מאמר שיטה

הדפסה ביולוגית של פרוסות גידול הידרוג'ל כמודל תלת מימד ללימפומה של תאי מעטפת

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/68417

⸱

12 בספטמבר 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dr. Margarete Fischer-Bosch Institute of Clinical Pharmacology and University of Tuebingen, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institute, 3Department of Clinical Pathology, Robert Bosch Hospital, 4Robert Bosch Hospital, 5Departments of Clinical Pharmacology, Pharmacy and Biochemistry, University of Tuebingen, 6iFIT Cluster of Excellence (EXC 2180), Image-guided and Functionally Instructed Tumor Therapies, University of Tuebingen, 7German Cancer Consortium (DKTK) and German Cancer Research Center (DKFZ), Partner Site Tuebingen, 8National Center for Tumor Diseases (NCT), NCT South-West, a partnership between DKFZ, University Hospital Tuebingen, University of Tuebingen, Tuebingen, Bosch Health Campus, Stuttgart, Robert Bosch Hospital, Stuttgart, University Hospital Ulm, and Ulm University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של הייצור, התרבית והניתוח של לימפומה של תאי מעטפת בפרוסות גידול הידרוג'ל מודפסות בתלת מימד.

תקציר

לימפומה של תאי מעטפת (MCL) היא ניאופלזמה נדירה ואגרסיבית של תאי B שחוזרת לעתים קרובות ומראה רק תגובה מוגבלת לכימותרפיה קונבנציונלית. אתגר מרכזי במחקר MCL הוא גידול תאי MCL ראשוניים ex vivo, שכן תאים נוטים לעבור אפופטוזיס ספונטני כאשר הם מתורבתים בתרבית תרחיף דו-ממדית. למרות שמודלים תלת מימדיים ידועים כמסכמים טוב יותר את המצב in vivo של גידולים מוצקים, היישום שלהם עדיין נחקר בצורה גרועה בלימפומות. פיתוח מודלים תלת מימדיים המשכפלים את תנאי ה-in vivo של MCL בתוך בלוטת הלימפה יכול לשפר את הישרדותם, להקל על חקר המיקרו-סביבה של MCL-גידול ולחקות את תגובת התרופות in vivo . כאן, הוקם מודל מודפס בתלת מימד של MCL בצורת פרוסות גידול הידרוג'ל, יחד עם שיטת תרבית אופטימלית. פותח תהליך סטנדרטי באמצעות קווי תאי MCL או תאי MCL ראשוניים, שבו התאים טובלים בהידרוג'ל המכיל אלגינט, קולגן מסוג I ומטריצת ממברנת הבסיס על ידי הדפסה ביולוגית לאמבט תמיכה בג'לטין. פרוסות גידול ההידרוג'ל MCL המתקבלות מתורבתות על תומך מסנן כדי לשמור על יציבותן לאורך כל תקופת התרבית. ניתן ליישם טיפולים תרופתיים על המערכת. ניתן לעקוב אחר התגובה של תאים בודדים בתוך פרוסת גידול ההידרוג'ל על ידי הדמיה פלואורסצנטית תלת מימדית חיה בארבעה צבעים. תאי MCL ראשוניים הראו כדאיות יציבה כאשר תרבית בפרוסות גידול ההידרוג'ל. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של הייצור, התרבית והניתוח של תאי MCL בפרוסות גידול הידרוג'ל. על ידי חיקוי הדוק של מיקרו-סביבת הגידול ושימוש בתרבית ממשק אוויר-נוזל, המודל המוצג משפר את הרלוונטיות הפיזיולוגית בהשוואה לתרבות הדו-ממדית המסורתית. הוא מציע פוטנציאל משמעותי לקידום מחקרים ביולוגיים וטיפוליים של MCL.

מבוא

לימפומה של תאי מעטפת (MCL) היא לימפומה נדירה ואגרסיבית של תאי B שאינה הודג'קין שמקורה באזור המעטפת של בלוטות הלימפה1. אזור המעטפת מורכב מטבעת של לימפוציטים קטנים המקיפה את מרכז הנבט של זקיק תאי B. בדרך כלל, MCL מראה מהלך קליני אגרסיבי, עם הישנות תכופות לאחר הכימותרפיה הראשונית. בשל הבנה משופרת של היווצרות מחלה1 ופיתוח טיפולים חדשים, כולל אימונוכימותרפיה2, מעכבי טירוזין קינאז3 של ברוטון או צימודי נוגדנים-תרופות4, אפשרויות הטיפול בחולי MCL הובילו לשיפור בשיעורי התגובה והישרדות ממושכת ללא התקדמות. עם זאת, עמידות לתרופות והישנות עדיין הופכות את המחלה לחשוכת מרפא5. חלקית, זו תוצאה של ההטרוגניות שלו והשפעת המיקרו-סביבה של הגידול על התפתחות הגידול ועמידות לתרופות6. אתגר בחקר MCL הוא הקושי לטפח תאי MCL ראשוניים בתרבית תרחיף7, שכן תאים עוברים אפופטוזיס ספונטני ex vivo 4,5. זה מדגיש את הצורך בגישות חלופיות למודל טוב יותר של MCL במודלים פרה-קליניים.

in vivo, גידולים הם מבנים תלת מימדיים (3D) המורכבים ממרכיבים תאיים שונים, כולל תאי גידול, תאי חיסון ותאי סטרומל, כמו גם רכיבים לא תאיים כגון המטריצה החוץ-תאית (ECM). ה-ECM, המורכב ממקרומולקולות כמו קולגן ולמינין, יוצר רשת סיבית מורכבת של סיבים אלסטיים שהיא הידרופילית מאוד, ויוצרת סביבה דמוית ג'ל 2,8,9,10. כדי לשכפל טוב יותר את אלה בתנאי in vivo של גידולים ex vivo, פותחו מגוון מודלים תלת מימדיים. בשנים האחרונות, מודלים אלה הפכו חיוניים לחקר פרמקולוגיה וביולוגיה של סרטן, תוך התמקדות בעיקר בגידולים מוצקים11.

נכון להיום, תחום זה נותר נחקר בצורה גרועה בלימפומות, מכיוון שלתאי סרטן המטולוגיים יש יכולת לגדול הן בתרחיף והן בסביבה סטרומלית כמו בלוטות לימפה, מח העצם או רקמות לימפה משניות12. in vivo, תאי MCL מתפשטים מאזור המעטפת של בלוטות הלימפה לדם או למח העצם, אם כי הם מתרבים בעיקר בתוך בלוטות הלימפה שמהן הם מקורם13,14. בתוך בלוטות הלימפה, תאי MCL מוקפים בתאי T, מקרופאגים ותאי סטרומה מזנכימליים, שכולם הוכחו כשולטים בהישרדות או בתגובה לתרופות של תאי MCL 14,15,16,17,18. יתר על כן, המיקרו-סביבה של MCL-גידול, כמו גם הנקבוביות והתכונות המכניות, הם גורמים חשובים שיכולים להשפיע על תגובות התרופות והעמידות 6,14. לפיכך, נדרשים מודלים תלת-ממדיים סטנדרטיים וניתנים לשחזור של MCL המדמים את המיקרו-סביבה המקומית כדי לחקור MCL ראשוני. עד כה, הוקמו בעיקר מודלים מבוססי תאים כגון ספרואידים או אורגנואידים של תאי MCL ראשוניים 6,19. הם משפרים בהצלחה את הכדאיות והתרבות ארוכת הטווח של תאי MCL ראשוניים. עם זאת, המטריצה החוץ-תאית אינה מיוצגת במודלים אלה. בהקשר זה, הדפסה ביולוגית תלת מימדית מתקדמת מציעה גישה מבטיחה. על ידי הרכבה ישירה של תאים חיים והידרוג'לים, טכנולוגיה זו מאפשרת יצירת מודלים של בלוטות לימפה תלת מימדיות מבוססות הידרוג'ל רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.

