הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה

897 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68411

⸱

22 באוגוסט 2025

 , 
1Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM), 2Programmes de biologie moléculaire, Université de Montréal, 3Département de Médecine, Université de Montréal

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול למדידת מגעים בין תאים בשכבות אפיתל סמוכות בדיסקים דמיוניים חיים של כנפי דרוזופילה באמצעות גישה מבוססת בנייה מחדש של GFP.

תקציר

צמיחה ודפוס של רקמות עובריות נשלטים במידה רבה על ידי אותות המוחלפים באופן מקומי בין אוכלוסיות תאים בתוך הרקמות עצמן. ציטונמים הם סוג של פילופודיה איתות שזוהה לראשונה בדרוזופילה המחברים ומתווכים חילופי תאים מייצרי אותות ומקבלים אותות. בדיסק הדמיוני המתפתח של כנף דרוזופילה, ציטונמים מעורבים בחילופי אותות בין אוכלוסיות נפרדות של תאים בתוך אפיתל הדיסק הנכון (DP), אשר יהווה את הכנף הבוגרת, כמו גם בין תאי DP לתאים ברקמות הקשורות לדיסק סמוך. ציטונמים מסנפסים עם תאי מטרה ליצירת מגעים אינטימיים של הממברנה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות מגע בתיווך ציטונם בין תאי DP לתאים של אפיתל הממברנה הפריפודיאלית (PerM) הסמוך, המופרד מתאי ה-DP על ידי לומן הדיסק, באמצעות גישת בנייה מחדש של GFP בדיסקי כנף חיים. באמצעות מערכות GAL4-UAS ו-LexA-LexAop, מקטעים משלימים של GFP מפוצל (spGFP1-10, spGFP11), שכל אחד מהם התמזג לתחום הטרנסממברני של CD4, מתבטאים משני צידי לומן הדיסק. הדמיה של פלואורסצנטי GFP משוחזר בתכשירי דיסק כנף חי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת לאחר מכן ליצירת ערימות תמונות שמהן ניתן למקם ולכמת פלואורסצנטיות GFP משוחזרת. באמצעות מערכת זו ניתן לבטא במשותף טרנסגנים של קידוד חלבון או הפרעות RNA בתאים המייצרים ציטונם או בתאי מטרה כדי לאמוד את השפעתם על מגעי תאי DP-PerM. מערכת זו, הניתנת להתאמה בקלות לרקמות אחרות, מאפשרת זיהוי של גורמים חשובים להיווצרות או תפקוד ציטונמים.

מבוא

התפתחות הרקמות העובריות נשלטת על ידי תאים הממוקמים ב'מרכזי ארגון' המאותתים לתאים מרוחקים בתוך רקמה, ושולטים בהחלטותיהם להתרבות (כלומר, לגדול ולהתחלק) או לאמץגורלות מסוימים. איתות תאים לא אוטונומי זה מתווך על ידי ליגנדים המיוצרים על ידי ארגון תאי מרכז היוצרים שיפועי ריכוז דרך הרקמות ומעוררים תגובות תלויות ריכוז. במקרים רבים, ליגנדים אלה מועברים או נאספים באמצעות פילופודיה איתות מבוססת אקטין ארוכה הנקראת ציטונמים המחברים בין תאים שולחי ומקבלים אותות ברקמות 2,3. ציטונמים שהתגלו לראשונה בדיסק הדמיוני של כנף דרוזופילה4, זוהו גם ביונקים ובבעלי חוליות אחרים 5,6,7,8,9. הבנה טובה יותר של תפקידם של ציטונמים באיתות לא אוטונומי של תאים, בשלב מוקדם, היא חיונית לפענוח האופן שבו תאים מתקשרים כדי להתארגן לרקמות וכיצד קווי תקשורת אלה משתנים במצבים פתולוגיים שונים, כולל מומים התפתחותיים וסרטן.

