הממוקמת בתוך החלק הפנימי של האורגנואיד (איור 2).

figure-results-2
איור 2: שחזורים תלת מימדיים של אורגנואיד רשתית (200 DIV) שנוקו עם FluoClear BABB שצולם במיקרוסקופ סריקת לייזר-קונפוקלי. המיקרוסקופ צויד במטרה אווירית (A) 10x NA 0.4 ו-(B) מטרת נפט 63x NA 1.5. הקלירינג וההדמיה מאפשרים הדמיה של כל האורגנואיד ובמקביל, תמונה בפירוט עדין של כמה אזורים מעניינים. DRAQ5 (גרעינים), אופסין B+GR (קונוסים) ו-TUJ1 (נוירונים). קיצורים: DIV = ימים במבחנה; BABB = בנזיל אלכוהול/בנזיל בנזואט; NA = צמצם מספרי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לסיכום, הבחירה שלנו לניקוי הייתה FluoClear BABB מכיוון שהיא הציעה הדמיה מעולה של כל האורגנואיד ברשתית ברזולוציה גבוהה ויחס אות לרעש. חשוב לציין, הצטמקות הנגרמת על ידי BABB, דוחסת את האורגנואיד בצורה איזוטרופית. קומפקטיות זו אפשרה לנו למנף יעדי הגדלה גבוהים לחקירה מפורטת של מבנים עמוקים יותר. לבסוף, התאימות של BABB ליעדי טבילה בשמן הבטיחה פיזור אור מינימלי והדמיה באיכות גבוהה על פני הגדלות.

זיהוי ופיזור מרחבי-זמני של תאי רשתית בתוך האורגנואידים לאורך ההתבגרות

בעקבות המתודולוגיה המפורטת כאן, ותוך שימוש בהדמיה שלמה על אורגנואידים עם תווית חיסונית עם הנוגדנים הספציפיים המפורטים בטבלה 1, חקרנו כיצד הנוירורטינה מעוצבת מאורגנואידים בנקודות שונות של התבגרות, משלבי התפתחות מוקדמים (40 DIV) ועד לשלבים בוגרים יותר (עד 250 DIV), המציגים מבנה תלת מימדי מוגדר היטב. גישה זו אפשרה לנו לדמיין את היווצרותם וארגונם של רכיבי רשתית שונים המתוארים בסעיף זה.

נוגדןספציפיותמטרותמיקום ב-Retinaסופי (דילול)מארח#RRDI
אנטי GFPGFPGFPתאים חיוביים ל-GCaMP6s10 מיקרוגרם/מ"ל (1:1,000)צAB_300798
CHX10הומאובוקס היפותלמוס גחוני 2 (Vsx2)גורם שעתוקנוירובלסטים ותאים דו קוטביים10 מיקרוגרם/מ"ל (1:2)גברתAB_10842442
אופסין בכחול אופסיןקטע חיצוני של אצטרובלים כחוליםאצטרובלים כחולים10 מיקרוגרם/מ"ל (1:100)ר.ב.AB_177457
אופסין RGאופסין ירוק ואדוםקטע חיצוני של קונוסים ירוקים ואדומיםקונוסים ירוקים ואדומים10 מיקרוגרם/מ"ל (1:100)צAB_11213279
רקובהתאוששותחלבון קושר סידןקולטני אור10 מיקרוגרם/מ"ל (1:100)ר.ב.AB_2253622
RHO (RET-P1)רודופסיןקטע חיצוני של מוטותמוטות63 מיקרוגרם/מ"ל (1:100)גברתAB_260838
TUJ1בטא-טובולין מסוג III ספציפי לנוירוניםבטא-III טובולין איזופורםנוירונים50 מיקרוגרם/מ"ל (1:200)גברתAB_2315514

טבלה 1: נוגדנים ראשוניים שנבדקו באורגנואידים ברשתית משלבי התבגרות שונים. קיצורים: עוף = Ch; עכבר = ms; ארנב = Rb.