כאן, הוקם מודל מודפס ביולוגי תלת מימדי של MCL בצורת פרוסות גידול הידרוג'ל, יחד עם שיטת תרבית אופטימלית. התאים מוטבעים בפרוסות הידרוג'ל מבוססות קולגן מסוג I, אלגינט ומטריגל על ידי הטבעה הפיכה בצורה חופשית של הידרוג'לים מרחפים (FRESH) הדפסה ביולוגית20. פרוסות גידול ההידרוג'ל מתורבתות על תומך מסנן, המאפשר לתאי MCL לגדול בסביבה המסכמת מקרוב את תנאי ה-in vivo של בלוטת הלימפה.

פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של הייצור, התרבות והניתוח של תאי MCL בפרוסות גידול הידרוג'ל. על ידי שימוש בהדמיה פלואורסצנטית תלת מימדית חיה בארבעה צבעים, ניתן לעקוב אחר הכדאיות או התגובה לתרופות של תאים בודדים בתוך פרוסת גידול ההידרוג'ל. תאי MCL ראשוניים הראו הישרדות משופרת כאשר תרבית בפרוסות גידול ההידרוג'ל. מודל זה מספק כלי לחקר הביולוגיה של MCL והתגובה לטיפול, וסולל את הדרך להבנת השפעות מיקרו-סביבתיות ושונות חולי MCL.

פרוטוקול

העבודה עם תאי MCL ראשוניים צריכה להיות מאושרת על ידי ועדת האתיקה המקומית. במחקר זה, ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת אברהרד-קרלס ובית החולים האוניברסיטאי טובינגן אישרה איסוף ועבודה של דגימות חולים ותורמים בריאים (מספר פרויקט 159/2011BO2), והתקבלה הסכמה מדעת בכתב מהמטופלים בהתאם להצהרת הלסינקי. תאי ה-MCL העיקריים ששימשו כאן בודדו מבלוטות לימפה שלמות של חולי MCL וכך כללו לא רק תאי MCL, אלא גם תאים אחרים כגון תאי חיסון ופיברובלסטים.

1. הכנת תמיסת ג'לטין לאמבט התמיכה

הערה: תמיסת הג'לטין תשמש כאמבט התמיכה במהלך תהליך ההדפסה הביולוגית התלת מימדית. זה גורם לקישור צולב של הדיו הביולוגי, ומאפשר היווצרות של מבנה תלת מימדי. הכנת תמיסת הג'לטין צריכה להתבצע בתנאים סטריליים בתוך מכסה המנוע של תרבית תאים.

  1. הכן תמיסת ג'לטין של 4.5% (w/v) ב-10 מ"מ HEPES ו-11 מ"מ CaCl2 על ידי המסת 6.75 גרם אבקת ג'לטין ב-1.5 מ"ל של 1 מ"ל של 1 M HEPES, 15 מ"ל של 110 מ"מ CaCl2 ו-133.5 מ"ל של H2O סטרילי בצנצנת מייסון סטרילית עם מכסה. ודא שצנצנת מייסון מתאימה לערבוב במיקסר בעל ביצועים גבוהים.
  2. דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או עד שלא נצפו מריחות בעת ערבוב התמיסה, מה שמעיד על כך שהג'לטין מומס לחלוטין. מצננים את הג'לטין בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או למשך 12 שעות לפחות.
  3. הכן מאגר כביסה סטרילי המורכב מ-10 מ"מ HEPES ו-14.4 מ"מ CaCl2. יש לקרר מראש את מאגר הכביסה ל-4 מעלות צלזיוס.
  4. שוברים את הג'לטין המוצק 4.5% למספר חתיכות בעזרת כף סטרילית.
  5. מלאו את צנצנת מייסון המכילה את הג'לטין 4.5% לחלוטין עם מאגר הכביסה שהתקרר מראש, והבטיחו שהמאגר יישאר קר לאורך כל תהליך הכנת תמיסת הג'לטין.
  6. הקפיאו את צנצנת מייסון המכילה ג'לטין בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 45-60 דקות, עד שתרחיף הג'לטין מגיע ל-0 מעלות צלזיוס, אך עדיין לא התחיל ליצור גבישי קרח. השתמש במדחום כדי לפקח על הטמפרטורה.
  7. חבר את מכסה המיקסר והלהב לצנצנת מייסון, ולאחר מכן הרכיב את צנצנת מייסון על המיקסר. מערבבים את מתלה הג'לטין למשך 120 שניות באמצעות הגדרת הדופק.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את הגדרות הבלנדר בעת שימוש בבלנדר מסוג אחר.
  8. העבירו את המתלה המעורבב לצינורות מקוררים מראש של 50 מ"ל. צנטריפוגה ב-3,800 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. ודא שהמתלה מופרד לתמיסת ג'לטין מוצקה בתחתית ולמאגר הכביסה הנוזלי בחלקו העליון.
  9. בצע את השלב הבא על קרח: שטפו את תמיסת הג'לטין. שאפו את שכבת הנוזל העליונה, ונסו להסיר את הבועות הנראות על גבי מאגר הכביסה. הוסף 20 מ"ל של מאגר כביסה טרי ב-4 מעלות צלזיוס לשפופרת. מערבל את הצינור כדי לערבב את תמיסת הג'לטין עם מאגר הכביסה.
  10. חזור על תהליך הצנטריפוגה והכביסה לפחות פי 3, או עד שלא נראות בועות בחלק העליון של מאגר הכביסה. לאחר הכביסה הסופית, הסר את כל שאריות מאגר הכביסה על ידי שאיפה. ניתן לאחסן את תמיסת הג'לטין בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.

2. הכנת דיו ביולוגי עמוס תאים

  1. הכן תמיסת אלגינט סטרילית של 5% 1-2 ימים לפני ההדפסה. הוסף 1 גרם אלגינט ל-20 מ"ל PBS סטרילי בצינור של 50 מ"ל. כדי למנוע שאריות אבקת אלגינט יבשות, הוסף את ה- PBS במרווחים קטנים, מערבולת בין תוספות. דגרו את התמיסה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות או למשך הלילה על גלגלת צינור בטמפרטורת החדר. לאחר המסה מלאה של האלגינט, אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.
  2. אם עובדים עם קו תאי MCL, תרבית את התאים בתרחיף בבקבוק T75. ביום ההדפסה, וודאו כי 1.4 x 107 תאים זמינים להכנת 1 מ"ל דיו ביולוגי, שיניב 9-10 פרוסות גידול הידרוג'ל.
  3. אם עובדים עם תאי MCL ראשוניים, אין צורך לתרבית תאים בתרבית תרחיף לפני הדפסה ביולוגית. הפשירו את תאי ה-MCL הראשוניים שנשמרו בהקפאה ישירות לפני ההדפסה הביולוגית. העבירו את תאי ה-MCL הראשוניים לצינור של 50 מ"ל עם מדיום תרבית. כדי להסיר את אמצעי ההקפאה שנותר, צנטריפוגה מיד את הצינור ב-340 x גרם למשך 5 דקות, ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את גלולת התא ב-20 מ"ל של מדיום טרי לספירת תאים.
  4. ביום ההדפסה, הכינו את הדיו הביולוגי המותאם לתאים המעניינים. עבור תאי Jeko-1, הכינו דיו ביולוגי המורכב מ-0.5% (w/v) אלגינט, 20% (v/v) קולגן מסוג I, 1x RPMI ו-2 מ"מ HEPES. מערבבים 100 מיקרוליטר של 5% אלגינט, 200 מיקרוליטר של קולגן מסוג I, 100 מיקרוליטר של 10x RPMI, 200 מיקרוליטר של 10 מ"מ HEPES ו-350 מיקרוליטר של PBS עבור 1 מ"ל דיו ביולוגי. תאים יתווספו בשלב 2.6.
  5. עבור תאי MCL ראשוניים, הכינו דיו ביולוגי המורכב מ-0.5% (w/v) אלגינט, 20% (v/v) קולגן מסוג I, 1x RPMI ו-0.5 מ"מ HEPES. מערבבים 100 מיקרוליטר של 5% אלגינט, 200 מיקרוליטר של קולגן מסוג I, 100 מיקרוליטר של 10x RPMI, 50 מיקרוליטר של 10 מ"מ HEPES ו-500 מיקרוליטר של מטריצת ממברנת הבסיס עבור 1 מ"ל דיו ביולוגי. תאים יתווספו בשלב 2.6. אם עובדים עם קו תאים MCL, העבירו את תרחיף התאים מבקבוק התרבות לצינור של 50 מ"ל.
  6. מערבבים את התאים עם 0.4% טריפן כחול ביחס של 1:1. ספרו את התאים הקיימים (לא מוכתמים) באמצעות מונה תאים או תא נויבאואר. חשב את נפח תרחיף התאים עבור 1 מ"ל דיו ביולוגי, השווה ל -1.4x107 תאים. העבירו את הנפח המחושב לצינור חדש של 50 מ"ל. צנטריפוגה ב -340 x גרם למשך 5 דקות, ואז הסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את גלולת התא בדיו הביולוגי המוכן כדי ליצור את הדיו הביולוגי הסופי עמוס התאים.
    הערה: ההערכה הייתה שלכדור התא יש נפח של 50 מיקרוליטר מדיום. יחד עם הדיו הביולוגי שהוכן בשלב 2.4, זה יניב 1 מ"ל דיו ביולוגי.

