מאמר שיטה

אקס ויוו ניתוח מולקולה אחת של מכלול קולטן ריאנודין 2 ברקמת לב ועצבים

385 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68408

⸱

15 ביולי 2025

 , 
1Department of Chemistry, University of Kentucky

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג שיטת הדמיה מבוססת שלפוחית, מולקולה בודדת המשמרת את ארגון הקולטנים המקורי, ומאפשרת כימות סטוכיומטריה מדויק ויישומים רחבים בהרכבת קולטנים, תפקוד וחקר מחלות.

תקציר

הבנת הרכבת הקולטנים היא קריטית להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס תפקודם וויסות בתהליכים פיזיולוגיים. בעוד שמחקרים מסורתיים של מולקולה בודדת במבחנה מסתמכים על בידוד חלבונים ממערכות ביטוי הטרולוגיות, לעתים קרובות הם לא מצליחים ללכוד את המורכבות הפיזיולוגית in vivo הכרוכה בארגון והרכבה של חלבוני פני התא. פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM) כדי לחקור מולקולות קולטן ריאנודין 2 (RyR2) המתויגות על ידי GFP עטופות בתוך שלפוחיות בקנה מידה ננומטרי. שלפוחיות אלה, הנוצרות מאיברים המופקים במהירות מהחיה, מספקות למעשה תמונת מצב של מצב ההרכבה של הקולטן בזמן החילוץ, ומאפשרות ניתוח מפורט של סטוכיומטריה תת-יחידה וארגון הקולטן בתגובה לשינויים בסביבה הפיזיולוגית של החיה. גישה זו משתמשת ב-TIRFM ובניתוח פוטו-הלבנה צעד כדי לספק קריאה של סטוכיומטריה של קולטנים. קולטני הדמיה ברמת המולקולה הבודדת מקלים על איתור הטרוגניות בתוך אוכלוסיות הקולטנים המורכבות בבעל חיים ומאפשרים מעקב אחר שינויי הרכבה הקשורים למצבי מחלה. כתוצאה מכך, שיטה זו מציעה כלי רב עוצמה לקביעת התפלגות מכלולי הקולטנים והמתאם שלהם לשינויים בסביבתם הפיזיולוגית.

מבוא

קולטני הממברנה ממלאים תפקידים מכריעים בתהליכים פיזיולוגיים בכל גוף האדם1. תפקיד עיקרי הוא לתווך תקשורת בין תאים באמצעות העברת גירויים חוץ-תאיים כדי ליזום אירועי איתות תוך תאיים. בגלל תפקידם הבסיסי באיתות, כמעט 70% מהטיפולים הקיימים מכוונים לקולטני ממברנה2. לעתים קרובות מדובר במבנים אוליגומריים המורכבים מתת-יחידות מרובות המורכבות לצורות הטרומריות עם סטויכיומטריות מרובות 3,4. הבנת האופן שבו קולטנים מתארגנים לקומפלקסים פונקציונליים היא קריטית להבהרת תפקידיהם בבריאות ומחלות 5,6. שיטות ביוכימיות מסורתיות, כגון משקעים חיסוניים וכתמים מערביים, מספקות מדידות אנסמבל ממוצעות, המטשטשות הטרוגניות בתת-אוכלוסיות קולטנים7. לעומת זאת, טכניקות של מולקולה בודדת מאפשרות תצפית ישירה על קולטנים בודדים, מה שמאפשר כימות של הטרוגניות בתוך אוכלוסיות קולטנים 8,9,10. טכניקות של מולקולה בודדת הפכו לסטנדרט לכימות הרכבת קולטני ממברנה, סטוכיומטריה ואוליגומריזציה11,12. גישה זו יושמה באופן נרחב על קולטני ממברנה רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית באמצעות חלבון מבודד או תנאי תרבית תאים. מחקרי מולקולה בודדת מסתמכים בעיקר על מערכות ביטוי במבחנה, שבהן ניתן לבודד חלבונים מסביבה תאית. עם זאת, המורכבות בתוך מערכת חיה אינה באה לידי ביטוי במלואה בסוגים אלה של מערכות ביטוי הטרולוגיות.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו גישה המבודדת ומדמה קולטני ממברנה במצב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית על ידי לכידתם בתוך ננו-שלפוחיות שמקורן ישירות מרקמות לב ועצביות. שיטה זו משמרת ביעילות את מצב הרכבת הקולטן בזמן היווצרות השלפוחית, ומאפשרת הדמיה ישירה של סטוכיומטריה של תת-יחידת הקולטן, המהווה אינדיקטור מרכזי לתגובת הקולטן בסביבות פיזיולוגיות שונות. גישה זו מאפשרת לנו לבחון את ההרכבה הסטויכיומטרית של קולטני ממברנה המתרחשים בסביבה הביולוגית המורכבת בתוך בעלי חיים ללא צורך בביטוי הטרולוגי או בנייה מחדש. על ידי שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM), אנו משיגים הדמיה ברזולוציה של מולקולה אחת של קולטנים עטופים בשלפוחית ומחלצים עקבות פוטו-הלבנה כדי לקבוע את הרכב תת-היחידה.

