Method Article

מיקרוסקופ אלקטרונים שידור כטכניקת הדמיה לניתוח הפלסטיות הסינפטית הצירקדית בקליפת המוח של חבית העכבר

DOI:

10.3791/68385

⸱

August 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המוצג מתאר את השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) כדי לכמת שינויים צירקדיים בקליפת המוח של חבית העכבר, תוך התמקדות בעיקר במספר הסינפסות ובמורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בחינת הפלסטיות הסינפטית הצירקדית דורשת שיכון עכברים בתנאי תאורה שונים (מחזור אור/חושך, LD 12:12, וחושך קבוע, DD), מתן גישה לגלגלי ריצה, והקרבתם בארבע נקודות זמן מוגדרות בתוך 24 שעות - בתחילת ואמצע היום/יום סובייקטיבי ובתחילת ואמצע הלילה/לילה סובייקטיבי. לאחר מכן המוח מקובע כראוי למיקרוסקופ אלקטרונים (TEM). קליפת החבית, עם הארגון הסומטוטופי המדויק שלה, מספקת מודל אידיאלי לניתוח כזה. כדי להשיג את אזור המוח הנדרש, המוחות נחתכים באופן משיק עם ויברטום, ולאחר מכן, חלקים המכילים את קליפת המוח החבית נבחרים ומשובצים בשרף פוליבד. מהבלוקים המוכנים המכילים את החביות שנבחרו, נחתכים קטעים אולטרה-דקים רצופים. צפיפות סינפטית, מעוררת ומעכבת, מנותחת ממיקרוגרפים אלקטרוניים בשיטת דיסקטור סטריאולוגי. בנוסף, תמונות TEM משמשות לשחזורים תלת מימדיים של קוצים דנדריטיים. שינויים בצורת הקוצים הדנדריטיים מצביעים על עיצוב מחדש של נוירונים במהלך היום. מספר הסינפסות המעוררות מגיע לשיא במהלך השינה (יום) בעכברים, בעוד שסינפסות מעכבות מגיעות לשיא בשלב הפעילות שלהן (באמצע הלילה).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקצבים צירקדיים נוצרים על ידי שעונים צירקדיים כמעט בכל התהליכים באורגניזם. בבעלי חיים ובבני אדם, הם זוהו ברמה המולקולרית, התאית והאורגניזם השלם, כמו גם בהתנהגותם. המערכת הצירקדית של אורגניזם מורכבת מהשעון הביולוגי הראשי (קוצב לב) ושעונים היקפיים. כל השעונים הביולוגיים מייצרים תנודות צירקדיות באמצעות ביטוי מחזורי של גנים של שעון, הנשלטים על ידי החלבונים שלהם. המנגנון המולקולרי של השעון מייצר מקצבים צירקדיים עם תקופה של ~1 יום (ארוך או קצר מ-24 שעות), אך בתנאי יום/לילה, תקופת המקצבים האנדוגניים מסונכרנת ל-24 שעות. מקצבים צירקדיים רבים התגלו בפיזיולוגיה של מערכת העצבים של חסרי חוליות ובעלי חוליות; עם זאת, מחקרים מסוימים הראו כי הם קיימים גם בפלסטיות סינפטית ועצבית, כלומר שינויים במספר ובמבנה של סינפסות ודנדריטים 1,2,3,4.

קליפת המוח הסומטוסנסורית של העכבר מספקת אתר מצוין לחקר הפלסטיות הסינפטית לאורך היום בשל הארגון המוגדר היטב שלה והקשר הישיר שלה לפעילות תנועתית של בעלי חיים 5,6,7,8,9. בשכבה IV של קליפת המוח הסומטוסנסורית, ישנם מבנים עצביים מובהקים (חביות) הבולטים מאוד אפילו במוח לא מוכתם10,11. סידורם משקף את המורפולוגיה והארגון של השפם על חוטם החיה, ומאפשר מיפוי מדויק של גירויים חושיים. החביות הגדולות מסודרות בחמש שורות קבועות, כל אחת מכילה בין ארבע לשבע חביות. שורות החביות המתאימות לשפם גדול מסומנות באותיות גדולות מ-A עד E ומייצגות את השפם המסודרים מאזור העין כלפי מטה לאורך החוטם. כל חבית מורכבת משני אזורים עיקריים: החלול, החלק המרכזי המלא בנוירופיל, והקיר הנקרא צד, הנשלט על ידי גופם של תאי כוכבים. החביות מופרדות זו מזו על ידי אזורים בעלי צפיפות תאים נמוכה יותר, הנקראים מחיצות. כל חבית מקבלת דחפים משפם ספציפי הממוקם בצד הנגדי של חוטם החיה10,12.

החלוקה לחביות ספציפיות, המסודרות בשורות קבועות, מאפשרת זיהוי מהיר וקל של השטח הנבחר10,13. בחירת החביות משורה B לניתוח שינויים צירקדיים מבוססת על מחקרים של פלסטיות תלוית פעילות 14,15,16,17. שורה B מאופיינת בגבולות סומטוטופיים מוגדרים היטב ומכילה רק ארבע חביות גדולות מובהקות, מה שמפשט את מיקומה בדגימות. בשל מיקומה המרכזי, הפעילות העצבית בשורה B קשורה להתנהגויות טבעיות של עכברים כגון חקר סביבתי ופעילות תנועתית. לספירת סינפסות על קוצים ופירים דנדריטיים, חשוב לבחור את החלקים המרכזיים של החביות, שבהם גופי התאים דלילים 12,15,18.