3. הדפסה ביולוגית באמבטיה

הערה: במידת האפשר, בצע את תהליך הדפסת התלת מימד בסביבה סטרילית, כגון מתחת למכסה המנוע של תרבית תאים. מדפסת התלת מימד ששימשה שונתה להדפסת FRESH על ידי הוספת מאריך משאבת מזרק, כמתואר בהינטון ואחרים 20.

  1. הפעל את המדפסת הביולוגית וחבר אותה לתוכנת מדפסת התלת מימד. פתח את קובץ ה- .stl המכיל את התוכנית עבור פרוסות גידול ההידרוג'ל. ניתן להדפיס עד 5 פרוסות בו זמנית. ודא שלכל פרוסת גידול הידרוג'ל יש קוטר של 8 מ"מ וגובה של 1.5 מ"מ. הגדר את צפיפות המילוי ל- 85%. בית את ראש המדפסת.
    הערה: קובץ STL תוכנן עם Fusion 360 וניתן למצוא אותו בקובץ הקידוד המשלים 1. להדפסת תלת מימד נעשה שימוש בתוכנה Cura גרסה 15.04.5.
  2. מעבירים את תמיסת הג'לטין שהוכנה בעבר לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ עד שהיא מלאה למחצה. ודא שלא יישארו פערי אוויר בתמיסת הג'לטין. משוך עודפי מים מהתרחיץ באמצעות מגבונים מדויקים חד פעמיים כדי ליצור אמבט תמיכה בג'לטין, שהוא דביק ושומר על הצורה עד להפעלת כוח מספיק.
  3. העבירו את הדיו הביולוגי עמוס התאים למזרק זכוכית של 2.5 מ"ל וחברו אותו לזרבובית קהה של 0.8 מ"מ. הפוך את המזרק והוציא בזהירות עודפי אוויר ובועות אוויר. לאחר הכנת המזרק, הכנס אותו למדפסת הביולוגית. באמצעות תוכנת מדפסת התלת מימד, הוצא דיו ביולוגי עד שהוא מתחיל להיפלט מהזרבובית. נגב את טיפת הדיו הביולוגית שנפלטה באמצעות מגבון חד פעמי למניעת סתימת הזרבובית.
  4. הנח את אמבט התמיכה בג'לטין ממש מתחת לפיית המזרק. הורד את ראש המדפסת עד שהזרבובית ממוקמת בתוך תמיסת הג'לטין, 2 מ"מ מעל החלק התחתון של אמבט התמיכה.
  5. התחל את תהליך ההדפסה באמצעות תוכנת מדפסת התלת מימד.
  6. לאחר השלמת תהליך ההדפסה, הסר את כל תמיסת הג'לטין העודפת מהזרבובית כדי למנוע סתימה. הוצא את אמבט התמיכה המכיל את פרוסות גידול ההידרוג'ל וכסה אותו במכסה לשמירה על סטריליות.
  7. דגרו את אמבט התמיכה המכיל את פרוסות גידול ההידרוג'ל המודפסות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לג'לטין להמיס. שלב זה ישחרר את פרוסות גידול ההידרוג'ל המודפסות מאמבט התמיכה.
  8. מחממים מראש את מאגר הכביסה ואת מדיום תרבית התאים ל-37 מעלות צלזיוס. בזמן שהג'לטין נמס, הכינו צלחת בת 6 בארות לשטיפת פרוסות גידול ההידרוג'ל. מלאו שתי בארות עם 10 מ"מ HEPES, 14.4 מ"מ CaCl2 מאגר כביסה (אותו מאגר המשמש לשטיפת תמיסת הג'לטין), ושתי בארות עם מדיום תרבית תאים.
  9. לאחר שהג'לטין נמס, השתמש במרית סטרילית כדי להעביר את פרוסות גידול ההידרוג'ל למאגר הכביסה. שוטפים את הפרוסות במשך דקה אחת כל אחת, תחילה בשתי הבארות המכילות מאגר כביסה, ולאחר מכן בשתי הבארות המכילות מדיום. פרוסות גידול ההידרוג'ל העמוסות בתאים מוכנות כעת לתרבית.
  10. שמור את הדיו הביולוגי שנותר כדי לחזור על תהליך ההדפסה.

4. תרבית פרוסות גידול הידרוג'ל וטיפול בהן

  1. כדי לתרבית את פרוסות ההידרוג'ל, העבירו אותן לתמיכת פילטר (גודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר) המונחת בתוך צלחת של 6 בארות. תרבית עד 5 פרוסות הידרוג'ל על תומך פילטר יחיד. הוסף 1.5 מ"ל של מדיום תרבית תאים מתחת לתמיכת המסנן. הוסף טיפת מדיום על גבי פרוסות גידול ההידרוג'ל כדי למנוע מהן להתייבש.
  2. לטיפול תרופתי בפרוסות גידול הידרוג'ל, הוסף את הכמות הרצויה של התרופה למדיום תרבית התאים. כאן, פרוסות גידול הידרוג'ל טופלו ב-0.33 מיקרומטר-27 מיקרומטר דוקסורוביצין למשך 48 שעות או 72 שעות. תמיד תרבית קבוצה של פרוסות ללא טיפול כבקרה.
  3. מניחים את צלחת 6 הבארות עם פרוסות גידול ההידרוג'ל בחממת תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לתקופת הגידול הרצויה.

5. ניתוח כדאיות של תאים על ידי בדיקת אי הכללת טריפאן כחול

  1. כדי להעריך את כדאיות התאים לאחר תרבית או טיפול, ממיסים את פרוסות גידול ההידרוג'ל. העבירו פרוסת גידול הידרוג'ל לצינור של 1.5 מ"ל. הוסף 500 מיקרוליטר לכל פרוסה של מאגר ממיס המכיל 30 מ"מ EDTA, 55 מ"מ נתרן ציטראט ו-150 מ"מ נתרן כלורי (pH 6.8). פיפטה למעלה ולמטה עד שההידרוג'ל נמס לחלוטין.
  2. צנטריפוגה את התמיסה ב -340 x גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט. השעו מחדש תאים ב-500 מיקרוליטר של מדיום לכל פרוסת הידרוג'ל מומסת.
  3. מערבבים את תרחיף התאים ביחס של 1:1 עם 0.4% טריפאן כחול. ספרו את התאים הקיימים (הלא מוכתמים) והמתים (מוכתמים) בעזרת מונה תאים או תא נויבאואר. רשום את מספר התאים החיים והמתים להמשך ניתוח.

