מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה

התפתחות הרקמות העובריות נשלטת על ידי תאים הממוקמים ב'מרכזי ארגון' המאותתים לתאים מרוחקים בתוך רקמה, ושולטים בהחלטותיהם להתרבות (כלומר, לגדול ולהתחלק) או לאמץ^גורלות מסוימים. איתות תאים לא אוטונומי זה מתווך על ידי ליגנדים המיוצרים על ידי ארגון תאי מרכז היוצרים שיפועי ריכוז דרך הרקמות ומעוררים תגובות תלויות ריכוז. במקרים רבים, ליגנדים אלה מועברים או נאספים באמצעות פילופודיה איתות מבוססת אקטין ארוכה הנקראת ציטונמים המחברים בין תאים שולחי ומקבלים אותות ברקמות ^2,3. ציטונמים שהתגלו לראשונה בדיסק הדמיוני של כנף דרוזופילה⁴, זוהו גם ביונקים ובבעלי חוליות אחרים 5,6,7,8,9. הבנה טובה יותר של תפקידם של ציטונמים באיתות לא אוטונומי של תאים, בשלב מוקדם, היא חיונית לפענוח האופן שבו תאים מתקשרים כדי להתארגן לרקמות וכיצד קווי תקשורת אלה משתנים במצבים פתולוגיים שונים, כולל מומים התפתחותיים וסרטן.

ציטונמים יכולים להתרחב מתאי מקור כדי להעביר ליגנדים לתאי מטרה או מתאי מטרה כדי לקבל ליגנדים קרובים למקורותיהם ^2,3. ציטונמים יוצרים מגעים אינטימיים עם המטרות שלהם, שם הם נחשבים ליוצרים מבנים דמויי סינפסה, שבהם העברת ליגנד יכולה להתרחש ^3,10,11. מגע זה יכול להתרחש בין קצות ציטונמי המקור והמטרה או בין ציטונמים לגופי תאים³. למרות שאינה מאופיינת בהרחבה, הידבקות תאים באמצעות מולקולות הידבקות או באמצעות אינטראקציות קולטן-ליגנד נחוצה, במקרים מסוימים, להפעלה נכונה של אירועי איתות במורד הזרם 12,13,14, מה שהופך את זה להיבט חשוב של ביולוגיה של ציטונמה.

מספר מחקרים יישמו את טכניקת "בנייה מחדש של GFP על פני שותפים סינפטיים" (GRASP) לניתוח מגעי ציטונם. שיטה זו פותחה לזיהוי ומיפוי שותפים סינפטיים במערכות עצבים מורכבות¹⁵. הוא מבוסס על ביטוי של שני השברים המשלימים של GFP מפוצל (spGFP1-10 ו-spGFP11), שכל אחד מהם התמזג לאזור החוץ-תאי של תחום טרנסממברני (למשל של CD4), באוכלוסיות שונות של תאים. אם ממברנות הפלזמה של תאים בשתי האוכלוסיות הללו באות במגע ישיר, זה מביא את התחומים המשלימים של spGFP לקרבה, מה שמוביל לבנייה מחדש של הקרינה של GFP. גישה זו שימשה בדרוזופילה כדי לזהות את קיומם של מגעי ציטונמה בין תאים בתוך דיסק הכנף ובין דיסק הכנף לרקמות אחרות הצמודות זו לזו 12,16,17,18,19,20,21.

מאמר זה מתאר את היישום של GRASP לאפיון מגעים בין שתי שכבות אפיתל נבדלות מורפולוגית של הדיסק הדמיוני של כנף הדרוזופילה, הדיסק הנכון (DP) והממברנה הפריפודיאלית (PerM). שכבות אפיתל אלה יוצרות שק המקיף לומן מרכזי, כאשר תאי ה-DP העמודיים הפסאודוסטאריים ממוקמים בצד אחד ותאי ה-PerM הקשקשיים בצד השני, שניהם עם הממברנות האפיקליות שלהם פונות פנימה לכיוון הלומן (איור 1A). ישנן עדויות מסוימות לאיתות טרנס-לומנלי בין שתי השכבות 22,23,24,25, ולאחרונה תיעדנו איתות מה-DP כדי לשלוט בהתפשטות של תאי PerM המתווכים על ידי ציטונמים אפיקליים ב-DP 21. פרוטוקול זה כולל שימוש במערכות ביטוי הטרנסגנים GAL4/UAS ו-LexA/LexAop כדי לבטא מקטעים משלימים של spGFP שהתמזגו ל-CD4 על הממברנות של תאי DP ו-PerM. הוא משתמש בפלואורסצנטיות GFP משוחזרת כדי לקרוא מגע ממברנה בין שתי אוכלוסיות התאים.