התיוג החיסוני עם סמנים שונים איפשר לזהות את התאים התואמים למבנה שכבתי זה. TUJ1 בטא-טובולין מסוג III ספציפי לנוירונים (טבלה 1), המשמש בדרך כלל בדגימות חתך לסימון תאי גנגליון ברשתית (RGCs)15 בשל שכיחותו. TUJ1 קיים בכל נוירוני הרשתית16 ומשלבים מוקדמים של התמיינות עצבית17. ביטוי TUJ1 נמצא בכל שלבי ההתבגרות בקליפת המוח של האורגנואיד, מה שמאפשר מעקב אחר ארגון תאי הרשתית בשכבות. באיור 3 ניתן לראות כי בשלבי התפתחות מוקדמים (40 DIV), TUJ1 מפוזר באופן אחיד בשכבה אחת, דקה ואחידה. מ-90 DIV, האזור האפיקלי של האורגנואיד הופך צפוף וקומפקטי יותר, מכיוון שהוא מאוכלס בתאים רבים יותר המצטברים באזור האפיקלי. ב-170 DIV, אורגנואיד הרשתית רכש מבנה רשתית מרובד בתלת מימד עם שכבה אפיקלית בדידה. ב-200 DIV, אנו יכולים לראות שישנם גופי תאים אחרים המשתרעים על הקרנות ארוכות, שמספרן הרבה פחות, שנמצאות עמוק יותר בתוך האורגנואיד. לבסוף, ב-250 DIV, המבנה בשלוש שכבות גרעיניות ניכר, המתאים ל: (1) השכבה הגרעינית החיצונית (ONL) התואמת על ידי קולטני אור בוגרים, (2) השכבה הגרעינית הפנימית (INL) המאוכלסת בעיקר על ידי תאים דו-קוטביים ו-(3) שכבת תאי הגנגליון (GCL) שנוצרה על ידי RGCs, כפי שמצוין באיור 3 (למטה מימין).

figure-results-3
איור 3: ארגון נוירונים עם התבגרות אורגנואידים ברשתית במבנה מרובד שכבות. הקרנות Z-stack של תמונות קונפוקליות של אורגנואידים רשתית שנוקו על ידי FluoClear BABB מוכתמים ב-TUJ1. ב-40 DIV, לא נוצרו מבנים שכבתיים. מ-170 DIV, הנוירורטינה מרובדת לשכבות. השכבות הגרעיניות של הרשתית מסומנות: ONL, INL ו-GCL (ראשי חץ צהובים). פסי קנה מידה = 25 מיקרומטר (משמאל) ו-10 מיקרומטר (מימין). קיצורים: BABB = בנזיל אלכוהול/בנזיל בנזואט; DIV = ימים במבחנה; ONL = שכבה גרעינית חיצונית, INL = שכבה גרעינית פנימית; GCL = שכבת תאי גנגליון. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

בעזרת מתודולוגיה זו, יכולנו גם לדווח על הרכבת צרורות אקסונים. כפי שניתן לראות באזורים המוגדלים (איור 4), ראינו צרורות של סיבים המשתרעים מהליבה הפנימית של האורגנואיד לכיוון הפריפריה, ומקרינים לעבר אזורים רחוקים זה מזה (עד 1 מילימטר). מעניין שהיווצרות סיבים אלה התרחשה בשלבים שונים של התבגרות. ככל שהאורגנואיד גדל, הסיבים מתעבים, נעשים מורכבים יותר ואוספים יותר הקרנות תאים (איור 4 [250 DIV] וסרטון משלים S1). RGCs הם התאים הראשונים להתמיין במהלך התפתחות הרשתית, ולכן הם יכולים לארגן את ההקרנות שלהם משלבי התפתחות מוקדמים מאוד. RGCs עשויים ליזום הרחבת נויריט עוד לפני קביעת מיקומם הסופי בתוך האורגנואיד. הממצאים שלנו עולים בקנה אחד עם דוחות קודמים18 המדגימים היווצרות מבנה דמוי עצב ראייה בתרביות משותפות של אורגנואידים ברשתית ובמוח.

figure-results-4
איור 4: הרכבת הקרנות עצביות בשלבים שונים של התבגרות. הסיבים משתרעים מהמישורים הפנימיים של האורגנואיד ברשתית לכיוון הפריפריה. היווצרות סיבים אלה התרחשה בשלבים שונים של התבגרות, מ-40 DIV ועד לנקודת ההתבגרות העתיקה ביותר שנחקרה (250 DIV). פסי קנה מידה = 25 מיקרומטר (שורה עליונה) ו-100 מיקרומטר (שורה תחתונה). קיצורים: DIV = ימים במבחנה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