6. הדמיית פלואורסצנציה תלת מימדית חיה בארבעה צבעים

הערה: הצביעה בארבעת הצבעים המשמשת כאן מאפשרת התמיינות בין תאים חיים (חיוביים ל-TMRM), תאים אפופטוטיים (חיובי ל-Caspase-3 פלואורוגני) ותאים מתים (חיוביים ל-PicoGreen)21,22,23. גרעינים מזוהים עם DRAQ5. עם זאת, פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם לכל צבע פלואורסצנטי ספציפי אחר הניתן לאור כדי לזהות את הסמנים הביולוגיים, המבנים התאיים או סוגי התאים הנבחרים. לפני הצביעה, ודא שהמיקרוסקופ מסוגל לזהות את אורכי הגל של הפלואורופורים המשמשים לצביעה.

  1. לצביעה בארבעה צבעים של פרוסת גידול הידרוג'ל, הכינו תמיסת צביעה על ידי הוספת TMRM, DRAQ5 ומצע Caspase-3 פלואורוגני ל-1 מ"ל של מדיום תרבית תאים בריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר, 5 מיקרומטר ו-2 מיקרומטר, בהתאמה.
  2. בעזרת מרית סטרילית, העבירו פרוסת גידול הידרוג'ל לכיסוי זכוכית תא. מוסיפים את תמיסת הצביעה המוכנה על גבי פרוסת ההידרוג'ל עד לכיסוי מלא. דגרו את הדגימה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך.
  3. לאחר הדגירה הראשונית, יש לאסוף את תמיסת הצביעה המכסה את פרוסת גידול ההידרוג'ל ולהוסיף 0.7 μL/mL PicoGreen. יש להחזיר את תמיסת הצביעה לפרוסת ההידרוג'ל ולדגור למשך 10 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך.
  4. לאחר הדגירה, הסר בזהירות את המדיום העודף תוך השארת מספיק תמיסת מכתים כדי לשמור על פרוסת ההידרוג'ל לחה.
  5. נתח את הפרוסה מיד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. כדי למנוע פוטוטוקסיות ופוטו-הלבנה, צמצם את מינון הפוטון המופעל על ידי הפחתת עוצמת הלייזר וזמן העירור. ניתן למצוא את ספקטרום העירור/פליטה של הכתמים שתוארו לעיל בטבלה 1.
  6. כדי לקבל סקירה כללית של ההתפלגות התאית של התא בהידרוג'ל, לכוד חתכי z. אם נלקחו חתכי z במהלך ההדמיה, צור שחזורים תלת מימדיים של פרוסות גידול ההידרוג'ל באמצעות התוכנה המתאימה. שחזורים אלה יאפשרו ניתוח יסודי של ההתפלגות המרחבית והמצב התאי של התאים בפרוסות גידול ההידרוג'ל.
  7. בצע את ההוראות וקובץ ה- Script המופיעים בקובץ משלים 1 ובקובץ משלים 2 כדי לבצע פילוח ושחזור תאים.

תוצאות

פרוסות גידול ההידרוג'ל המכילות תאי MCL נוצרו עם הפרוטוקול שתואר לעיל. שלבי זרימת העבודה להדפסת תלת מימד ותרבית פרוסות גידול ההידרוג'ל מוצגים באיור 1A. מדפסת התלת מימד ששימשה שונתה להדפסת FRESH על ידי הוספת מאריך משאבת מזרק כמתואר בהינטון ואחרים 20 (איור 1B). עד חמש פרוסות הודפסו בבת אחת (איור 1C) ותורבו על תומך מסנן אחד (איור 1D). מדיום נוסף מתחת לתמיכת המסנן כדי לספק אספקת חומרים מזינים לפרוסות גידול ההידרוג'ל. טיפת מדיום נוספה על גבי כל פרוסת גידול הידרוג'ל כדי למנוע מהם להתייבש. סקירה כללית של חמש פרוסות גידול הידרוג'ל שתרבית על תומך מסנן אחד מוצגת באיור 1E, יחד עם תמונות תקריב של פרוסת הידרוג'ל. במהלך תקופת תרבית של 3 ימים, פרוסות גידול ההידרוג'ל היו יציבות ושמרו על המבנה שלהן (איור 2A). מיד אחרי ההדפסה, בועות אוויר היו נוכחות בפרוסות גידול ההידרוג'ל, אולם הן נעלמו במהלך הגידול (איור 2A).

הכדאיות של קו תאי MCL Jeko-1 שתורבת בפרוסות גידול הידרוג'ל (3D) בהשוואה לתאי Jeko-1 שגודלו בתרבית תרחיף (2D) הוערכה על ידי בדיקת אי הכללה כחולה של טריפן (איור 2B). לאחר 3 ימי תרבית, 80% מהתאים היו ברי קיימא, בהשוואה לכדאיות ראשונית של 88% מתאי Jeko-1 לפני ההדפסה. תאי Jeko-1 שגודלו בדו-ממד שמרו על הכדאיות הראשונית של 88%. לא היה הבדל משמעותי בין תאי Jeko-1 שגודלו בדו-ממד ובתלת-ממד. כדי להעריך אם תאי Jeko-1 מתרבים בפרוסות ההידרוג'ל, נקבע מספר התאים הממוצע של תאי Jeko-1 לכל פרוסת הידרוג'ל (איור 2C). בעוד ש-5x105 תאי Jeko-1 נכללו בכל פרוסה מיד לאחר ההדפסה (d0), מספר זה כמעט הוכפל ל-9.3x105 תאים לאחר 3 ימי תרבית.

התפוצה והסטטוס של תאי Jeko-1 שגודלו בפרוסות הידרוג'ל הוערכו על ידי הדמיה פלואורסצנטית חיה בארבעה צבעים (איור 2D) מיד לאחר ההדפסה או לאחר 3 ימי תרבית. לאחר ההדפסה, שחזורים תלת-ממדיים של פרוסות ההידרוג'ל Jeko-1 הראו התפלגות הומוגנית של תאים. רוב התאים היו חיוביים ל-TMRM, סמן לפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית22. מיעוט התאים היו חיוביים לפעילות Caspase-3, סמן לאינדוקציה של אפופטוזיס23, כמו גם לסמן התאים המתים PicoGreen21. לאחר 3 ימי תרבית, נצפתה עלייה במספר התאים לצד היווצרות אשכולות תאים. רוב התאים נשארו חיוביים ל-TMRM, בעוד שרק תאים מעטים נצבעו חיוביים לפעילות Caspase-3 או PicoGreen (איור 2C).

