מאמר שיטה

מדריך מדורג לבידוד וניתוח של משטח העלים ו-RNA אפופלסטי באמצעות רוזטות Arabidopsis

DOI:

10.3791/68406

⸱

8 באוגוסט 2025

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה פשוטה אך ניתנת לשחזור מאוד לבידוד RNA חוץ-תאי מפני השטח של העלים והאפופלסט של צמחי Arabidopsis.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פני השטח של עלי הצמח והחלל הבין-תאי בתוך העלים (האפופלסט) משמשים כממשקים מרכזיים להחלפה מולקולרית בין צמחים לבין המיקרובים האינטראקטיביים שלהם. בעבודה קודמת הדגמנו את נוכחותם של מגוון רחב של מיני RNA באפופלסט של שושנות Arabidopsis. לאחרונה, הממצאים שלנו חשפו שצמחי Arabidopsis מפרישים באופן פעיל RNA על פני העלים שלהם. כדי לחקור זאת, פיתחנו שיטה הניתנת לשחזור מאוד לאיסוף שטיפת משטח עלים (LSW) ונוזל שטיפה אפופלסטי (AWF) מאותה קבוצה של צמחי Arabidopsis. בנוסף, חקרנו טכניקה לא פולשנית המערבת ספוגית פני עלים (LSS), שאפשרה לנו לאסוף RNA על ידי ניקוי עדין של פני השטח של העלה עם מקלות כותנה סטריליים. כדי למזער את הסיכון לזיהום מיקרוביאלי, סיננו שברי LSW, AWF ו-LSS לפני בידוד ה-RNA החוץ-תאי (exRNA). לאחר ניתוח ה-exRNA המטוהר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל RNA דנטורינג, צפינו במגוון רחב של מיני RNA ארוכים וקטנים בדגימות RNA של LSW, LSS ו-AWF. כימות נוסף וניתוח השוואתי בין דגימות exRNA לתנאי הניסוי בוצעו באמצעות התוכנה הנגישה בחינם ImageJ. פרוטוקול זה מספק גישה יעילה וחסכונית לבידוד וניתוח כמויות קטנות של exRNA מעלי הצמח. ניתן לאפיין את תכשירי ה-RNA הללו באמצעות ריצוף וניתוחים מולקולריים אחרים, המציעים תובנות לגבי התפקידים הדינמיים של exRNA באינטראקציות בין צמח לחיידקים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עלים מיושבים על ידי מגוון חיידקים, כולל חיידקים, פטריות, אומיצטים ופרוטיסטים, שיכולים לסייע בהגנה על צמחים מפני גורמי עקה ביוטיים ואביוטיים, ובסופו של דבר לקדם צמיחה והתפתחות של צמחים 1,2,3,4. לעלה הצמח יש שני תאים עיקריים המארחים את החיידקים האינטראקטיביים שלהם: אפיפיטי (משטח העלה) ואנדופיטי (אפופלסט)2. משטח העלה מוגן על ידי שכבת ציפורן הידרופובית, המונעת איבוד מים וכוללת רכיבים כמו שעווה וקוטין. פני השטח העליונים של העלים (האדקסיים) כוללים לעתים קרובות תאי אפידרמיס מיוחדים דמויי שיער הנקראים טריכומות, המגנים מפני קרינת UV, מווסתים את הטמפרטורה ומשמשים כמרתיעים לאוכלי עשב. לעומת זאת, האפופלסט מקל על חילופי גזים ומים לפוטוסינתזה ומספק סביבה לחה התורמת להתיישבות מיקרוביאלית5. למרות ההבדלים הללו, שני תאי העלים מעדיפים חיידקים מסוימים, כאשר רשתות מיקרוביאליות אפיפיטיות מורכבות יותר מבחינת המגוון בהשוואה לרשתות המיקרוביאליות האנדופיטיות5. כיצד הרכב הקהילות המיקרוביאליות הללו מווסת בכל תא חוץ-תאי נותר לא מובן היטב. אנו משערים שמבנה הקהילה המיקרוביאלית עשוי להיקבע, בין השאר, על ידי RNA חוץ-תאי (exRNA) המופרש על ידי הצמח המארח.

במחקר האחרון שלנו, דיווחנו על נוכחות של מיני RNA מגוונים על פני העלים השונים מ-RNA באפופלסט או בליזאטים של התא6. בעוד שרוב המחקר על exRNAs בצמחים התמקד ב-RNA קטנים שאינם מקודדים, כגון microRNAs (miRNAs) ו-RNA מפריע קטן (siRNAs), פחות תשומת לב ניתנה למיני RNA אחרים, כגון שברים שמקורם ב-rRNA ו-tRNA, שיכולים לווסת תהליכים תאיים ללא תלות בהשלמת הרצף, במיוחד במינים חסרי מנגנוני הפרעה של RNA 7,8, 9.

השיטה שאנו מתארים כאן מאפשרת בידוד רציף של RNA הן משטיפת פני העלים (LSW) והן מנוזל השטיפה האפופלסטי (AWF) באמצעות אותה קבוצה של צמחי Arabidopsis. בנוסף, אנו מתארים טכניקה אורתוגונלית לא פולשנית הכוללת ספוגית משטח עלים (LSS), המאפשרת איסוף RNA על ידי ספוגית עדינה של משטח העלה המרוסס במקלות סטריליים עם קצה כותנה6. כדי למזער את הסיכון לזיהום מיקרוביאלי, אנו מסננים את חלקי ה-LSW וה-AWF לפני בידוד ה-RNA החוץ-תאי. כדי להעריך את התפלגות הכמות והגודל של דגימות exRNA, אנו מתארים פרוטוקול המשתמש באלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד בשילוב עם ניתוח תמונה באמצעות התוכנה הנגישה בחינם ImageJ. פרוטוקול זה מספק גישה יעילה וחסכונית לבידוד וניתוח כמויות קטנות של exRNA. ניתן לאפיין את תכשירי ה-RNA הללו באמצעות ריצוף וניתוחים מולקולריים, המציעים תובנות לגבי התפקידים הדינמיים של RNA חוץ-תאי באינטראקציות בין צמח לחיידקים.