באתר האפיקלי של אורגנואידים ברשתית, חלק מקולטני האור מבשילים למוטות, המכילים רודופסין בקטעים החיצוניים כדי לזהות ראייה מונוכרומטית בתנאי אור עמום, בעוד שאחרים מבשילים לקונוסים, המבטאים אופסינים כחולים, ירוקים ואדומים ואחראים על ראייה צבעונית וחדה גבוהה בתנאי אור בהיר. איור 5 (למעלה) ממחיש את אוכלוסיית קולטני האור של החרוט בתוך האורגנואיד ברשתית שביטאו אופסינים כחולים ו/או ירוקים/אדומים (OPSIN B ו-GR, טבלה 1). תאים אלה מציגים מורפולוגיה מוארכת עם האופסינים השונים המפוזרים בכל גוף התא, למעט הגרעין. יש לציין כי הקצה החיצוני של תאים אלה נראה בהיר יותר, ועשוי להידמות לחלק החיצוני של קולטן האור המכיל את הדיסקים. כדי לדמיין מדוכים כחולים וירוקים/אדומים באמצעות ערוץ יחיד לזיהוי פלואורסצנטי, נוגדנים משניים נגד אופסין כחול (OPSIN B, ארנב) ואופסין ירוק/אדום (OPSIN GR, עוף) תויגו באותו פלואורופור, מה שמייעל את השימוש בערוץ ומייעל את תהליך ההדמיה תוך הימנעות מחפיפה ספקטרלית. תת-קבוצה של תאים קולטני אור באיור 5 (למטה) ביטאה רודופסין (RHO, טבלה 1 וסרטון משלים S2), מה שמצביע באופן חד משמעי על זהותם כמוטות. תאי מוט אלה חולקים את המורפולוגיה המוארכת שתוארה קודם לכן, כאשר הגרעין ממוקם במרכז וגוף התא העשיר באופסין מכוון לכיוון פריפריה של האורגנואיד.

figure-results-5
איור 5: אורגנואידים ברשתית משלבי התפתחות מאוחרים יותר. למעלה: קונוסים בוגרים, למטה: מוטות. הקרנת Z של תמונות קונפוקליות של אורגנואידים רשתית מנוקים של FluoClear BABB מוכתמים ב-TUJ1 (נוירונים), DRAQ5 (גרעינים), opsin-B+GR (קונוסים) ו-RHO (מוטות). שרטוטים סכמטיים מוצגים לעיון. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (משמאל) ו-10 מיקרומטר (מימין). קיצורים: DIV = ימים במבחנה; BABB = בנזיל אלכוהול/בנזיל בנזואט. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

התאים הדו-קוטביים והתפלגותם המרחבית-זמנית זוהו על ידי מעקב אחר ביטוי Chx10 (הידוע גם בשם Vsx2) על פני 250 DIV של התבגרות (איור 6). Chx10 (טבלה 1) הוא גורם שעתוק קריטי לשגשוג תאי אב וקביעת תאים דו-קוטביים ברשתית המתפתחת19,20. כגן הומאובוקס, הוא מתבטא בשלבי התפתחות מוקדמים בנוירובלסטים, וברשתית הבוגרת הוא נמצא אך ורק בתאים דו קוטביים. איור 6 מדגים את התפלגות התאים החיוביים ל-Chx10 בתוך האורגנואיד המתפתח. בתחילה, נצפים תאים חיוביים רבים ל-Chx10 המשתרעים מהפריפריה הנוירו-רשתית לכיוון המרכז. ככל שהאורגנואיד מתבגר, תאים אלה הופכים פחות נפוצים ועוברים ל-INL, שם שוכנים תאים דו קוטביים.