כדי לנתח אם תאי MCL בפרוסות הידרוג'ל מגיבים לכימותרפיה, תאי Jeko-1 שגודלו בתרבית תרחיף (2D) או בפרוסות הידרוג'ל (3D) טופלו בתרופה הכימותרפית Doxorubicin, שהיא חלק מהטיפול הסטנדרטי בחולי MCL24. המבנה הכללי של פרוסות ההידרוג'ל נשמר במהלך הטיפול בדוקסורוביצין (איור 3A). הכדאיות של תאי Jeko-1 שגודלו בפרוסות הידרוג'ל ירדה במינון בהתאם לטיפול בדוקסורוביצין. ה-IC50 של דוקסורוביצין בתאי ג'קו-1 גדל כאשר תאים תרבית בפרוסות הידרוג'ל (IC50=5.8 מיקרומטר) בהשוואה לתאי ג'קו-1 שגודלו בתרבית תרחיף דו-ממדית (IC50=2.0 מיקרומטר; איור 3B). הדמיה פלואורסצנטית חיה בארבעה צבעים הראתה TMRM מופחת ואות PicoGreen מוגבר בתאי Jeko-1 שגודלו בפרוסות הידרוג'ל בתגובה לטיפול בדוקסורוביצין, מה שאישר ירידה בכדאיות הנגרמת על ידי הטיפול. תמונות שהתקבלו מהדמיה פלואורסצנטית חיה בארבעה צבעים שוחזרו בתלת מימד, פולחו על סמך אות גרעיני DRAQ5, ונותחו באמצעות סקריפט Python המתואר בקובץ משלים 1. מסכת סגמנטציה לדוגמה מוצגת באיור משלים 1. מספר התא שזוהה מהאות DRAQ5 שימש לקביעת מספר התא הכולל. מספר התאים החיובי לפעילות TMRM, PicoGreen ו-Caspase-3 שימש לזיהוי אחוז התאים בני הקיימא, המתים או האפופטוטיים, בהתאמה. כימות של צביעת פלואורסצנטיות חיה בארבעה צבעים של תאי Jeko-1 שגודלו בפרוסות הידרוג'ל במשך 3 ימים עם או בלי 9 מיקרומטר דוקסורוביצין הראו כדאיות דומה לבדיקת אי הכללת הטריפן הכחול (טבלה 2).

בנוסף לקווי תאי MCL מבוססים, תאי MCL ראשוניים של שלושה חולי MCL שונים תורבבו בתרבית תרחיף דו-ממדית או בפרוסות הידרוג'ל תלת-ממדיות (איור 4, איור משלים 2). כפי שאומת על ידי פתולוג, כל שלושת ה-MCL (מטופל 1-3) היו בעלי מורפולוגיה קלאסית/שכיחה עם מדדי Ki67 של 20%-50%. תאי ה-MCL הראשוניים כללו את כל סוגי התאים שבודדו מבלוטות הלימפה של חולי MCL ולכן הכילו לא רק תאי MCL אלא גם סוגים אחרים של תאי חיסון או תאי סטרומל. הכדאיות של פרוסות ההידרוג'ל הראשוניות של MCL הוערכה על ידי מבחן ההדרה הכחולה של טריפאן. לאחר 4 ימים של תרבית, תאי MCL ראשוניים בפרוסות הידרוג'ל שמרו על כדאיות של 43.6% (45.7% ביום השלישי) בהשוואה לכדאיות בסיסית של 71.0% לפני ההדפסה (איור 4A). זה מייצג כדאיות מוגברת בהשוואה לתאים שגודלו בתרחיף (2D), שהיו בעלי הישרדות של 19.6% לאחר ארבעה ימי תרבית (28.4% ביום השלישי). כדאיות זו הודגמה על ידי הדמיה פלואורסצנטית חיה בארבעה צבעים, שבה רוב התאים היו חיוביים ל-TMRM וברי-קיימא, בעוד שתת-אוכלוסייה הייתה חיובית לפעילות Caspase-3 ו-PicoGreen, מה שמצביע על אפופטוזיס ומוות תאי, בהתאמה (איור 4B). נתוני הכימות של איור 4B מוצגים בטבלה 2. תאים ראשוניים משני חולי MCL נוספים הראו הישרדות מוגברת של תאים בתרבית בפרוסות ההידרוג'ל (3D) בהשוואה לתרבית התרחיף הדו-ממדית המתאימה (איור משלים 1).

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה של הדפסת תלת מימד של פרוסות גידול הידרוג'ל.(A) זרימת עבודה של הדפסת תלת מימד ותרבית של תאים בפרוסות גידול הידרוג'ל. (B) מערך מדפסת המשמש להדפסה ביולוגית תלת-ממדית של פרוסות הידרוג'ל באמבט תומך ג'לטין. (ג) הדפסת שרטוט בתוכנת מדפסת התלת מימד. עד חמש פרוסות הידרוג'ל הודפסו בבת אחת. (D) ייצוג סכמטי של תרבית פרוסות ההידרוג'ל. פרוסות הידרוג'ל תורבבו על תומך פילטר בצלחת של 6 בארות. טיפת מדיום נוספה על גבי כל פרוסת הידרוג'ל כדי לשמור על הלחות שלהם. ניתן לתרבית עד חמש פרוסות הידרוג'ל על תומך מסנן אחד. (E) פרוסות הידרוג'ל מודפסות בתלת-ממד בתרבית על תומך מסנן, כפי שמוצג בתמונת סקירה או בתמונות תקריב. פסי קנה המידה מייצגים 5 מ"מ, 1 מ"מ או 200 מיקרומטר כפי שמצוין. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תרבית של קו תאים של לימפומה של תאי מעטפת (MCL) בפרוסות הידרוג'ל מודפסות בתלת מימד.(A) תקריב של פרוסת הידרוג'ל מייצגת המכילה את קו תאי ה-MCL Jeko-1 לאחר הדפסה (d0) או לאחר 3 ימי תרבית (d3). סרגל קנה המידה מייצג 1 מ"מ. (B) כדאיות של תאי Jeko-1 שגודלו בתרחיף (2D) או בפרוסות הידרוג'ל (3D) למשך יומיים כפי שהוערך על ידי בדיקת אי הכללה כחולה של טריפאן. מוצג ממוצע ± SD של שלושה ניסויים עצמאיים בהדפסה ביולוגית. (C) מספר תא Jeko-1 הכלול בכל פרוסת הידרוג'ל מיד לאחר ההדפסה (d0) או לאחר עד 3 ימי תרבית (d1-d3). מוצג ממוצע ± SD של שלושה ניסויים עצמאיים בהדפסה ביולוגית. לא נצפה הבדל מובהק סטטיסטית (n.s., p > 0.05, מבחן מאן-וויטני). (D) שחזור תלת מימדי של פרוסות הידרוג'ל Jeko-1 ביום ההדפסה (d0) או אחרי 3 ימי תרבית (d3). המודל נוצר מערימות z של הדמיה פלואורסצנטית תלת מימדית חיה בארבעה צבעים. תאים חיים מוצגים באדום (TMRM), תאים אפופטוטיים בצהוב (פעילות אנזימטית Caspase-3), תאים מתים בירוק (PicoGreen) וגרעינים בכחול (DRAQ5). סרגל קנה המידה מייצג 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: טיפול תרופתי בקו תאי לימפומה של תאי מעטפת (MCL) בפרוסות הידרוג'ל. (A) תקריב של פרוסת הידרוג'ל מייצגת שמכילה את קו תאי ה-MCL Jeko-1 שטופל ב-3 מיקרומטר דוקסורוביצין במשך 3 ימים (d3). סרגל הסולם מייצג 1 מ"מ. (B) תאי Jeko-1 שגודלו בתרחיף (2D) או בפרוסות הידרוג'ל (3D) טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של החומר הכימותרפי Doxorubicin במשך יומיים. כדאיות התאים הוערכה על ידי בדיקת אי הכללת טריפאן כחול. מוצג ממוצע ± SD של ארבעה ניסויים עצמאיים בהדפסה ביולוגית. (C) שחזור תלת מימדי של פרוסות הידרוג'ל Jeko-1 שטופלו ב-9 מיקרומטר דוקסורוביצין (Doxo) במשך 3 ימים (d3). המודל נוצר מערימות z של הדמיה פלואורסצנטית תלת מימדית חיה בארבעה צבעים. תאים חיים מוצגים באדום (TMRM), תאים אפופטוטיים בצהוב (פעילות אנזימטית Caspase-3), תאים מתים בירוק (PicoGreen) וגרעינים בכחול (DRAQ5). סרגל קנה המידה מייצג 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תרבית של תאי MCL ראשוניים בפרוסות הידרוג'ל מודפסות בתלת-ממד. (A) כדאיות של תאי MCL ראשוניים שגודלו בתרחיף (2D) או בפרוסות הידרוג'ל (3D) למשך עד 4 ימים, כפי שהוערך על ידי בדיקת אי הכללה כחולה של טריפאן. מוצגת כדאיות ממוצעת של ניסוי אחד. (B) שחזור תלת מימדי של תאי MCL ראשוניים שגודלו בפרוסות הידרוג'ל (3D) במשך 3 ימים. ערימות Z נוצרו מפרוסות הידרוג'ל שהוכתמו בצביעה חיה בארבעה צבעים ונותחו באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM). תאים חיים מוצגים באדום (TMRM), תאים אפופטוטיים בצהוב (פעילות אנזימטית Caspase-3), תאים מתים בירוק (PicoGreen) וגרעינים בכחול (DRAQ5). סרגל קנה המידה מייצג 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