הפרוטוקול המתואר להלן שונה מהפרוטוקול שתואר קודם לכן לבידוד RNA משלפוחיות חוץ-תאיות של הצמח10. הפרוטוקול הנוכחי אינו דורש שלבי אולטרה-צנטריפוגה ומאפשר בידוד של RNA מנוזל שטיפה חוץ-תאי כולל, לא רק משלפוחיות חוץ-תאיות. המשמעותי ביותר, הוא מספק שתי שיטות אורתוגונליות לבידוד RNA מפני השטח של העלה. למיטב ידיעתנו, בידוד ה-RNA ממשטחי העלים לא תואר לפני הפרסום האחרון שלנו6.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת חיץ ועיקור

  1. הכן מאגר בידוד שלפוחית (VIB) המורכב מ-20 מ"מ 2-(N-מורפולינו) חומצה אתנסולפונית (MES), pH 6.0, 2 מ"מ CaCl2 ו-0.01 מ"מ NaCl ב-1 ליטר מים מזוקקים.
    הערה: התאמות קלות לריכוז NaCl ב-VIB נעשו מ-0.1 מ' ל-0.01 מ' כדי לחקות את הריכוז היוני של אפופלסט העלה.
  2. חיטוי ה-VIB למשך 20 דקות ב-121 מעלות צלזיוס, מחזור נוזלי. לחלופין, יש לעקר את ה-VIB באמצעות מסנן ואקום של 0.45 מיקרומטר.
    הערה: שלב זה נועד להבטיח שהמאגר יהיה סטרילי, שכן כל זיהום מיקרוביאלי עלול להוביל להפקת צמחים ובתורו, לשונות בתוצאות. ניתן לאחסן מאגר זה בטמפרטורת החדר (ללא פתיחת המכסה לאחר עיקור) לאחסון לטווח קצר או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.

2. חומר צמחי ומצב גידול

  1. זרעו זרעי Arabidopsis thaliana Col-0 מסוג בר (WT) בעציצי פלסטיק עגולים בגודל 4 אינץ' המכילים תערובת עציצים סטנדרטית. לאחר הזריעה יש להשרות את הזרעים בקוטל פטריות ביולוגי (600 מ"ג/ליטר), לכסות אותם בכיפת פלסטיק שקופה ולשמור אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 3 ימים כדי לגרום לנביטה סינכרונית.
  2. העבירו את העציצים עם הזרעים לתא גידול מבוקר טמפרטורה ליום קצר המוגדר בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס תחת תקופת אור של 9 שעות / 15 שעות חושך עם צפיפות שטף פוטון פוטוסינתטי של 150 μmol·m−2·s−1 ברמת הצמח (תערובת של 50:50 של נורות פלורסנט 3,500 ו-5,000 K ספקטרום 32 וואט).
  3. לאחר כ-10 ימים, העבירו שתילים בודדים לתוספות מגש של 36 תאים המכילות תערובת עציצים וכסו בכיפת פלסטיק שקופה למשך 1-2 שבועות.
    הערה: ניסוי טיפוסי דורש ~12-24 צמחים בריאים לכל גנוטיפ/טיפול. צוין כי צמחים בני 6-7 שבועות מניבים את הכמות האופטימלית של LSW ו-AWF RNA עם הסיכון הקטן ביותר לזיהום תאי.
  4. בהתאם לתערובת העציצים המשמשת, השקה את הצמחים כל 10-15 ימים כדי למנוע בצורת או לחץ שיטפונות.

3. איסוף RNA משטח עלה

  1. שיטה מבוססת צנטריפוגה (שטיפת משטח עלים; LSW)
    1. עבור כל שכפול, השתמש בצמחי Arabidopsis בני 6-7 שבועות.
    2. הוסף את Silwet-L77 (המכונה מעתה והלאה חומר הרטבה) ל-VIB הסטרילי בריכוז סופי של 0.001% (1 מיקרוליטר ב-100 מ"ל של VIB) לפני תחילת הבידוד של LSW.
      הערה: Silwet-L77 הוא חומר הרטבה, המפחית את מתח הפנים ומאפשר למאגר לצפות את משטחי העלים.
    3. העבירו 100 מ"ל של VIB לבקבוק ריסוס של 500 מ"ל.
    4. נתק בזהירות את רוזטות Arabidopsis משורשיהם בעזרת מספריים עדינים.
    5. הסר עודפי אדמה מהפטוטרת בעזרת מברשת רכה.
    6. הניחו את הרוזטות על מגש שטוח כשהמשטח האבקסיאלי פונה כלפי מעלה.
    7. רססו את המשטח האבקסיאלי בחומר הרטבה VIB + באמצעות חמש משאבות של בקבוק הריסוס.
    8. הפוך את הרוזטות בזהירות ורסס את המשטח האדקסיאלי בחומר הרטבה VIB + חמש פעמים.
    9. כדי לשחזר LSW, הנח בזהירות את הרוזטות המרוססות בתוך מזרקים ללא מחט של 60 מ"ל עם חורים בתחתית (מקסימום שתי רוזטות בנות 6 שבועות יכולות להתאים לכל מזרק) המונחות בתוך בקבוקי צנטריפוגה של 250 מ"ל. עטפו את המזרק עם פרפילם סביב הצוואר כדי לתלות את קצה המזרק מעל תחתית הבקבוק (ראה איור 1 לעיון).
      הערה: לפרטים על הכנת מזרקי 60 מ"ל עם חורים, עיין בפרוטוקול11 שפורסם בעבר.
    10. צנטריפוגה את הבקבוקים העמוסים ב-100 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס (רוטור JA-14).
    11. סנן את ה-LSW דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר ואסוף את המסנן בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל המונח על קרח.
      הערה: בדרך כלל, 12 צמחים יניבו כ-30 מ"ל של LSW בסוף באמצעות פרוטוקול זה. עם זאת, זוהי רק הערכה המבוססת על מספר התרסיסים שבוצעו בכל שלב. נפח זה בדרך כלל קטן מהנפח המרוסס, מכיוון שחלק מהמאגר המרוסס הולך לאיבוד במהלך הטיפול.
  2. שיטת ספוגית משטח עלים (LSS).
    1. רססו את הרוזטות המנותקות בחומר הרטבה VIB + כמתואר בסעיף הקודם (שלבים 3.1.1-3.1.7).
    2. כדי לשחזר LSS, ספוג את המשטחים האדקסיאליים והאבקסיאליים באמצעות מקלות סטריליים עם קצה כותנה ולחץ את הקצוות הספוגים על הדופן הפנימית של צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל כדי לסחוט את הנוזל החוצה.
      הערה: ניתן לאסוף את דגימות ה-LSS האדאקסיאליות והאבקסיאליות בצינורות נפרדים בהתבסס על מערך הניסוי והתוצאה הצפויה.
    3. סנן את דגימות ה-LSS דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל המונח על קרח.
      הערה: בהתאם למספר הצמחים שנלקחו, ניתן לאסוף כמויות משתנות של LSS לכל ניסוי.