figure-results-6
איור 6: ביטוי Chx10 מעל 250 DIV של התבגרות. תמונות קונפוקליות של הקרנת Z של אורגנואיד רשתית מנוקה על ידי FluoClear BABB צבוע ב-DRAQ5 (גרעינים) ו-Chx10 (נוירובלסטים ותאים דו-קוטביים בוגרים). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: DIV = ימים במבחנה; BABB = בנזיל אלכוהול/בנזיל בנזואט. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לבסוף, אנו מדגימים כי ה-GFP האנדוגני מסמני סידן GCaMP נשמר לאחר ניקוי במתודולוגיה זו. באיור 7, אנו יכולים לצפות בנויררטינה של 70 אורגנואידים ברשתית DIV הנגועים ב-Ad5-CMV-GCaMP6s ומסומנים באנטי-GFP (טבלה 1) כדי לשפר את הקרינה לאחר קיבוע ארוך טווח.

figure-results-7
איור 7: GCaMP אנדוגני נשמר בשיטת הסליקה FluoClear BABB. אורגנואיד רשתית 70 DIV נגוע ב-Ad5-CMV-GCaMP6s עם תווית חיסונית עם אנטי-GFP (תאים המבטאים GCaMP), Chx10 (נוירובלסטים ותאים דו-קוטביים בשלב מוקדם) ו-DRAQ5 (גרעינים). פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר (משמאל) ו-25 מיקרומטר (מימין). קיצורים: BABB = בנזיל אלכוהול/בנזיל בנזואט; DIV = ימים במבחנה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון משלים S1: שחזור תלת מימד של אורגנואיד רשתית המציג מכלול של הקרנות עצביות. הקרנת Z של תמונות קונפוקליות של אורגנואידים רשתית מנוקים של FluoClear BABB ב-250 DIV צבועים ב-TUJ1 (נוירונים) המיוצגים בסגול ו-DRAQ5 (גרעינים) בצהוב. קיצורים: BABB = בנזיל אלכוהול/בנזיל בנזואט; DIV = ימים במבחנה. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

סרטון משלים S2: שחזור תלת מימד של המוטות מיושרים על פני השטח של אורגנואיד רשתית בשלבי התפתחות מאוחרים (200 DIV). הקרנת Z של תמונות קונפוקליות של אורגנואידים רשתית של FluoClear BABB ב-200 DIV מוכתמים ב-RECOV (קולטני אור) המיוצגים בירוק ו-RHO (מוטות) בסגול. קיצורים: DIV = ימים במבחנה; BABB = בנזיל אלכוהול/בנזיל בנזואט. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מקל על חקר ההתפלגות המרחבית-זמנית של התאים היוצרים את האורגנואיד ברשתית בשלבים שונים של התבגרות, תוך שמירה על הארכיטקטורה התלת-ממדית הטבעית שלו, היבט קריטי להבנת מודלים אלה בהקשר של רפואה מותאמת אישית עתידית. הוא מספק תצוגה מפורטת של ארכיטקטורת הרשתית ברמה של שכבות נפרדות וסוגי תאים בודדים, ומאפשר הדמיה של מבנים תת-תאיים תוך שמירה על ההקשר התלת-ממדי הגלובלי.

האלטרנטיבה להדמיה בהרכבה שלמה היא עיבוד הדגימה לביצוע הדמיה בקטעים קונבנציונליים (פרפין או שימור בהקפאה). בעוד שחתך מספק מידע רב ערך על לוקליזציה של חלבונים ומבנים, נתונים אלה מוגבלים למישור יחיד, מה שמגביל את ההבנה של קשרים תאיים מרחביים. כתוצאה מכך, תכונות כמו שיעור הקונוסים והמוטות או היווצרות צרורות אקסונליים באזורים ספציפיים עשויות שלא להיות מיוצגות במדויק, מה שמסבך את הפרשנות בתלת מימד. אורגנואידים ברשתית הם הטרוגניים מאוד, כאשר אזורים שונים עשויים להכיל סוגי תאים שונים ו/או להפגין דרגות שונות של מורכבות והתמיינות. הדמיה שלמה פותרת בעיה זו מכיוון שהיא מאפשרת לנתח שיפועי הטרוגניות באופן גלובלי מבלי להסתמך על בחירה של תת-קבוצה של קטעים שאולי לא מייצגים את כל המדגם.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור (LSFM)21,22,23 יכולה לשמש כחלופה למיקרוסקופיה קונפוקלית בסריקת לייזר. ב-LSFM, הדגימה מוארת ביריעת אור דקה בעובי של כמה מיקרונים, וכל הקרינה שנוצרת מהקטע האופטי המואר מזוהה באמצעות מצלמה. LSFM היא טכניקת זיהוי מבוססת שדה רחב המייצגת אסטרטגיה יעילה ביותר להדמיה מהירה של נפחים גדולים (עד דגימות בקנה מידה של סנטימטר) עם השפעות פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות מינימליות. עם זאת, אורגנואידים עשויים להפגין סטייה כדורית משמעותית מכיוון שהאור העובר דרך המשטחים המעוקלים נשבר בצורה שונה בהתאם לזווית השכיחות. בניסויים אלה, עיוות זה יצר אובדן מיקוד, מה שהוביל לטשטוש ולפגיעה ברזולוציה של מבנים עמוקים יותר. להדמיית אורגנואידים ברשתית שלנו (בקוטר של כ-1 מ"מ), מיקרוסקופיה קונפוקלית בסריקת לייזר הוכיחה את עצמה כגישה היעילה ביותר.