TIRFM מתאים היטב להדמיית חלבון ממברנה של מולקולה אחת מכיוון שהוא מעורר באופן סלקטיבי פלואורופורים בטווח של ~150 ננומטר משטח הזכוכית, ומפחית את הקרינה ברקע ממולקולות בתמיסה 3,10. כליאה זו משפרת משמעותית את יחס האות לרעש, ומאפשרת זיהוי מדויק של קומפלקסים בודדים של קולטני ממברנה. על ידי ניתוח פוטוהלבנה צעדית של קולטנים מתויגים פלואורסצנטיים, אנו יכולים לקבוע ישירות סטוכיומטריה של תת-יחידה ולהעריך הטרוגניות פוטנציאלית בתוך אוכלוסיות קולטנים12. זה רלוונטי במיוחד עבור קולטן ריאנודין 2 (RyR2), ערוץ שחרור Ca²⁺ תוך-תאי גדול הממלא תפקיד מכריע בצימוד עירור-התכווצות בלב, שם הוא מתכנס רק כהומו-טטרמר, ובתפקוד הסינפטי במוח, שם ההרכבה שלו לא הוקמה 1,13,14. בהתחשב בנוכחותם של איזופורמים מרובים של RyR ברקמות עצביות, עדיין לא ברור אם RyR2 יוצר קומפלקסים טטרמריים הומומריים בלבד במוח, המורכבים מארבע תת-יחידות זהות כמו בלב, או שמא מכלולים הטרומריים עם RyR1 או RyR3 מתרחשים in vivo 15,16,17,18.

על ידי בידוד שלפוחיות מאזורים ספציפיים בלב ובמוח, שיטה זו מאפשרת לחקור הבדלים פוטנציאליים ספציפיים לרקמות בארגון RyR2. אנו מנצלים את התכונות של RyR2 ברקמת הלב שבה הוא יכול ליצור רק הומוטרמרים כדי לספק בסיס חזק סטטיסטית לסטוכיומטריה של תת-יחידה חד-מולקולה ex vivo, ומכלול הטטרמר הידוע משמש כבקרה לחקירת מכלולים לא ידועים באיברים אחרים. היכולת לדמות קולטנים במצבם הטבעי תוך שמירה על האינטראקציות הפיזיולוגיות שלהם מספקת מסגרת איתנה לחקר הרכבת קולטנים באיברים שונים ובתנאים פיזיולוגיים שונים. פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה לבידוד שלפוחית, קיבוע והדמיה של מולקולה בודדת של RyR2 מתויג GFP, המאפשר אפיון מדויק של סטוכיומטריה של קולטנים. טכניקה זו לא רק מקדמת את הבנתנו את ארגון RyR2 ברקמות לב ועצביות, אלא גם מציעה יישומים רחבים יותר לחקר הרכבה וויסות של קולטנים בהקשרים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים 19,20,21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מדגם