figure-protocol-1
איור 1: כלים המשמשים לשטיפת משטח עלים ובידוד נוזל כביסה אפופלסטי. (A) כדי לאסוף LSW ו-AWF, שתי רוזטות Arabidopsis thaliana שלמות מונחות במזרק של 60 מ"ל עם שמונה חורים נוספים המומסים לתוך קצה המזרק עם מלקחיים מחוממים כדי ליצור תעלות לזרימת הכביסה. (B) המזרק ללא מחט הזה נעטף בפאראפילם באזור הצוואר כפי שמתואר. (C) שלב זה מאפשר למזרק להיכנס לבקבוק צנטריפוגה של 250 מ"ל מבלי לגעת בתחתית הבקבוק. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

4. איסוף נוזל כביסה אפופלסטי (AWF)

  1. הניחו את אותה קבוצת צמחים המשמשת לבידוד LSW או LSS בכוס ושטפו אותם בעדינות פעמיים במים מזוקקים.
  2. ואקום הסתנן לרוזטות עם VIB למשך 20 שניות באופן הבא:
    הערה: למרות שתהליך חדירת הוואקום מתואר היטב בפרוטוקול11 שפורסם בעבר, הוא שוחזר כאן כדי להבהיר את הפרוטוקול הנוכחי.
    1. מניחים בזהירות רוזטות במכונת קפה צרפתית עם 300-500 מ"ל VIB. הניחו את המכסה על המכבש הצרפתי והורידו בעדינות את הבוכנה עד שהצמחים שקועים לחלוטין.
    2. מניחים את העיתונות הצרפתית עם צמחים ומאגרים בתא ואקום. החל ואקום למשך 20 שניות באמצעות משאבת ואקום. המאגר צריך פשוט להתחיל לרתוח.
    3. שחרר את הוואקום והסר את המכבש הצרפתי מתא הוואקום, הסר את המכסה ושפך את ה-VIB לכוס פלסטיק נפרדת של 500 מ"ל. מוציאים את הרוזטות מהעיתונות הצרפתית.
      הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר ב-VIB מספר פעמים באותו יום עבור גנוטיפ אחד, אך לאחר השימוש בו לחדירת ואקום, אין לאחסן את ה-VIB לשימוש ביום אחר.
    4. הסר עודפי VIB מהצמחים על ידי ניעור עדין ולאחר מכן הברשה של העלים על פני מגבת נייר.
  3. הסר עודפי חיץ ממשטחי העלים על ידי ספיגה עדינה עם נייר סופג.
  4. כדי לאסוף את נוזל הכביסה האפופלסטי (AWF), הנח את הרוזטות בתוך מזרקים ללא מחט של 60 מ"ל המונחים בתוך בקבוקי צנטריפוגה של 250 מ"ל כמתואר לאיסוף LSW וצנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב-600 × גרם עם תאוצה איטית.
  5. סנן את ה-AWF המאוגד דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר ואסוף את המסנן בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל המונח על קרח.
    הערה: בדרך כלל, 12 צמחים יניבו כ-6 מ"ל של AWF בסוף באמצעות פרוטוקול זה. ניתן להשתמש ב-LSW, AWF ו-LSS מסוננים באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  6. רשום את המשקל הטרי (FW) של הצמחים המשמשים לכל שכפול לאחר בידוד AWF. לאחר מכן, השתמשו בקריאה זו כדי לנרמל את כמות הרנ"א בכל דגימה (איור 2).

figure-protocol-2
איור 2: איורים סכמטיים של הפרוטוקול ושיטת ספוגית פני העלים. (A) המחשה סכמטית של פרוטוקול מדורג לבידוד נוזל שטיפת משטח עלים ונוזל שטיפה אפופלסטי באמצעות רוזטות Arabidopsis. (B) איור סכמטי של שיטת ספוגית פני העלה (LSS) לבידוד RNA פני השטח של העלה. הדמויות נלקחו מאיור S1 ואיור S4 של Borniego et al., 20256. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