פרוטוקול זה מותאם לדרישות הניסוי שלנו. זה יכול לשמש כמדריך התחלתי לחוקרים היוצאים להדמיה שלמה של אורגנואידים ברשתית שעברו ניקוי אופטי ויש להתאים אותו אם אלה שונים. בחלק זה, השלבים הקריטיים, השינויים והמגבלות של המתודולוגיה מתוארים בפירוט.

שלב קריטי הוא ההחלטה על פרוטוקול הסליקה. יש לקחת בחשבון קריטריונים רבים. ראשית, שקול את הטיפולוגיה של המדגם. ניקוי עצמות אינו זהה לניקוי רקמת מוח, בדיוק כפי שניקוי אורגנואידים ברשתית שונה מניקוי אורגנואידים בקיבה, מכיוון שכל אחד מהם דורש גישה שונה. כדי לדמיין אורגנואידים מנוקים מסוג אחר, חיוני לסקור את הספרות כדי לזהות פרוטוקולים שעברו אופטימיזציה במיוחד עבור המדגם המעניין. פרוקטוז/גליצרול היא שיטת ניקוי מהירה ולא רעילה שהוכחה כיעילה לניקוי אורגנואידים שמקורם ברקמות שונות (אורגנואידים של דרכי הנשימה, המעי הגס, הכליות, הכבד והשד האנושיים, ואורגנואידים של בלוטות החלב של העכברים)12 אך לא התאימה להפיכת אורגנואידים ברשתית האנושית לשקופים. למיטב ידיעתנו, אף מחקר לא מדווח על יישום פרוקטוז/גליצרול על רקמה עצבית/אורגנואיד. לכן, אנו מסיקים ששיטת ניקוי זו אינה מתאימה להבהרת רקמות עצביות. יש צורך בחקירה נוספת כדי להבהיר את הסיבות הבסיסיות לחוסר התאמה זו.

גורם קריטי נוסף שיש לקחת בחשבון הוא ה-FoV הנדרש, מכיוון שהוא משפיע ישירות על אסטרטגיית ההדמיה ועל בחירת הרכיבים האופטיים. FoVs גדולים מושגים בדרך כלל עם יעדי הגדלה נמוכים, אשר לרוב מיועדים לשימוש ללא מדיית טבילה (למשל, אוויר, RI = 1.00). מטרות אלו חוות אי התאמה גדולה יותר של RI בעת הדמיית דגימות שאושרו על ידי BABB (RI = 1.56), מה שמוביל לשינויים במיקוד העומק שיש לתקן במהלך העיבוד שלאחר העיבוד. לעומת זאת, יעדי טבילת שמן (RI = 1.51) מציגים פחות אי התאמה של RI עם פתרונות סליקה כמו BABB (RI = 1.56) ולכן אינם דורשים כיול מחדש.