  1. זלוף טרנסקרדיאלי ושאיבת איברים
    1. הרדמו את העכבר באמצעות CO₂ עד להפסקת הנשימה.
    2. מקם את העכבר במצב שכיבה ואבטח את הגפיים.
    3. בצע חתך בקו האמצע לאורך הבטן והמשך לרוחב לכיוון כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל בית החזה.
    4. הכנס בזהירות מחט לחדר השמאלי וחצה את האטריום הימני כדי לאפשר ניקוז פרפוזה.
    5. להכנת שלפוחית, יש לחלחל עם PBS קר 1x עד שמערכת הדם מתנקה מדם.
    6. לצורך הקפאה, לאחר זלוף PBS, המשך לחלחל עם 4% פרפורמלדהיד (PFA) כדי לתקן רקמות.
    7. מחלצים בזהירות את הלב ומניחים אותו מיד על קרח.
    8. בעזרת מספריים עדינים, חותכים בזהירות לאורך קו האמצע של הקרקפת ומקלפים את העור לאחור כדי לחשוף את הגולגולת.
    9. בצע חתך בבסיס הגולגולת ליד הפורמן מגנום.
    10. בעזרת מלקחיים עדינים, פתחו בזהירות את הגולגולת לאורך הסדק האורכי, והסירו שברי עצם כדי לחשוף את המוח.
    11. הרם בעדינות את המוח באמצעות מלקחיים מעוקלים, חתך את עצבי הגולגולת כדי לחלץ אותו במלואו.
    12. אם משתמשים בו להקפאה, יש לקבע את המוח ב-4% PFA ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    13. אם משתמשים בו להכנת שלפוחית, הניחו מיד את המוח על קרח ללא קיבוע להמשך עיבוד.
  2. הקפאה
    1. הסר את המוח או הלב מ-4% PFA וייבש את הכתמים.
    2. הטמע את האיבר כולו בתרכובת OCT בתוך קריו-תבנית.
    3. הקפיאו את הרקמה המוטמעת על ידי הנחת התבנית במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד להתמצקות מלאה.
    4. לפני החיתוך, יש לאזן את תא הקריוסטט וראש הדגימה ל-20 מעלות צלזיוס.
    5. העבירו את בלוק ה-OCT הקפוא מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס לתא הקריוסטט והניחו לו להתייצב למשך 10 דקות.
    6. נקו את צ'אק הדגימה עם 70% אתנול, יבשו אותו ומרחו שכבה דקה של OCT כדבק.
    7. אבטח את בלוק ה-OCT הקפוא על הצ'אק, והבטיח את הכיוון הנכון.
    8. הכנס את הצ'אק למחזיק דגימת הקריוסטט והתאם את מיקום הלהב.
    9. חתוך עודפי OCT עד שמשטח הרקמה נחשף.
    10. חתכו את הרקמה בעובי של 10 מיקרומטר, אספו חלקים על שקופיות זכוכית.
    11. לאחר ייבוש האוויר של החלקים בטמפרטורת החדר למשך שעה, יש למרוח אמצעי הרכבה על החלקים ולהניח כיסוי כדי לאטום את הדגימה.
    12. אפשר למדיית ההרכבה להתייצב לפני אחסון השקופיות ב-4 מעלות צלזיוס להדמיה.
  3. הכנת שלפוחית
    1. הכנת שלפוחית לב
      1. חלצו את הלב לאחר זלוף דרך הלב עם 1x PBS והניחו אותו על קרח.
      2. בעזרת אזמל סטרילי מנתחים כ -30 מ"ג שריר החדר מתחתית הלב.
      3. העבירו את הרקמה לצינור צנטריפוגה המכיל 4-5 מ"ל של 10 מ"מ NaHCO₃ עם 5 מ"מ NaN₃ לשמירה על שלמות השלפוחית.
      4. הומוגניזציה של הרקמה באמצעות הומוגנייזר עד לליזה מלאה.
      5. צנטריפוגה את ההומוגנאט בטמפרטורה של 10,000 × גרם למשך 20 דקות כדי להסיר פסולת גדולה ולאסוף את הסופרנטנט.
      6. בצע אולטרה-צנטריפוגה ב-37,000 × גרם למשך 65 דקות, ולאחר מכן השליך את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-3-4 מ"ל של 20 מ"ל Tris-maleate buffer (pH 6.8) עם 0.6 M KCl.
      7. חזור על אולטרה-צנטריפוגה ב-37,000 × גרם למשך 65 דקות נוספות כדי להסיר אקטומיוזין מסיס.