ציטונמים יכולים להתרחב מתאי מקור כדי להעביר ליגנדים לתאי מטרה או מתאי מטרה כדי לקבל ליגנדים קרובים למקורותיהם 2,3. ציטונמים יוצרים מגעים אינטימיים עם המטרות שלהם, שם הם נחשבים ליוצרים מבנים דמויי סינפסה, שבהם העברת ליגנד יכולה להתרחש 3,10,11. מגע זה יכול להתרחש בין קצות ציטונמי המקור והמטרה או בין ציטונמים לגופי תאים3. למרות שאינה מאופיינת בהרחבה, הידבקות תאים באמצעות מולקולות הידבקות או באמצעות אינטראקציות קולטן-ליגנד נחוצה, במקרים מסוימים, להפעלה נכונה של אירועי איתות במורד הזרם 12,13,14, מה שהופך את זה להיבט חשוב של ביולוגיה של ציטונמה.

מספר מחקרים יישמו את טכניקת "בנייה מחדש של GFP על פני שותפים סינפטיים" (GRASP) לניתוח מגעי ציטונם. שיטה זו פותחה לזיהוי ומיפוי שותפים סינפטיים במערכות עצבים מורכבות15. הוא מבוסס על ביטוי של שני השברים המשלימים של GFP מפוצל (spGFP1-10 ו-spGFP11), שכל אחד מהם התמזג לאזור החוץ-תאי של תחום טרנסממברני (למשל של CD4), באוכלוסיות שונות של תאים. אם ממברנות הפלזמה של תאים בשתי האוכלוסיות הללו באות במגע ישיר, זה מביא את התחומים המשלימים של spGFP לקרבה, מה שמוביל לבנייה מחדש של הקרינה של GFP. גישה זו שימשה בדרוזופילה כדי לזהות את קיומם של מגעי ציטונמה בין תאים בתוך דיסק הכנף ובין דיסק הכנף לרקמות אחרות הצמודות זו לזו 12,16,17,18,19,20,21.

מאמר זה מתאר את היישום של GRASP לאפיון מגעים בין שתי שכבות אפיתל נבדלות מורפולוגית של הדיסק הדמיוני של כנף הדרוזופילה, הדיסק הנכון (DP) והממברנה הפריפודיאלית (PerM). שכבות אפיתל אלה יוצרות שק המקיף לומן מרכזי, כאשר תאי ה-DP העמודיים הפסאודוסטאריים ממוקמים בצד אחד ותאי ה-PerM הקשקשיים בצד השני, שניהם עם הממברנות האפיקליות שלהם פונות פנימה לכיוון הלומן (איור 1A). ישנן עדויות מסוימות לאיתות טרנס-לומנלי בין שתי השכבות 22,23,24,25, ולאחרונה תיעדנו איתות מה-DP כדי לשלוט בהתפשטות של תאי PerM המתווכים על ידי ציטונמים אפיקליים ב-DP 21. פרוטוקול זה כולל שימוש במערכות ביטוי הטרנסגנים GAL4/UAS ו-LexA/LexAop כדי לבטא מקטעים משלימים של spGFP שהתמזגו ל-CD4 על הממברנות של תאי DP ו-PerM. הוא משתמש בפלואורסצנטיות GFP משוחזרת כדי לקרוא מגע ממברנה בין שתי אוכלוסיות התאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דוחף nubbin-GAL4 משמש לביטוי CD4-spGFP1-10 במיוחד באזור נרתיק הכנף של ה-DP (איור 1A). דוחף PerM-LexA21 משמש לביטוי CD4-spGFP11 במיוחד ב-PerM (איור 1A). שתי מערכות הביטוי הללו אינן תלויות זו בזו, ומאפשרות ביטוי בו-זמני וספציפי של טרנסגנים שונים ב-DP ו-PerM (איור 1B,C).