אימונוהיסטוכימיה בשילוב עם הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית היא טכניקה שמילאה תפקיד מכריע בהבהרת מנגנוני המפתח של פלסטיות סינפטית בעכברים. בעוד ששימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית מספק תמונות ברזולוציה גבוהה עם פלואורסצנטיות רקע מופחתת ובהירות מבנה תאית משופרת, הוא סובל מהלבנה פוטואלית ודורש הכנת דגימה מורכבת, שעלולה לשנות את מצב הרקמות הביולוגיות. הסתמכותו על סמנים פלואורסצנטיים יכולה להגביל את סוגי החלבונים שניתן לחקור בו זמנית בשל החפיפה ביניהם. מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית מספקת אמצעי לתיוג חלבונים ספציפיים, רמות הביטוי שלהם ולוקליזציה הקשורה לפעילות סינפטית על ידי שימוש בנוגדנים לאיתור אנטיגנים מטרה בקטעי רקמה קבועים. למרות ששיטה זו מציעה ספציפיות וגמישות לחקר חלבונים שונים המעורבים בהולכה עצבית, היא מוגבלת על ידי חוסר יכולתה לספק נתונים בזמן אמת על תהליכים דינמיים עקב שלב הקיבוע המעורב. חוסר העקביות בקשירת הנוגדנים עלול גם לגרום לתוצאות לא אמינות 19,20,21.

השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים במקום בשיטות אימונופלואורסצנטיות עם מיקרוסקופ אור מאפשר רזולוציה גבוהה משמעותית ודיוק רב יותר הן בבחירת לוקליזציה והן בהבחנה של מבנים עצביים. קטעי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור סדרתי (TEM) עוזרים לדמיין את המבנה הסינפטי ברמה האולטרה-מבנית ויש להם את היתרון בכך שהם משמשים לחקר היווצרות או חיסול סינפסות. TEM מאפשר לחוקרים לנתח את התכונות הפיזיקליות של סינפסות ושינויים בצפיפות ובמבנה שנקראים הפלסטיות של סינפסות. אף על פי שהכנת הדגימות וההדמיה דורשות עבודה רבה, TEM מספק הבנה מפורטת יותר של שינויים המתרחשים במהלך למידה, יצירת זיכרון ועיבוד מידע חושי, ובמהלך היום, השנה וגיל החיה.

השיטה שלנו שואפת לחקור את הדינמיקה הצירקדית של צפיפות סינפטית ומורפולוגיה על ידי שימוש בגישה מבוססת ארבע נקודות זמן לפחות בשילוב עם שיטת דיסקטור סטריאולוגית המבוססת על תמונות TEM סדרתיות. שיטת הדיסקטור הסטריאולוגית מאפשרת הערכה אמינה של מספרי הסינפסות גם כאשר משתמשים רק בכמה קטעים טוריים דקים במיוחד 22,23,24,25,26. הארגון הסומטוטופי המוגדר היטב של קליפת החבית מבטיח בחירה אנטומית מדויקת של מיקומי המחקר, בעוד ש-TEM סדרתי מאפשר בידול של סוגי סינפסות (מעוררים ומעכבים) ומיקומם (על קוצים ופירים דנדריטיים). שיטה זו מספקת כלי רב ערך לחוקרים החוקרים נוירופלסטיות יומית וצירקדית, ומאפשרת לחקור כיצד גורמים סביבתיים ופנימיים משפיעים על הדינמיקה הסינפטית. המרכיבים הבודדים של השיטה שלנו מאפשרים את יישומה לניתוח שינויים בנוירופלסטיות במגוון רחב הרבה יותר של מחקרים, שאינם מוגבלים בהכרח לשינויים הקשורים לשעון הביולוגי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הליכי הניסוי הכוללים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית המתאימה ונערכו בהתאם להנחיה 2010/63/EU של הפרלמנט האירופי והמועצה להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות, כמו גם עם תקנות לאומיות. כל המאמצים נעשו כדי למזער את סבל בעלי החיים ולהפחית את מספר בעלי החיים שנעשה בהם שימוש.

1. הכנת רקמות מוח

  1. הקריבו עכברים בארבע נקודות זמן שונות כל 6 שעות במשך מחזור של 24 שעות, הן בתנאי אור/חושך (LD 12:12) והן בתנאי חושך קבוע (DD) (איור 1). בתנאי LD 12:12, עיין ב-Zeitgeber Time (ZT), כאשר ZT0 מתאים לתחילת שלב האור ו-ZT12 לתחילת השלב החשוך. בחושך מתמיד, עיין בשעון הביולוגי (CT), שבו CT0 מייצג את תחילת היום הסובייקטיבי, ו-CT12 מציין את תחילת הלילה הסובייקטיבי.
    הערה: נקודות הזמן הן ZT0/CT0 (תחילת היום, יום סובייקטיבי), ZT6/CT6 (אמצע היום, יום סובייקטיבי), ZT12/CT12 (תחילת הלילה, לילה סובייקטיבי) ו-ZT18/CT18 (אמצע הלילה, לילה סובייקטיבי).
  2. לחלחל ולתקן מוחות עכברים עם 2.5% גלוטראלדהיד ו-2% פרפורמלדהיד במאגר פוספט של 0.1 M (pH 7.4).
  3. הסר כל מוח מהגולגולת והשאיר אותו בתמיסה מקבעת (2.5% גלוטראלדהיד ו-2% פרפורמלדהיד במאגר פוספט 0.1 M, pH 7.4) למשך 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
  4. כדי להכין את המוח לחתך, חתכו את המוח הקטן וחלקו את המוח לשתי המיספרות (איור 2A,B).
  5. בחר חצי כדור אחד (ימין או שמאל) וכוון אותו כך שהחלקים ייחתכו באופן משיק לקליפת החבית. הרכיבו את חצי הכדור שנבחר על צ'אק הוויברטום והדביקו אותו בחוזקה (איור 2C).
  6. חותכים קטעים בעובי 60 מיקרומטר (מהירות חתך ויברטום: 7.10 ותדירות: 5.00) (איור 2D) ולאחר מכן מעבירים חלקים לתערובת של מאגר פוספט 0.1 M ותמיסה מקבעת (יחס 1:5).
  7. בחנו קטעים תחת מיקרוסקופ אור עם הגדלה פי 4 ואספו רק את אלה עם קליפת השדה הגלויה לשלב הבא (איור 2E). השתמש במגלשה הקעורה כדי להבטיח שהחלק יישאר כל הזמן בנוזל.