      8. השהה מחדש את הגלולה הסופית ב-0.5 מ"ל של 20 מ"מ Tris-maleate buffer (pH 6.8) עם 50 מ"מ KCl כדי להשיג את תמיסת שלפוחית הלב ולאחסן אותה ב-80 מעלות צלזיוס.
    2. הכנת שלפוחית מוח
      1. חלץ את המוח לאחר זלוף דרך הלב עם 1x PBS והנח אותו על קרח.
      2. חתכו את המוח למקטעים של 1 מ"מ באמצעות מטריצה קורונלית של מוח עכבר בגודל 1 מ"מ.
      3. זהה את החלקים השלישי והרביעי מנורת הריח ונתח בזהירות: 1) שכבת קליפת המוח החיצונית ביותר משתי ההמיספרות; 2) ההיפוקמפוס, הממוקם באזור המרכזי של החתך.
      4. מהקצה האחורי, בודד את המוח הקטן על ידי ביצוע חתך רוחבי בבסיסו.
      5. אסוף את אותם אזורי מוח מחמישה עכברים כדי להבטיח תפוקת שלפוחית נאותה.
      6. הומוגניזציה של הרקמה באופן מיידי באמצעות הומוגנייזר Dounce ב-2 מ"ל של מאגר הומוגניזציה קרה (0.32 M סוכרוז, 10 מ"מ HEPES, 2 מ"מ EDTA, מעכב פרוטאז, pH 7.4).
      7. הוסף 3 מ"ל של מאגר הומוגניזציה וצנטריפוגה נוספים ב-200 × גרם למשך 15 דקות כדי להסיר שברי רקמות גדולות.
      8. אסוף את הסופרנטנט והצנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את השבר הגרעיני.
      9. צנטריפוגה נוספת של הסופרנטנט ב-10,000 × גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את המיטוכונדריה.
      10. אולטרה-צנטריפוגה הסופרנטנט המתקבל ב-100,000 × גרם למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את השלפוחית.
      11. השעו מחדש את כדור השלפוחית הסופי ב-1x PBS כדי להשיג את תמיסת השלפוחית במוח ולאחסן אותה ב-80 מעלות צלזיוס.
  4. אפיון ננו-שלפוחית באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)
    1. הרכיבו את תא הזיהוי בהתאם להוראות היצרן.
    2. הפעל את המכשיר והפעל את התוכנה התואמת.
    3. טען מזרק של 1 מ"ל במים נטולי יונים (DI) ושטוף ידנית את צינורות המערכת עד שהרקע נקי ממזהמים.
    4. הכן את דגימת הננו-שלפוחית על ידי דילול ב-1x PBS.
    5. טען ~1 מ"ל של דגימת הננו-שלפוחית המדוללת למזרק נקי של 1 מ"ל, מה שמבטיח שאין בועות אוויר.
    6. הזריק ידנית את הדגימה לתא הזיהוי והתאם את המיקוד עד שהשלפוחיות נראות בבירור.
    7. אבטח את המזרק על משאבת המזרק, והגדר את קצב הזרימה ל-200 מיקרוליטר לשנייה בלוח החומרה.
    8. בלוח ה-SOP , הגדר את משך המדידה ל-60 שניות, את מספר המחזורים ל-5, ואשר שבקרת הטמפרטורה מופעלת ומוגדרת ל-25 מעלות צלזיוס. שמור את ההגדרות כ-SOP חדש על ידי לחיצה על שמור SOP ומתן שם לקובץ כראוי (למשל, "nanovesicle_standard.sop").
    9. בחלונית Capture, הגדר את הגדרות המכשיר על ידי בחירת רמת מצלמה של 13 וסף זיהוי ראשוני של 3.
    10. לחץ על הפעל ובחר את ה-SOP הקודם שנשמר. התוכנה תבצע את המדידה באופן אוטומטי בהתאם להגדרות.
    11. לאחר השלמתו, לחץ על נתח כדי לעבד כל סרטון. התאם את סף הזיהוי כדי להבטיח שכל החלקיקים נראים בבירור, ולחץ על סיום לאחר השלמת ניתוח האצווה. ייצא את התוצאה על-ידי לחיצה על ייצוא נתונים | All Measurements, ושמור כקובץ CSV לשימוש במועד מאוחר יותר.
    12. לאחר השלמת הניסוי, יש לשטוף את המערכת ב~ 2 מ"ל מי DI עד שלא יישארו שלפוחיות.
    13. הזרקו אוויר דרך הצינור כדי להסיר את כל הנוזלים שנותרו, וודא שהמערכת יבשה לשימוש הבא.