5. משקעים של RNA

  1. זרז RNA על ידי ערבוב הנפח הנדרש של AWF, LSW או LSS עם נפח 0.1 של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2) ונפח 1.0 של איזופרופנול קר בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
  2. הוסף גליקוגן (20 מ"ג/מ"ל ציר) לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/מ"ל.
    הערה: ודא שניתן לצנטריפוגה את צינורות הצנטריפוגה המשמשים לזירוז RNA במהירות גבוהה של 13,000 × גרם. שבירת צינורות בשלב זה עלולה להוביל לאובדן דגימות RNA.
  3. דגרו את התערובת בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות או למשך הלילה.
  4. צנטריפוגה את הצינורות ב-13,000 × גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס (רוטור JA-25.50).
  5. שטפו את הכדור פעמיים עם 70% EtOH קר כקרח והניחו לו להתייבש באוויר לא יותר מ-10 דקות.
  6. השעו מחדש את הכדורים ב-100 מיקרוליטר של מים נטולי DNase/RNase או VIB טהורים במיוחד, והעבירו את ה-RNA לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    הערה: לאחר שלב זה, ניתן לאחסן את ה-RNA המשקע בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.

6. בידוד RNA מבוסס TRIzol

  1. הוסף 1 מ"ל של TRIzol Reagent לכל צינור וערבב על ידי ניעור על מסובב.
    זהירות: לטיפול ב-TRIzol, השתמש בו במכסה אדים, ללבוש כפפות ולהגן על העיניים.
  2. הנח את הצינורות על מסובב שולחן למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  3. הוסף 200 מיקרוליטר של כלורופורם לכל צינור, ואחריו שלב מערבולת קצר אך נמרץ.
    זהירות: לטיפול בכלורופורם, יש להשתמש בו במכסה אדים, ללבוש כפפות ולהגן על העיניים.
  4. הניחו לצינורות לעמוד ב-RT למשך כ-3 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-13,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  5. העבירו את השלב המימי לצינורות צנטריפוגה מסומנים של 1.5 מ"ל והוסיפו 10 מיקרוגרם של גליקוגן נטול RNase ונפח אחד של איזופרופנול קר.
    זהירות: עבור פסולת ביולוגית מסוכנת שנוצרת (כגון פסולת פנול), אסוף ממיסים אורגניים במיכלי פסולת ייעודיים בהתאם להנחיות המוסד.
  6. דגרו את הצינורות לא יותר משעה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: שקע ה-RNA במשך יותר משעה בשלב זה מפחית את יעילות בידוד ה-RNA ומוביל לריכוז נמוך מאוד של RNA.
  7. כדי לגלול את ה-RNA, צנטריפוגה את הצינורות ב-13,000 × גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  8. שטפו את כדורי ה-RNA פעמיים באמצעות 70% EtOH קר כקרח ותנו להם להתייבש באוויר לפני השעיית 10-20 מיקרוליטר של מים נטולי DNase/RNase טהורים במיוחד.
  9. אחסן את ה-RNA המרחף ב-20 מעלות צלזיוס או -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר או ארוך, בהתאמה.

7. הסרת זיהום פנול או גואנידין

  1. כדי להסיר זיהום פנול או גואנידין מדגימות ה-RNA, בצע משקע סדרתי אחד או שניים עם 96% EtOH ואמוניום אצטט.
  2. הוסף 1 מיקרוגרם גליקוגן ל-10 מיקרוליטר של דגימות RNA וערבב עם 0.5 נפח של 7.5 M אמוניום אצטט לפני הוספת 2.5 נפחים של 96-100% EtOH.
    הערה: הריכוז הסופי של EtOH צריך להיות 70-75% בכל הנפח בשלב זה.
  3. דגרו את התערובת בחום של -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות וצנטריפוגה בחום של 13,000 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  4. שטפו את כדור ה-RNA פעמיים עם 70% EtOH והשעו מחדש ב-10 מיקרוליטר של מים נטולי DNase/RNase טהורים במיוחד.

8. אלקטרופורזה של ג'ל RNA לכימות והשוואה

  1. הכן מיני ג'ל (7.2 ס"מ x 8.6 ס"מ x 0.75 מ"מ) המכיל 10% או 15% פוליאקרילאמיד ו-7 M אוריאה ב-1x Tris-Boric Acid EDTA (TBE, pH 8.4) באמצעות תמיסת 40% אקרילאמיד/BIS, 37.5:1. לחלופין, ניתן להשתמש במיני ג'ל מסחרי לדנטורציה (15% ג'ל TBE-אוריאה) להפעלת דגימות ה-RNA.
  2. מערבבים דגימות RNA (1:1) עם 2x מאגר טעינת דנטורציה (95% פורממיד, 10 מ"מ EDTA, 0.02% SDS, 0.02% ברומופנול כחול ו-0.01% קסילן ציאנול), מנטרלים ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ומניחים מיד על קרח.
  3. פתור את דגימות ה-RNA במאגר ריצה של 0.5x TBE ב-RT ב-220 וולט למשך כשעה ו-15 דקות.
  4. לתקני גודל, השתמש בתערובת של 1:1 של סמני סולם ssRNA לטווח נמוך ו-14-30 nt ssRNA.
  5. צבעו את הג'ל עם כתם ג'ל חומצת גרעין זהב SYBR 1x ב-0.5x TBE למשך 10 דקות, שטפו פעמיים במים מזוקקים וצלמו באמצעות מערכת הדמיה (איור 3).
  6. כדי לכמת את ה-RNA שנפתר בכל נתיב, השתמש בשיטת ניתוח הג'ל המתוארת בתיעוד ImageJ תחת כותרת המשנה "ניתוח ג'ל": https://imagej.net/ij/docs/menus/analyze.html
  7. מכיוון ש-100 ננוגרם/מיקרוליטר של CL RNA נטען בכל פעם כדי להשוות את דפוס הפסים בין דגימות CL ו-exRNA, העריכו את ריכוז דגימות ה-exRNA ביחס ל-CL RNA (איור 4).