2. קיבוע וחתך מוחי

  1. השתמש במכחול והעביר בעדינות טישו לצלחת פטרי קטנה מזכוכית. לאחר מכן, שטפו את חלקי המוח במאגר הקקודילאט 0.1 M (BC, pH 7.4) למשך 3 x 5 דקות.
  2. תקן קטעים ב-1% אוסמיום טטרוקסיד (OsO4) ב-0.1 מ' לפני הספירה עם 1.5% אשלגן פריציאניד והשאיר ב-+4 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    הערה: הכן את תמיסת OsO4 מיד לפני השימוש מכיוון ש-OsO4 אינו יציב ופעילותו פוחתת עם הזמן.
  3. חתכים לאחר תיקון ב-1% OsO4 בתמיסה של 0.1 M BC למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    הערה: בצע את כל השלבים הללו תוך לבישת כפפות מגן ומתחת למכסה האדים עם אוורור מתפקד היטב מכיוון ש-OsO4 רעיל מאוד.
    יש לשמור את הפסולת בבקבוק נפרד עם מכסה הדוק. אל תאפשר למוצר להיכנס לניקוז.
  4. לאחר הקיבוע יש לשטוף חלקים במים מזוקקים למשך 2 x 5 דקות.
  5. בשלב הבא יש לדגור על קטעי מוח למשך 40 דקות בתמיסה של 70% אתנול המכיל 1% אורניל אצטט. לאחר הערבוב השתמשו במזרק עם פילטר (25 מ"מ) ושפכו לאט לאט 2 מ"ל מהתמיסה לכל צלחת פטרי עם הרקמות.
  6. לייבש רקמות בריכוזים עולים של אלכוהול: 70%, 80% ו-90% אתנול למשך 5 דקות כל אחד ו-100% אתנול, 3 x 5 דקות כל אחד.
    הערה: ניתן להשאיר רקמות ב-70% אתנול למשך הלילה בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס.
  7. שוטפים טישו בתחמוצת פרופילן 2 x 10 דקות.
    הערה: תחמוצת פרופילן היא כימיקל מאכל מאוד; השתמש בו בזהירות תוך לבישת כפפות מגן ועבודה מתחת למכסה האדים. שימוש במיכל זכוכית (צלחת פטרי מזכוכית) הוא חיוני לשלב זה.
    תחמוצת פרופילן היא נוזל ואדים דליקים במיוחד. יש לשמור את הפסולת במיכל זכוכית נפרד סגור היטב. אל תתנו למוצר להיכנס לניקוז; קיים סכנת פיצוץ.
  8. החלף את תחמוצת הפרופילן בתערובת של שרף פוליבד ותחמוצת פרופילן (יחס של 1:1). שופכים לפחות 2 מ"ל מהתמיסה לכל צלחת פטרי עם החלקים, מכסים במכסה ודוגרים למשך 40 דקות.
  9. לבסוף, הטמיעו חלקי מוח בתערובת של שרף פוליבד ותחמוצת פרופילן (יחס של 3:1). השתמש לפחות 2 מ"ל מהתערובת לכל צלחת פטרי, כסה אותה והשאיר למשך שעה וחצי.
    הערה: ודא שהרקמות שקועות במלואן וודא שהן אינן צפות מעל הנוזל.
  10. חותכים את סרט Aclar לחתיכות התואמות את גודל שקופית הזכוכית. בעזרת פיפטה מפלסטיק, מרחו נפח קטן של שרף על סרט Aclar והעבירו את חלקי המוח מצלחת הפטרי לשרף בעזרת מברשת. הטמיעו כל חלק בין שני סרטי Aclar ודגרו במשך 48 שעות בתנור של 65 מעלות צלזיוס לפילמור.