2. הדמיה

  1. הדמיה קונפוקלית של הקפאת רקמות
    1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי של סריקת הלייזר ופתח את התוכנה המקושרת.
    2. בחר את המטרה המתאימה (20x אוויר או 60x שמן) וטען את שקופית הקריוחתך המוכנה על המיקרוסקופ stage.
    3. הגדר את הגדרות הלייזר עבור עירור GFP באמצעות קו לייזר של 488 ננומטר עם מסנן פליטה של 535/70 ננומטר.
    4. אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה, כולל גודל חור סיכה (28.9 מיקרומטר), עוצמת לייזר (17%) והגבר גלאי (15.3), כדי לשפר את יחס האות לרעש תוך מזעור פוטו-הלבנה.
    5. במידת הצורך, רכשו מחסנית Z על ידי הגדרת מישורי המוקד העליונים והתחתונים והגדרת גודל הצעד המתאים (0.275 מיקרומטר).
    6. אפשר תפירת תמונות אוטומטית עם חפיפה של 15% תמונה בעת רכישת תמונות בשטח גדול.
    7. התאימו את רזולוציית התמונה והחילו ממוצע מסגרות במידת הצורך כדי להפחית את רעשי הרקע.
    8. צלם תמונות ושמור אותן בפורמט '.nd2' להמשך ניתוח.
  2. הדמיית פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת (TIRF)
    1. קיבוע שלפוחית באמצעות עוגן ביו-תואם לממברנה (BAM) שיטה22
      1. נקו כלים עם תחתית זכוכית בגודל 35 מ"מ על ידי סוניקציה שלהם ב-5 M NaOH למשך שעה אחת ב-45 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שלוש שטיפות מים DI יסודיות.
      2. סוניקציה של הכלים ב-0.1 מ' HCl למשך שעה נוספת ב-45 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שלוש שטיפות מים DI נוספות.
      3. טפל במשטח הזכוכית הנקי עם 2% 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) באתנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להציג קבוצות פונקציונליות של אמין.
      4. שטפו את הכלי פי 3 במי DI ואתנול כדי להסיר עודפי APTES ולאפשר לו להתייבש.
      5. דגרו את המנה עם 100 מיקרומטר Oleyl-O(CH₂CH₂)nCO-CH₂CH₂-COO-NHS (Sunbright OE-020CS) ב-1x PBS למשך 10 דקות.
      6. שטפו את הכלי עם PBS כדי להסיר מגיב שלא הגיב.
      7. הכניסו את השלפוחיות בריכוז הרצוי ודגרו למשך 15 דקות כדי לאפשר קשירת שלפוחית.
      8. שטפו את הכלי בעדינות עם PBS כדי להסיר שלפוחיות לא קשורות תוך הקפדה על השלפוחיות המשותקות להישאר מחוברות.
    2. הגדרה ורכישה של הדמיית TIRF
      1. הפעל את המיקרוסקופ הקרינה ההפוך, מקור לייזר 488 ננומטר ומצלמת EMCCD.
      2. הפעל את התוכנות Metamorph ו-CellSens כדי לאתחל את בקרת ההדמיה.
      3. נקה את יעד טבילת השמן פי 60 (1.49 NA APO) עם מתנול כדי להסיר אבק ושאריות שמן.
      4. מרחו טיפה קטנה של שמן טבילה תואם מקדם שבירה (RI) על עדשת האובייקט.
      5. הנח את צלחת השלפוחית המוכנה על שלב המיקרוסקופ, וודא שהיא מרוכזת ליישור אופטימלי.
      6. כוונן את מיקוד קרן הלייזר על ידי ריכוז קרן העירור באמצע הצמצם האחורי של המטרה במצב אפיפלואורסצנטי.
      7. השתמש במנוע הצעד כדי לכוונן את זווית תקרית הלייזר עד להגעה לזווית הקריטית, מה שמבטיח השתקפות פנימית מוחלטת על משטח הזכוכית.
      8. זהה את מישור המוקד על ידי סריקה דרך ציר ה-Z, תוך הבחנה: 1) מישור המיקוד הראשון, המתאים למשטח תחתית הזכוכית; 2) מישור המיקוד השני, המתאים למשטח המשותק בשלפוחית.
      9. ברגע שהשלפוחיות ממוקדות, הפעל פוקוס אוטומטי ב-CellSens כדי לנעול את מיקום המטרה במישור זה, ולמנוע סחיפה במהלך ההדמיה.
      10. כבה זמנית את הלייזר והעבר את שלב המיקרוסקופ לשדה ראייה רענן שטרם נחשף לאור עירור.
      11. התחל להקליט תוך הפעלת הלייזר בו-זמנית, כדי להבטיח לכידת תהליך ההלבנה המלא ללא חשיפה מוקדמת.
      12. רכוש תמונות עם הפרמטרים הבאים: זמן חשיפה: 100 אלפיות השנייה למסגרת, מצב רכישה: 900 פריימים רציפים לכל שדה ראייה, הגדרת רווח: 1,400.
      13. חזור על התהליך עבור שדות תצוגה מרובים כדי להבטיח איסוף נתונים מספיק.
      14. שמור אוספי תמונות בתבנית TIFF להמשך עיבוד.