דוחף nubbin-GAL4 משמש לביטוי CD4-spGFP1-10 במיוחד באזור נרתיק הכנף של ה-DP (איור 1A). דוחף PerM-LexA²¹ משמש לביטוי CD4-spGFP11 במיוחד ב-PerM (איור 1A). שתי מערכות הביטוי הללו אינן תלויות זו בזו, ומאפשרות ביטוי בו-זמני וספציפי של טרנסגנים שונים ב-DP ו-PerM (איור 1B,C).

התוכנית הגנטית הבסיסית כוללת הכלאה של זבובים ליצירת זחלים של הגנוטיפ nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. כבקרה שלילית, אנו משאירים את הטרנסגן LexAop-CD4-spGFP11 . טרנסגנים אחרים (למשל, קידוד חלבון, RNA דו-גדילי) יכולים להתבטא כרצונם בשכבת ה-DP (בשליטת רצפי הכטב"מים ) או ב-PerM (בשליטת אופרטור LexA).

זהו פרוטוקול הדמיה חיה שלא ניתן להפריע לו. הכנת החומר מוערכת ב~10 דקות. אין לבצע נתיחות יותר מ-20 דקות בכל פעם לפני ההדמיה. ההדמיה אורכת ~30 דקות ולא אמורה להימשך יותר מ~1 שעה. עבור מספר תנאים או מספר גבוה של דגימות, יש לבצע את ההליך במספר סבבים כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר.

1. הכנת חומר

1. לפני הנתיחה, פינצטה נקייה, צלחת שקע זכוכית בעלת 9 בארות (או מיכל אחר המתאים לאיסוף וניקוי זחלים), וצלחת פטרי מצופה סילגארד (סיליקון) לשימוש חוזר המשמשת לדיסקציה עם 70% אתנול.
2. הכן שקופיות מיקרוסקופ על ידי ביצוע שטיפת אתנול של 70% ולאחר מכן הדבקת מרווח הדמיה לשקופית המיובשת. חותכים בארות בודדות מרצועת 8 הבארות בעזרת מספריים וחותכים לשניים (איור 2A). הסר את גב המגן מצד אחד של כל מחצית והדביק מרווחים למגלשה, במרווחים קלים זה מזה כדי ליצור מרחב מוגן באמצע שבו הדיסקים יוצבו (איור 2B).
   הערה: מניסיוננו, זה מפשט את הרכבת הדגימה מכיוון שהנפח המדויק של המדיום המועבר לשקופית הוא פחות קריטי. כל נפח עודף קטן פשוט יזרום החוצה דרך הפער בעת החלקת הכיסוי. מכיוון שאנו מצלמים רק לזמן קצר יחסית (בדרך כלל ~ שעה), לא חווינו בעיות עם ייבוש בינוני.
3. הפשירו מדיום הדמיה חיה (מדיום דרוזופילה של שניידר ללא תוספת מאוחסן בכמות קפואה של 10 מ"ל) ושמרו אותו נגיש בדלי קרח.
4. בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל, מערבבים 1.5 מ"ל של מדיום עם 20 מיקרוליטר של 200 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst 33342 (ריכוז סופי 2.7 מיקרוגרם/מ"ל). שמור את הצינור על קרח.
   הערה: צורה ספציפית זו של צבע Hoechst משמשת מכיוון שהיא חדירה מאוד לממברנה. זהירות: יש להשתמש בכפפות בעת טיפול ב-Hoechst 33342. יש לשטוף כלים לאחר השימוש.