figure-protocol-3
איור 3: עלי הצמח מצופים ב-RNA מגוון. 100 ננוגרם של RNA מליזאט תאי עלה (CL), ו-2 מיקרוליטר של RNA שבודד מ-AWF ו-LSW הופרדו על ג'ל פוליאקרילאמיד 15% ונצבעו בצביעה של חומצת גרעין SYBR Gold כדי לדמיין ולהשוות את דפוסי רצועות ה-RNA. תקני גודל RNA מוצגים בנתיב השמאלי ביותר. מדידות צפיפות המתקבלות באמצעות ניתוח ג'ל ImageJ מצוינות בתחתית כל נתיב ומציינות את כמות ה-RNA ביחס ל-RNA בנתיב הליזאט הכולל של תא העלה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-4
איור 4: מיצוי חוזר של RNA LSW. LSW בודד לראשונה באמצעות VIB ללא Silwet L-77 או ריכוזים משתנים של Silwet L-77 (0.001% או 0.01%). ניתן להשתמש בבידוד חוזר של LSW באמצעות אותה קבוצה של צמחי Arabidopsis כדי להעשיר את RNA LSW באמצעות VIB + Silwet L-77 (0.001%). L1, L2 ו-L3 מציינים דגימות RNA שבודדו באמצעות LSW שנאספו באמצעות שלושה סבבים רצופים של צנטריפוגה לאחר ריסוס אותה קבוצת צמחים. הגדלת ריכוז חומר ההרטבה מ-0.001% ל-0.01% לא שיפרה את בידוד ה-RNA של LSW. מדידות צפיפות המתקבלות באמצעות ניתוח ג'ל ImageJ מצוינות בתחתית כל נתיב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

9. שיטה חלופית לכימות RNA בשיטה מבוססת צלחת מיקרוטיטר

  1. הכן פתרונות RNA סטנדרטיים באמצעות CL RNA במים נטולי RNase/DNase טהורים במיוחד. קבע את טווח הריכוז המתאים לתקנים על סמך הריכוז הצפוי של הדגימות. השתמש בריכוזי ה-RNA הבאים: 0, 6.75, 12.5, 25, 50, 100, 200 ננוגרם/מיקרוליטר, והכן נפח מספיק של כל תקן כדי לאפשר שני שכפולים טכניים.
  2. הכן כתם ג'ל חומצת גרעין 1.5x SYBR זהב ב-500 מ"מ Tris HCl pH = 8.
    הערה: SYBR Gold תלוי ב-pH ובעל רגישות צביעה אופטימלית בין pH = 7.0 ל-8.0.
  3. הגדרת מיקרופלייט:
    1. הוסף 99 מיקרוליטר של dH2O לכל באר.
    2. הוסף 1 מיקרוליטר RNA לכל באר. השתמש ב-1 מיקרוליטר הן עבור דגימות RNA והן עבור תקני RNA.
    3. הוסף 50 מיקרוליטר של 1.5x SYBR Gold לכל באר.
  4. הגדר את הפרמטרים בקורא המיקרו-פלטות באופן הבא:
    טלטול - ליניארי או מסלולי: 0:03 (MM:SS)
    קרא - נקודת קצה פלואורסצנטית עם אורך גל עירור מוגדר על 496 ננומטר, ואורך גל פליטה מוגדר על 540 ננומטר.
  5. בנה קו כיול באמצעות ערכי התקנים. באמצעות משוואת קו הכיול, חשב את ריכוזי ה-RNA בדגימות.
    הערה: ניתן להשתמש בצבעים חלופיים כדי לכמת RNA בדגימות מבודדות TRIzol. תוצאות דומות התקבלו עם ריאגנט לכימות RNA Ribo488. מדריך מפורט מסופק על ידי החברה עבור צבע זה. בקצרה, יש לדלל את הצבע פי 1000 (1 עד 1000) באמצעות 200 מ"מ Tris pH = 8. לאחר מכן כדי לבצע את המדידות, הוסף 99 מיקרוליטר של dH2O אוטוקלאב לכל באר + 1 מיקרוליטר RNA (מדגם או סטנדרטי) + 100 מיקרוליטר של דילול Ribo488, דגירה 5 דקות וכימת פלואורסצנטיות באמצעות קורא צלחות באמצעות עירור של 480 ננומטר ופליטה של 520 ננומטר. עקומות סטנדרטיות המתקבלות באמצעות שני צבעי ה-RNA מוצגות באיור 5.

figure-protocol-5
איור 5: עקומות סטנדרטיות המתקבלות באמצעות שיטת כימות RNA מבוססת לוח מיקרוטיטר. שני צבעי RNA שונים, SYBR Gold (משמאל) ו-Ribo488 (מימין) מניבים תוצאות עקביות עם שני שכפולים טכניים לכל דגימה. ניתן להשתמש בכל אחת מהשיטות לביצוע כימות RNA. עם זאת, יש להשיג עקומה סטנדרטית בכל פעם שצריך לכמת RNA. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סקירה סכמטית של הפרוטוקול המדורג שתואר לעיל לבידוד שטיפת משטח עלים (LSW) ושברי שטיפה אפופלסטיים (AWF) מצמחי Arabidopsis מוצגת באיור 2A. שיטה זו מאפשרת מיצוי של LSW ו-AWF משלושה עד שישה צמחים לכל שכפול, תוך הפקת כמויות שוות ערך של RNA משני השברים. כדי למדוד את ריכוז ה-RNA בליזטים של תאים, אנו משתמשים בספקטרופוטומטריה של NanoDrop. עם זאת, עבור דגימות ה-RNA שמקורן ב-LSW, LSS ו-AWF, אנו מסתמכים על כימות צפוף של ג'לי פוליאקרילאמיד מוכתמים בזהב SYBR. שלב כימות זה הכרחי מכיוון שהשברים החוץ-תאיים מכילים מזהם לא ידוע - פוליסכרידים סבירים - שיכולים לפעמים לטהר ולהפריע לשיטות כימות RNA מבוססות ספיגה, מה שמוביל להערכת יתר של ריכוז ה-RNA. כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו מתכננים להשתמש בשיטות טיהור RNA שאינן מבוססות פנול בעבודתנו העתידית.