3. עיבוד תמונה וניתוח נתונים

  1. עיבוד תמונה קונפוקלי
    1. פתח את התמונות הקונפוקליות שנרכשו בתוכנה המקושרת.
    2. התאימו את הגדרות טבלת החיפוש (LUT) כדי למטב את הבהירות והניגודיות.
    3. החילו את אותן התאמות LUT באופן אחיד על כל התמונות כדי לשמור על עקביות חזותית.
  2. עיבוד וידאו TIRF וניתוח עוצמת הקרינה
    1. עיבוד וידאו להדמיה
      1. פתח את ערימות התמונות TIRF שנרכשו (פורמט TIFF) ב-ImageJ לצורך הדמיה.
      2. כוונן את הבהירות והניגודיות כדי לשפר את בהירות האות, ולהבטיח שניתן יהיה להבחין בקלות בין שלפוחיות פלואורסצנטיות מהרקע.
      3. ייצוא תמונות מותאמות להצגה או לניתוח איכותני נוסף.
    2. ניתוח שלב פוטוהלבנה
      1. חילוץ עקבות זמן
        1. פתח את קובץ ה- Script של MATLAB (ראה קובץ משלים 1) בשם "getTimeTraces.m" והפעל אותו. בממשק המשתמש הגרפי (GUI), לחץ על Load Movie ובחר את קובץ .tiff ההדמיה TIRF כדי לייבא את ערימת סרטי השלפוחית.
        2. לחץ/י על ״חפש פסגות״ כדי לזהות באופן אוטומטי אותות פלואורסצנטיים של מולקולה בודדת. אזורי האות יסומנו בעיגולים בחלון התצוגה המקדימה.
        3. לחץ על אכלס נתונים. פעולה זו תייצא את המעקב אחר עוצמת הזמן עבור כל נקודה לקובץ .xlsx לניתוח במורד הזרם.
      2. ספירת צעדים ידנית
        1. הפעל את הסקריפט "simpleGraph.m" (ראה קובץ משלים 1) כדי להפעיל את ממשק המשתמש הגרפי, לחץ על טען קבצי נתונים ובחר את .xlsx file שנוצר בשלב 3.2.2.1.3.
        2. בדוק את שלבי ההלבנה של כל עקבות זמן המוצגים בחלונית השמאלית. ודא שרק עקבות העומדות בקריטריונים הבאים מתקבלות לניתוח: 1) עקבות הזמן מכילות לפחות שלב הלבנה מובהק אחד. 2) משך צעד אחד הוא לפחות 1 שניות. 3) הפרש העוצמה בין רמות הצעד הוא לפחות פי 3 מסטיית התקן של עוצמת ההלבנה שלאחר ההלבנה.
        3. בצד ימין, אתר את השדה שלב # והשתמש בלחצני + או - כדי להזין את מספר שלבי ההלבנה עבור כל עקבה.
        4. לאחר השלמת כל ערך, לחץ על הבא כדי לעבור למעקב הבא. לאחר עיבוד כל המעקבים, התוכנה תיצור ותשמור אוטומטית קובץ .txt המתעד את ספירת הצעדים של כל מעקב.
      3. סיכום ספירת צעדים
        1. הפעל את קובץ ה- Script "CombinedFiles.m" (ראה קובץ משלים 1) כדי לפתוח את ממשק המשתמש הגרפי.
        2. הקלד את השם הרצוי עבור פלט הסיכום בתיבת הטקסט.
        3. לחץ על שלב תוצאות simpleGraph מרובות לקובץ אחד. בדפדפן הקבצים, בחר קובץ .txt רצוי אחד או יותר שנוצרו משלב 3.2.2.2.3. הסקריפט יאסוף אוטומטית את כל נתוני ספירת השלבים וייצור קובץ .xlsx משולב המסכם את התדירות של שלב אחד ושני שלבים,... עקבות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לאשר את הישימות של שיטה זו, אימתנו תחילה את הביטוי והלוקליזציה של GFP-RyR2 על ידי הדמיה קונפוקלית של הקפאת רקמות לב ורקמות עצביות (איור 1). אות הקרינה ברקמת הלב הציג דפוס מפוספס רוחבי התואם את הלוקליזציה הצפויה של RyR2 בקרדיומיוציטים, אך הפגין עוצמה גבוהה באזורים מסוימים במוח, כלומר קליפת המוח, ההיפוקמפוס והמוח הקטן, מה שמעיד על ביטוי ספציפי לאזור.