כתםTMRMDRAQ5מצע NucView405 Caspase-3פיקוגרין
עירור / פליטה548 ננומטר/574 ננומטר647 ננומטר/681 ננומטר429 ננומטר / 469 ננומטר488 ננומטר / 520 ננומטר

טבלה 1: מקסימום עירור/פליטה של הכתמים המשמשים להדמיית פלואורסצנציה תלת מימדית חיה בארבעה צבעים.

לדוגמה% מהתאים
TMRM (תאים ברי קיימא)PicoGreen (תאים מתים)Caspase-3 (תאים אפופטוטיים)
Jeko-1 Ctrl8323.618.3
ג'קו-1 דוקסו 9 מיקרומטר27.681.386.6
מטופל MCL ראשי 175.231.133.1

טבלה 2: כימות של שחזורים תלת מימדיים של צביעה חיה בארבעה צבעים של פרוסות גידול הידרוג'ל מתורבתות. פרוסות גידול הידרוג'ל תורבבו במשך 3 ימים והכילו תאי Jeko-1 שגודלו עם או בלי טיפול ב-9 מיקרומטר דוקסורוביצין או תאי MCL ראשוניים (מטופל 1).

איור משלים 1: זיהוי תאים משחזורים תלת מימדיים של צביעה חיה בארבעה צבעים. שחזורים תלת מימדיים של תמונה קונפוקלית המסומנת ב-DRAQ5 המתקבלים מ-(A) צביעה חיה בארבעה צבעים ו-(B) תמונה מפולחת בערוץ זה שנוצרה באמצעות צינור ניתוח ההדמיה של Python. סרגל קנה המידה מייצג 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת איור זה.

תוספת 2: תרבית של תאי MCL ראשוניים של חולים 2 ו-3 בפרוסות גידול הידרוג'ל.כדאיות של תאי MCL ראשוניים של (A) מטופל 2 או (B) מטופל 3 שתורבת בתרחיף (2D) או בפרוסות הידרוג'ל (3D) למשך עד 4 ימים כפי שהוערך על ידי בדיקת אי הכללה כחולה של טריפאן. מוצגת כדאיות ממוצעת של ניסוי אחד. אנא לחץ כאן להורדת איור זה.

קובץ משלים 1: הוראות לניתוח שחזורים תלת מימדיים המתקבלים מצביעה חיה בארבעה צבעים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: סקריפט Python לניתוח שחזורים תלת מימדיים המתקבלים מצביעה חיה בארבעה צבעים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קידוד משלים File 1: Stl. קובץ המכיל את התוכנית לפרוסות גידול ההידרוג'ל. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

פרוסות גידול ההידרוג'ל המתוארות בפרוטוקול זה מציעות מודל MCL המחקה את מבנה בלוטות הלימפה, ומאפשר לחקור את הישרדות תאי MCL ותגובה לתרופות במיקרו-סביבת גידול תלת מימדית שנוצרת על ידי הדפסה ביולוגית.

שיטות ההדפסה הביולוגית הנפוצות ביותר מבוססות על אקסטרוזיה, שבה דיו ביולוגי נפלט דרך מערכת חלוקה. בהדפסת הזרקת דיו, למשל, דיו ביולוגי מקושר במהירות לאחר התצהיר ליצירת מבנים תלת מימדיים25. עם זאת, גישה זו מגיעה עם מגבלות, במיוחד מבחינת צמיגות החומרים המשמשים והיכולת לערום שכבות. לעומת זאת, הדפסת ביולוגית תלת מימדית שחול משובצת מבוססת מזרק, כגון ההדפסה הביולוגית FRESH המשמשת בפרוטוקול זה, מיישמת גישת ג'ל בג'ל. זה מאפשר הדפסה של דיו ביולוגי בעל צמיגות נמוכה, כמו קולגן, למבנים יציבים, מה שמאפשר לחקות את המיקרו-סביבה המורכבת של הגידול20,26. בעוד שמדפסות תלת מימד שפותחו במיוחד עבור הדפסה ביולוגית יכולות להיות יקרות, השיטה המוצגת כאן מציעה נקודת כניסה נגישה יותר. ניתן להתאים אותו למדפסות שחול סטנדרטיות עם שינויים פשוטים יחסית. ניתן להדפיס שינויים אלה בתלת מימד עם חוטים במחירים סבירים, והעיצובים זמינים כמשאבי קוד פתוח, למשל, על ידי Hinton et al.20. עם זאת, חשוב לציין שהכנת אמבט התמיכה בהידרוג'ל להדפסה ביולוגית FRESH רגישה מאוד לטמפרטורה ודורשת תשומת לב קפדנית במהלך הכנת התרחיץ.

לעתים קרובות, מודלים של גידולים מודפסים בתלת מימד מתורבתים במערכות צפות, חסרות את שיפוע החמצן in vivo 25, או בתרביות שבב מיקרופלואידיות27, הלוכדות רמה גבוהה של מורכבות אך בעלות תפוקה נמוכה ודורשות תחזוקה גבוהה. ניתן להתגבר על מכשולים אלה באמצעות פרוסות גידול ההידרוג'ל המתוארות כאן. ההגדרה של תרבית של עד חמש פרוסות גידול הידרוג'ל בממשק אוויר-נוזל נגזרת מתרבית של פרוסות גידול חתוכות במדויק של גידולים מוצקים28. הממברנה של תמיכת המסנן המשמשת בפרוטוקול זה מורכבת מממברנה פוליטטרפלואורואתילן (PFTE) בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר, המאפשרת חילופי חומרים מזינים אך מונעת התקשרות תאית או נדידת תאים29. התרבית על קרום ה-PTFE מספקת תמיכה פיזית לפרוסות כדי לשמור על יציבותן ולמנוע מהן להיקרע או להתפרק. בנוסף, הם מספקים ממשק אוויר-נוזל, המספקים חמצן בעיקר מהאוויר שמעל וחומרים מזינים מהמדיום שמתחת למסנן30. המערכת משלבת אפוא וריאציות מרחביות-זמניות באספקת חומרים מזינים, התפשטות תאים וחמצון, כפי שהן עשויות להתרחש in vivo25. תאי MCL ראשוניים, שגודלו בפרוסות גידול ההידרוג'ל על תומך מסנן, שמרו על כדאיות של מעל 40% למשך 4 ימים, שהייתה עדיפה על הכדאיות שנצפתה בתרבית תרחיף דו-ממדית (איור 3A, איור משלים 2). חקירות נוספות צריכות לבחון האם ניתן להשיג כדאיות ממושכת על ידי הוספת ציטוקינים או גידול משותף עם פיברובלסטים המבטאים CD40L, כפי שתואר בספרואידים ואורגנואידים של גידול ראשוני של לימפומה של תאי B 6,19,30 או תרביות משותפות של תאי MCL ראשוניים עם תאי פיברובלסטים L המבטאים CD40L14. יש לשקול שילוב גישות כאלה בפרוסות גידול ההידרוג'ל כדי לשפר את התרבות של תאי MCL ראשוניים כמו גם את הדמיון למיקרו-סביבה המקומית.