2. חיתוך דיסק כנף והכנת שקופיות

1. לאחר הכלאה וגידול גנטי ב-25 מעלות צלזיוס, קוטפים זחלי כוכב שלישי נודדים מהצינור ושוטפים אותם במדיום הדמיה חי קר בצלחת שקע זכוכית עם 9 בארות.
   הערה: ציטונמים שבירים מאוד. בשלבים הבאים, יש להקפיד על מניפולציה של רקמות סביב הדיסקים, בניסיון להימנע ממגע ישיר בין הדיסקים לכלי הדיסקציה. אנו מכינים שלושה או ארבעה זחלים בכל פעם, מכיוון שפגיעה בכמה דיסקים היא בלתי נמנעת, וזה עשוי להיות מורגש רק במהלך שלבי ההדמיה.
2. תחת מיקרוסקופ הניתוח, העבירו את הזחלים לטיפה של מדיום הדמיה חיה על צלחת פטרי מצופה סיליקון והתחילו לנתח באמצעות שני מלקחיים לניתוח. לשם כך, תחילה החזק את הראש וחלק הגוף הקדמי יציב על ידי צביטה של הזחלים עם זוג מלקחיים אחד בכשליש מאורך הגוף (מהקדמי). בעזרת זוג המלקחיים השני, צבטו את הגוף ממש אחורי למלקחיים הראשונים. לאחר מכן, משוך את החלק האחורי של הזחלים כדי לבודד את ה"חצי" הקדמי.
3. הפוך את החצי הקדמי על ידי אבטחתו עם פינצטה אחת משני צידי הקצה החתוך ודחיפת הראש עם הזוג השני (כמו סיבוב גרב כלפי חוץ), כדי לחשוף את המבנים הפנימיים, כולל דיסקים דמיוניים, קנה הנשימה, בלוטות הרוק, גוף השומן והמעיים.
4. הסר בזהירות את בלוטות הרוק, גוף השומן והמעיים, והיזהר לא להפריע לגזעים הצדדיים של קנה הנשימה, שאמורים לכסות ולהגן על דיסקי הכנף.
5. השתמש במלקחיים כדי להעביר בזהירות את החצאים הקדמיים הנקיים עם דיסקי כנף מחוברים לתוך טיפה של מדיום הדמיה חיה נקי עם Hoechst, המונח בין המרווחים על מגלשה מוכנה (איור 2C). בודד את דיסקי הכנף משאר הרקמות על ידי ניתוחם בעדינות הרחק מהענפים העדינים של קנה הנשימה המתחברים לדיסק, באמצעות להב אחד של מלקחיים המנתחים, או חוט טונגסטן דק המחובר למחזיק מחט ניתוח. השליכו את שאר הפגר.
6. כוון את הדיסקים באמצעות להב אחד של מלקחיים או מחט ניתוח חוט טונגסטן. בשל צורתם השטוחה דמוית טיפת הדמעה, דיסקי הכנפיים ייפלו כאשר ה-DP או PerM פונים כלפי מעלה. עבור פרוטוקול זה, כוון את כל הדיסקים כשצד ה-PerM כלפי מעלה.
7. כוונן את נפח המדיום כדי למלא את הבאר במלואה, מעט מעל רמת מרווח ההדמיה, על ידי הוספה או הסרה של המדיום לפי הצורך. הסר את גב המגן מהצד העליון של כל חצי מרווח הדמיה ולאחר מכן הורד בזהירות את הכיסוי מעל הדגימה. לחץ בעדינות על משטח הכיסוי במקום שבו הוא נוגע במרווחי ההדמיה (למשל, עם הקצה המעוגל של מלקחיים לניתוח) כדי לוודא שהחלקת הכיסוי נצמדת למרווח.
   הערה: המפלס הבינוני צריך להיות מעט מעל גובה המרווח כדי למנוע לכידת בועות אוויר, אך לא גבוה עד כדי יצירת זרימה משמעותית בעת הורדת הכיסוי.