שיטות טבילה פשוטות בדרך כלל אינן משיגות שקיפות גבוהה ואינן מתאימות לרכישת תמונות באיכות גבוהה של דגימות הרכבה שלמות. פרוטוקולי ניקוי רקמות משפיעים על רזולוציה יעילה באמצעות נפיחות או התכווצות של הדגימות. בהתאם למטרת הניסוי, נפיחות או התכווצות יכולים להועיל. פרוטוקולים המרחיבים את המדגם יכולים לשפר את הרזולוציה של פרטים עדינים באותה מערכת אופטית שאינה מסוגלת להציג את אותם פרטים לפני כן. ניתן לרצות הצטמקות כדי לדמיין דגימות גדולות שאחרת לא היו נכנסות לתא הדגימה או מסתגלות למרחקי העבודה האובייקטיביים. עם זאת, מכיוון שהתכווצות דוחסת את הדגימה ועלולה לעוות מרחקים פנימיים, טכניקה זו אינה מתאימה להערכה ממדית או למדידה מדויקת של מרחקים בין-תאיים.

גורם חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון הוא תאימות לחלבונים פלואורסצנטיים. פרוטוקולים מבוססי ממס אורגניים ברובם מרווים חלבונים פלואורסצנטיים מכיוון שהם דורשים טמפרטורות גבוהות או מפרקים את החלבונים הפלואורסצנטיים תוך הטמעה בתמיסות תואמות RI. למרבה המזל, רוב השיטות תואמות לטכניקות תיוג חיסוני. עם זאת, יש לאשר את התאימות של כל אפיטופ בניסוי.

יתר על כן, ניתן לחסום חדירה של מולקולות IgG גדולות דרך הרקמה, להפחית את יעילות הצביעה ולהגביל את ההדמיה של המבנה הממוקד למשטח הדגימה. צביעת דגימות שלמות בנוגדנים עשויה להימשך מספר ימים (או אפילו שבועות), בהתאם לגודל ואופי הדגימה, מה שמגדיל באופן משמעותי את משך הפרוטוקול.

לבסוף, תאימות למכשיר האופטי היא חובה. רוב השיטות המבוססות על ממס אורגני (למעט ECi) הן קורוזיביות מאוד ואינן תואמות כימית לתאי דגימה מסחריים ולמטרות טבילה. יתר על כן, לחלק מפתרונות הסליקה יש RI שאינו תואם את הטווח הנדרש על ידי היעדים הזמינים (בדרך כלל מים).

ישנם כמה שלבים בפרוטוקול שדורשים תשומת לב מיוחדת. FluoClear BABB, כשיטת ניקוי הידרופובית, דורשת שלב התייבשות קודם. ה-pH ממלא תפקיד חשוב בשימור הקרינה של חלבונים אנדוגניים כגון GFP. לאחר מכן, חיוני לוודא שלתמיסות האלכוהול יש את ה-pH מותאם כראוי. התייבשות היא המפתח לניקוי מלא. תוצאות אופטימליות מושגות על ידי דגירה של הדגימות עם שיפוע הולך וגדל של תמיסות אלכוהול.

גודל הדגימה ממלא תפקיד חשוב במתן אפשרות לנוגדנים להגיע ליעדים הספציפיים שלהם. נוגדנים עלולים לא לחדור בצורה הומוגנית ולהישמר בחלק החיצוני של הדגימה שלך. אם זה קורה, שקול לעבור לסוג אחר של חומר ניקוי (Tween-20 או Saponin), ולהגדיל את הריכוז וזמן הדגירה של חומר הניקוי והנוגדנים. אם התאמות אלה אינן מספיקות, אסטרטגיות חלופיות יכולות לשפר את חדירות הנוגדנים. עבור תיוג חיסוני שלם של דגימות גדולות (בקנה מידה של סנטימטר), חוקרים מצאו כי ה-SDS יכול להקל על חדירת נוגדנים עמוקה יותר24. SDS גורם לאובדן חלקי של המבנה השלישוני של הנוגדנים, ולמעשה הופך את החלבון ליניארי ומאפשר לו לחדור עמוק יותר לתוך הרקמה. לאחר מכן, שטיפת ה-SDS משחזרת את תכונות קשירת האנטיגן של הנוגדנים, ומאפשרת צביעה אחידה יותר של רקמות עבות יותר ומפחיתה את השיפוע הנפוץ של תיוג חזק יותר על פני הדגימה.