התוכנית הגנטית הבסיסית כוללת הכלאה של זבובים ליצירת זחלים של הגנוטיפ nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. כבקרה שלילית, אנו משאירים את הטרנסגן LexAop-CD4-spGFP11 . טרנסגנים אחרים (למשל, קידוד חלבון, RNA דו-גדילי) יכולים להתבטא כרצונם בשכבת ה-DP (בשליטת רצפי הכטב"מים ) או ב-PerM (בשליטת אופרטור LexA).

זהו פרוטוקול הדמיה חיה שלא ניתן להפריע לו. הכנת החומר מוערכת ב~10 דקות. אין לבצע נתיחות יותר מ-20 דקות בכל פעם לפני ההדמיה. ההדמיה אורכת ~30 דקות ולא אמורה להימשך יותר מ~1 שעה. עבור מספר תנאים או מספר גבוה של דגימות, יש לבצע את ההליך במספר סבבים כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר.

1. הכנת חומר

  1. לפני הנתיחה, פינצטה נקייה, צלחת שקע זכוכית בעלת 9 בארות (או מיכל אחר המתאים לאיסוף וניקוי זחלים), וצלחת פטרי מצופה סילגארד (סיליקון) לשימוש חוזר המשמשת לדיסקציה עם 70% אתנול.
  2. הכן שקופיות מיקרוסקופ על ידי ביצוע שטיפת אתנול של 70% ולאחר מכן הדבקת מרווח הדמיה לשקופית המיובשת. חותכים בארות בודדות מרצועת 8 הבארות בעזרת מספריים וחותכים לשניים (איור 2A). הסר את גב המגן מצד אחד של כל מחצית והדביק מרווחים למגלשה, במרווחים קלים זה מזה כדי ליצור מרחב מוגן באמצע שבו הדיסקים יוצבו (איור 2B).
    הערה: מניסיוננו, זה מפשט את הרכבת הדגימה מכיוון שהנפח המדויק של המדיום המועבר לשקופית הוא פחות קריטי. כל נפח עודף קטן פשוט יזרום החוצה דרך הפער בעת החלקת הכיסוי. מכיוון שאנו מצלמים רק לזמן קצר יחסית (בדרך כלל ~ שעה), לא חווינו בעיות עם ייבוש בינוני.
  3. הפשירו מדיום הדמיה חיה (מדיום דרוזופילה של שניידר ללא תוספת מאוחסן בכמות קפואה של 10 מ"ל) ושמרו אותו נגיש בדלי קרח.
  4. בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל, מערבבים 1.5 מ"ל של מדיום עם 20 מיקרוליטר של 200 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst 33342 (ריכוז סופי 2.7 מיקרוגרם/מ"ל). שמור את הצינור על קרח.
    הערה: צורה ספציפית זו של צבע Hoechst משמשת מכיוון שהיא חדירה מאוד לממברנה. זהירות: יש להשתמש בכפפות בעת טיפול ב-Hoechst 33342. יש לשטוף כלים לאחר השימוש.