בלוטות הלימפה מכילות רשת מפותחת של סיבי מטריצה חוץ-תאיים. בשל הדפוס שלהם, הם ידועים כסיבים רשתיים. בעיקר, סיבים אלה מורכבים מקולגן ומרכיבים ספציפיים לקרום הבסיס 31,32,33. כדי ליצור מטריצה הדומה למצב in vivo בבלוטות הלימפה, הדיו הביולוגי המשמש ליצירת פרוסות גידול ההידרוג'ל מורכב מקולגן מסוג I ומטריג'ל, המורכב מארבעת חלבוני ה-ECM העיקריים של קרום הבסיס למינין, קולגן IV, אנטקטין ופרלקן34. יתר על כן, אלגינט מתווסף לדיו הביולוגי כדי לייצב את פרוסות גידול ההידרוג'ל, מה שמאפשר תרבית ממושכת והובלה מכלי אחד למשנהו באמצעות מרית. בדיקת הידרוג'לים שונים המכילים קולגן ואלגינט הדגימה את הכדאיות התאית הגבוהה ביותר בשילוב עם פרוסת הידרוג'ל יציבה ועמידה בעת שימוש בדיו ביולוגי עם 0.5% אלגינט ו-20% קולגן (הנתונים לא מוצגים). מלבד הרכיבים, קוטר פרוסת גידול ההידרוג'ל של 0.8 ס"מ דומה עוד יותר לקוטר בלוטת הלימפה הממוצע של 1 ס"מ35. הדמיה תלת-ממדית חיה של פרוסות גידול ההידרוג'ל הראתה עוד פיזור אחיד של תאים (איור 2C).

כאן, היכולת לטפל בפרוסות ההידרוג'ל בתרופות הוכחה על ידי טיפול בדוקסורוביצין, שהוא חלק מטיפול R-CHOP (ריטוקסימאב, ציקלופוספאמיד, דוקסורוביצין, וינקריסטין, פרדניזון), טיפול סטנדרטי לתת-קבוצות של חולי MCL מבוגרים24. בהשוואה לתרביות דו-ממדיות, ניתן לחקור את ההשפעות של מיקרו-סביבת הגידול על השפעות הטיפול בפרוסות גידול ההידרוג'ל. כפי שמוצג באיור 3, תאי Jeko-1 שגודלו בפרוסות הידרוג'ל היו עמידים יותר לטיפול בדוקסורוביצין מאשר תאים בתרבית דו-ממדית. זה עולה בקנה אחד עם תצפיות כי המטריצה החוץ-תאית יכולה להשפיע על תגובות לתרופות ולעתים קרובות לשפר את העמידות לתרופות באמצעות ויסות נוקשות הגידול36, תקשורת תא-תא37 ואספקת תרופות38. בנוסף, ניתוח זרימה ציטומטרי, כמו גם צביעה אימונוהיסטוכימית או אימונופלואורסצנטית מרובה, יכולים לתת תובנות עמוקות יותר לגבי תגובת הטיפול של תאים בודדים בפרוסות גידול ההידרוג'ל.

לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את היצירה והתרבות של פרוסות גידול הידרוג'ל, המייצגות מודל בלוטות לימפה תלת מימדיות המחקה את מבנה בלוטות הלימפה התלת מימדיות המקוריות. הוא טומן בחובו פוטנציאל להרחיב את היישום מתאי MCL להתוויות לימפומה ראשוניות אחרות.

גילויים

מחקר זה נתמך על ידי קרן רוברט-בוש ומשרד המדע, המחקר והאמנויות באדן-וירטמברג (3R-Network BW).

תודות

אנו מודים לקרסטין וילק על הסיוע הטכני המצוין שלה וליאנג ז'אנג על עזרתו רבת הערך בניתוח התמונות התלת מימדיות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
µ-slide 8 באר זכוכית תחתיתibidi GmbH80827שקופיות תחתית זכוכית המשמשות להדמיה חיה של פרוסות הידרוג'ל
10x PBSCarl Roth GmbH + Co.KG9150.1רכיב דיו ביולוגי
10X RPMI-1640 בינוניסיגמא-אולדריץ'₪245רכיב דיו ביולוגי
מזרק אטום לגז 2.5 מ"ל דגם 1002 TLLהמילטון81420מזרק להדפסה ביולוגית
מדפסת שחול תלת מימדית, PrintrBot פשוטPrintrbotשינוי עצמי כדי לאפשר הדפסת דיו ביולוגי
צלחת 6 בארותTh. Geyer GmbH & Co.KG7696790תרבות פרוסות ההידרוג'ל
מערכות סינון ואקום לבקבוקים, ממברנת PES, 500 מ"ל, 0.22 ומיקרו; גודל נקבוביות M, 70  קרום בקוטר מ"מקורנינג בע"מ513-3355סינון סטרילי של מאגרים
סידן כלוריד מיובשCarl Roth GmbH + Co.KGT885.2רכיב של מאגר כביסה ותמיסת ג'לטין
קולגן I מחולדהקורנינג בע"מCLS354249רכיב דיו ביולוגי
תוכנת Cura גרסה 15.04.5 להדפסת תלת מימדאולטימייקרתוכנה המשמשת להדפסת תלת מימד
DRAQ5ביוסטטוס בע"מDR50050כתם להדמיה חיה של פרוסות הידרוג'ל
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) מלח דיסודיום דיהידראטסיגמא-אולדריץ'E5134רכיב של מאגר המסת אלגינט
מונה תאים אוטומטי EVEננו אנטק בע"מ10027-452מונה תאים
פלקון בקטריולוגי צלחות פטרי עם מכסה, קוטר 35 מ"מבז351008ממולא בתמיסת ג'לטין ליצירת אמבט תמיכה להדפסה ביולוגית
צינורות פלקון, 50 מ"לSarstedt AG & Co.KG62.547.254
סרום עגל עובריסיגמא-אולדריץ'S0615תוסף מדיום תרבית תאים
ג'לטין מעור חזירסיגמא-אולדריץ'G1890המרכיב העיקרי של תמיסת הג'לטין
HEPES, חומצה חופשית, בביולוגיה מולקולריתMerck KGaACAS 7365-45-9רכיב של מאגר כביסה ותמיסת ג'לטין
קו תאים Jeko-1 MCLATCCCRL-3006קו תאי MCL
מגבונים מדויקים של KIMTECH Scienceתאגיד קימברלי קלארק7551משמש לשאיבת עודפי מים מתמיסת הג'לטין ולהסרת טיפות מפיית מדפסת התלת-ממד
תוכנת LAS X גרסה 3.5.7.23225לייקהתוכנה המשמשת לשחזורי תלת מימד
Leica TCS SP8 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלילייקהTCS SP8מיקרוסקופ קונפוקלי להדמיה חיה
צנצנת מייסון, חצי ליטר רגיל, 16 אונקיותבול קורפוריישןG001צנצנת בה מכינים את תמיסת הג'לטין
מטריצת ממברנת הבסיס של Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)קורנינג בע"מ356231רכיב דיו ביולוגי
תוספת תרבית תאים מילית, 0.4 ומיקרו; גודל נקבוביות MMerck KGaAפיקמורג 50תמיכה בסינון לפרוסות הידרוג'ל
מצע NucView 405 Caspase-3, 1 מ"מ ב-1x PBSביוטיום10405כתם להדמיה חיה של פרוסות הידרוג'ל
בלנדר מסדרת Oster ProfessionalאוסטרBPST02-B00בלנדר ליצירת תמיסת ג'לטין
פניצילין/סטרפטמיציןג'יבקו15140163תוסף למדיום תרבית תאי MCL
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-ReagenzienInvitrogenעמ' 7589כתם להדמיה חיה של פרוסות הידרוג'ל
רוטינה 35 רהטיך24573צנטריפוגה של תאים
צנטריפוגה ROTINA 38/38RהטיךZ720109צנטריפוגציה של תמיסת ג'לטין
RPMI-1640+GlutaMAXג'יבקו61870036בסיס מדיום תרבית לתאי MCL
נתרן אלגינטשיתוף פעולה FMCGQ9109901רכיב דיו ביולוגי
נתרן כלוריMerck KGaA1.06404רכיב של מאגר המסת אלגינט
נתרן ציטראטCarl Roth GmbH + Co.KG3580.1רכיב של מאגר המסת אלגינט
צינוריות יישום קהות Sterican 21G 0.8x22 מ"מב.בראון9180109זרבובית להדפסת תלת מימד
טטרמתילרודמין-מתילאסטר-פרכלורט (TMRM)סיגמא-אולדריץ'T5428כתם להדמיה חיה של פרוסות הידרוג'ל
טריפאן כחול, 0.4%סיגמא-אולדריץ'T8154כתם לניתוח כדאיות
מדחום עמיד למיםVWR620-2099מדחום לניטור הטמפרטורה של תמיסת הג'לטין