3. הדמיה וחתך של קליפת החבית

  1. צלמו מקטעי מוח בהגדלה אובייקטיבית פי 2 באמצעות מיקרוסקופ אור (איור 2F).
  2. אסוף את כל התמונות וייבא אותן לתוכנת גרפיקה.
    1. כדי לפתוח תמונות, לחץ על קובץ |פתח ובחר את התמונות באמצעות Shift |לפתוח. התמונות ייפתחו בחלונות נפרדים.
    2. התחל לערום תמונות מקליפת המוח (החלק הקטן ביותר) והמשך עד שכל החלקים מיושרים כהלכה.
    3. לחץ לחיצה ימנית על שכבה 1 |שכפל שכבה בכל תמונה. בתיבת הדו-שיח, הזינו את מספר התמונה כשמה, בחרו תמונה אחת כקובץ היעד ולחצו על הלחצן 'אשר'. חזור על שלבים אלה עבור כל התמונות, ושכפל אותן לאותו קובץ יעד.
    4. יישר את התמונות כדי לשחזר את שדה הקנה, תוך הבטחת סדר אנטומי תקין. השתמש בכלי Move כדי למקם כל שכבה באופן ידני ולאחר מכן לחץ על Edit |טרנספורמציה |הכלי Rotate או Flip להתאמת הכיוון במידת הצורך. כדי לכוונן את היישור, השתמש באפשרות Edit | טרנספורמציה | עיוות והזזה של פינות התמונה כך שיתאימו למבנים האנטומיים בנפרד. כדי להקל על היישור, קבעו את מצב המיזוג של השכבה העליונה על 'כיסוי ' בחלונית 'שכבות '.
    5. השווה ציוני דרך אנטומיים כגון קווי מתאר חבית וכלי דם כדי להבטיח מיקום נכון. כדי לשמור את המחסנית, לחץ על קובץ |שמור בשם, תן שם לקובץ ובחר את הפורמט שלו (PSD או TIFF); לאחר מכן, לחץ על אישור.
  3. סקור את החלקים המרובים המכילים את שדה הקנה ברצף, תוך זיהוי חביות גלויות בכל קטע.
  4. מתאר ידנית כל חבית גלויה על שכבה משותפת נוספת, כדי להבטיח שחזור של כל שדה החבית. ליצירת שכבה נוספת, לחצו על Layer |חדש |הוסיפו שכבות, תנו שם לשכבה ולחצו על הלחצן 'אשר'. בחר את הכלי Brush מסרגל הכלים ובשכבה החדשה, צייר ידנית כל גליל גלוי.
    1. לדיוק רב יותר, השתמשו בזום והתאימו את גודל המברשת לפי הצורך. כדי להגדיל ולהקטין את התמונה, השתמש בכלי הזום או הקש Ctrl + "+" / Ctrl + "-". כדי לשנות את גודל המברשת, לחץ לחיצה ימנית על בד הציור בזמן שהכלי Brush פעיל והזז את המחוון Size .
  5. זהה את הקנה שנבחר על סמך שחזור זה.
  6. מצא את הקנה שנבחר תחת מיקרוסקופ האור על סמך תבנית שדה הקנה (חמש שורות, כל אחת עם ארבע עד שבע חביות) וסידור כלי הדם המציינים את מיקומו בתוך שדה החבית.
  7. בכל קטע עם קליפת חבית גלויה, זהה את הקנה שנבחר תחת סטריאומיקרוסקופ וחתוך אותו יחד עם הסמוך באמצעות סכין גילוח.
  8. הסר את החתיכה הקטנה מהקטע, הדביק אותה על גוש שרף והניח אותה לייבוש. מאוחר יותר, חתוך את עודפי השרף המקיף את הרקמה.
    הערה: הקפד להניח את פיסת הרקמה שטוחה על פני השרף.
  9. השתמש באולטרה-מיקרוטום ובסכין יהלום כדי לחתוך מקטעים רצופים אולטרה-דקים (3-6 מקטעים, עובי 65 ננומטר) (איור 3A), ולאסוף על רשתות ניקל מצופות פורמבר עם חריץ יחיד (2 x 0.75 מ"מ).
  10. לאחר הייבוש, דגימות ניגודיות עם 2% אורניל אצטט למשך 3 דקות ו-0.03% ציטראט עופרת למשך 1.5 דקות.
    הערה: לעומת זאת, חשוב לשטוף את הרשתות כמה פעמים ולהשאיר אותן לייבוש מלא לאחר כל שלב. השתמש במזרקים עם מסננים לאורניל אצטט וציטראט עופרת.
  11. צלם תמונות עוקבות מהשקע של הקנה שנבחר (לדוגמה, B2) תחת TEM (מתח מאיץ של 80 קילו וולט בהגדלות 4K או 8K, בהתאם לשטח ולנפח הנדרשים לניתוח.
    הערה: בדרך כלל, לפחות נפח כולל של 100 מיקרומטר3 לכל בעל חיים מנותח.

4. ניתוח תמונות

הערה: יצירה ויישור של ערימות של תמונות TEM יכולות להיעשות באותו אופן הן באמצעות תוכנה חופשית (כמו GIMP) והן באמצעות תוכנה מסחרית (למשל, פוטושופ). גם שחזורים יכולים להתבצע באותו אופן באמצעות תוכנות מסחריות (למשל, 3D Studio Max) ותוכנות חופשיות לחלוטין, כגון בלנדר.