2. חיתוך דיסק כנף והכנת שקופיות

  1. לאחר הכלאה וגידול גנטי ב-25 מעלות צלזיוס, קוטפים זחלי כוכב שלישי נודדים מהצינור ושוטפים אותם במדיום הדמיה חי קר בצלחת שקע זכוכית עם 9 בארות.
    הערה: ציטונמים שבירים מאוד. בשלבים הבאים, יש להקפיד על מניפולציה של רקמות סביב הדיסקים, בניסיון להימנע ממגע ישיר בין הדיסקים לכלי הדיסקציה. אנו מכינים שלושה או ארבעה זחלים בכל פעם, מכיוון שפגיעה בכמה דיסקים היא בלתי נמנעת, וזה עשוי להיות מורגש רק במהלך שלבי ההדמיה.
  2. תחת מיקרוסקופ הניתוח, העבירו את הזחלים לטיפה של מדיום הדמיה חיה על צלחת פטרי מצופה סיליקון והתחילו לנתח באמצעות שני מלקחיים לניתוח. לשם כך, תחילה החזק את הראש וחלק הגוף הקדמי יציב על ידי צביטה של הזחלים עם זוג מלקחיים אחד בכשליש מאורך הגוף (מהקדמי). בעזרת זוג המלקחיים השני, צבטו את הגוף ממש אחורי למלקחיים הראשונים. לאחר מכן, משוך את החלק האחורי של הזחלים כדי לבודד את ה"חצי" הקדמי.
  3. הפוך את החצי הקדמי על ידי אבטחתו עם פינצטה אחת משני צידי הקצה החתוך ודחיפת הראש עם הזוג השני (כמו סיבוב גרב כלפי חוץ), כדי לחשוף את המבנים הפנימיים, כולל דיסקים דמיוניים, קנה הנשימה, בלוטות הרוק, גוף השומן והמעיים.
  4. הסר בזהירות את בלוטות הרוק, גוף השומן והמעיים, והיזהר לא להפריע לגזעים הצדדיים של קנה הנשימה, שאמורים לכסות ולהגן על דיסקי הכנף.
  5. השתמש במלקחיים כדי להעביר בזהירות את החצאים הקדמיים הנקיים עם דיסקי כנף מחוברים לתוך טיפה של מדיום הדמיה חיה נקי עם Hoechst, המונח בין המרווחים על מגלשה מוכנה (איור 2C). בודד את דיסקי הכנף משאר הרקמות על ידי ניתוחם בעדינות הרחק מהענפים העדינים של קנה הנשימה המתחברים לדיסק, באמצעות להב אחד של מלקחיים המנתחים, או חוט טונגסטן דק המחובר למחזיק מחט ניתוח. השליכו את שאר הפגר.
  6. כוון את הדיסקים באמצעות להב אחד של מלקחיים או מחט ניתוח חוט טונגסטן. בשל צורתם השטוחה דמוית טיפת הדמעה, דיסקי הכנפיים ייפלו כאשר ה-DP או PerM פונים כלפי מעלה. עבור פרוטוקול זה, כוון את כל הדיסקים כשצד ה-PerM כלפי מעלה.
  7. כוונן את נפח המדיום כדי למלא את הבאר במלואה, מעט מעל רמת מרווח ההדמיה, על ידי הוספה או הסרה של המדיום לפי הצורך. הסר את גב המגן מהצד העליון של כל חצי מרווח הדמיה ולאחר מכן הורד בזהירות את הכיסוי מעל הדגימה. לחץ בעדינות על משטח הכיסוי במקום שבו הוא נוגע במרווחי ההדמיה (למשל, עם הקצה המעוגל של מלקחיים לניתוח) כדי לוודא שהחלקת הכיסוי נצמדת למרווח.
    הערה: המפלס הבינוני צריך להיות מעט מעל גובה המרווח כדי למנוע לכידת בועות אוויר, אך לא גבוה עד כדי יצירת זרימה משמעותית בעת הורדת הכיסוי.