מקורות

  1. Jain, P., Wang, M. L. Mantle cell lymphoma in 2022-a comprehensive update on molecular pathogenesis, risk stratification, clinical approach, and current and novel treatments. Am J Hematol. 97 (5), 638-656 (2022).
  2. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  3. Wen, T., Wang, J., Shi, Y., Qian, H., Liu, P. Inhibitors targeting Bruton's tyrosine kinase in cancers: Drug development advances. Leukemia. 35 (2), 312-332 (2021).
  4. Lee, H. J., et al. Phase 1/2 study of zilovertamab and ibrutinib in mantle cell lymphoma (mcl) or chronic lymphocytic leukemia (cll). J Clin Oncol. 40 (16_suppl), 7520(2022).
  5. Roué, G., Sola, B. Management of drug resistance in mantle cell lymphoma. Cancers. 12 (6), 1565(2020).
  6. Araujo-Ayala, F., et al. A novel patient-derived 3d model recapitulates mantle cell lymphoma lymph node signaling, immune profile, and in vivo ibrutinib responses. Leukemia. 37 (6), 1311-1323 (2023).
  7. Bryant, J., et al. Development of intermediate-grade (mantle cell) and low-grade (small lymphocytic and marginal zone) human non-Hodgkin's lymphomas xenotransplanted in severe combined immunodeficiency mouse models. Lab Invest. 80 (4), 557-573 (2000).
  8. Andersen, T., Auk-Emblem, P., Dornish, M. 3d cell culture in alginate hydrogels. Microarrays. 4 (2), 133-161 (2015).
  9. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  10. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).
  11. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnol J. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  12. Rossi, M., Alviano, F., Righi, S., Sabattini, E., Agostinelli, C. Three-dimensional models: A novel approach for lymphoma research. J Cancer Res Clin Oncol. 148 (4), 753-765 (2022).
  13. Saba, N. S., et al. Pathogenic role of B-cell receptor signaling and canonical nf-κb activation in mantle cell lymphoma. Blood. 128 (1), 82-92 (2016).
  14. Chiron, D., et al. Rational targeted therapies to overcome microenvironment-dependent expansion of mantle cell lymphoma. Blood. 128 (24), 2808-2818 (2016).
  15. Nylund, P., Nikkarinen, A., Ek, S., Glimelius, I. Empowering macrophages: The cancer fighters within the tumour microenvironment in mantle cell lymphoma. Front Immunol. 15, 1373269(2024).
  16. Nygren, L., et al. T-cell levels are prognostic in mantle cell lymphoma. Clin Cancer Res. 20 (23), 6096-6104 (2014).
  17. Medina, D. J., et al. Mesenchymal stromal cells protect mantle cell lymphoma cells from spontaneous and drug-induced apoptosis through secretion of b-cell activating factor and activation of the canonical and non-canonical nuclear factor κb pathways. Haematologica. 97 (8), 1255-1263 (2012).
  18. Jindal, U., et al. Targeting cers6-as1/fgfr1 axis as synthetic vulnerability to constrain stromal cells supported proliferation in mantle cell lymphoma. Leukemia. 38 (10), 2196-2209 (2024).
  19. Nie, L., et al. Establishment of a patient-derived organoid culture platform for mantle cell lymphoma drug sensitivity and car t cell anti-tumor activity assay. Blood. 140 (Supplement 1), 9219-9220 (2022).
  20. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).
  21. Van Der Kuip, H., et al. Short-term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug Taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6 (1), 86(2006).
  22. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76 (1), 469-477 (1999).
  23. Porter, A. G., Jänicke, R. U. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differentiat. 6 (2), 99-104 (1999).
  24. Huseynov, V. Treatment of mantle cell lymphoma in transplant non-eligible patients. Hematol Transfus Cell Ther. 44, S2-S3 (2022).
  25. Augustine, R., et al. 3d bioprinted cancer models: Revolutionizing personalized cancer therapy. Transl Oncol. 14 (4), 101015(2021).
  26. Budharaju, H., Sundaramurthi, D., Sethuraman, S. Embedded 3d bioprinting – an emerging strategy to fabricate biomimetic & large vascularized tissue constructs. Bioact Mater. 32, 356-384 (2024).
  27. Seaman, K., Sun, Y., You, L. Recent advances in cancer-on-a-chip tissue models to dissect the tumour microenvironment. Med-X. 1 (1), 11(2023).
  28. Davies, E. J., et al. Capturing complex tumour biology in vitro: Histological and molecular characterisation of precision cut slices. Sci Rep. 5 (1), 17187(2015).
  29. Millipore PICM03050: Millicell Standing Cell Culture Inserts Data Sheet. , Merck KGaA. Darmstadt, Germany. (2025).
  30. Lamaison, C., et al. A novel 3d culture model recapitulates primary fl b-cell features and promotes their survival. Blood Adv. 5 (23), 5372-5386 (2021).
  31. Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell Tissue Res. 252 (2), 367-375 (1988).
  32. Kaldjian, E. P., Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shi, Y., Shaw, S. Spatial and molecular organization of lymph node T cell cortex: A labyrinthine cavity bounded by an epithelium-like monolayer of fibroblastic reticular cells anchored to basement membrane-like extracellular matrix. Int Immunol. 13 (10), 1243-1253 (2001).
  33. German, S. V., et al. Plug-and-play lymph node-on-chip: Secondary tumor modeling by the combination of cell spheroid, collagen sponge, and T-cells. Int J Mol Sci. 24 (4), 3183(2023).
  34. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: From discovery and ecm mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliver Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  35. Ogassavara, B., Tucunduva Neto, R. R., De Souza, R. R., Tucunduva, M. J. Ultrasound evaluation of the morphometric patterns of lymph nodes of the head and neck in young and middle-aged individuals. Radiol Brasileira. 49 (4), 225-228 (2016).
  36. Huang, J., et al. Extracellular matrix and its therapeutic potential for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  37. Subrahmanyam, N., Ghandehari, H. Harnessing extracellular matrix biology for tumor drug delivery. J Personalized Med. 11 (2), 88(2021).
  38. Ahmad, V. Prospective of extracellular matrix and drug correlations in disease management. Asian J Pharma Sci. 16 (2), 147-160 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MCL
הדפסה ביולוגית של פרוסות גידול הידרוג'ל כמודל תלת מימד ללימפומה של תאי מעטפת
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.