ניתוח ג'ל דנטורינג של RNA חשף נוכחות של מגוון רחב של מיני RNA ב-LSW ו-AWF, כולל RNA ארוך וקטן כאחד (איור 3). יש לציין כי כמויות RNA שוות ערך בודדו בהצלחה הן משטח העלים והן משברים אפופלסטיים, כאשר כמויות ה-RNA נורמלו לכל משקל טרי של הצמח (FW). באופן מפתיע, פרופילי גודל ה-RNA של חלקי ה-LSW וה-AWF היו שונים באופן משמעותי זה מזה ומהפרופיל של ה-RNA הכולל של התא (CL). הבדלים אלה מצביעים על כך שחלקי ה-exRNA אינם מזוהמים ב-RNA תאי. מבין שלושת השברים, ה-RNA האפופלסטי (AWF) הציג את המגוון הגדול ביותר בהתפלגות הגודל, מה שמרמז על כך ש-RNA אפופלסטי מתפרק יותר מ-RNA פני העלה.

כדי לבחון עוד יותר את נוכחות הרנ"א על פני השטח של עלי ארבידופסיס, השתמשנו במקלוני צמר גפן. שיטה זו אפשרה לנו לאסוף בנפרד וברצף RNA ממשטחי העלים האדקסיאליים (העליונים) והאבקסיאליים (התחתונים)6. ניתוחים אלה גילו כי שני משטחי העלים הכילו כמויות דומות של RNA. יתר על כן, היכולת לאסוף RNA פשוט על ידי ספיגת חיץ מפני השטח של העלה ללא צורך בצנטריפוגה תומכת עוד יותר במסקנה ש-RNA אכן ממוקם על פני העלה, ולא מופק דרך הפיוניות במהלך הצנטריפוגה.

התאמה עיקרית אחת שאפשרה לנו לחלץ כמות שופעת של RNA על פני העלים הייתה הוספת חומר ההרטבה. החזרנו כמעט פי שניים יותר RNA עם הוספת חומר הרטבה (בריכוז נמוך מאוד של 0.001%) ל-VIB. הבדל זה בריכוז ה-RNA המתקבל עם ובלי Silwet L-77 מצביע על כך שהשימוש בחומר הרטבה משפר את פירוק ה-RNA על פני העלה. עם זאת, הגדלת ריכוז חומר ההרטבה מ-0.001% ל-0.01% לא שיפרה את בידוד ה-RNA של LSW (איור 4). יש לציין כי חזרה על בידוד ה-RNA של LSW מאותם עלים הניבה RNA נוסף (כ-63% מההתאוששות שהתקבלה מהשטיפה הראשונה), מה שמצביע על כך שעלים מפרישים RNA ללא הרף על פני השטח, כאשר כמעט שני שלישים ממנו מוחלפים תוך כ-30 דקות הנדרשות לעיבוד העלים. כדי להגדיל את תפוקת ה-RNA הכוללת של LSW כאשר החומר הצמחי מוגבל, ניתן לשטוף את אותם העלים מספר פעמים ברציפות. עם זאת, איננו ממליצים על יותר משלוש כביסות, מכיוון שהטיפול הכרוך בכך עלול להוביל לנזק מצטבר לחומר העלה, כפי שמוערך על ידי הצבע הירוק של נוזל הכביסה. עבור ניסויים אלה, ריכוז ה-RNA הוערך באמצעות ניתוח צפיפות מבוסס ג'ל RNA. עם זאת, ניתן להשתמש בשיטת כימות RNA מבוססת לוחית מיקרוטיטר שתוארה לעיל לכימות מדויק של RNA בעת הערכת מספר דגימות בבת אחת (איור 5).

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט כיצד לבודד שטיפת משטח עלים (LSW), ספוגית משטח עלים (LSS) ונוזל שטיפה אפופלסטי (AWF) משושנות Arabidopsis בריאות, ולאחר מכן מיצוי RNA. השלבים הקריטיים כוללים הכנה ועיקור של VIB לפני ביצוע הניסוי, גידול הצמחים בתנאים מבוקרים ושימוש ב-Silwet-L77 כדי להבטיח ציפוי נכון של פני העלה על ידי ה-VIB. הליכים אלה אמורים להניב כמויות שוות של RNA הן מ-LSW והן מ-AWF המנורמל על ידי משקל טרי של עלים. התאוששות של RNA מהשברים החוץ-תאיים הללו דורשת טיפול זהיר, במיוחד בכל הנוגע לכדורי RNA לאחר שלבי משקעים.

למרות שהפרוטוקול לעיל עבר אופטימיזציה עבור עלי Arabidopsis, השתמשנו בו בהצלחה גם על מיני צמחים אחרים עם שינויים קלים בלבד. ניתן לייעל את מיצוי ה-RNA משטח העלה על ידי יישום שתי התאמות עיקריות: ראשית, על ידי ביצוע סבבים מרובים של בידוד LSW, ושנית, על ידי הגדלת ריכוז חומר ההרטבה. מיני צמחים בעלי משטחי עלים הידרופוביים מאוד, כגון אורז12,13, עשויים לדרוש ריכוזים גבוהים יותר של חומר ההרטבה.