  1. כדי להעריך את צפיפות הסינפסות, ערמו לפחות שלוש תמונות TEM בתוכנת הגרפיקה (איור 6). ככל שמספר התמונות הסדרתיות גדול יותר, כך דיוק החישובים גבוה יותר.
    1. כדי לפתוח תמונות, לחץ על קובץ |פתח ובחר את התמונות באמצעות Shift |לפתוח; התמונות ייפתחו בחלונות נפרדים.
    2. עבור כל תמונה, לחץ לחיצה ימנית על שכבה 1 |שכפל שכבה. בתיבת הדו-שיח, הזינו את מספר התמונה כשם, בחרו תמונה אחת כיעד ולחצו על הלחצן 'אשר'. חזור על אותם שלבים עבור כל התמונות ושכפל אותן באותו יעד.
    3. כדי לשמור את הערימה, לחץ על קובץ |שמור בשם, תן שם לקובץ, בחר את התבנית שלו (PSD או TIFF) ולחץ על OK.
  2. ליישור תמונות TEM, בחרו בשכבת התמונה העליונה וקבעו את מצב המיזוג ל-Overlay בחלונית Layers . שימוש בעריכה |טרנספורמציה |סובב או את הכלי Flip להתאמת כיוון התמונה. השתמשו בכלי הזזה ליישור מבנים.
    1. להתאמות מדויקות יותר, השתמש באפשרות Edit |טרנספורמציה | עיוות כדי להזיז את פינות התמונה בנפרד. כדי להגביר את הדיוק, החזק את מקש Ctrl וגרור נקודות פינה בודדות. השתמש בשינויים בגודל ובצורה של מיטוכונדריה ומעטפת מיאלין אקסונלית בין תמונות TEM עוקבות כדי לאמת את הרצף הנכון של התמונות.
  3. השתמש בשיטת דיסקטור לספירת סינפסות.
    1. הוסף שכבה לאוסף התמונות של EM על-ידי לחיצה על Layer |חדש |שכבה |בסדר. ודא שהשכבה החדשה שקופה (ללא מילוי רקע).
    2. כדי להגדיר את אזור הניתוח, לחץ על Layer |חדש |שכבה |בסדר; לאחר מכן בחר את הכלי Rectangle , עבור אל Layer |סגנון שכבה |הגדר קו, הגדר את צבע, העובי (גודל) והמיקום של הקו (מומלץ בפנים), לחץ על OK וצייר מלבן. בחר מילוי: 0%. סמן את כל הסינפסות הקיימות בתמונות TEM שאינן חוצות שני קצוות נבחרים סמוכים של המלבן (למשל, הימני והתחתון או העליון והשמאלי).
    3. הוסף שכבה חדשה לביאורים על-ידי לחיצה על Layer |חדש |שכבה |בסדר. השתמשו בכלי Brush כדי לסמן סינפסות בשכבה החדשה. השתמש בכלי זום ובכלי יד לסימון מדויק.
    4. בחר צבע אחד לסימון סינפסות מעוררות וצבע אחר לסינפסות מעכבות. כדי לשנות את הצבע, לחץ על תיבת צבע החזית בסרגל הכלים, בחר צבע בחלון בורר הצבעים ולחץ על אישור.
  4. אם תמונות TEM מכילות מבנים גדולים (למשל, סיבי עצב מיאלינים, דנדריטים גדולים או חלקים מגוף התא), השתמשו ברשת עם ריבועים מרובים. זה מאפשר להוציא את כל הריבועים התפוסים במלואם על ידי מבנים גדולים.
    1. הוספת שכבה שקופה חדשה על-ידי לחיצה על Layer |חדש |שכבה |בסדר. אפשר תצוגת רשת על ידי לחיצה על תצוגה |הצג |רשת, ואפשר הצמדה לרשת על ידי לחיצה על תצוגה |הצמד אל |רשת.
    2. הגדר מרווח רשת על ידי לחיצה על ערוך |העדפות |קווי עזר, רשת ופרוסות. בחרו בכלי Line, קבעו את המצב ל-Shape או Pixels, קבעו את עובי הקו (לדוגמה, 1 פיקסלים) וציירו קווים אנכיים ואופקיים לאורך הרשת הגלויה כדי לכסות את כל אזור התמונה.
  5. הגדר את החלקים "העליונים" וה"תחתונים" עבור כל ערימת תמונות. ספור רק סינפסות שנעדרות בתמונה האחרונה אך קיימות בתמונות הקודמות. זה מאפשר זיהוי מדויק של סינפסות מבלי להעריך יתר על המידה את מספרן.
  6. השתמש בקנה המידה בתמונה וחשב את נפח הדגימה (ערימת תמונות TEM). מדוד את האזור שבו סופרים את הסינפסות והכפל במספר תמונות ה-TEM בערימה ובעובי החלקים האולטרה-דקים.
  7. חלקו את מספר הסינפסות בנפח כדי לקבוע את צפיפות הסינפסות ליחידת נפח.
  8. השתמש בכל תמונות TEM המכילות עמוד שדרה דנדריטי (בדרך כלל 10-12 מיקרוגרפים אלקטרונים רצופים) כדי לשחזר עמוד שדרה דנדריטי ואת הסינפסות שהוא יוצר.
    1. פתחו את אוסף התמונות בתוכנת הגרפיקה. בחר בכלי חיתוך , סמן את האזור הכולל את השידרה הדנדריטית בערימה והקש Enter. האזור שנבחר ייחתך בכל השכבות הגלויות. הפוך רק שכבה אחת לגלויה בכל פעם, הסתר שכבות אחרות באמצעות סמל העין בחלונית Layers .
    2. שמור כל תמונה חתוכה בנפרד על ידי לחיצה על קובץ |שמור בשם, תן שם לקובץ, בחר תבנית (מומלץ ב- JPG) ולחץ על OK. חזור על הפעולה עבור כל שכבה בערימה.
      הערה: לפני העברת התמונות לתוכנת שחזור תלת מימד, עדיף לסמן תחילה את האלמנטים המשוחזרים בצבעים.
    3. הוסף שכבה חדשה להערות על ידי לחיצה על שכבה | חדש |שכבה | בסדר.
    4. קבעו את אטימות השכבה ל- 30% עד 50% בחלונית 'שכבות '.
    5. בחרו בכלי Brush , בחרו צבע שונה לכל מבנה (למשל, שדרה דנדריטית, סינפסה) וסמנו את הרכיבים. עבדו רק על השכבה החדשה כדי לשמור על התמונה המקורית. בסיום, מזג את שכבת הביאור עם התמונה, לחץ לחיצה ימנית על השכבה העליונה ומזג למטה. חזור על שלבים אלה עבור כל תמונת TEM המכילה חתך רוחב של עמוד השדרה הדנדריטי .