3. הדמיה

1. דגימות תמונה בטמפרטורת החדר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (לייזר יון ארגון עם אורך גל של 488 ננומטר עבור GFP, לייזר UV עם אורך גל של 350 ננומטר עבור Hoechst) המצויד בעדשת טבילה בשמן 40x/1.30 NA ותוכנת מיקרוסקופיה. רכוש ערימות תמונות בגודל צעד של 1 מיקרומטר המשתרעות מהרמה הגבוהה ביותר של ה-PerM (היכן שהפלואורסצנטיות של Hoechst פוחתת) לצד הבסיסי של ה-DP, שבדרך כלל מסתכם ביותר מ-100 תמונות לערימה. רכשו אוספי תמונות חוזרים כדי ליצור סרטוני דולג זמן.
   הערה: אנו מדמיינים שקופית לא יותר מ~1-2 שעות.
2. עבור הגדרות תוכנת המיקרוסקופ, רכוש תמונות באמצעות קידוד 8 סיביות, ממוצע קו של 2, רווח גלאי בדרך כלל בין 650 ל-750, ומסלולי ערוצים מופרדים כדי להפחית את דימום האות. השתמש בהגדרות לייזר וגלאי זהות לכל התנאים, שנקבעו מראש על ידי ביצוע בדיקות על כל מצב מראש.
   הערה: בהגדלה של פי 40, לתמונות שלנו יש רזולוציה של 5.0386 פיקסלים למיקרומטר (גודל פיקסל: 0.1985 x 0.1985 מיקרומטר²). במערך שלנו, הגדרות המיקרוסקופ הקונפוקלי האופטימליות כללו את עוצמת הלייזר הגבוהה ביותר האפשרית (מבלי לפגוע ברקמה) כדי ללכוד כמה שיותר אותות, ובמקביל להניב רוויה מועטה או ללא רוויה; והרעש הנמוך ביותר האפשרי כפי שהוערך בבקרות שליליות, המושג על ידי הפחתת היסט הגלאי ומהירות הרכישה (במידת הצורך). בדרך כלל אנו משתמשים בפחות מ-5% עוצמת לייזר ומהירות ראש סריקה מקסימלית ('9' בהגדרות תוכנת Zen). ערימת תמונות בודדת לוקחת בדרך כלל ~1 דקה ו-45 שניות, והתמונות מצולמות כל 2-3 דקות לניתוחי זמן-lapse.

4. ניתוח תמונות

1. ערימות הקרנה באמצעות פונקציית ההקרנה בעוצמה המרבית של חבילת התוכנה ImageJ (לחץ על התמונה | ערימות | Z, בחר עוצמה מקסימלית בתפריט).
2. בתמונות MIP, קבע את שטח נרתיק הכנף על סמך דפוס קיפול דיסק הכנף (באמצעות ערוץ Hoechst) באמצעות בחירת מצולע. השתמש באותה בחירה בערוץ GFP עם הפונקציה Clear Outside (לחץ על Edit | Clear outside) כדי להגדיר כל ערך פיקסל חיצוני ל- 0.
3. בתמונות MIP, השתמש בערוץ Hoechst לניקוי תמונות GFP, ובמיוחד הסר את כל הכתמים המלאכותיים המופיעים בשני הערוצים על-ידי הגדרת ערך הפיקסלים הנוגע בדבר ל- 0 (לחץ על בחירת מצולע ולאחר מכן על ערוך | נקה).
4. בתמונות ה-MIP המנוקות, השתמש בפונקציה היסטוגרמה (לחץ על נתח | היסטוגרמה | List) כדי להשיג ולהעתיק את רשימת כל ערכי הפיקסלים לטבלה בגיליון אלקטרוני.
5. הגדר ערך סף על סמך ניתוח אות הרקע בבקרות שליליות (ולאחר מכן אומת בדגימות אחרות; ראה דיון).
6. חשב את אחוז המשטח החיובי ל-GFP באמצעות הנוסחה הבאה:
   % משטח חיובי ל-GFP = × 100
7. נרמל את הנתונים בסוף על-ידי חלוקת כל ערך בממוצע של תנאי הייחוס (המוגדר ל- 1).
   הערה: פיקסל חוקי = פיקסל עם ערך ≥ 1, ולמעשה מתעלם מכל פיקסל שנמחק שהערך שלו נקבע ל- 0. ערכי פיקסלים של 0 אינם מתרחשים באופן טבעי.
8. כדי לקבוע היכן בדיסקים מתמקם אות ה-GFP המחודש, השתמש ב-XZ-reslices של ערימות תמונות כדי להסתכל על הציר האפיקובזאלי של אפיתל הדיסק. בצע את הפרוסות בפיג'י ללא אינטרפולציה, והגדל את גובה התמונה בציר Z באמצעות הפונקציה Scale עם אינטרפולציה דו-ליניארית כדי לשפר את הנראות.