בנוסף, תיארנו שיטה לא פולשנית לאיסוף RNA על פני העלים באמצעות ספוגיות כותנה. בשיטת בידוד RNA זו של משטח העלה, אנו מבטיחים שצינור האיסוף מונח בדלי קרח. בהתחשב בכך שה-RNA על פני העלה מופרש ומצטבר בטמפרטורת החדר, אנו מניחים שהוא יישאר יציב גם בתהליך האיסוף. השווינו גם את דפוסי הרצועות של LSW ו-LSS RNA, והם לא מראים הבדל גדול מבחינת השפלה.

הפרוטוקול לעיל משתמש במגיב TRIzol כדי לטהר RNA מ-LSW, LSS או AWF. מגיב זה משתמש בפנול להסרת חלבונים. עם זאת, מצאנו כי טיהור מבוסס טריזול אינו מסיר פוליסכרידים כגון פקטין, הנמצאים בשפע ב-LSW ו-AWF6. מולקולות מטהרות כאלה עלולות לגרום לבעיות בכימות RNA באמצעות ספקטרופוטומטריה או פלואורומטריה. לכן אנו מסתמכים על ניתוח צפיפות מבוסס ג'ל RNA כדי להעריך את ריכוזי ה-exRNA. אנו בוחנים כעת שיטות טיהור מבוססות עמודות שאמורות לספק הפרדה טובה יותר של RNA מפוליסכרידים. עם זאת, שיטות אלה מגבילות לעתים קרובות את ההתאוששות של RNA קטנים מכיוון שממברנת הסיליקה מותאמת לקשירת מולקולות RNA גדולות מ~200 נוקלאוטידים. RNA קטנים עלולים לעבור דרך הממברנה במהלך הקשירה או ללכת לאיבוד בשלבי הכביסה. לכן, עד כה, אנו מסתמכים רק על שיטה מבוססת TRIzol לשחזור מקיף יותר של כל גדלי ה-RNA, כולל RNA קטן, אם כי היא דורשת טיפול זהיר והפרדת פאזות.

בנוסף, בעת ביצוע ניתוח ג'ל RNA, איננו רואים שברים קטנים מ-80 nt עבור סך דגימות ה-RNA התאיות בהשוואה ל-AWF ו-LSW RNAs, בעיקר בשל שפע נמוך ביחס לכמויות הגדולות של rRNA ו-tRNA. נוכחותן של להקות קטנות יותר ב-AWF וב-LSW נובעת מפירוק ה-rRNA וה-tRNA בשפע, המתרחש באופן טבעי לאחר הפרשת ה-RNA בתא החוץ-תאי של הצמחים, וזה אינו חפץ שהוצג במהלך האיסוף והטיפול בצמחים כפי שאושר על ידי ריצוף וניתוח כתמים צפוניים6.

שיטת בידוד שטיפת משטח העלים שלנו היא כלי רב-תכליתי עם פוטנציאל משמעותי למגוון רחב של יישומי מחקר. הוא אמור לאפשר בידוד של ביומולקולות מפני השטח של העלה, כגון RNA, חלבונים ומטבוליטים אחרים שעשויים להיות מרכזיים להבנת האינטראקציות בין צמחים לחיידקים. אם רצוי לזהות את החיידקים הקיימים ב-AWF ו-LSW, ניתן להשיג זאת על ידי ביטול סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.

צמחים מקיימים אינטראקציה עם מגוון רחב של מיקרובים, כולל חיידקים, פטריות ווירוסים, היוצרים קהילותמורכבות על פני השטח שלהם. לקהילות מיקרוביאליות אלה יכולות להיות השפעות עמוקות על צמיחת צמחים, עמידות למחלות ורכישת חומרים מזינים 2,3,4. על ידי בידוד וניתוח שטיפת פני השטח של העלים בשיטה זו, חוקרים יכולים לבודד exRNA, מטבוליטים מיקרוביאליים, לזהות קהילות מיקרוביאליות הקיימות על פני העלים ולחקור כיצד קהילות אלה מווסתות ברמה המולקולרית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי שני מענקים מהקרן הלאומית למדע של ארצות הברית,