3. הדמיה

  1. דגימות תמונה בטמפרטורת החדר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (לייזר יון ארגון עם אורך גל של 488 ננומטר עבור GFP, לייזר UV עם אורך גל של 350 ננומטר עבור Hoechst) המצויד בעדשת טבילה בשמן 40x/1.30 NA ותוכנת מיקרוסקופיה. רכוש ערימות תמונות בגודל צעד של 1 מיקרומטר המשתרעות מהרמה הגבוהה ביותר של ה-PerM (היכן שהפלואורסצנטיות של Hoechst פוחתת) לצד הבסיסי של ה-DP, שבדרך כלל מסתכם ביותר מ-100 תמונות לערימה. רכשו אוספי תמונות חוזרים כדי ליצור סרטוני דולג זמן.
    הערה: אנו מדמיינים שקופית לא יותר מ~1-2 שעות.
  2. עבור הגדרות תוכנת המיקרוסקופ, רכוש תמונות באמצעות קידוד 8 סיביות, ממוצע קו של 2, רווח גלאי בדרך כלל בין 650 ל-750, ומסלולי ערוצים מופרדים כדי להפחית את דימום האות. השתמש בהגדרות לייזר וגלאי זהות לכל התנאים, שנקבעו מראש על ידי ביצוע בדיקות על כל מצב מראש.
    הערה: בהגדלה של פי 40, לתמונות שלנו יש רזולוציה של 5.0386 פיקסלים למיקרומטר (גודל פיקסל: 0.1985 x 0.1985 מיקרומטר2). במערך שלנו, הגדרות המיקרוסקופ הקונפוקלי האופטימליות כללו את עוצמת הלייזר הגבוהה ביותר האפשרית (מבלי לפגוע ברקמה) כדי ללכוד כמה שיותר אותות, ובמקביל להניב רוויה מועטה או ללא רוויה; והרעש הנמוך ביותר האפשרי כפי שהוערך בבקרות שליליות, המושג על ידי הפחתת היסט הגלאי ומהירות הרכישה (במידת הצורך). בדרך כלל אנו משתמשים בפחות מ-5% עוצמת לייזר ומהירות ראש סריקה מקסימלית ('9' בהגדרות תוכנת Zen). ערימת תמונות בודדת לוקחת בדרך כלל ~1 דקה ו-45 שניות, והתמונות מצולמות כל 2-3 דקות לניתוחי זמן-lapse.

4. ניתוח תמונות

  1. ערימות הקרנה באמצעות פונקציית ההקרנה בעוצמה המרבית של חבילת התוכנה ImageJ (לחץ על התמונה | ערימות | Z, בחר עוצמה מקסימלית בתפריט).
  2. בתמונות MIP, קבע את שטח נרתיק הכנף על סמך דפוס קיפול דיסק הכנף (באמצעות ערוץ Hoechst) באמצעות בחירת מצולע. השתמש באותה בחירה בערוץ GFP עם הפונקציה Clear Outside (לחץ על Edit | Clear outside) כדי להגדיר כל ערך פיקסל חיצוני ל- 0.
  3. בתמונות MIP, השתמש בערוץ Hoechst לניקוי תמונות GFP, ובמיוחד הסר את כל הכתמים המלאכותיים המופיעים בשני הערוצים על-ידי הגדרת ערך הפיקסלים הנוגע בדבר ל- 0 (לחץ על בחירת מצולע ולאחר מכן על ערוך | נקה).
  4. בתמונות ה-MIP המנוקות, השתמש בפונקציה היסטוגרמה (לחץ על נתח | היסטוגרמה | List) כדי להשיג ולהעתיק את רשימת כל ערכי הפיקסלים לטבלה בגיליון אלקטרוני.
  5. הגדר ערך סף על סמך ניתוח אות הרקע בבקרות שליליות (ולאחר מכן אומת בדגימות אחרות; ראה דיון).
  6. חשב את אחוז המשטח החיובי ל-GFP באמצעות הנוסחה הבאה:
    % משטח חיובי ל-GFP = figure-protocol-1 × 100
  7. נרמל את הנתונים בסוף על-ידי חלוקת כל ערך בממוצע של תנאי הייחוס (המוגדר ל- 1).
    הערה: פיקסל חוקי = פיקסל עם ערך ≥ 1, ולמעשה מתעלם מכל פיקסל שנמחק שהערך שלו נקבע ל- 0. ערכי פיקסלים של 0 אינם מתרחשים באופן טבעי.
  8. כדי לקבוע היכן בדיסקים מתמקם אות ה-GFP המחודש, השתמש ב-XZ-reslices של ערימות תמונות כדי להסתכל על הציר האפיקובזאלי של אפיתל הדיסק. בצע את הפרוסות בפיג'י ללא אינטרפולציה, והגדל את גובה התמונה בציר Z באמצעות הפונקציה Scale עם אינטרפולציה דו-ליניארית כדי לשפר את הנראות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לבחון את התועלת של נוהל GRASP למדידת מגעים בין תאי DP ו-PerM, בחנו דיסקי כנף של ארבעה גנוטיפים שונים: דיסקי בקרה שלילית מסוג פרא (גנוטיפ: w1118) שיציגו רק רמות רקע של אוטופלואורסצנטיות בערוץ GFP; דיסקים המבטאים את CD4-spGFP1-10 בשכבת ה-DP, אך חסרים את הטרנסגן CD4-spGFP11, שיראה את רמת הקרינה המיוצרת על ידי GFP1-10 בלבד (שציפינו שתהיה זניחה, מכיוון ש-GFP1-10 לא אמור להאיר26); דיסקים שבהם CD4-spGFP1-10 ו-CD4-spGFP11 באים לידי ביטוי ב-DP ו-PerM, בהתאמה (אי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ציטונמים ממלאים תפקיד חשוב בהפצת ליגנדים, ושולטים בצמיחה ובארגון של רקמות מתפתחות. חילופי אותות מתרחשים במקום שבו קצות ציטונם יוצרים מגעים אינטימיים של הממברנה עם המטרות שלהם. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לניתוח מגעים בתיווך ציטונמה בין שכבות אפיתל בדיסקת הכנף באמצעות טכניקת GRASP.