בעקבות יצירת שלפוחית מרקמות אלה באמצעות פרוטוקו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקר זה קובע פרוטוקול מפורט וניתן לשחזור עבור אנקפסולציה ex vivo והדמיה של מולקולה בודדת של קולטני ממברנה באמצעות RyR2 מתויג GFP כמערכת מודל. הפרוטוקול מקדם משמעותית את השיטות הנוכחיות על ידי מתן אפשרות לניתוח סטויכיומטרי של קומפלקסים של קולטנים ישירות מרקמה טבעית, תוך שמירה על ההקשר הפיזיולוגי של חלבוני הממברנה. בהשוואה למערכות ביטוי מסורתיות במבחנה, גישה זו ממזערת חפצים המוצגים על ידי ביטוי יתר או מסיסות חומרי ניקוי, ומאפשרת תובנות רלוונטיות יותר מבחינה ביולוגית לגבי הרכבת קול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

ברצוננו להודות לליבת המיקרוסקופיה של UKY Light ולמרכז הביו-אלקטרוניקה והננו-רפואה על השימוש במתקנים שלהם. תמיכה בעבודה זו ניתנה על ידי ה-NIH (GM138837 ו-GM138882). איור 2 (https://BioRender.com/s69w811) ואיור 3 (https://BioRender.com/y54b47) נוצרו ב-BioRender.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת 35 מ"מ | מס' 1.5 כיסוי | 14 מ"מ קוטר זכוכיתמטקP35G-1.5-14-C
אנדווין סיינטיפיק  Tissue-Tek Cryomold תבניות/מתאמיםFisher ScientificNC9542860
APTESMillipore Sigma440140-100ML(3-Aminopropyl) triethoxysilane
Bio-Gen PRO200 Laboratory HomogenizerPro Scientific1204B59
cellSENSOlympus Scientific Solutionsn/a
מצלמת EMCCDAndorn/aiXon Ultra 897
אתנול מוחלט ≥ 100% (v/v) USP לביולוגיה מולקולרית (200 הוכחה)VWR71006-012
Leica CM1860Leican/acryostat
MetaMorph AdvancedMolecular Devices/a
Nanosight NS300 (עם תוכנת Nanosight NTA)Malvern Panalyticaln/a
Nikon AXR מיקרוסקופ קונפוקלי הפוךNikonn/a
אולימפוס IX83 מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ממונע פוקוסאולימפוסn/aTIRFM
פרפורמלדהיד 4% ב-PBS מוכן לשימוש מגיב קיבועVWR76221-378
פוספט חוצץ מלח (PBS) 20x, דרגה טהורה במיוחדVWR97062-950
נתרן הידרוקסיד, חרוזים, ריאגנט כיתהVWR97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +NOF אמריקה קורפוריישןn/aOleyl-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakuraM71484
VectaMount AQ מעבדות וקטור בינוני להרכבה מימיתH-5501-60
n אוטומטי