IOS-2243531 ו-IOS-2141969 ל-R.W.I.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סמן סולם 14-30 nt ssRNAטאקארה3416
צינורות מיקרו-צנטריפוגה 1.5 מ"לVWR20170-038
מזרק ללא מחט 10 מ"לב.ד.303347
15 מ"ל צינורות בזVWR89039-668
15% ג'ל Mini-PROTEAN TBE-Urea, 10 בארות/12 בארות, 30 ומיקרו; ליטר/20 ומיקרו; Lביו-ראד4566053 / 4566055
תוספות מגש ל-36 תאיםTrue Leaf שוק
תמיסת 40% אקרילאמיד וביס-אקרילאמיד, 37.5:1ביו-ראד1610148
סירים עגולים בגודל 4 אינץ'True Leaf שוק
50 מ"ל צינורות בזVWR89039-656
מזרק ללא מחט 50 מ"לב.ד.309653
96 צלחת באר תחתית שחורהגרנייה655090
Acrodisc 0.22 μ מסנן מזרק Mפאל4192
Acrodisc 0.45 μ מסנן מזרק Mפאל4454
אמוניום פרסולפט (APS) סיגמא-אולדריץ'א3678
סידן כלורי סיגמא-אולדריץ'ג1016
כלורופורם (ללא RNase)מקרון פיין כימיקליםMK444110
כיפות פלסטיק שקופותהאמרט אינטרנשיונל11 3348ניתן להשתמש בכל כיפת פלסטיק לכיסוי הצמחים ולשמירה על לחות
מקל כותנה בדרגה רפואיתUlineס-21102
אתנול (ללא רנאז)מעבדות דקון בע"מברקוד 2716גאה
מכונת קפה פרנץ' פרס, 24 אונקיות נוזלפסגת השלגCS-111
מגש גידול ללא חורים 10X20True Leaf שוק
דלי קרח Schuett-Biotech, ספוג3-680 052
איזופרופנולתרמו סיינטיפיק149320050
רוטור JA-14 בזווית קבועהבקמן קולטר; דגם: JA-14339247
קימוויפסKCWW, קימברלי-קלארק34120
מצע ssRNA לטווח נמוךנבN0364S
הידרט MESסיגמא-אולדריץ'M8250
קורא מיקרו-פלטותביוטק  סינרגיה H1
מירקל-גרומירקל-גרו24-8-16זהו מזון צמחי לכל מטרה. בהתאם למקור האדמה המשמש לגידול הצמחים, ניתן להתאים את היישום.
בקבוק צנטיפוגה של Nalgene 250 מ"ל (ללא מכסה)נלג'ן3120
מגבות נייר
ParaFilm  סרט מעבדה Mפרפילםס-25929
פלסטיק (500 מ"ל)Ulineס-21658
גליקוגן נטול RNase (20 מ"ג/מ"ל)תרמו סיינטיפיק₪0561
RootShield Plus WP קוטל פטריות ביולוגיביווורקס68539-9
מספריים
סילווט L-77מעבדות פיטוטקS7777ניתן להשתמש בכל מותג Silwet L-77. עם זאת, סילווט מאבד מיעילותו לאורך זמן. אידיאלי להחליף אותו פעם בשנה.
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'S7653
מברשת צבע שיער ניילון רכהאותנו. אספקת אמנותמס' 6
בקבוק ריסוסUlineS-7272ניתן להשתמש בכל בקבוק ריסוס, אך הגדרות ההתזה צריכות להיות במקלחת.
תערובת גידול מקצועית של Sungroסונגרו
תערובת ריבוי Sungroסונגרו
כתם ג'ל חומצת גרעין זהב SYBR (תרכיז פי 10,000 ב-DMSO)תרמו סיינטיפיקS11494
תמדתרמו סיינטיפיק17919
מגיב טריזולInvitrogen15596026
מים נטולי דנאז/רנאז טהורים במיוחדInvitrogen10977015
אוריאהסיגמא-אולדריץ'U5378
תא ואקום, 0.20 מ"ק. רגלSP Scienceware - מוצרי בל-ארט - מכשיר H-Bפ42031-0000
משאבת ואקום, 3.5 CFMמוצרי ואקום אידיאלייםP101532
משקל שקילהאסקליWBB480535זו רק דוגמה. ניתן להשתמש בכל סולם שקילה.

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vorholt, J. A. Microbial life in the phyllosphere. Nat Rev Microbiol. 10 (12), 828-840 (2012).
  2. Ritpitakphong, U., Falquet, L., Vimoltust, A., Berger, A., M'etraux, J., L'Haridon, F. The microbiome of the leaf surface of Arabidopsis protects against a fungal pathogen. New Phytol. 210 (3), 1033-1043 (2016).
  3. Chaudhry, V., Runge, P., Sengupta, P., Doehlemann, G., Parker, J. E., Kemen, E. Shaping the leaf microbiota: plant-microbe-microbe interactions. J Exp Bot. 72 (1), 36-56 (2021).
  4. Vacher, C., Hampe, A., Port'e, A. J., Sauer, U., Compant, S., Morris, C. E. The phyllosphere: microbial jungle at the plant-climate interface. Ann Rev Ecol Evol Syst. 47, 1-24 (2016).
  5. Mahmoudi, M., Almario, J., Lutap, K., Nieselt, K., Kemen, E. Microbial communities living inside plant leaves or on the leaf surface are differently shaped by environmental cues. ISME Commun. 4 (1), ycae103(2024).
  6. Borniego, M. L., et al. Diverse plant RNAs coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).
  7. Ren, B., Wang, X., Duan, J., Ma, J. Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation. Science. 365 (6456), 919-922 (2019).
  8. Chery, M., Drouard, L. Plant tRNA functions beyond their major role in translation. J Exp Bot. 74 (7), 2352-2363 (2022).
  9. Panstruga, R., Spanu, P. Transfer RNA and ribosomal RNA fragments-Emerging players in plant-microbe interactions. New Phytol. 241 (2), 567-577 (2024).
  10. Baldrich, P., Rutter, B. D., Karimi, H. Z., Podicheti, R., Meyers, B. C., Innes, R. W. Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide "Tiny" RNAs. Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).
  11. Rutter, B. D., Rutter, K. L., Innes, R. W. Isolation and quantification of plant extracellular vesicles. Bio Protoc. 7 (17), e2533(2017).
  12. Zhang, Z., et al. OsHSD1, a hydroxysteroid dehydrogenase, is involved in cuticle formation and lipid homeostasis in rice. Plant Sci. 249, 35-45 (2016).
  13. Zhou, L., Ni, E., Yang, J., Zhou, H., Liang, H., Li, J., Jiang, D., Wang, Z., Liu, Z., Zhuang, C. Rice OsGL1-6 is involved in leaf cuticular wax accumulation and drought resistance. PLoS One. 8 (5), e65139(2013).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Leaf Surface RNAExtracellular RNARNA IsolationLeaf Surface WashApoplastic Wash FluidRNA Gel ElectrophoresisImageJ AnalysisPlant Microbe Interactions

מאמרים קשורים