הכנת נוגדנים משניים פלואורסצנטיים משלך מציעה מספר יתרונות, מכיוון שהיא מספקת גמישות רבה יותר בעיצוב התיוג החיסוני, ומאפשרת בחירה של שילוב הנוגדנים הספציפיים של פלואורופור-משני, ומגדילה את מספר הצבעים שניתן להשתמש בהם באותה דגימה. בנוסף, ניתן לכוונן את יחס הפלואורופור לנוגדנים, כך שהם בדרך כלל בהירים יותר. עם זאת, יש לקחת בחשבון כמה היבטים. נוגדנים משניים בהתאמה אישית הם בדרך כלל פחות יציבים מאלה הזמינים מסחרית ויש להשתמש בהם טריים. רובם שומרים על זיקת הליגנדים שלהם במשך 3-6 חודשים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, אך יש לקבוע את היציבות בניסוי, מכיוון ששילובים מסוימים עלולים להתפרק מהר יותר. יתר על כן, כמה זיווגים של נוגדנים-פלואורופור יכולים לשנות את הזיקה של הנוגדן לאפיטופ שלו, וכתוצאה מכך תיוג לא ספציפי חלקי או מלא. כדי להבטיח אמינות, מומלץ לבדוק תחילה נוגדנים משניים בהתאמה אישית באמצעות בקרות, כגון תאים בתרבית, לפני החלתם על דגימות ניסוי.

פרוטוקול אופטימלי זה משלב ניקוי אופטי עם תיוג חיסוני כדי להקל על הדמיה קונפוקלית של אורגנואידים ברשתית שלמה. הוא שומר על שלמות מבנית ומאפשר זיהוי של סוגי תאי רשתית מרכזיים בתוך האורגנואיד. לפיכך, הפרוטוקול מספק לחוקרים כלי רב עוצמה לחקירת התבגרות אורגנואידים ברשתית וארגון מרחבי.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לאנג'ל סנדובל, אריק קלטאיוד, גוסטבו קסטרו-אולברה, מרתה מרטין ואלינה הירשמן (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) על תמיכתם הטכנית. הגופים המממנים שתמכו בעבודה זו הם Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Ministerio de Economía y Competitividad - תוכנית Severo Ochoa למרכזי מצוינות במו"פ (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades - Agencia Estatal de Investigación (PID2021-122807OB-C31 ו-PID21-122807OB-C32); Instituto de Salud Carlos III (PI22/01747); Fundación La ONCE; Generalitat de Catalunya באמצעות תוכנית CERCA; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA מס' 871124); ו-Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10x NA0.40 אובייקט יבשלייקהHC PL APO CS2-
63x NA1.40 מטרת שמןלייקהHC PL APO CS2-
נוגדן נגד GFPאבקםאילן אלכסנדר-
בנזיל אלכוהול (BA)סיגמא אולדריץ'13162-
בנזיל בנזואט (BB)סיגמא אולדריץ'W213802-
צלחת פטרי מזכוכית תחתונהמטקP35G-1.5-14-C-
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמא אולדריץ'א7030-
נוגדן Chx10סטה קרוז ביוטקSC-365519-
עמודי סינון ג'ל Cytiva Illustra Nap-5, Sephadex G-25סיגמא אולדריץ'17-0853-02-
DAPIסיגמא אולדריץ'D9542-
DMSOסיגמא אולדריץ'D8418-
DRAQ5תרמופישר62251-
צבע (חומצה קרבוקסילית, אסתר סוקסינימידיל)Invitrogen או Abberior--
תמונהJ/פיג'י ה-NIH  גרסה 1.50i-
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הפוךמיקרו-מערכות של LeicaTCS SP8 STED 3X-FALCON-
תוכנת עיבוד תלת מימד LAS Xמיקרו-מערכות של Leica--
mQ H2O--מים אולטרה-טהורים ממערכת טיהור המים Synergy
NaHCO3אקרוס אורגניקס424270010-
IgG משני ללא תוויתג'קסון אימונו-מחקר--
נוגדן כחול אופסיןמיליפור   AB5407 -
נוגדן אופסין RGמיליפורAB5745 -
פרפורמלדהיד (PFA) 4%תרמו מדעי J199943-K2-
פתרון PBSג'יבקו18912-014-
בדיקות תיוג פלואידיןתרמופישר--
תמיסת מלח עם חומצת פוספט (PBS)גיבקו 10010023-
נוגדן RECOVמיליפורAB5585-I -
נוגדן RHO (RET-P1)סיגמא אולדריץ'O4886 -
סודיום ציטראט טריבייסיק דיהידרט סיגמא אולדריץ'C8532-
טריטון X-100סיגמא אולדריץ'T8787-
נוגדן TUJ1קובאנס MMS-435P -