מקורות

  1. Taur, Y., Frishman, W. H. The cardiac ryanodine receptor (RyR2) and its role in heart disease. Card Rev. 13 (3), 142-146 (2005).
  2. Lundstrom, K. Structural genomics and drug discovery. J Cell Mol Med. 11 (2), 224-238 (2007).
  3. Levitz, J., et al. Mechanism of assembly and cooperativity of homomeric and heteromeric metabotropic glutamate receptors. Neuron. 92 (1), 143-159 (2016).
  4. Fox-Loe, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. Organelle-specific single-molecule imaging of α4β2 nicotinic receptors reveals the effect of nicotine on receptor assembly and cell-surface trafficking. J Bio Chem. 292 (51), 21159-21169 (2017).
  5. Degani-Katzav, N., Gortler, R., Gorodetzki, L., Paas, Y. Subunit stoichiometry and arrangement in a heteromeric glutamate-gated chloride channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E644-E653 (2016).
  6. Aryal, S. P., Fu, X., Masud, A. A., Neupane, K. R., Richards, C. I. Single-molecule studies of membrane receptors from brain region specific nanovesicles. Bio-protocol. 11 (10), e4018(2021).
  7. Schneeweis, L. A., et al. Comparison of ensemble and single molecule methods for particle characterization and binding analysis of a pegylated single-domain antibody. J Pharm Sci. 104 (12), 4015-4024 (2015).
  8. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. J Gen Phys. 141 (6), 737-746 (2013).
  9. Lee, J., Lee, T. H. Single-molecule investigations on histone h2a-h2b dynamics in the nucleosome. Biochem. 56 (7), 977-985 (2017).
  10. Aggarwal, V., Ha, T. Single-molecule pull-down (SiMPull) for new-age biochemistry: methodology and biochemical applications of single-molecule pull-down (SiMPull) for probing biomolecular interactions in crude cell extracts. Bioessays. 36 (11), 1109-1119 (2014).
  11. Sungkaworn, T., et al. Single-molecule imaging reveals receptor-g protein interactions at cell surface hot spots. Nature. 550 (7677), 543-547 (2017).
  12. Fu, X., et al. Brain region specific single-molecule fluorescence imaging. Anal Chem. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  13. Anderson, K., et al. Structural and functional characterization of the purified cardiac ryanodine receptor-Ca2+ release channel complex. J Bio Chem. 264 (2), 1329-1335 (1989).
  14. Waddell, H. M. M., Mereacre, V., Alvarado, F. J., Munro, M. L. Clustering properties of the cardiac ryanodine receptor in health and heart failure. J Mol Cell Card. 185, 38-49 (2023).
  15. Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor ryr2. Science. 354 (6310), aah5324(2016).
  16. Xiao, B., et al. Isoform-dependent formation of heteromeric Ca2+ release channels (ryanodine receptors). J Bio Chem. 277 (44), 41778-41785 (2002).
  17. Xu, L., Wang, Y., Yamaguchi, N., Pasek, D. A., Meissner, G. Single channel properties of heterotetrameric mutant ryr1 ion channels linked to core myopathies. J Biol Chem. 283 (10), 6321-6329 (2008).
  18. Chagovetz, A. A., Klatt Shaw, D., Ritchie, E., Hoshijima, K., Grunwald, D. J. Interactions among ryanodine receptor isotypes contribute to muscle fiber type development and function. Dis Model Mech. 13 (2), dmm038844(2019).
  19. Yao, J., et al. Limiting RyR2 open time prevents Alzheimer's disease-related neuronal hyperactivity and memory loss but not β-amyloid accumulation. Cell Rep. 32 (12), 108169(2020).
  20. Hiess, F., et al. Subcellular localization of hippocampal ryanodine receptor 2 and its role in neuronal excitability and memory. Comm Biol. 5 (1), 183(2022).
  21. Clowsley, A. H., et al. Analysis of RyR2 distribution in HEK293 cells and mouse cardiac myocytes using 3D MINIFLUX microscopy. bioRxiv. , (2023).
  22. Kato, K., et al. Immobilized culture of nonadherent cells on an oleyl poly(ethylene glycol) ether-modified surface. Biotech. 35 (5), 1014-1021 (2003).
  23. Yin, Q., Aryal, S. P., Song, Y., Fu, X., Richards, C. I. Quantitative single-molecule analysis of ryanodine receptor 2 subunit assembly in cardiac and neuronal tissues. Anal Chem. 96 (41), 16298-16306 (2024).
  24. Moonschi, F. H., et al. Cell-derived vesicles for single-molecule imaging of membrane proteins. Angew Chem Int Ed. 54 (2), 481-484 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GFP
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים