הדמיה חיה ואפיון של דינמיקת מיקרוגליה ואינטראקציות עם סינפסות ברשתית עכברים חולים

Summary

מאמר זה מדגים שיטה לדמיון וכימות תנועתיות מיקרוגליה ומגע עם פונקטות פוסט-סינפטיות ברשתית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

Abstract

מיקרוגליות הן המאקרופאגים התושבים במערכת העצבים המרכזית (CNS) שמגיבים לזיהום ולפציעות ברקמה. בנוסף לתפקידן בדלקת, מיקרוגליות ממלאות תפקיד התפתחותי בשיפור המעגלים באמצעות גיזום סינפטי. עם זאת, מנגנוני הגיזום הסינפטי בדלקת עצבית ובנוירודגנרציה נותרו לא ידועים. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במודל אקסלנט של רשתית עכבר כדי לחקור דינמיקת מיקרוגליה אקס ויבו. כדי לבחון את תנועתיות המיקרוגליה ואת האינטראקציות שלהן עם חלבונים פוסט-סינפטיים, אנו מתייגים סינפסות עם AAV-PSD95-RFP ומקליטים סרטוני טיימלפס של מיקרוגליה ניידת שממוקמת יחד עם חלבונים פוסט-סינפטיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית דיסקית מסתובבת. לאחר מכן אנו יוצרים שחזורי שטח ונקודות של מיקרוגליה ו-PSD95 באמצעות תוכנת ניתוח תמונות. ניתן להפיק נתונים כמו אורך הזזת מיקרוגליה, מהירות תהליך ומגע עם נקטות פוסט-סינפטיות ממשטחים אלו כדי להבין את התנהגות המיקרוגליה הן במצבים הומאוסטטיים והן לאחר פגיעה נוירונלית. פרוטוקול זה יכול להיות שימושי בבחינת תפקיד המיקרוגליה בגיזום סינפטי במחלות ניווניות של הרשתית.

Introduction

תפקוד המעגל וההומאוסטזיס נשענים על ירי סינפסות מווסת מאוד ואינטראקציות ייחודיות נוספות בין סוגי תאים שונים¹. המיקרוגליה, המשמשת כמאקרופאגים התושבים של מערכת העצבים המרכזית (CNS), היא אוכלוסייה לא-נוירונית ברשתית שממלאה תפקיד ייחודי בגיזום סינפטי. במהלך התפתחות מערכת העצבים המרכזית, מיקרוגליה גוזמת סינפסות לא תפקודיות או חלשות כדי לחדד מעגלים עצביים². מיקרוגליות במוח המתפתח סוקרים את סביבתם ומוכנים לתפקיד נוירו-מגן בתקופות קריטיות³. בהתפתחות מערכת הראייה, מיקרוגליות הן רגולטורים מרכזיים בהתפתחות נוירונים קורטיקליים ואינטרנוירונים, בנוסף להצגת שינויים מורפולוגיים בתקופות קריטיות של עיצוב סינפטי⁴. באופן דומה, ברשתית המתפתחת, מיקרוגליות מנקות תאים אפופטוטיים כדי לפנות מקום לקשרים סינפטיים חדשים, כפי שאושר על ידי הגברת הסמן ההומאוסטטי P2Ry12^{במהלך אירועי} ניקוי אלו. עם זאת, ממצאים אחרונים מדגישים כי מיקרוגליה עשויה שלא למלא תפקיד מכריע בשיפור המעגלים העצביים^במערכת הראייה המתפתחת, ומדגישים כי קיימת מחלוקת לגבי תפקיד המיקרוגליה בהתפתחות מעגלים חזותיים.

בהקשרי פציעות, מיקרוגליה משנה את המורפולוגיה למצב פעיל ויכול למלא תפקיד ניווני נוירולוגי. לדוגמה, מיקרוגליה במודלים של מחלת אלצהיימר הראתה עלייה בבליעה של פלאקים אמילואידי-בטא⁷ וסמנים סינפטיים כמו SPH ו-PSD95⁸. בניוורון עצבי הרשתית, קבוצות מחקר רבות מצאו מיקרוגליה עם חומר סינפטי שנבלע, אך אין עדות ברורה לבליעה פעילה של סינפסות^שלמות 9,10,11,12,13. לדוגמה, He ואחרים מצאו שמספר המיקרוגליות גדל ויש להם נפח חומר סינפטי שנבלע במודל של רטיניטיס פיגמנטוזה⁹, אך לא ברור אם הייתה פגוציטוזיס של סינפסות שלמות לעומת פינוי פסולת. בנוסף, סיווגים מסורתיים של מיקרוגליאליים – כמו "מנוחה מול מופעל" או "M1 מול M2" – הם פשוטים מדי ופחות מדויקים בהתחשב בתובנות המודרניות. מיקרוגליות קיימות בגרדיאנט של מצבים, לא בקטגוריות נפרדות¹². לכן, פאוליצ'לי ואחרים קראו למעבר מסיווגים בינאריים מיושנים למונחים מדויקים ומוגדרים יותר למצבים מיקרוגליאליים כדי להבין ולהגדיר טוב יותר את המורפולוגיה^{והפעילות של} מיקרוגליה. לכן, אסטרטגיות להערכת תפקוד המיקרוגליה מחוץ לחיים ו-in vivo יגבירו את יכולת התחום לזהות מצבי מיקרוגליה ופעילות הן בהתפתחות והן בהקשרי מחלה.

למרות שקיימות אסטרטגיות לחקר תפקוד המיקרוגליה הן ב-ex vivo והן in vivo, הדמיה חיה אקס ביבו מציעה מספר יתרונות. ראשית, בהירות הקרנית או התפתחות הקטרקט לא יפריעו להדמיית הרשתית, ויוצרות הדמיה ברורה של תהליכים זעירים ונקודות סינפטיות. יתרה מזאת, הדמיה ב-vivo דורשת מיומנות טכנית גבוהה יותר להגדרה, מה שהופך את ההכנות ל-ex vivo עם יכולת תפוקה גבוהה יותר, מה שמוביל ליותר בעלי חיים שצולמו בכל ניסוי. למרות היתרונות התיאורטיים שהדמיה ב-vivo עשויה לאפשר, נדרש הספק לייזר גבוה (100-230 מיקרוואט) כדי ללכוד את תנועתיות תהליך המיקרוגליה להדמיה אורכית ^14,15. עם זאת, הדמיה אקס-ויבו של מיקרוגליה עם עוצמת לייזר נמוכה יותר ומדיה דימוית מספקת יכולה לספק את אותה איכות הדמיה כמו בהדמיה ב-vivo עם ההכנה הנכונה, אף על פי שהרקמה כבר אינה במקום.

הראינו כי מיקרוגליה עולה במספר, במורכבות ובתנועת התהליך לאחר עליית לחץ תוך-עיני חולף (IOP)¹⁰. ברקמה קבועה, מיקרוגליוזיס זה גורם לקולוקליזציה מוגברת עם חלבונים סינפטיים¹⁰. מחקרים קודמים הראו גם אובדן מוקדם של סינפסות וניוון דנדריטים בתאי גנגליון רשתית (RGCs) במודל יתר לחץ דם עיני מושרה בלייזר עכברים (LIOH) ובמודלים נוירודגנרטיביים נוספים 10,16,17,18,19,20. עם זאת, עדיין לא ידוע אם הם ממלאים תפקיד פעיל בגיזום הסינפסות או תפקיד פסיבי יותר בניקוי פסולת תאים, כולל סינפסות מפורקות. מכיוון שפירוק הסינפסות הוא סימן מוקדם של ניוורדגנרציה, הבנת דינמיקת המיקרוגליה ותפקידה בפירוק הסינפסות היא קריטית ^8,10. כאן, אנו משתמשים בהדמיה חיה כדי להבין את דינמיקת המיקרוגליה ואת האינטראקציה שלה עם חלבון צפיפות פוסט-סינפטי מעורר-95 (PSD95) על הדנדריטים של RGCs.

Protocol

בעלי החיים אוחסנו באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו, במחזורי אור של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך, וקיבלו מים ותזונה סטנדרטית לפי הדרישות, אלא אם צוין במפורש. כל ההליכים אושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו. ראו את טבלת החומרים לחומרים ולכלים המשמשים בפרוטוקול זה. סקירה של ההליך הניסוי, מהזרקה תוך-זגוגית ועד הדמיה וניתוח, מוצגת באיור 1.

1. ייצור ויעילות וירוס AAV-PSD95-TagRFP

1. בניית AAV-PSD95-tagRFP על ידי לקיחת רצף PSD-95pTagRFP (Addgene plasmid #52671; RRID:Addgene_52671) והכנסתו במורד הזרם של פרומוטר CMV ב-AAV-CMV-GFP לאחר הסרת ה-GFP (Addgene plasmid #67634; RRID: Addgene_67634).
2. הכינו את הווירוס באמצעות HEK293T משולש שעברו טרנספקט, טוהרו באמצעות PEG/כלורופורם, ומרוכזים לטיטר של 10¹² ip/mL (כפי שמתואר ב-Negrini ואחרים).²¹.
   הערה: שיטת ייצור וירוס זו בדרך כלל מפיקה טיטר נמוך יותר מאולטרה-צנטריפוגה, אך בניסויים אלו רצוי שיהיו תאים מזוהמים בדלילות²¹. הגרסה הקפסידית/סרוטיפית ששימשה בניסויים אלו הייתה 7 מ"ר (Addgene plasmid # 64839; RRID: Addgene_64839).
   1. בדקו את יעילות ה-AAV לפני שממשיכים בפרוטוקול ההדמיה המלא.
      הערה: קוראים שמיישמים פרוטוקול זה צריכים לשאוף לתיוג דליל של RGCs, שכן המטרה היא לזהות ולבודד דנדריטים בודדים של RGC.
3. אמת שהעברה מוצלחת ואז תקבע את הרשתית ב-2% PFA ב-1x ACSF. לגבי חלבונים סינפטיים, בדוק את האות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי ב-63x כדי לוודא ברזולוציה ברורה של סימון הפלואורסצנטי.
   הערה: ריכוז קיבוע קל יותר מסייע בשימור הסימון לחלבונים סינפטיים. אם ה-AAV אינו מיועד לרכיבים סינפטיים, הקוראים יכולים לבחור להשתמש ב-4% PFA במקום.

2. גידול עכברים והזרקות תוך-זכוכיתיות AAV-PSD95-TagRFP

1. הצלבת עכברים אלבינו זכרים ונקבות CD-1 (זן 022) עם B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J (זן 005582) ליצירת עכברי אלבינו CD-1 עם מיקרוגליה המבטאת EGFP. המתינו לפחות לארבעה דורות של הכלאה לאחור כדי להשתמש בעכברים ההטרוזיגוטיים Cx3cr1 הזכרים והנקבות בניסויים. לשמור ולרענן את הזן אחרי 10 דורות חזרה לרקע CD-1 כדי למנוע נדידה גנטית.
2. הרדמה של בעלי חיים (P30-P60) באמצעות הרדמה איזופלורנית דרך תא השראה באמצעות 3-5% הרדמה בחמצן עם קצב זרימה של 1 ליטר לדקה של חמצן. הניחו את החיה על מיקרוסקופ סטריאו, תוך שמירה על מתן איזופלוראן ברציפות דרך חרוט אף. כדי לוודא שהחיה מורדמת, צבוט את האצבע לפחות 3 פעמים כדי לוודא.
3. הוסיפו טיפה של 0.5% פרופרקאין לפני הזרקת ה-AAV. הזרקו 2 מיקרוליטר של AAV-PSD95-RFP באיטיות בשתי העיניים בלימבוס הסופרו-טמפורלי באמצעות מזרק 26s G 10 מיקרוליטר. הסר לאט את המחט כדי למנוע זרימה חוזרת של ה-AAV דרך אתר ההזרקה. מרחו משחה אנטיביוטית על העיניים לאחר ההזרקה.
4. הערה: המחט לא צריכה להגיע ליותר מחצי הדרך של היקף תא הזגוגית. כתוצאה מכך, הרשתית והעדשה עלולות להיפגע עם קצה המחט, מה שמוביל לטרנספקטציה חלקית או אפילו לא מוצלחת. התפתחות או דימום בקטרקט מעידים על טכניקת הזרקה שגויה.
5. לאחר ההזרקה, וודא שהחיות ערניות לפני החזרתן לכלובים ולחדרי המגורים המקוריים שלהן. אם בעל חיים יש כאב לאחר הזרקה, ניתן להזריק בופרנורפין באמצעות הזרקה תוך-פריטוניאלית. חכה 3 שבועות לביטוי AAV. אם משתמשים במודל אינדוקטיבי להעלאת לחץ תוך-עיני (או ביצוע מניפולציה אחרת), יש להמתין 3 שבועות לפני השראת לחץ תוך-עיני מוגבר בעין אחת, תוך שימוש בעין הנגדית או בעיני חיה תמימה כשליטה.

3. המתת חסד והטיה שטוחה ברשתית

1. הכינו תמיסה טרייה של 1x נוזל מוח-שדרה מלאכותי (ACSF, pH 7.4) ב-1x PBS המכילה את הרכיבים הבאים במילימטר: 119 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 MgCl₂·6H₂O, 2.5 CaCl₂·2H₂O, 1 NaHPO₄, 11 גלוקוז ו-20 HEPES).
2. חמצן את התמיסה לפחות 15 דקות לפני השימוש בה לניתוח אקוטי. חבר את הצינור למיכל חמצן, והניח פקק עם חור במרכז כדי למנוע מהגז לברוח.
3. הורד את העכבר עם לפחות 1 מ"ל הרדמה איזופלורנית בתא השראה קטן, ואחריו הפרעת צוואר הרחם. סמן את צד האף של הקרנית עם טוש לפני ההוצאה כדי שניתן יהיה לעקוב אחרי מיקום הרשתית לאורך כל הניסוי.
   1. כדי להוציא עיניים שהוזרקו במיקרו-חרוזים או בלייזר, יש לבצע פריטומיה מוגבלת של הלחמית ולהניח את המספריים מאחורי העין כדי לנתח את העין בבסיס עצב הראייה. זה מאפשר לעין העדינה להישאר שלמה.
4. באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה, דוקר חור קטן עם מחט של 23 או 25 גרם בקרנית, מה שמאפשר ל-ACSF מחומצן לחדור את העין. הכנס מספריים לחור הזה כדי ליצור חתך נאמנות בקצה האף.
5. חתוך את שאר הקרנית והאיריס בלימבוס.
6. הסר את הקשתית והעדשה. אם הרשתית נדבקת לעדשה, הפרד אותה עם מלקחיים.
7. הפרדו את הרשתית מהסקלרה באמצעות מלקחיים לניתוח עדין בין ה-RPE לרשתית העצבית.
8. הניחו את הרשתית בצד הלא-רשתי של נייר סינון ממברנלי Mixed Cellulose Esters (MCE) לצורך הדמיה והמחשה ברורה.
9. בצע חתכים קטנים מרגיעים ברשתית בשלושת הרבעים האחרים, כאשר החתך הארוך ביותר ברשתית האף למעקב אחר מיקום הרשתית.
   הערה: הרשתית צריכה להיראות כמו תלתן בעל ארבעה עלים.
10. העבר את הרשתית מנייר פילטר למגבון במעבדה. השתמש בטיפה אחת של ACSF כדי להרטיב את הרשתית ואז השתמש במגבון לייבוש נייר הסינון. חזור על זה לפחות 8-10 טיפות כדי שהרשתית תידבק לנייר הסינון.
11. הניחו את הרשתית בתא חמצן תוך כדי ניתוח העין הנגדית.
12. כשהם מוכנים להדמיה, ייבשו את נייר הסינון כפי שצוין בשלב 3.10 והפכו את הרשתית על צלחת Matek Petri. כבדו את הרשתית עם חרוזי מתכת או טבעת. תוסיף 3-5 טיפות של ACSF.
    הערה: חרוזי מתכת קטנים, כמו אלו מאמבט חרוזים או טבעת, הם בגודל ובמשקל מספיק כדי למנוע סחיפה מבלי לפגוע בשלמות הרשתית.
13. צור טבעת על ידי לקיחת חוט פלדה וחוטי ניילון מתוחים, הדבקה והוספת משקולת כדי ליצור טבעת עם חוטים מקבילים קבועים ומתוחים.
    1. עטוף את החוט סביב גליל בקוטר חצי אינץ' ומשך היטב עם פלייר. חתכו כל טבעת מהגליל ושטחו בין מבצעים.
    2. לשייף את הטבעת בצד אחד כדי לקבל צד שטוח ומחוספס. מתוחים חוטי ניילון מעל פתח בקבוק בקוטר 1-2 אינץ', והחזקו אותם במקום באמצעות גומיות.
    3. מניחים את הטבעת מעל מיתרי הניילון ומדביקים אותה בזהירות לחוטי הניילון על ידי מריחת כמויות קטנות של דבק לאורך ההיקף הפנימי של הטבעת. לאחר מכן, מניחים משקל קל מעל הטבעת, למשל מטבע או חוט מתכת דק, כדי להחזיק את הטבעת במקומה.
    4. לאחר הייבוש, חתכו את חוטי הניילון מהשפה החיצונית של הטבעת באמצעות מספריים מדויקים. התוצאה היא מיתרים מקבילים קבועים שמאריך את קוטר הטבעת במתוח.
    5. אם צפיפות מיתר הניילון גבוהה מדי בתוך הטבעת, חתוך מיתרים בודדים עם מספריים בקפיצי מיקרודיסקציה כדי להתאים לצרכי הניסוי.
       הערה: תהליך הניתוח וההתקנה אמור להימשך ~5 דקות בלבד. ככל שלוקח מהר יותר שהרקמה תעבור לתנאים פיזיולוגיים מאוזנים מחוץ לחיים (ex vivo), כך הרקמה בריאה יותר.

4. רכישת קונפוקלית בדיסק מסתובב

הערה: הפעל את תא הלחות ב-5%_CO2 והפעיל אותו לפחות שעה לפני ההדמיה. מתן אפשרות למערכת ולדגימה להגיע לשיווי משקל תרמי יעזור להפחית את ההסחפות.

1. תתחיל לסרוק דרך העינית במהירות של 10x כדי להתמקד במיקרוגליה. כאשר סורקים את הרקמה לאזורים לצילום, השתמשו בערוץ המיקרוגליה כהפניה, והתמקדו רק במיקרוגליות שיש להן פונקטות סינפטיות בהירות מוקדמות (בטווח של 10-20 מיקרון). מכיוון שסימון AAV אינו הומוגני בכל הרקמה, סרקו אזורים שבהם גם מיקרוגליה וגם פונקטה נמצאים באותו מישור. לאחר שאזור שעומד בקריטריונים אלו אותרו, עברו ל-60x לפוקוס, ועברו למצב מצלמה על ידי לחיצה על כפתור המצלמה .
   1. באמצעות תוכנת מערכת ההדמיה, לחץ קליק ימני על המסך כדי למצוא ניווט xy. יופיע מסך תצוגה מקדימה שיכול לסרוק את הרקמה על ידי יצירת מסגרת 3x3, 5x5, או גודל מותאם אישית למסך לאזורים אופטימליים. השתמש בגודל 3 על 3 או 5 על 5 פריימים ובמסך עם ערוץ ייחוס אחד כדי למנוע הלבנה רציפה של פוטו.
      הערה: לפרוטוקול זה השתמשנו בערוץ המיקרוגליה.
2. דמיינו את הרשתית המותקנת מיד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב עם מטרה 60x (NA 1.49).
3. כדי להציג את הדגימה, לחץ קליק ימני על המסך, בחר ב-Live ולחץ על כפתור ההתאמה האוטומטית כדי שהמערכת תוכל להתאים את התצוגה בהתאם ל-LUTs הנוכחיים. כדי להתאים את הגדרות הלייזר, בחר כל ערוץ בנפרד קודם והתאם את עוצמת הלייזר והחשיפה לפי הצורך. לאחר מכן, לחץ קליק ימני על הפלואורופור כדי להקצות הגדרות למיקרוסקופ ושמור את ההגדרות המותאמות, כי התוכנה לא שומרת את זה כשעוברים לערוץ אחר.
   1. עבור לערוץ הבא וכיוון לפי הצורך. לחץ קליק ימני על הפלואורופור כדי לשמור את ההגדרות. אם רוכשים מספר ערוצים באותו פריים, הזן את אותם ערכים לאחר צפייה מקדימה בכל ערוץ בנפרד. לחץ קליק ימני על הפלואורופור כדי לשמור את ההגדרות.
   2. לרכישה מרובת ערוצים, בחרו את הערוצים המעניינים תחת לשונית Lambda . להדמיה חיה, משלבים את כל הערוצים לערוץ אחד ללכידה מהירה של תנועה עדינה מהתא הרצוי, כדי לאפשר רכישת כל ערוץ בו-זמנית, ולא בנפרד, מה שעלול ליצור עיכוב בטיימלפס בהתאם למהירות התא.
4. המשך בהשגת טיימלפס לזמן הרצוי.
   1. בלשונית הזמן בפינה השמאלית התחתונה, הזינו טיימלפס של 5-10 דקות לזמן עם מרווח של 20 שניות.
   2. בלשונית הגדרות הרכישה מימין, הגדר את רזולוציית התמונה ל-608 על 832 עם גודל פיקסל של 0.12 מיקרון.
   3. אסוף תמונות ב-10 - 20 מיקרון באמצעות גודל צעד של 0.3 מיקרון כדי להבטיח רזולוציה סבירה של תהליכי מיקרוגליה עדינים ונקודות סינפטיות לאורך ציר ה-z. כדי להבטיח מעקב מוצלח אחרי תאים, שמרו על מרווח הזמן בין הפריימים ל-20 - 30 שניות.
      הערה: בשל השבריריות של הרקמה ex vivo, מומלץ לצלם תחילה את הרשתית הניסיונית ולא יותר משעה. זה נועד לנרמל את מצב עין השליטה הנגדית, שצריכה להיות בתא מחומצן בזמן הדמיית הרשתית הראשונה.
5. השתמשו בפרוטוקול זה כדי לצלם את השכבות השטחיות יותר של הרשתית. על ידי רכישת הפסקות זמן הגדולות מ-20 מיקרון, קשה יותר ללכוד תנועת תהליך עדינה במהלך מרווחי 20 שניות. לכן, רק מיקרוגליה של תמונה שנכנסת לערימת 20 מיקרון.

5. מעקב אחר ניתוח ויצוא נתונים

1. הדמיית פני שטח למיקרוגליה
   1. המר את קובץ הטיימלפס לפורמט IMS באמצעות תוכנת ממיר הקבצים. הזן את גדלי הווקסלים הבאים בהתבסס על תכונות התמונה שנרכשו משלב 4.2: x = 0.1272423 מיקרון, y = 0.1272423 מיקרון, z = 0.3 מיקרון.
   2. לאחר ההשקה, תוכנת הניתוח תתחיל בארנה. לחץ על תיקיית Observe כדי לפתוח את הקובץ שהומר קודם. ודא שהתמונה בתצוגת תלת-ממד.
   3. כדי לזהות מיקרוגליה שלמה, לחץ על סמל המשטח הכחול בסרגל הכלים של האובייקטים . בחר את שלוש האפשרויות האחרונות תחת הגדרות האלגוריתם : משטחים למעקב (לאורך זמן), סיווג משטחים, וסטטיסטיקת אובייקט-אובייקט. לחצו על כפתור ההפעלה הכחול כדי לעבור לשלב הבא.
      1. במקרה של מיקרוגליות מרובות, בחר ב-Segment only a Area of Interest (ROI) כדי להבטיח שקיים מיקרוגליות בודדות בתוך אובייקט שטח אחד. הגדר את פרמטרי x, y ו-z בהתאם כך שייצור רק משטח של המיקרוגליה הספציפית הרלוונטית.
   4. בחר את הערוץ שעבורו ייווצר רינדור שטח. אם רוצים, בחרו ב-Smooth כדי להחליק את יצירת המשטח והשתמשו ביחס של 1:1 - 1.25 לגודל הווקסלים של התמונה. לדוגמה, אם לתמונה יש גודל ווקסל של 0.12 x 0.12 x 0.3 מיקרון, הגדר את פירוט פני השטח ל-0.15 - 0.16 מיקרון. תחת סף, בחר ב-Me Learning Segmentation כדי לאמן את התוכנה בזיהוי התאים הרלוונטיים.
      הערה: השלב הבא כולל הזנת נתוני הדרכה ל-Imaris AI באמצעות סגמנטציה של למידת מכונה.
   5. תחת נתוני הדרכה, התבוננו בשני כלי המכחול: רקע (לזיהוי רקע) וקדמת התמונה (לזיהוי האות האמיתי של הדגימה). צייר משיכות מכחול על ידי בחירת מברשת הצבע הרצויה ושימוש בלחיצה Shift + Left. ודא ש-Interpolate Display נבחר תחת הגדרות. בחר Train ו-Predict כדי להזין נתוני אימון מתוך משיכות המכחול שנעשו.
      הערה: הזנה של יותר משש פעימות גורמת לזמן עיבוד ארוך יותר של הבינה המלאכותית וללכידה לא מדויקת של התא.
      1. השתמש במצביע הצהוב במרכז כדי לעבור על ערימת ה-z. צייר כמה משיכות מכחול צבע על פני מישורי x, y ו-z, וגם בכמה (לא כל) מסגרות זמן של הטיימלפס. תעשה 3-5 משיכות מכחול קצרות בכל כניסה, כי הבינה המלאכותית לומדת הכי טוב עם חתיכות מידע קטנות בכל פעם. כוון שלב זה באופן איטרטיבי עם כל כניסה עד שנוצר משטח מדויק של התא.
      2. בחר את המלבן הצהוב כדי להחליף בין תצוגת האימון למשטח שנוצר כבדיקה סופית. גם בדוק לאורך הזמן שהמשטח מייצג את התא במדויק.
   6. לאחר שהושג רינדור מדויק של פני השטח, עברו לשלב הבא. בטל את הבחירה בפיצול אובייקטים.
   7. כוון את מספר הווקסלים בהיסטוגרמה. הזז את הסף כך שיסיר עצמים קטנים שלא מחוברים למשטח הראשי.
      הערה: שלב זה משמש להסרת משטחים קטנים לא רצויים שנוצרו עקב רעש רקע. המטרה היא להסיר כל משטח שאינו מחובר לגוף התא הראשי הרלוונטי.
   8. לאחר מכן, ערוך את המשטח לפי הצורך. נקה ידנית כל אובייקט שאינו חלק מהמשטח הראשי או מהקצוות החתוכים באמצעות כלי המספריים לפי הצורך.
   9. אם רוצים, קבע סף של פערים מותר שניתן עדיין לשייך לאובייקט. בחר את אלגוריתם המעקב של התא הנע.
      הערה: תנועה אוטורגרסיבית היא הכלי הנפוץ ביותר למעקב תאים, שכן היא תעקוב אחרי תנועה רציפה לאורך כל הטיימלפס.
      1. המרחק המקסימלי וגודל הפער המקסימלי הם מספרים שהוגדרו על ידי המשתמש שקובעים נקודות משמעותיות מהן המשטח יכול לסטות מהם. הגדר מרחק רווח מקסימלי של 0.96 מיקרון וגודל רווח מקסימלי של 3 (הגדרות ברירת מחדל).
   10. בדומה לאופן שבו אובייקטים על פני השטח סיננו בשלב 5.1.7, מסננים מסלולים שאינם קשורים למשטח הראשי. גם זה מותאם על ידי היסטוגרמה. הגדר היכן להגדיר את הסף על ידי חיפוש מתי מסלולים נקודתיים קטנים שנמשכים לא יותר מחמש מסגרות זמן מוסרים מהתאמות המסנן.
   11. לאחר מכן, קבע סיווגים אם רוצה. לדוגמה, יש לסווג את אורך ההעתקה בין 0 - 1 מיקרון ל-1+ מיקרון כדי לקבוע תנועת תהליך קטנה או תזוזה גדולה משמעותית של תהליך או תא.
   12. לבסוף, הניחו תוויות נכונות על אירועים מסוימים לפי הסיווגים מהשלב הקודם.
       הערה: שלב זה מומלץ לנצל לאחר שנוצרו נקודות לאות הפוסט-סינפטי.
2. סיווג נקודתי עבור PSD95
   1. כדי לזהות מיקרוגליה שלמה, לחץ על סמל המשטח הכחול בסרגל הכלים של האובייקטים . בחר את שלוש האפשרויות האחרונות תחת הגדרות האלגוריתם : משטחים למעקב (לאורך זמן), סיווג משטחים, וסטטיסטיקת אובייקט-אובייקט. לחצו על כפתור ההפעלה הכחול כדי לעבור לשלב הבא.
   2. בחר את ערוץ המקור של הסמן הסינפטי. כבה את הסלייסר וכל ערוץ אחר כדי להמחיש רק את PSD95. השתמש בכפתור ctrl ובכלי בחירת המצביע כדי להעריך את קוטר ה-xy של הפנקטה.
      1. בחר כמה פונקטות בהירות שנשארות לאורך כל הטיימלפס (גדלים נעים בין 0.6 מיקרון ל-1.2 מיקרון).
      2. כבה את חיסור הרקע. אם התמונה דורשת חיסור ברקע, השתמש בכלי החיסור ברקע תחת עיבוד תמונה לפני עיבוד הטיימלפס.
   3. לאחר מכן, הוסיפו פילטר לפי איכות הכתם. גרור את ההיסטוגרמה כך שכל הנקודות של PSD95 יתפסו במדויק לאורך כל הטיימלפס.
      הערה: האיכות מבוססת על עוצמת מרכז הספוט⁹. מסנן זה לוכד בצורה המדויקת ביותר את האות האמיתי של PSD95, בהשוואה למספר מסנני הווקסלים או מסנני הקוטר.
   4. לאחר מכן, הסר כל נקודה שנוצרה מרעש באמצעות שלב העריכה. החלף בין סמן הקובייה או סמן המעגל כדי להסיר נקודות בודדות או מרובות, בהתאמה, שמופיעות רק ל-1-2 מסגרות זמן בגלל רעש.
   5. אם רוצים, קבע סף של פערים מותר שניתן עדיין לשייך לאובייקט. בחר את אלגוריתם המעקב המתאים לסמן הסינפטי.
      1. המרחק המקסימלי וגודל הפער המקסימלי הם מספרים שהוגדרו על ידי המשתמש שקובעים נקודות משמעותיות מהן הנקודות יכולות לסטות. הגדר מרחק רווח מקסימלי של 14.6 מיקרון וגודל רווח מקסימלי של 3 (הגדרות ברירת מחדל).
   6. בדומה לאופן שבו אובייקטים נקודתיים סיננו בשלב 5.2.3, מסננים מסלולים שאינם קשורים לפנקטה מובחנת. גם זה מותאם על ידי היסטוגרמה. כדי להגדיר היכן להגדיר את הסף, חפש מתי מסירות אובייקט קטנות מוסרות.
   7. הגדר סיווגים אם רוצים. לדוגמה, יש להבחין בין פונקטה נבלעת, במגע או לא במגע באמצעות סיווג המרחק הקצר ביותר למשטח . הסט נבלע ככל פונקטה < 0 מיקרון בתוך המשטח, במגע בין 0 ל-0.5 מיקרון מהמשטח, או לא במגע כ-0.5+ מיקרון מהמשטח.
   8. לבסוף, הניחו תוויות נכונות על אירועים מסוימים לפי הסיווגים מהשלב הקודם.
3. לאחר שמשטחים ונקודות מייצגים במדויק את המיקרוגליה והפונקטה המעניינים, ייצא את כל הסטטיסטיקות מכל אובייקט תחת לשונית הסטטיסטיקות . ודא שהסטטיסטיקות המפורטות מופקות, שיכללו את אורך ההזזה, המהירות ואירועי המגע מסווגים.
   1. סטטיסטיקות רבות, כגון שטח, נפח, אורך תזוזה ומהירות, הן פלטים מאימאריס. ייצוא את אורך ומהירות ההזזה של פני השטח כדי להגדיר דינמיקת מיקרוגליה בניסוי.
      1. הגדר אורך תזוזה כמרחק בין המיקום ההתחלתי של המשטח למיקום הסופי, הנמדד במיקרומטר²².
      2. הגדר מהירות כמהירות מיידית של פני השטח מפרק זמן אחד לאחר, הנמדדת ב-μm/s²².
         הערה: אירועי מגע הם תופעה שתוארה על ידי המחברים כפנקטות פוסט-סינפטיות שלמות החולקות מרחק של 0 מיקרון בין מיקרוגליות בודדות למשך לפחות חמישה מסגרות זמן עקביות בתוך הטיימלפס.

Results

מיקרוגליה מרשתית עכברים של CX3CR1-GFP צולמו באמצעות הפרוטוקול שתיאר. העכברים נעו בין P30 ל-P60 בזמן הזרקת AAV-PSD95-RFP, וחלפו לפחות 21 ימים כדי לאפשר ביטוי של AAV. תמונות מייצגות של מיקרוגליה והאינטראקציות שלהן עם פונקטה PSD95 לפני ואחרי ניתוח מוצגות באיור 2. כדי לגרום להפעלת מיקרוגליה, השתמשנו במודל LIOH (לייזר עכברים), מודל שמעלה באופן זמני לחץ תוך-עיני (IOP)10,16,17,1

Discussion

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה ומעקב אחר אינטראקציה בין מיקרוגליה בודדת עם אתרים פוסט-סינפטיים לאורך הדנדריטים של RGCs. במחלה ניוונית נוירולוגית כמו גלאוקומה, מיקרוגליות מתחברות לסינפסות בשכבת הפלקסיפורם הפנימית (IPL) של הרשתית. תפקיד המיקרוגליה בפירוק הסינפסות אינו מובן היטב. עם זאת, מיקרוגליות פוטנציאלית תורמת באמצעות מספר מנגנונים פוטנציאליים, כולל בליעת סינפסות באופן חריג, ניקוי פסיבי של פסולת מהתאים האפופטוזיים, או שילוב של מנגנונים אלו.

פרוטוקול זה יכול לשמש ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מחט 25 גייג'	אלקון	8065420920
26s Gauge 10 ומיקרו; מזרק L	המילטון	701RNWG
7m8	אדג'ין	64839	http://n2t.net/addgene:64839
חוט נירוסטה 304 רב-תכליתי Bend-and-stay	חומרים מתקדמים של סטנפורד	SS3368	חוט פלדה ליצירת טבעות
סידן כלוריד הקסהידרט	סיגמא-אלדריץ'	C5080-500G
מיקרוסקופ דיסקציה	אמסקופ		לנתח ולהרכיב רשתית
מספריים לניתוח	FST	15024-10
D-(+)-גלוקוז	סיגמא-אלדריץ'	G7528-250G
מלקחיים	דומון	11252-21
HEPES	סיגמא-אלדריץ'	H3375-500G
אימאריס 10.0.2	אוקספורד אינסטרומנטס		תוכנת ניתוח
ממיר קבצים אימאריס	אוקספורד אינסטרומנטס
Loctite Super Glue Ultra Gel Control	לוקטיט	1363589	דבק ליצירת טבעות
מגנזיום כלוריד הקסיהידרט	סיגמא-אלדריץ'	M9272-100G
נייר סינון ממברנה MCE (13 מ"מ)	מיליפור	HABG01300	0.45 & mu; m גודל נקבוביות
חדר מיקרו-סביבתי	טוקאי היט	STXG-TIZBX-SET
מיקרוסקופ הפוך Nikon Eclipse Ti2-E	ניקון
יסודות NIS	ניקון
משחת תמיסת עיניים של ניאומיצין ופולימיקסין B סולפאות ובציטרצין אבץ לעיניים, USP	באוש + לומב	24208-780-55
מברשת צבע בגודל 00	אמזון
פריזמה 8.0	GraphPad
תמיסת אופטלמית פרופרקאין הידרוכלוריד USP, 0.5%	סנדוז	61314-0016-01
צלחת פטרי מצופה PDL (35 מ"מ)	מטק	P35GC-1.5-14-C	קאברסליפ מס' 1.5
PSD95_pTagRFP	אדג'ין	52671	http://n2t.net/addgene:52671
כלוריד אשלגן	סיגמא-אלדריץ'	P9333-500G
כלוריד נתרן	סיגמא-אלדריץ'	S7653-1KG
נתרן פוספט מונו-בסיסי מונוהידרט	סיגמא-אלדריץ'	S9638-25G