  9. העבר את תמונות ה-TEM עם חתכים גלויים של עמוד השדרה הדנדריטי לתוכנת שחזור תלת מימדית. כדי למחוק את אובייקט הקובייה המוגדר כברירת מחדל, לחץ לחיצה ימנית על האובייקט ומחק אותו. כדי ליישר את הפרספקטיבה של אזור התצוגה לפני העלאת תמונות, לחץ על Z בגיזמו הניווט או הקש בלוח מקשי המספרים 7. כדי להעלות תמונות, לחץ על הוסף |תמונה |הפניה, בחר את התמונה הראשונה ולחץ עליה פעמיים כדי לאשר. חזור על הפעולה עבור כל תמונה, כדי להבטיח שנקודת המבט של אזור התצוגה תישאר עקבית לאורך כל התמונה.1
    הערה: כדי לסובב את התצוגה, החזק את לחצן העכבר האמצעי והזז את העכבר או השתמש בגיזמו הניווט. כדי לגלול את התצוגה, החזק את מקש Shift + לחצן העכבר האמצעי, הזז את העכבר או השתמש בהזז את התצוגה.
  10. סדרו את תמונות ה-TEM במרחק המתאים, תוך התחשבות בעובי החלקים האולטרה-דקים (איור 4A). כדי למקם את תמונת ה-TEM האחרונה לאורך ציר Z, לחץ על התמונה, לחץ על מאפייני אובייקט (סרגל הצד הימני) והזן את הערך במיקום Z. כעת ניתן לחלק את התמונות בין התמונה הראשונה והאחרונה. כדי לפזר אותן, בחר את כל התמונות, הקש N כדי לפתוח את החלונית N ולחץ על הכרטיסייה Edit (בחלונית N) | Dist Z.
    הערה: לפני ביצוע התאמות כלשהן, יישר את נקודת המבט של אזור התצוגה ולחץ על Z ב-Navigation Gizmo או הקש בלוח מקשי המספרים 7.
    יש להפעיל את הכלי Distributed כדי להפיץ את התמונות. כדי להפעיל אותו, עבור אל עריכה | העדפות | קבל תוספים, חפש "הפצה" ולחץ על התקן. לאחר הפיכת כלי ההפצה לזמין, הוא נשאר פעיל בכל ההפעלות ואין צורך להפעיל אותו מחדש, כל עוד נעשה שימוש באותה גירסה של התוכנית.
  11. מתאר ידנית את צורת עמוד השדרה הדנדריטי בכל תמונה באמצעות עקומה אחת לכל תמונת TEM (איור 4B,C).
    1. ודא שרק תמונת ה-TEM הראשונה גלויה. באוסף הסצנות, הסתר את כל האובייקטים האחרים באמצעות סמל העין . כדי ליצור עקומת בסיס עבור החלוקה לרמות, לחץ על הוסף |עקומה |מעגל. הזז את האובייקט BézierCircle החזק את G, הזז את העכבר ולחץ כדי לקבל את השינויים.
    2. כדי להתאים את גודל פרופיל השדרה הדנדריטית, שנה את גודל האובייקט, הקש S, הזז את העכבר ולחץ. היכנס לכרטיסייה Modeling כאשר האובייקט BézierCircle נבחר. יישר שוב את הפרספקטיבה של אזור התצוגה ולחץ על Z בגיזמו הניווט או הקש בלוח מקשי המספרים 7.
    3. כדי להתאים את צורת העקומה, בחר נקודת בקרה, החזק את G, הזז את העכבר ולחץ.
    4. כדי לכוונן את הכיוון והחוזק של נקודות האחיזה, בחר נקודת אחיזה, הקש G כדי לזוז או S כדי לשנות את קנה המידה ולחץ כדי לאשר. חזור על הפעולה עבור כל נקודה.
    5. כדי להוסיף נקודת בקרה חדשה, בחר שתי נקודות בקרה קיימות, החזק את מקש Shift ולחץ על כל נקודה, לחץ לחיצה ימנית, בחר חלוקת משנה. כאשר העקומה מתאימה לגבול פרופיל השדרה הדנדריטית במידה מספקת, היכנסו לכרטיסייה Layout , לחצו לחיצה ימנית על האובייקט BézierCircle ועל Duplicate Object, ולחצו מבלי להזיז את העכבר. צור את אותו מספר עותקים של BézierCircle כמו שיש תמונות TEM המשמשות לשחזור. יישר אותם עם תמונות ה-TEM המסודרות באמצעות הכלי הפצה כמו בשלב 4.10.
    6. התאימו כל עקומת BézierCircle בכרטיסייה Modeling כך שתתאים לפרופיל עמוד השדרה הדנדריטי בכל תמונה. ודא שרק האובייקט BézierCircle הערוך כעת ותמונת ה-TEM המתאימה גלויים בכל פעם.
      הערה: כל פעולות הלחיצה הימנית הנדרשות לשלבים מסוימים חייבות להתבצע בגבולות הסצנה. העקומות העוקבות חייבות להתאים לגבולות של קטעי עמוד שדרה דנדריטי עוקבים ולהכיל את אותו מספר של נקודות בקרה.
  12. חבר קווים סמוכים באמצעות פונקציית השחזור התלת-ממדי כדי ליצור משטח רציף וליצור את הצורה התלת-ממדית הסופית (איור 4D).
    1. ודא שרק האובייקטים של BézierCircle גלויים. באוסף הסצנות, הסתר את כל האובייקטים האחרים באמצעות סמל העין בסרגל הצד.
    2. כדי ליצור את אובייקט השדרה הדנדריטית, עבור אל הכרטיסייה פריסה , בחר את כל האובייקטים של BézierCircle, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ולחץ על הצטרף. המרת האובייקט המצורף לרשת שינוי בלחיצה ימנית ובחירה באפשרות Convert To |רשת.
    3. כדי לחבר את הקצוות של האובייקט המצורף, היכנס לכרטיסייה דוגמנות , לחץ על 2 כדי להיכנס למצב בחירת קצה |בחר |הכל |לחיצה ימנית |לולאות קצה גשר.
    4. למילוי הרווח בחלק העליון של האובייקט, בטל את הבחירה ב- All על-ידי לחיצה ליד האובייקט, הקש Alt ולחץ על מקטע קצה אחד של המדף העליון, לחץ לחיצה ימנית, בחר Extrude Edges, גרור כלפי מעלה על ציר Z, הקש S והזז את העכבר כדי לכווץ את לולאת הקצוות החדשה, לחץ כדי לקבל את השינוי. כאשר לולאת הקצה החדשה עדיין נבחרת, לחץ לחיצה ימנית ובחר New Face מתוך Edges. מלא את הפער התחתון באותה שיטה.
    5. להחלקת האובייקט, היכנסו לכרטיסייה Layout, לחצו לחיצה ימנית ובחרו Shade Smooth. כדי להחליק עוד יותר את הצורה, עבור אל Modifiers (סרגל הצד הימני) |הוספת משנה |צור |משטח חלוקת משנה. הגדר את רמות התצוגה והרינדור לאותו ערך (מומלץ 1).
  13. חזור על שלבים 4.11-4.12 לשחזור סינפסות (איור 4E,F).