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, Y. J., Jo, D. H. Retinal organoids from induced pluripotent stem cells of patients with inherited retinal diseases: A systematic review. Stem Cell Rev Rep. 21 (1), 167-197 (2025).
  2. Onyak, J. R., Vergara, M. N., Renna, J. M. Retinal organoid light responsivity: Current status and future opportunities. Trans Res. 250, 98-111 (2022).
  3. O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), dev189746(2020).
  4. Wahle, P., et al. Multimodal spatiotemporal phenotyping of human retinal organoid development. Nat Biotechnol. 41 (12), 1765-1775 (2023).
  5. Isla-Magrané, H., Veiga, A., García-Arumí, J., Duarri, A. Multiocular organoids from human induced pluripotent stem cells displayed retinal, corneal, and retinal pigment epithelium lineages. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 581(2021).
  6. Isla-Magrané, H., Zufiaurre-Seijo, M., García-Arumí, J., Duarri, A. All-trans retinoic acid modulates pigmentation, neuroretinal maturation, and corneal transparency in human multiocular organoids. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 376(2022).
  7. Avilov, S. V. Navigating across multi-dimensional space of tissue clearing parameters. Methods Appl Fluoresc. 9 (2), 022001(2021).
  8. Brenna, C., et al. Optical tissue clearing associated with 3D imaging: application in preclinical and clinical studies. Histochem Cell Biol. 157 (5), 497(2022).
  9. Bálint, Š, Verdeny Vilanova, I., Sandoval Álvarez, Á, Lakadamyali, M. Correlative live-cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (9), 3375-3380 (2013).
  10. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).
  11. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).
  12. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  13. Wang, Y., Zhang, D. -H., Zhang, J. -Y., Chen, N., Zhi, G. -Y. High-yield synthesis of bioactive ethyl cinnamate by enzymatic esterification of cinnamic acid. Food Chem. 190, 629-633 (2016).
  14. Schellinger, A. P., Carr, P. W. Solubility of buffers in aqueous-organic eluents for reversed-phase liquid chromatography. LCGC North America. 22 (6), 544(2004).
  15. Jiang, S. -M., et al. β-III-Tubulin: A reliable marker for retinal ganglion cell labeling in experimental models of glaucoma. Int J Ophthalmol. 8 (4), 643-652 (2015).
  16. Guo, J., Walss‐Bass, C., Ludueña, R. F. The β isotypes of tubulin in neuronal differentiation. Cytoskeleton. 67 (7), 431-441 (2010).
  17. Lee, S., et al. TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue. Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 453-459 (2005).
  18. Fernando, M., et al. Differentiation of brain and retinal organoids from confluent cultures of pluripotent stem cells connected by nerve-like axonal projections of optic origin. Stem Cell Rep. 17 (6), 1476-1492 (2022).
  19. Belecky-Adams, T., et al. Pax-6, Prox 1, and Chx10 homeobox gene expression correlates with phenotypic fate of retinal precursor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 38 (7), 1293-1303 (1997).
  20. Rowan, S., Cepko, C. L. Genetic analysis of the homeodomain transcription factor Chx10 in the retina using a novel multifunctional BAC transgenic mouse reporter. Dev Biol. 271 (2), 388-402 (2004).
  21. Andilla, J., et al. Imaging tissue-mimic with light sheet microscopy: A comparative guideline. Sci Rep. 7, 44939(2017).
  22. Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: A tutorial. Adv Opt Photonics. 10, 111(2018).
  23. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  24. Darche, M., et al. Light sheet fluorescence microscopy of cleared human eyes. Commun Biol. 6 (1), 1025(2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Whole MountBABB

מאמרים קשורים