הטכניקה המוצגת כאן דורשת, לכל הפחות, ארבעה רכיבים - מנהל התקן GAL4, דרייבר LexA ושני הטרנסגנים המקודדים היתוך CD4 של מקטעי spGFP המשלימים תחת בקרת UAS ו-LexAop

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק CIHR (PJT-162109) ל-D.H. M.J. החזיק במלגת דוקטורט מקרן Institut de Recherches Cliniques de Montréal ומהתוכנית לביולוגיה מולקולרית של אוניברסיטת מונטריאול. המחברים מודים מאוד על הסיוע של פלטפורמת המיקרוסקופיה וההדמיה של IRCM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דיסקברי V12 מיקרוסקופ דיסקציהצייסמיקרוסקופ דיסקציה
דומונט #55 מלקחיים, טיפים לביולוגיהכלים מדעיים עדינים11255-20ניתוח מלקחיים
EP-Slik (slik20358)BDSCPanneton et al. 2015 זן זבוב לשאיבת סליק
פיג׳יSchindelin J. et al. (2012) תוכנה לניתוח תמונות
הוכסט 33342 תרמו-פישר סיינטיפיקH3570 הדמיה חיה כתם גרעיני 
LexAop-CD4-spGFP11  BDSC93018זן זבוב
מיקרוסקופ קונפוקלי LSM 700 צייסמיקרוסקופ קונפוקלי
nub-GAL4מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה (BDSC)86108זן זבוב
PerM-LexAרמבו, יוסף ואחרים, 2025זן זבוב
פלטת ספוט זכוכית PYREX 9-שקעקורנינג מדעי החיים7220-85לאיסוף ושטיפת זחלים
מדיום הדרוזופילה של שניידרתרמו-פישר סיינטיפיק21720024מדיום הדמיה חיה
מרווחי הדמיה SecureSeal, 8 בארות, עובי 0.12 מ"מ גרייס ביו-לאבס654008מרווח
SYLGARD 184 ערכת אלסטומר סיליקוןסילגארד3097358-1004להכנת לוחות חיתוך
UAS-CD4-spGFP1-10  BDSC93017זן זבוב
זן שחורצייסתוכנת רכישה