  14. הקצה צבע לכל מבנה והשתמש בפונקציית הרינדור כדי להכין את התמונה הסופית (איור 4G,H). עבור אל תפריט הצללת אשנב תצוגה ובחר מעובד כדי להציג תצוגה מקדימה של שינויים בחומרים. בחר את האובייקט שברצונך לצבוע ולחץ על חומר (סרגל הצד הימני) |חדש |התאם את צבע הבסיס.
    1. כדי לחדד את מראה החומר, התאם את מחווני החספוס או המתכת לפי הצורך. השתמשו בשיטה זו להקצאת צבע ייחודי לכל מבנה.
    2. כדי להתאים את תאורת הסצנה, לחץ על אובייקט האור, החזק את G והזז את העכבר כדי למקם אותו מחדש. כדי לשנות את עוצמת האור, עבור אל נתונים (סרגל הצד הימני) והתאם את ערך ההספק .
    3. כדי למקם את המצלמה, כוון את אזור התצוגה כך שיפנה אל עמוד השדרה המשוחזר כפי שהוא אמור להופיע בתמונה הסופית, הקש Ctrl + Alt + Numpad 0. בחר את מסגרת המצלמה הגלויה, החזק את G והזז את העכבר כדי לשנות את מיקומה במידת הצורך.
    4. כדי להתכונן לעיבוד, עבור אל פלט (סרגל הצד הימני), שנה את ערכי הרזולוציה X ו-Y כך שיתאימו לתמונה הרצויה. כדי לשפר את איכות התמונה, עבור אל עיבוד (סרגל הצד הימני) |רינדור, התאם את ערך הדגימות בין 120 ל-250. לרקע שקוף, עברו אל רינדור |קולנוע |סמן שקוף. כדי לעבד את התמונה, הקש F12 או עבור אל Render (תפריט עליון) |עיבוד תמונה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי ליישם כראוי את השיטה שלנו לניתוח שינויים סינפטיים צירקדיים, יש צורך להתחיל בבחירת לפחות ארבע נקודות זמן במרווחים שווים, עם שתי נקודות לכל שלב בפעילות החיות (כל 6 שעות). בנקודות זמן ייעודיות אלה, בעלי החיים מוקרבים, ומוחותיהם נאספים. גישה זו מאפשרת לזהות דפוסים יומיומיים או צירקדיים של פלסטיות סינפטית, ומקשרת אותם לשינויים בפעילות התנועתית של בעלי החיים (איור 1). שימוש בשתי נקודות זמן בלבד מאפשר ניתוח של הבדלים בצפיפות הסינפטית בין שלבי הפעילות, אך עשוי שלא לשקף במדויק את הדפוס האמיתי של ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, הצגנו את המתודולוגיה המשמשת לחקר הפלסטיות הצירקדית של סינפסות ושחזור קוצים דנדריטיים בקליפת המוח החבית של עכברים. כדי להבטיח תוצאות אמינות, מחקר הפלסטיות הצירקדית צריך לכלול לפחות ארבע נקודות זמן. המחקר שלנו הראה שנתונים משתי נקודות זמן - אחת בשלב המנוחה (יום) ואחת בשלב הפעילות (לילה) - סיפקו מידע על ההבדלים היומיים בין שלבי הפעילות של בעלי חיים בתנאי LD 12:12. צפיפות הסינפסות הכוללת (הן מעוררת והן מעכבת) הייתה גבוהה ב-21% במהלך שלב המנוחה (שינה) בהשוואה לשלב הפעילות (פעילות מוטורית...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהמרכז הלאומי למדע בפולין, NCN OPUS20 nr UMO-2020/39/B/NZ7/03366 ל-EP והמכללה הרפואית של אוניברסיטת Jagiellonian, nr N41/DBS/001129 ל-MJ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
סרט Aclarאגר מדעיAGL4458
תוכנת בלנדר גרסה: v. 2.91.2
חומצה קקודילית, נתרן מלח טריהידרטמדעי העולם01131-100
מגלשה קעורהמנזל9.161 151
סכין יהלום צורנית15-ארה"בזווית סכין: Ultra 45°  
מצלמה דיגיטלית ניקון DXM 1200 F
די-נתרן מימן פוספט דודקהידראטפוץ'799280115
הטמעת שרףמדעי העולם08792-1נוסחת לופט 
אתנולפול-אאורהPA-11-0004
תוכנת GIMPגרסה: V 3.0.4
ציטראט עופרתטאבL018
מיקרוסקופ אור ניקון אוטיפות
אוסמיום טטרוקסיד מדעי העולם0223ג-10גבישי (99.95%)
מכחול
תוכנת Photoshopגרסה: CS5
אשלגן פריציאנידסיגמאלדריץ'עמ' 8131
תחמוצת פרופילן סיגמאלדריץ'82320פוריס. p.a., ≥ 99.5% (GC)
רשתות חריץ יחידאגר מדעיAGG25252 x 0.75 מ"מ או 2 x 1 מ"מ
נתרן כלורי צ'מפור117941206
נתרן דימימן פוספט דיהידראטצ'מפור117991808
מיקרוסקופ סטריאוPZO
מסנן מזרק ביוסנסBS25PES045
טמ ג'ואלג'ם-2100
אולטרה-מיקרוטוםלייקהUC7
אורניל אצטטלאצ'מה
ויברטוםלייקהVT1000 S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jasinska, M., Pyza, E. Circadian plasticity of mammalian inhibitory interneurons. Neural Plast. 2017, 1-12 (2017).
  2. Krzeptowski, W., Hess, G., Pyza, E. Circadian plasticity in the brain of insects and rodents. Front Neural Circuits. 12, 32(2018).
  3. Mansilla, A., et al. Molecular mechanisms that change synapse number. J Neurogenet. 32 (3), 155-170 (2018).
  4. Frank, M. G. Renormalizing synapses in sleep: the clock is ticking. Biochem Pharmacol. 191, 114533(2021).
  5. Jasinska, M., et al. Daily rhythm of synapse turnover in mouse somatosensory cortex. Acta Neurobiol Exp. 74 (1), 104-110 (2014).
  6. Jasinska, M., et al. Circadian rhythmicity of synapses in mouse somatosensory cortex. Eur J Neurosci. 42 (8), 2585-2594 (2015).
  7. Jasinska, M., et al. Circadian clock regulates the shape and content of dendritic spines in mouse barrel cortex. PLOS ONE. 14 (11), e0225394(2019).
  8. Jasinska, M., et al. Circadian changes of dendritic spine geometry in mouse barrel cortex. Front Neurosci. 14, 578881(2020).