כדי לבחון את התועלת של נוהל GRASP למדידת מגעים בין תאי DP ו-PerM, בחנו דיסקי כנף של ארבעה גנוטיפים שונים: דיסקי בקרה שלילית מסוג פרא (גנוטיפ: w1118) שיציגו רק רמות רקע של אוטופלואורסצנטיות בערוץ GFP; דיסקים המבטאים את CD4-spGFP1-10 בשכבת ה-DP, אך חסרים את הטרנסגן CD4-spGFP11, שיראה את רמת הקרינה המיוצרת על ידי GFP1-10 בלבד (שציפינו שתהיה זניחה, מכיוון ש-GFP1-10 לא אמור להאיר26); דיסקים שבהם CD4-spGFP1-10 ו-CD4-spGFP11 באים לידי ביטוי ב-DP ו-PerM, בהתאמה (איור 3A), אשר יחשפו את הרמה ה"נורמלית" של מגע DP-PerM; ודיסקים אשר, בנוסף ל-CD4-spGFP1-10 ו-CD4-spGFP11, מבטאים גם את חלבון קינאז Ser/Thr Slik בתאי DP תחת שליטת UAS . ביטוי סליק בתאי DP מניע התפשטות לא אוטונומית של תאי PerM27. זה גם מניע את היווצרותם של ציטונמים אפיקליים בתאי DP החוצים את לומן הדיסק ונראה שהם יוצרים מגע עם תאי PerM, לעתים קרובות ביציבות21. לפיכך ציפינו שביטוי Slik ישפר את השלמת ה-GFP במערך ניסיוני זה.

הדמיה ברמת ה-PerM בדיסקים מסוג פרא חשפה את הסידור הרגיל של תאים אלה, שהמורפולוגיה הקשקשית שלהם וקצב ההתפשטות הנמוך שלהם מביאים למראה מפוזר של גרעינים (מדומיין על ידי צביעת הוכסט, איור 3B). זוהתה כמות מינימלית של אוטופלואורסצנטיות, בעיקר בצורה של כתמים גרגיריים בעוצמה נמוכה שנטו להיות מקובצים לכיוון מרכז כיס הכנף (איור 3B). דיסקים שמבטאים רק CD4-spGFP1-10 ב-DP נראו דומים מאוד, והפלואורסצנטיות נראתה בעוצמה דומה (איור 3C). השתמשנו ברמת העוצמה של האוטופלואורסצנציה בדיסקי בקרה שלילית כדי לקבוע סף לאותות בניסוי, כאשר פחות מ~0.2% מעוצמות הפיקסלים ברוב תמונות הבקרה השלילית נופלות מעל סף זה. כימות השטח היחסי של אזור כיס הכנף בכל תמונה עם ערכי פיקסלים מעל סף זה אישר כי לא ניתן להבחין ברמת הקרינה מהרקע בדיסקים המבטאים רק CD4-spGFP1-10 (איור 3F).

בדיסקים שמבטאים CD4-spGFP1-10 בכיס הכנף ו-CD4-spGFP11 ב-PerM, ראינו הופעה של כתמים בהירים יותר של פלואורסצנטיות GFP (איור 3D). ב-XZ-reslices של ערימות תמונות דיסק, הכתמים הבהירים יותר הללו התמקמו בלומן הדיסק, שם אנו מצפים שהשלמת ה-GFP תתרחש21. הכימות גילה כי השטח היחסי של אזור כיס הכנף בכל תמונה עם ערכי פיקסלים מעל הסף היה בדרך כלל גדול מ-0.5%, רמה שהייתה גבוהה משמעותית מהבקרות השליליות (איור 3F). תוצאה זו מצביעה על כך שבדרך כלל יש רמה נמוכה של מגע בין תאי DP ו-PerM במהלך התפתחות הדיסק.