מקורות

  1. Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development. Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).
  2. Kornberg, T. B. Cytonemes and the dispersion of morphogens. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (6), 445-463 (2014).
  3. Daly, C. A., Hall, E. T., Ogden, S. K. Regulatory mechanisms of cytoneme-based morphogen transport. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 119(2022).
  4. Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
  5. Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of Sonic Hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a Dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. Elife. 10, e61432(2021).
  6. Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
  7. Stanganello, E., et al. Filopodia-based Wnt transport during vertebrate tissue patterning. Nat Commun. 6, 5846(2015).
  8. Hall, E. T., et al. Cytoneme signaling provides essential contributions to mammalian tissue patterning. Cell. 187 (2), 276-293.e23 (2024).
  9. Zhang, C., Brunt, L., Ono, Y., Rogers, S., Scholpp, S. Cytoneme-mediated transport of active Wnt5b-Ror2 complexes in zebrafish. Nature. 625 (7993), 126-133 (2024).
  10. Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
  11. Wood, B. M., et al. Cytonemes with complex geometries and composition extend into invaginations of target cells. J Cell Biol. 220 (5), e202101116(2021).
  12. Gonzalez-Mendez, L., Seijo-Barandiaran, I., Guerrero, I. Cytoneme-mediated cell-cell contacts for Hedgehog reception. Elife. 6, e24045(2017).
  13. Du, L., Sohr, A., Li, Y., Roy, S. GPI-anchored FGF directs cytoneme-mediated bidirectional contacts to regulate its tissue-specific dispersion. Nat Commun. 13 (1), 3482(2022).
  14. Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624(2014).
  15. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  16. Yang, S., et al. Competitive coordination of the dual roles of the Hedgehog co-receptor in homophilic adhesion and signal reception. Elife. 10, e65770(2021).
  17. Patel, A., et al. Cytonemes coordinate asymmetric signaling and organization in the Drosophila muscle progenitor niche. Nat Commun. 13 (1), 1185(2022).
  18. Chen, W., Huang, H., Hatori, R., Kornberg, T. B. Essential basal cytonemes take up Hedgehog in the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144 (17), 3134-3144 (2017).
  19. Huang, H., Kornberg, T. B. Myoblast cytonemes mediate Wg signaling from the wing imaginal disc and Delta-Notch signaling to the air sac primordium. Elife. 4, e06114(2015).
  20. Hatori, R., Kornberg, T. B. Hedgehog produced by the Drosophila wing imaginal disc induces distinct responses in three target tissues. Development. 147 (22), dev195974(2020).
  21. Rambaud, B., et al. Slik sculpts the plasma membrane into cytonemes to control cell-cell communication. EMBO J. 44 (8), 2186-2210 (2025).
  22. Gibson, M. C., Schubiger, G. Peripodial cells regulate proliferation and patterning of Drosophila imaginal discs. Cell. 103 (2), 343-350 (2000).
  23. Gibson, M. C., Lehman, D. A., Schubiger, G. Lumenal transmission of decapentaplegic in Drosophila imaginal discs. Dev Cell. 3 (3), 451-460 (2002).
  24. Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. Egfr/Ras pathway mediates interactions between peripodial and disc proper cells in Drosophila wing discs. Development. 130 (20), 4931-4941 (2003).
  25. Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. Signaling interactions between squamous and columnar epithelia of the Drosophila wing disc. J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3363-3370 (2005).
  26. Pedelacq, J. D., Cabantous, S. Development and applications of superfolder and split fluorescent protein detection systems in biology. Int J Mol Sci. 20 (14), 3479(2019).
  27. Panneton, V., et al. Regulation of catalytic and non-catalytic functions of the Drosophila Ste20 kinase Slik by activation segment phosphorylation. J Biol Chem. 290 (34), 20960-20971 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מגע באמצעות ציטונמותדיסק כנף של דרוזופילהדימיון חימיקרוסקופיה קונפוקליתמערכת Split GFPקרום פריפודיאליסיגנלינג לצמיחת רקמהביטוי חלבון
מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.