Method Article

מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה

DOI:

10.3791/68411

⸱

August 22nd, 2025

 , 
1Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM), 2Programmes de biologie moléculaire, Université de Montréal, 3Département de Médecine, Université de Montréal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול למדידת מגעים בין תאים בשכבות אפיתל סמוכות בדיסקים דמיוניים חיים של כנפי דרוזופילה באמצעות גישה מבוססת בנייה מחדש של GFP.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צמיחה ודפוס של רקמות עובריות נשלטים במידה רבה על ידי אותות המוחלפים באופן מקומי בין אוכלוסיות תאים בתוך הרקמות עצמן. ציטונמים הם סוג של פילופודיה איתות שזוהה לראשונה בדרוזופילה המחברים ומתווכים חילופי תאים מייצרי אותות ומקבלים אותות. בדיסק הדמיוני המתפתח של כנף דרוזופילה, ציטונמים מעורבים בחילופי אותות בין אוכלוסיות נפרדות של תאים בתוך אפיתל הדיסק הנכון (DP), אשר יהווה את הכנף הבוגרת, כמו גם בין תאי DP לתאים ברקמות הקשורות לדיסק סמוך. ציטונמים מסנפסים עם תאי מטרה ליצירת מגעים אינטימיים של הממברנה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות מגע בתיווך ציטונם בין תאי DP לתאים של אפיתל הממברנה הפריפודיאלית (PerM) הסמוך, המופרד מתאי ה-DP על ידי לומן הדיסק, באמצעות גישת בנייה מחדש של GFP בדיסקי כנף חיים. באמצעות מערכות GAL4-UAS ו-LexA-LexAop, מקטעים משלימים של GFP מפוצל (spGFP1-10, spGFP11), שכל אחד מהם התמזג לתחום הטרנסממברני של CD4, מתבטאים משני צידי לומן הדיסק. הדמיה של פלואורסצנטי GFP משוחזר בתכשירי דיסק כנף חי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת לאחר מכן ליצירת ערימות תמונות שמהן ניתן למקם ולכמת פלואורסצנטיות GFP משוחזרת. באמצעות מערכת זו ניתן לבטא במשותף טרנסגנים של קידוד חלבון או הפרעות RNA בתאים המייצרים ציטונם או בתאי מטרה כדי לאמוד את השפעתם על מגעי תאי DP-PerM. מערכת זו, הניתנת להתאמה בקלות לרקמות אחרות, מאפשרת זיהוי של גורמים חשובים להיווצרות או תפקוד ציטונמים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפתחות הרקמות העובריות נשלטת על ידי תאים הממוקמים ב'מרכזי ארגון' המאותתים לתאים מרוחקים בתוך רקמה, ושולטים בהחלטותיהם להתרבות (כלומר, לגדול ולהתחלק) או לאמץגורלות מסוימים. איתות תאים לא אוטונומי זה מתווך על ידי ליגנדים המיוצרים על ידי ארגון תאי מרכז היוצרים שיפועי ריכוז דרך הרקמות ומעוררים תגובות תלויות ריכוז. במקרים רבים, ליגנדים אלה מועברים או נאספים באמצעות פילופודיה איתות מבוססת אקטין ארוכה הנקראת ציטונמים המחברים בין תאים שולחי ומקבלים אותות ברקמות 2,3. ציטונמים שהתגלו לראשונה בדיסק הדמיוני של כנף דרוזופילה4, זוהו גם ביונקי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוחף nubbin-GAL4 משמש לביטוי CD4-spGFP1-10 במיוחד באזור נרתיק הכנף של ה-DP (איור 1A). דוחף PerM-LexA21 משמש לביטוי CD4-spGFP11 במיוחד ב-PerM (איור 1A). שתי מערכות הביטוי הללו אינן תלויות זו בזו, ומאפשרות ביטוי בו-זמני וספציפי של טרנסגנים שונים ב-DP ו-PerM (איור 1B,C).