  9. Jasinska, M., et al. Light-modulated circadian synaptic plasticity in the somatosensory cortex: link to locomotor activity. Int J Mol Sci. 25 (23), 12870(2024).
  10. Woolsey, T. A., Vander Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
  11. Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the Sml-face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
  12. Armstrong-James, M., Fox, K. Spatiotemporal convergence and divergence in the rat SI barrel cortex. J Comp Neurol. 263 (2), 265-281 (1987).
  13. Barrel cortex. Fox, K. , Cambridge University Press. (2008).
  14. Jasinska, M., et al. Rapid, learning-induced inhibitory synaptogenesis in murine barrel field. J Neurosci. 30 (3), 1176-1184 (2010).
  15. Knott, G. W., Quairiaux, C., Genoud, C., Welker, E. Formation of dendritic spines with GABAergic synapses induced by whisker stimulation in adult mice. Neuron. 34 (2), 265-273 (2002).
  16. Jasinska, M., et al. Effect of associative learning on memory spine formation in mouse barrel cortex. Neural Plast. 2016, 1-11 (2015).
  17. Jasinska, M., et al. Fear learning increases the number of polyribosomes associated with excitatory and inhibitory synapses in the barrel cortex. PLOS ONE. 8 (2), e54301(2013).
  18. White, E. L. Ultrastructure and synaptic contacts in barrels of mouse SI cortex. Brain Res. 105 (2), 229-251 (1976).
  19. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing whole-brain activity and development at the single-cell level using light-sheet microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
  20. Serrano, M. E., Kim, E., Petrinovic, M. M., Turkheimer, F., Cash, D. Imaging synaptic density: the next holy grail of neuroscience. Front Neurosci. 16, 796129(2022).
  21. Woelfle, S., et al. CLARITY increases sensitivity and specificity of fluorescence immunostaining in long-term archived human brain tissue. BMC Biol. 21 (1), 113(2023).
  22. Weibel, E. R. Stereological methods. Vol. 1: practical methods for biological morphometry. , Academic Press. London. (1979).
  23. Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134 (2), 127-136 (1984).
  24. Gundersen, H. J. G. Stereology of arbitrary particles. J Microsc. 143 (1), 3-45 (1986).
  25. Fiala, J. C., Harris, K. M. Cylindrical diameters method for calibrating section thickness in serial electron microscopy. J Microsc. 202 (3), 468-472 (2001).
  26. Napper, R. M. A. Total number is important: using the disector method in design-based stereology to understand the structure of the rodent brain. Front Neuroanat. 12, 16(2018).
  27. Perez-Cruz, C., Simon, M., Czéh, B., Flügge, G., Fuchs, E. Hemispheric differences in basilar dendrites and spines of pyramidal neurons in the rat prelimbic cortex: activity- and stress-induced changes. Eur J Neurosci. 29 (4), 738-747 (2009).
  28. Kasthuri, N., et al. Saturated reconstruction of a volume of neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  29. Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nat Methods. 9 (12), 1198-1201 (2012).
  30. Videnovic, A., Zee, P. C. Consequences of circadian disruption on neurologic health. Sleep Med Clin. 10 (4), 469-480 (2015).
  31. Logan, R. W., McClung, C. A. Rhythms of life: circadian disruption and brain disorders across the lifespan. Nat Rev Neurosci. 20 (1), 49-65 (2018).
  32. Nassan, M., Videnovic, A. Circadian rhythms in neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurol. 18 (1), 7-24 (2021).
  33. Shen, Y., et al. Circadian disruption and sleep disorders in neurodegeneration. Transl Neurodegener. 12 (1), 8(2023).
  34. Dufort-Gervais, J., Mongrain, V., Brouillette, J. Bidirectional relationships between sleep and amyloid-beta in the hippocampus. Neurobiol Learn Mem. 160, 108-117 (2019).
  35. Adler, P., et al. Aging disrupts the circadian patterns of protein expression in the murine hippocampus. Front Aging Neurosci. 11, 368(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transmission Electron MicroscopyCircadian Synaptic PlasticityBarrel CortexMouse BrainSynaptic DensityDendritic Spine ReconstructionExcitatory SynapsesInhibitory SynapsesStereological Dissector MethodTangential Brain Sectioning

Related Articles