ביטוי של סליק בשכבת ה-DP גרם לשינויים דרמטיים במראה ה-PerM. באזור שמעל כיס הכנף שבו התבטא סליק, הייתה עלייה עצומה במספר גרעיני תאי PerM, המשקפת גירוי חזק של התפשטות תאים (איור 3E). הייתה גם הופעה נרחבת של פלואורסצנטיות GFP בעוצמה גבוהה שתואמת את המיקום של התפשטות מוגברת של תאי PerM (איור 3E,F). זה מצביע על כך שהציטונמים האפיקליים שנוצרו בתגובה לסליק אכן יוצרים מגעים קרובים עם תאים ב-PerM, בהתאם לתגובה ההתפשטות של תאים אלה. בעוד שברור מהתוצאות הללו שסליק מקדם מגעי ממברנה-ממברנה DP-PerM, איננו יכולים לשלול שמנגנונים אחרים, כגון שלפוחיות ממברנת DP המופרשות או נשפכות, עשויים לתרום לאפקט.

איור 1: ארגון הדיסק הדמיוני של כנף דרוזופילה . (A) סכמטי של דיסק דמיוני של כנף. התמונה משמאל היא תצוגת פנים (XY), מימין חתך YZ. ה-DP הוא בכחול, כאשר אזור נרתיק הכנף מוצל בכחול כהה יותר. ה-PerM מיוצג על-ידי קו מקווקו שחור בתצוגת XZ. ה-DP וה-PerM סוגרים לומן מרכזי. (B) הקרנת MAX Z של ערימת תמונה קונפוקלית של דיסקת כנף שבה TdTomato myristoylated (אדום) התבטא בכל נרתיק הכנף תחת שליטת דוחף nubbin-GAL4 , ו-GFP גרעיני (GFPnls, ירוק) התבטא ב-PerM בשליטת דוחף PerM-LexA . סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (C) פריסת XZ של ערימת תמונות דיסק כמו ב-B, המראה אי-חפיפה של תחומי הביטוי nubbin-GAL4 ו-PerM-LexA . סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הרכבה של דגימות עם מרווחים עבור הדמיה חיה. תמונות המציגות (A) חיתוך של מרווחי ההדמיה של 8 הבארות, (B) מיקום והדבקה של המרווחים על שקופית מיקרוסקופ זכוכית, ו-(C) מיקום של טיפת מדיום הדמיה חי בתוך החלל המוגן על ידי מרווחי ההדמיה, שבו מותקנים דיסקים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: כימות מגעי הממברנה בין אוכלוסיות תאי DP ו-PerM בדיסק הכנף. (A) סכמטי של מערך הניסוי, עם ביטוי מונע GAL4 של CD4-spGFP1-10 בביטוי מונע DP ו-LexA של CD4-spGFP11 ב-PerM. מגע בין שתי שכבות האפיתל על פני הלומן מביא להשלמת פלואורסצנטיות GFP. (ב-ה) תמונות קונפוקליות המציגות ערוצים ממוזגים של דיסקי כנף חיים המבטאים (B) אף אחד מהחלקים של spGFP (w1118), (C) CD4-spGFP1-10 בשכבת ה-DP בלבד, (D) יחד עם CD4-spGFP11 ב-PerM, או (E) עם CD4-spGFP11 ב-PerM ו-Slik ב-DP. התמונות הן הקרנות MAX Z, עם Hoechst בלבן וערוץ GFP בירוק בתמונות העליונות. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. (F) גרף המייצג את השטח היחסי של הקרינה GFP מעל עוצמת הסף לכל דיסק עבור כל מצב (ממוצע ± סטיית תקן). הנתונים נורמלו למצב CD4-spGFP1-10 + CD4-spGFP11 (קו בסיס). ערכי p חושבו באמצעות השוואה מרובה חד-כיוונית של Welch ANOVA עם Dunnett T3. קיצורים: DP = דיסק תקין; סלסול = קרום פריפודאלי. נתון זה שונה מ-Rambaud et al.21. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר עליהם.