התוכנית הגנטית הבסיסית כוללת הכלאה של זבובים ליצירת זחלים של הגנוטיפ nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. כבקרה שלילית, אנו משאירים את הטרנסגן LexAop-CD4-spGFP11 . טרנסגנים אחרים (למשל, קידוד חלבון, R....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לבחון את התועלת של נוהל GRASP למדידת מגעים בין תאי DP ו-PerM, בחנו דיסקי כנף של ארבעה גנוטיפים שונים: דיסקי בקרה שלילית מסוג פרא (גנוטיפ: w1118) שיציגו רק רמות רקע של אוטופלואורסצנטיות בערוץ GFP; דיסקים המבטאים את CD4-spGFP1-10 בשכבת ה-DP, אך חסרים את הטרנסגן CD4-spGFP11, שיראה את רמת הקרינה המיוצרת על ידי GFP1-10 בלבד (שציפינו שתהיה זניחה, מכיוון ש-GFP1-10 לא אמור להאיר26); דיסקים שבהם CD4-spGFP1-10 ו-CD4-spGFP11 באים לידי ביטוי ב-DP ו-PerM, בהתאמה (אי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ציטונמים ממלאים תפקיד חשוב בהפצת ליגנדים, ושולטים בצמיחה ובארגון של רקמות מתפתחות. חילופי אותות מתרחשים במקום שבו קצות ציטונם יוצרים מגעים אינטימיים של הממברנה עם המטרות שלהם. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לניתוח מגעים בתיווך ציטונמה בין שכבות אפיתל בדיסקת הכנף באמצעות טכניקת GRASP.

הטכניקה המוצגת כאן דורשת, לכל הפחות, ארבעה רכיבים - מנהל התקן GAL4, דרייבר LexA ושני הטרנסגנים המקודדים היתוך CD4 של מקטעי spGFP המשלימים תחת בקרת UAS ו-LexAop

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק CIHR (PJT-162109) ל-D.H. M.J. החזיק במלגת דוקטורט מקרן Institut de Recherches Cliniques de Montréal ומהתוכנית לביולוגיה מולקולרית של אוניברסיטת מונטריאול. המחברים מודים מאוד על הסיוע של פלטפורמת המיקרוסקופיה וההדמיה של IRCM.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
דיסקברי V12 מיקרוסקופ דיסקציהצייסמיקרוסקופ דיסקציה
דומונט #55 מלקחיים, טיפים לביולוגיהכלים מדעיים עדינים11255-20ניתוח מלקחיים
EP-Slik (slik20358)BDSCPanneton et al. 2015 זן זבוב לשאיבת סליק
פיג׳יSchindelin J. et al. (2012) תוכנה לניתוח תמונות
הוכסט 33342 תרמו-פישר סיינטיפיקH3570 הדמיה חיה כתם גרעיני 
LexAop-CD4-spGFP11  BDSC93018זן זבוב
מיקרוסקופ קונפוקלי LSM 700 צייסמיקרוסקופ קונפוקלי
nub-GAL4מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה (BDSC)86108זן זבוב
PerM-LexAרמבו, יוסף ואחרים, 2025זן זבוב
פלטת ספוט זכוכית PYREX 9-שקעקורנינג מדעי החיים7220-85לאיסוף ושטיפת זחלים
מדיום הדרוזופילה של שניידרתרמו-פישר סיינטיפיק21720024מדיום הדמיה חיה
מרווחי הדמיה SecureSeal, 8 בארות, עובי 0.12 מ"מ גרייס ביו-לאבס654008מרווח
SYLGARD 184 ערכת אלסטומר סיליקוןסילגארד3097358-1004להכנת לוחות חיתוך
UAS-CD4-spGFP1-10  BDSC93017זן זבוב
זן שחורצייסתוכנת רכישה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development. Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).
  2. Kornberg, T. B. Cytonemes and the dispersion of morphogens. Wiley Interdiscip....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cytoneme Mediated ContactDrosophila Wing DiscGFP ComplementationLive ImagingConfocal MicroscopySplit GFP SystemCell Cell ContactPeripodial MembraneTissue Growth SignalingProtein Expression

Related Articles